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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin und L-Methionin, unter Verwendung coryneformer Bakterien,
in denen mindestens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR,
smtB2, dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2,
lexA, ccpA3 und degA2 abgeschwächt,
insbesondere ausgeschaltet ist (sind). Die genannten Gene kodieren
für Proteine
aus der Gruppe der Transkriptionsregulatoren.
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Stand der
Technik
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Chemische
Verbindungen, mit denen insbesondere L-Aminosäuren, Vitamine, Nukleoside
und Nukleotide und D-Aminosäuren gemeint
sind, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie,
in der Kosmetik, in der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
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Zahlreiche
dieser Verbindungen werden durch Fermentation von Stämmen coryneformer
Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt.
Wegen der großen
Bedeutung wird ständig
an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Maßnahmen
wie zum Beispiel Rührung
und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein
oder die Methionin-Analoga α-Methyl-Methionin,
Ethionin, Norleucin, N-acetylnorleucin,
S-Trifluoromethylhomocystein, 2-amino-5-heprenoitsäure, Seleno-Methionin, Methioninsulfoximin,
Methoxin, 1-Aminocyclopentan-Carboxylsäure oder auxotroph für regulatorisch
bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender
Stämme
von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert
und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion
untersucht.
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Aufgabe der
Erfindung
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Die
Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin und L-Methionin,
mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
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Beschreibung
der Erfindung
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Werden
im folgenden L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
erwähnt,
sind damit eine oder mehrere der proteinen Aminosäuren einschließlich ihrer
Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin,
L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Glutamin,
L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin,
L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin,
L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin und L-Prolin gemeint. Besonders
bevorzugt sind L-Lysin und L-Methionin.
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Unter
proteinogenen Aminosäuren
versteht man die Aminosäuren
die in natürlichen
Proteinen, das heißt
in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen
vorkommen. Sie dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen
miteinander verknüpft
sind.
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Werden
im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit nicht nur die
Basen, sondern sind auch die Salze wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat gemeint.
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Werden
im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze
wie z.B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat gemeint.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter
Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits
L-Aminosäuren
produzieren und in denen mindestens eine oder mehrere der für die Gene
smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR, smtB2, dtxR,
degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2, lexA, ccpA3
und degA2 kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abgeschwächt, insbesondere
ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird (werden).
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Gegenstand
dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von
L-Aminosäuren,
in dem folgende Schritte durchführt
werden:
- a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden
coryneformen Bakterien, in denen mindestens eines oder mehrere der
Gene, ausgewählt
aus der Gruppe smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR, smtB2,
dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2, lexA,
ccpA3 und degA2 abgeschwächt,
insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert
wird (werden),
- b) Anreicherung der L-Aminosäuren
im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolierung der gewünschten
L-Aminosäuren,
wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder
der Biomasse in Anteilen (> 0
bis 100 %) oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
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Die
eingesetzten coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits
vor der Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3,
gatR, glcR, tcmR, smtB2, dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR,
merR, hrcA, glpR2, lexA, ccpA3 und degA2 L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin und L-Methionin.
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Es
wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung eines
oder mehrerer der Gene smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR,
glcR, tcmR, smtB2, dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA,
glpR2, lexA, ccpA3 und degA2, in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin und L-Methionin, produzieren.
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Die
Genprodukte der abzuschwächenden
Gene smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR, smtB2,
dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2, lexA,
ccpA3 und degA2 gehören
zur Gruppe der Transkriptionsregulatoren.
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Transkriptionsregulatoren
sind solche Proteine, die durch eine spezifische Proteinstruktur,
genannt Helix-Turn-Helix-Motiv,
an DNA binden können
und so die Transkription anderer Gene entweder verstärken oder
abschwächen
können.
Die Abschwächung
eines oder mehrerer der genannten Transkriptionsregulatoren verbessert
die Produktion von L-Lysin
und L-Methionin in den entsprechenden coryneformen Bakterien.
