CN104480058B - 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用 - Google Patents

一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104480058B
CN104480058B CN201410841171.7A CN201410841171A CN104480058B CN 104480058 B CN104480058 B CN 104480058B CN 201410841171 A CN201410841171 A CN 201410841171A CN 104480058 B CN104480058 B CN 104480058B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
gene
corynebacterium glutamicum
ilva
bacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410841171.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104480058A (zh
Inventor
黄钦耿
黄建忠
梁玲
翁雪清
吴伟斌
黄祥峰
施巧琴
吴松刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Maidan Biology Group Co ltd
Fujian Normal University
Original Assignee
Fujian Maidan Biology Group Co ltd
Fujian Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Maidan Biology Group Co ltd, Fujian Normal University filed Critical Fujian Maidan Biology Group Co ltd
Priority to CN201410841171.7A priority Critical patent/CN104480058B/zh
Publication of CN104480058A publication Critical patent/CN104480058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104480058B publication Critical patent/CN104480058B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01002—Alanine transaminase (2.6.1.2), i.e. alanine-aminotransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01019—Threonine ammonia-lyase (4.3.1.19)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高产L‑亮氨酸工程菌及其应用。本发明提供了制备重组菌的方法，包括如下步骤：包括如下步骤：将α‑异丙基苹果酸合成酶突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述α‑异丙基苹果酸合成酶突变体为将α‑异丙基苹果酸合成酶第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸和第499位亮氨酸突变为缬氨酸得到的酶。本发明的高产L‑亮氨酸的工程菌，特别是谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum MD0032具有比目前国内生产菌株更高的L‑亮氨酸产酸率，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的L‑亮氨酸的生产菌株。

Description

一株高产L-亮氨酸工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株高产L-亮氨酸工程菌及其应用。
背景技术
L-亮氨酸与L-异亮氨酸(L-isoleucine)、L-缬氨酸(L-valine)的分子结构中含有一个甲基侧链，而被称为支链氨基酸(branched chain amino acids，BCAA)。L-亮氨酸作为人体必需的八种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果，但体内无法自身合成。因此，L-亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的应用及商业价值，而且随着对L-亮氨酸功能的不断开发，其应用领域正逐渐扩大，市场也在持续攀升。
目前，L-亮氨酸的生产方法主要以发酵法生产为主导，其中，发酵法生产L-亮氨酸以日本企业占主导地位，其中尤以日本味之素公司为主，其在L-亮氨酸产量和品质均具有明显优势，大罐产酸能力达30-35g/L，糖酸转化率为22-28％，并可达70％以上的提取率，合计年产量400-500吨。迄今为止，工业化L-亮氨酸生产菌主要通过传统诱变筛选获得的，这种经典育种方法虽可获得L-亮氨酸相对高产的优良菌株，但是该法也会引入有害突变，使目标菌株生长缓慢，杂酸增多。另外，这种方式工作量大，周期长，很难在短期内进一步提高目标物产量。为了克服这些问题，理性化代谢工程育种正成为L-亮氨酸高产菌株获得的主要方式，也是L-亮氨酸高产菌株的育种趋势。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备重组菌的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将α-异丙基苹果酸合成酶(2-isopropylmalate synthase，IPMS)突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；
所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体为仅将α-异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸、第499位亮氨酸突变为缬氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；其与α-异丙基苹果酸合成酶比，仅是第494、497、499这3个位置的氨基酸不同，其他氨基酸残基均相同。
所述α-异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列为序列表中序列7；
所述目的菌为失活苏氨酸脱水酶编码基因、丙氨酸转氨酶编码基因、乳酸脱氢酶编码基因、D-泛酸合成酶编码基因和亮氨酸合成调节子编码基因活性的谷氨酸棒杆菌突变菌。
上述方法中，所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
上述方法中，所述目的菌按照包括如下步骤的方法制备：将谷氨酸棒杆菌基因组中的苏氨酸脱水酶编码基因替换为苏氨酸脱水酶编码基因突变基因ΔilvA、丙氨酸转氨酶编码基因替换为丙氨酸转氨酶编码基因突变基因ΔalaT、乳酸脱氢酶编码基因替换为乳酸脱氢酶编码基因突变基因Δldh、D-泛酸合成酶编码基因替换为D-泛酸合成酶编码基因突变基因ΔpanBC和亮氨酸合成调节子编码基因替换为亮氨酸合成调节子编码基因突变基因ΔltbR，得到的谷氨酸棒杆菌突变菌；
所述ΔilvA的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述ΔalaT的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述Δldh的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述ΔpanBC的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述ΔltbR的核苷酸序列为序列表中序列6。
上述方法中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
由上述的方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组菌为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum MD0032CCTCC NO:CCTCCM 2014620。
上述重组菌在制备L-亮氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备L-亮氨酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述重组菌，收集发酵产物上清液，即得到L-亮氨酸。
上述方法中，所述发酵条件为在发酵培养基中28-31℃、200-230r/min振荡培养15-55小时；
或所述发酵条件为在发酵培养基中28-31℃、培养45-55小时，其使所述发酵过程中发酵体系中的溶氧量为25-45％，葡萄糖含量为0.3-0.7g/100mL。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)MD0032简称谷氨酸棒杆菌MD0032，已于2014年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014620，分类命名为Corynebacteriumglutamicum MD0032。
本发明的实验证明，本发明的高产L-亮氨酸的工程菌，特别是谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum MD0032具有比目前国内生产菌株更高的L-亮氨酸产酸率，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的L-亮氨酸的生产菌株。试验证明，本发明的L-亮氨酸工程菌株，30L发酵罐发酵40h，产酸率达40.5g/L，处于国内领先水平。
附图说明
图1为重组质粒pZ8-1-leuA*的结构示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)获自美国模式培养物集存库(http://www.atcc.org/，简称ATCC)，ATCC编号为13032，简称谷氨酸棒杆菌13032。
实施例1、工程菌的构建
一、外源高效表达leuA*重组载体的构建
1、leuA基因的克隆及定点突变
1)、以谷氨酸棒杆菌13032的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(leuA基因片段)。
F1:5’-GAATTCATGCCAGTTAACCGCTACATGCCT-3’；
R1:5’-GTCGACTTAAACGCCGCCAGCCAGGAC-3’。
其中，F1带有EcoR I酶切位点，R1带有Sal I酶切位点(上述引物的划线部分序列)。
PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、59℃退火1分钟、72℃延伸2分钟，30个循环；72℃反应10分钟，4℃保温。
2)、回收步骤1)的PCR扩增产物T-A克隆连接至Simple pMD-18T克隆载体(购自于宝生物工程(大连)有限公司)，得到克隆质粒pMDleuA。
3)、以步骤1)的重组质粒pMDleuA为模板，用F2和R2引物进行PCR扩增(将leuA基因片段进行定点突变，将定点突变后的基因命名为leuA*基因)，得到PCR扩增产物(模板与突变后的环状质粒的混合物)。
F2:5’-ACGTCACCGTCGATGGCC CGGCAACGCCCATG-3’；
R2:5’-GGCCATCGACGGTGACGTCCTTGCCGTTGT-3’。
其中引物中的划线部分为互补序列，方框中的序列为突变选择点。
4)、将步骤3)的PCR扩增产物用DPNⅠ酶处理1小时(去除模板)，得到重组质粒pMDleuA*。
leuA*基因与野生型leuA基因的差异仅在于第1481位的碱基由G突变为A，其对应编码的第494位精氨酸突变为组氨酸；第1490位的碱基上由G突变为A，其对应编码的氨基酸第497位甘氨酸突变为天冬氨酸；第1495位的碱基由C突变为G，其对应编码的第499位亮氨酸突变为缬氨酸。
2、pZ8-1-leuA*高效表达质粒的构建
1)、用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pMDleuA*载体，回收约1750bp的片段。
2)、用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切载体pZ8-1(记载在如下文献中：Expression of the Corynebacterium glutamicum panD Gene Encoding L-Aspartate-a-Decarboxylase Leads to Pantothenate Overproduction in Escherichia coli，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Vol.65,No.4；1530–1539，1999.公众可从福建师范大学和福建省麦丹生物集团有限公司获得)，回收约7000bp的载体骨架片段。