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Die
Nukleotidsequenzen der genannten Gene von Corynebacterium glutamicum
gehören
zum Stand der Technik und können
verschiedenen Patentanmeldungen sowie der Datenbank des National
Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library
of Medicin (Bethesda, MD, USA) entnommen werden. smtB-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsrepressor
SmtB |
| Funktion: | Metall-abhängiger Repressor
der Expression des für ein
Metallothionein kodierenden smtA-Gens, Regulation der Zell-Antwort
auf verschiedene Schwermetalle, ArsR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 3056 und Nr. 7068 aus EP1108790 ; Sequenz
Nr. 559 aus WO 01/00805 |
| Accession
No.: | AX123140,
AX127152 und AX066977 |
cgl1-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
Cgl1 |
| Funktion: | Transkriptionsregulator
der GntR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 3251 und Nr. 7069 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX123335
und AX127153 |
hspR-Gen:
| Bezeichnung: | Hitzeschock-Regulatorprotein
HspR |
| Funktion: | Bindet
in der Promotor-Region vor dem für
ein Chaperon kodierenden Gen dnaK |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 3073 und Nr. 7068 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX123157
und AX127152 |
cgl2-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
Cgl2 |
| Funktion: | Transkriptionsregulator
der TetR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 1700 und Nr. 7064 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX121784
und AX127148 |
cebR-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
CebR |
| Funktion: | Regulation
der Aufnahme von Cellobiose und Cellotriose |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 2889 und Nr. 7068 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX122973
und AX127152 |
cgl3-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
Cgl3 |
| Funktion: | Transkriptionsregulator
der TetR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 3379 und Nr. 7069 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX123463
und AX127153 |
gatR-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
GatR |
| Funktion: | Repressor
des Gat-Operons für
Aufnahme und Verwertung von Galaktitol |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 129 und Nr. 1 aus EP1108790 ,
Sequenz Nr. 195 aus WO 01/00844 |
| Accession
No.: | AX120213,
AX120085 und AX065069 |
glcR-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
GlcR |
| Funktion: | Transkriptionsregulator
der DeoR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 123 und Nr. 1 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX120207
und AX120085 |
tcmR-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsrepressor
TcmR |
| Funktion: | Regulation
von Tetracenomycin-Resistenz und -Export, TetR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 424 und Nr. 7060 aus EP1108790 ;
die Basen 506 bis 606 des kodierenden Bereichs sind jeweils in den
Sequenzen 247 und 249 aus WO 01/00804 enthalten |
| Accession
No.: | AX120508
und AX127144; AX066343 und AX066345 |
smtB2-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsrepressor
SmtB2 |
| Funktion: | Metall-abhängiger Repressor
der Expression des für ein
Metallothionein kodierenden smtA-Gens, Regulation der Zell-Antwort
auf verschiedene Schwermetalle, ArsR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 292 und Nr. 1 aus EP1108790 ,
Sequenz Nr. 119 aus WO 01/00804 |
| Accession
No.: | AX120376,
AX120085 und AX066215 |
dtxR-Gen:
| Bezeichnung: | Diphterie-Toxin
Repressor |
| Funktion: | Eisen-bindender
Repressor der Diphterie-Toxin
Genexpression |
| Referenzen: | Oguiza
et al., Journal of Bacteriology 177 (2), 465–467 (1995) |
| Accession
No.: | L35906 |
degA-Gen:
| Bezeichnung: | Degradations-Regulator
DegA |
| Funktion: | Beteiligung
an der Kontrolle von Inaktivierung und Abbau von Enzymen, LacI-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 2240 und Nr. 7966 aus EP1108790 , Sequenz
Nr. 337 aus WO 01/00844 |
| Accession
No.: | AX122324,
AX127150 und AX065211 |
galR-Gen:
| Bezeichnung: | Galaktose-Operon
Repressor |
| Funktion: | Galaktose-induzierbarer
Repressor des Galaktose-Operons |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 2309 und Nr. 7066 aus EP1108790 , Sequenz
Nr. 383 aus WO 01/00844 |
| Accession
No.: | AX122393,
AX127150 und AX065257 |
tipA2-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
TipA2 |
| Funktion: | Transkriptionsregulator
der MerR-Familie |
| Referenzen: | Sequenzen
Nr. 2349 und Nr. 7066 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX122433
und AX127150 |
malI-Gen:
| Bezeichnung: | Maltose-Regulon
Repressor |
| Funktion: | Maltose-induzierbar,
LacI-Familie |
| Referenzen: | Aus EP1108790 : Nukleotide 149
bis 601 in Sequenz Nr. 2724, Nukleotide 1 bis 346 in Sequenz Nr.
2725, Nukleotide 539 bis 1080 in Nr. 2727 und gesamter kodierender
Bereich in Nr. 7067 |
| Accession
No.: | AX122808,
AX122809, AX122811 und AX127151 |
cgl4-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
Cgl4 |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 972, Nr. 7061 und Nr. 7062 aus EP1108790 ,
Nukleotide 205 bis 309 in Sequenz Nr. 617 aus WO 01/00805 |
| Accession
No.: | AX121056,
AX127145, AX127146 und AX067035 |
arsR-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsregulator
ArsR |
| Funktion: | Regulation
und Expression des Arsen-Resistenz-Operons |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 500 und Nr. 7060 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX120584
und AX127144 |
merR-Gen:
| Bezeichnung: | Quecksilber-Resistenz-Operon
Regulator |
| Funktion: | Vermittelt
Quecksilber-abhängige
Induktion des Quecksilber-Resistenz-Operons, MerR-Familie |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 1009 und Nr. 7062 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX127146
und AX121093 |
hrcA-Gen:
| Bezeichnung: | Transkriptionsrepressor
HrcA |
| Funktion: | Hitze-induzierbarer
Transkriptionsrepressor von Hitzeschock-Proteinen, HrcA-Familie |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 2513, Nr. 7066 und Nr. 7067 aus EP1108790 , |
| Accession
No.: | AX127150,
AX127150 und AX127151 |
glpR2-Gen:
| Bezeichnung: | Glycerin-3-Phosphat-Regulon
Repressor |
| Funktion: | Regulation
der Gene des Glycerinmetabolismus, DeoR-Familie |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 2123 und Nr. 7065 aus EP1108790 ,
Nukleotide 881 bis 981 in Sequenz Nr. 57 aus WO 01/00845 |
| Accession
No.: | AX122207,
AX127149 und AX064931 |
lexA:
| Bezeichnung: | SOS-Regulon
Repressor LexA (EC-Nr. 3.4.21.88) |
| Funktion: | Vermittelt
SOS-induzierte Expression von DNA-Reparatur-Proteinen, Peptidase-Familie
S24 |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 2119 und Nr. 7065 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX122203
und AX127149 |
ccpA3:
| Bezeichnung: | Katabolit-Kontroll-Protein
CcpA3 |
| Funktion: | Beteiligt
an der Repression von Kohlenhydrat-abbauenden Genen und der positiven
Regulation von Genen für
die Exkretion von überschüssigem Kohlenstoff,
LacI-Familie |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 200 und Nr. 1 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX120284
und AX120085 |
degA2:
| Bezeichnung: | Degradations-Regulator
DegA2 |
| Funktion: | Beteiligung
an der Kontrolle von Inaktivierung und Abbau von Enzymen, LacI-Familie |
| Referenzen: | Sequenz
Nr. 191 und Nr. 1 aus EP1108790 |
| Accession
No.: | AX120275
und AX120085 |
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Die
in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend
für die
Gene smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR, smtB2,
dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2, lexA,
ccpA3 und degA2 können
erfindungsgemäß verwendet
werden. Weiterhin können
Allele der genannten Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit
des genetischen Kodes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen
(„sense
mutations") ergeben.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
finden sich in den Ansprüchen.
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Der
Begriff „Abschwächung" bzw. „Abschwächen" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert
bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert.
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Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins,
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
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Die
Herabsetzung der Proteinkonzentration ist über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung
und anschließende
optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender
Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation
der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung
der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712–23 (2001))
beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls
durch Western-Blot-Hybridisierung
mit einem für das
nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)
und anschließender
optischer Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung
(Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32–39; Lottspeich, Angewandte
Chemie 111; 2630–2647
(1999)) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen
kann mittels DNA Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet)
gemessen werden wie beispielsweise im Lehrbuch „Bioanalytik" (Lottspeich/Zorbas,
Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Deutschland, 1998)
beschrieben und bei Wilson et al. (J. Bacteriol. 183:2151–2155 (2001))
angewendet. Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression
anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des
Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
Aminosäuren
aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose
oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter
coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium
handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit
bekannt ist, L-Aminosäuren
zu produzieren.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und
daraus hergestellte L-Aminosäuren
produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium
lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P
6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium
glutamicum DSM 5715
oder wie beispielsweise der L-Methionin
produzierende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
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Stämme mit
der Bezeichnung „ATCC" können von
der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen
werden. Stämme
mit der Bezeichnung „FERM" können vom
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)
bezogen werden. Der genannte Stamm von Corynebacterium thermoaminogenes
(FERM BP-1539) ist in der US-A-5.250.434 beschrieben.
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Zur
Erzielung einer Abschwächung
können
entweder die Expression der Gene oder die regulatorischen Eigenschaften
der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls
werden beide Maßnahmen
kombiniert.
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Die
Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische
Veränderung
(Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene,
Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen,
das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann
z.B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal
of Bacteriology 170: 5949–5952
(1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3584–3590 (1998),
bei Pátek
et al. (Microbiology 142: 1297–309
(1996) und Journal of Biotechnology 104: 311–323 (2003)) und in bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers
(„Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), oder dem von
Winnacker („Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
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Ein
Beispiel für
die gezielte Regulation der Genexpression ist die Klonierung des
abzuschwächenden Gens
unter die Kontrolle eines durch Zugabe dosierter Mengen von IPTG
(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbaren
Promotors wie zum Beispiel des trc-Promotors oder des tac-Promotors. Hierzu
eignen sich Vektoren wie beispielsweise der Escherichia coli Expressionsvektor
pXK99E (WO0226787; hinterlegt gemäß Budapester Vertrag am 31.
Juli 2001 in DH5alpha/pXK99E als DSM14440 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)) oder pVWEx2
(Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397,
ISSN 0994–2952,
Jülich,
Deutschland (1997)), die eine IPTG- abhängige
Expression des klonierten Gens in Corynebacterium glutamicum ermöglichen.
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Eingesetzt
wurde diese Methode beispielsweise in der Patentschrift WO0226787
zur regulierten Expression des deaD-Gens durch Integration des Vektors
pXK99EdeaD in das Genom von Corynebacterium glutamicum und von Simic
et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321–3327 (2002))
zur regulierten Expression des glyA-Gens durch Integration des Vektors
pKl8mobglyA' in
Corynebacterium glutamicum.
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Eine
weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression
ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxyukleotide oder
Vektoren zur Synthese längerer
Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA
kann dort an komplementäre
Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern
oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet
der Fachmann bei Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology
2000 Oct; 66 (10): 4366–4371).
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Mutationen,
die zu einer Veränderung
bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:
8611–8617
(1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760–1762
(1997)) und Möckel
(„Die
Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der
allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums
Jülichs,
Jül-2906,
ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen („missense
mutations") oder
Nichtsinnmutationen („nonsense
mutations") gesprochen.
Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem
Gen führen
zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), in deren Folge
falsche Aminosäuren
eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen
von mehreren Kodonen führen
typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität.
Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum
Stand der Technik und können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers
(„Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
(„Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann
(„Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Eine
gebräuchliche
Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology
9, 84–87
(1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung („gene disruption") und des Gen-Austauschs
(„gene
replacement").
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Bei
der Methode der Gen-Unterbrechung wird zum Beispiel ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor
kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber
in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise
pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob, pK19mob,
pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)),
pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman
(1994), Journal of Biological Chemistry 269:32678–84; US-Patent
5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534–541
(1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510–4516)
in Frage. Der Plasmidvektor, der den zentralen Bereich der Kodierregion des
Gens enthält,
wird anschließend
durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Journal of Bacteriology 172: 1663–1666 (1990) und Applied and
Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden
zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067–1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994))
beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des
betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige
Allele, denen jeweils das 3'-
bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese
Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 42, 575–580
(1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
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Bei
der Methode des Genaustausches („gene replacement") wird eine Mutation
wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Rasenaustausch in dem interessierenden
Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in
einen für
C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch
Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw.
des Allels. Diese Methode ist bei Scharzer und Pühler (Bio/Technology 9: 84–87 (1991) beschrieben
und wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology
144, 915–927
(1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion
auszuschalten oder von Wehmeier et al. (Microbiology 144: 1853–1862 (1998))
zum Einfügen
einer Deletion in das rel-Gen von C. glutamicum.
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Einen Überblick über verschiedene
gentechnische Methoden bei C. glutamicum geben Kirchner und Tauch
(Journal of Biotechnology 104: 287–299 (2003).
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In
eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe smtB, cgl1,
hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR, smtB2, dtxR, degA, galR,
tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2, lexA, ccpA3 und degA2
kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch
eingebaut werden.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich
zur Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe smtB, cgl1,
hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR, smtB2, dtxR, degA, galR,
tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2, lexA, ccpA3 und degA2,
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse,
der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus,
des Pentosephosphat-Zyklus,
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine entweder zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren,
oder abzuschwächen,
insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
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Der
Begriff „Verstärkung" bzw. „Verstärken" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem
Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden,
indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen
starken Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym
bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombiniert.
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Durch
die Maßnahmen
der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000 bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise
der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
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Die
Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen
Genen" oder „endogenen
Nukleotidsequenzen" versteht
man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise
Nukleotidsequenzen.
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So
kann beispielsweise für
die Herstellung L-Lysin neben der Abschwächung eines oder mehrerer der Gene,
ausgewählt
aus der Gruppe smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR,
smtB2, dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2,
lexA, ccpR3 und degA2, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus
der Gruppe der Gene oder Allele der Lysinproduktion verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden. Unter „Gene
oder Allele der Lysinproduktion sind sämtliche, bevorzugt endogene,
offene Leserahmen, Gene oder Allele zu verstehen, deren Verstärkung/Überexpression
eine Verbesserung der Lysinproduktion bewirken kann.
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Hierzu
gehören
unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: accBC,
accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC,
dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd,lysC, lysCFBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH,
ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA,
tkt, tpi, zwa1, zwf und zwf A243T. Diese sind in Tabelle 1 zusammengefasst
und erläutert.
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Tabelle
1 Gene
und Allele der Lysinproduktion
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-
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Weiterhin
kann es für
die Produktion L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung eines
oder mehrerer der Gene, ausgewählt
aus der Gruppe smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR,
smtB2, dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2,
lexA, ccpA3 und degA2 gleichzeitig eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt
aus der Gruppe der Gene oder Allele, die für das Wachstum oder die Lysinproduktion
nicht essentiell sind, abzuschwächen,
insbesondere die Expression zu verringern.
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Hierzu
gehören
unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: aecD,
ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR,
luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB und zwa2, welche
in Tabelle 2 zusammengefasst und erläutert sind.
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Tabelle
2 Gene
und Allele, die für
die Lysinproduktion nicht essentiell sind
-
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Weiterhin
kann es beispielsweise für
die Herstellung von L-Methionin
vorteilhaft sein, wenn neben der Abschwächung des Importes von Methionin
aus dem umgebenden Medium, beispielsweise zu erreichen durch Abschwächung eines
oder mehrerer der Gene, ausgewählt
aus der Gruppe yaeC, abc und yaeE, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus
der Gruppe der Gene oder Allele der Methioninproduktion verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden. Unter „Gene
oder Allele der Methioninproduktion" sind sämtliche, bevorzugt endogene,
offene Leserahmen, Gene oder Allele zu verstehen, deren Verstärkung/Überexpression
eine Verbesserung der Methioninproduktion bewirken kann.
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Hierzu
gehören
unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: accBC,
accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno,
fda, gap, gap2, gdh, gnd, glyA, hom, homFBR,
lysC, lysCFBR, metA, metB, metE, metH, metY,
msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA,
pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC,
sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf und zwf A213T.
Diese sind in Tabelle 3 zusammengefasst und erläutert.
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Tabelle
3 Gene
und Allele der Methioninproduktion
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-
-
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Weiterhin
kann es für
die Produktion L-Methionin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des Importes
von Methionin aus dem umgebenden Medium, beispielsweise zu erreichen
durch Abschwächung
eines oder mehrerer der Gene, ausgewählt aus der Gruppe yaeC, abc
und yaeE, gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe der Gene oder Allele, die für das Wachstum oder die Methioninproduktion
nicht essentiell sind, abzuschwächen,
insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
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Hierzu
gehören
unter anderem folgende offene Leserahmen, Gene oder Allele: brnQ,
ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR,
luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, metD, metK, pck, pgi, poxB und
zwa2. Diese sind in Tabelle 4 zusammengefasst und erläutert.
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Tabelle
4 Gene
und Allele, die für
die Methioninproduktion nicht essentiell sind
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Schließlich kann
es für
die Produktion von Aminosäuren,
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung eines oder mehrerer der
Gene, ausgewählt
aus der Gruppe smtB, cgl1, hspR, cgl2, cebR, cgl3, gatR, glcR, tcmR,
smtB2, dtxR, degA, galR, tipA2, malI, cgl4, arsR, merR, hrcA, glpR2,
lexA, ccpA3 und degA2 unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms", in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
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Die
erfindungsgemäß hergestellten
Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich
oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung)
oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch „Manual of
Methods for General Bacteriology„ der American Society for
Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
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Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette wie z.B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren
wie z.B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
z.B. Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Stickstoffquelle können
organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter
Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen
wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
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Mit
den Methoden der Erfindung kann die Leistung der Bakterien oder
des Fermentationsprozesses bezüglich
der Produkt-Konzentration ((Produkt pro Volumen), der Produkt- Ausbeute (gebildetes
Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle), der Produkt-Bildung (gebildetes
Produkt pro Volumen und Zeit) oder anderer Prozess-Parameter und
Kombinationen davon um mindestens 0,5%, mindestens 1% oder mindestens
2% verbessert werden.
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Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie
bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben
durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin
Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC
erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979)
51: 1167–1174)
beschrieben. Informationen dazu findet der Fachmann auch bei Ashman
et al. (in: Tschesche (Hrsg), Modern Methods in Protein Chemistry.
155–172,
de Gruyter, Berlin 1985).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin oder L-Methionin.
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Die
Konzentration von L-Lysin oder L-Methionin im Endprodukt kann gegebenenfalls
durch den Zusatz von L-Lysin oder L-Methionin auf den gewünschten
Wert eingestellt werden.