3)、将步骤1)的基因片段和步骤2)的载体骨架片段连接，得到重组载体pZ8-1-leuA*。
经过测序，重组载体pZ8-1-leuA*为将序列表的序列1自5’末端第1至1746位核苷酸所示的leuA*基因(编码IPMS蛋白)插入载体pZ8-1的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间中得到的载体，重组载体pZ8-1-leuA*的结构示意图见图1。
二、目的菌的构建
1、自杀载体敲除重组载体的构建
1)、pk18ΔilvA重组载体的构建
(1)根据公布的谷氨酸棒杆菌的基因组信息，设计融合PCR引物，采用重叠延伸PCR的方法，获得部分基因缺失的ΔilvA基因。首先通过ilvA-1与ilvA-2引物扩增ilvA基因的上游序列，ilvA-3与ilvA-4引物扩增ilvA基因的下游序列。PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、55℃退火40秒、72℃延伸40秒，30个循环；72℃反应10分钟，4℃保温。
ilvA-1：5’-GAATTC AGGAGAAGATTACACTAGTCAACC-3’
ilvA-2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTA TGCAGCCGATGCTTCGTCGAAG-3’
ilvA-3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTATGATGAGCGCGACCGAGGGCGC-3’
ilvA-4：5’-GTCGAC TTAGGTCAAGTATTCGTACTCAG-3’
PCR反应结束后采用PCR产物回收试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)分别回收ilvA基因的上游片段(约为480bp)和下游片段(约为480bp)。
(2)、以步骤(1)获得的ilvA基因的上游片段和下游片段互为模板，同时加入引物ilvA-1与ilvA-4，进行重叠延伸PCR，扩增截短的ilvA基因(ΔilvA基因)。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、57℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，30个循环；72℃反应10分钟，4℃保温。
PCR反应结束后采用PCR产物回收试剂盒回收约为960bp大小的产物片段，并进行T-A克隆，连接至Simple pMD-18T克隆载体(购自于宝生物工程(大连)有限公司)，得到克隆质粒pMDΔilvA。
(3)、用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pMDΔilvA载体，回收约960bp的片段。另外，用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切载体pk18mobsacB，回收约5600bp的载体骨架片段。
(4)、用T4DNA ligase对步骤(3)回收的酶切片段进行连接，获得重组自杀载体pk18ΔilvA。
经过测序，重组自杀载体pk18ΔilvA为将序列表中序列2所示的ΔilvA(内部基因缺失378bp片段的ilvA基因，导致其无法编码正常功能的苏氨酸脱水酶基因(TD，完整ilvA基因编码)基因插入表达载体pk18mobsacB(购自于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间得到的载体。
2)、pk18ΔalaT重组载体的构建
根据公布的谷氨酸棒杆菌的基因组信息，设计融合PCR引物，采用重叠延伸PCR的方法，获得部分基因缺失的ΔalaT基因。
alaT-1：5’-GAATTC GTGACTACAGACAAGCGCAAAACCTC-3’
alaT-2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTATTGAGGAGTGCTTGGGTGGTCATG-3’
alaT-3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGG-3’alaT-4：5’-GTCGAC CTACTGCTTGTAAGTGGACAGGAAG-3’
其余步骤，pk18ΔalaT载体的构建方法与pk18ΔilvA载体的构建方法相同。
pk18ΔalaT载体为将序列表中序列3所示的ΔalaT(内部基因缺失412bp片段的alaT)基因插入表达载体pk18mobsacB的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间得到的载体。
3)、pk18Δldh重组载体的构建
根据公布的谷氨酸棒杆菌的基因组信息，设计融合PCR引物，采用重叠延伸PCR的方法，获得部分基因缺失的Δldh基因。
ldh-1：5’-GAATTC CTGCAGGGCATAGATTGGTTTTG-3
ldh-2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTA ATGACATCGCCAACGATGGACTTC-3’
ldh-3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT ATCGGCATGGGTCTTGCTCGCATC-3’
ldh-4：5’-GTCGAC TTGGTGCGAAGATGCGCGTAATG-3’
其余步骤，pk18Δldh组件的构建方法与pk18ΔilvA组件构建方法相同。
pk18Δldh载体为将序列表中序列4所示的Δldh(内部基因缺失373bp片段的ldh)基因插入表达载体pk18mobsacB的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间得到的载体。
4)、pk18ΔpanBC重组组件的构建
根据公布的谷氨酸棒杆菌的基因组信息，设计融合PCR引物，采用重叠延伸PCR的方法，获得部分基因缺失的ΔpanBC基因。
panBC-1:5’-GAATTC CATGTCAGGCATTGATGCAAAG-3’
panBC-2:5’-AACTACAGACCTAGAACCTAAGCATCAACAATGCGTCGAATC-3’
panBC-3:5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTGCTTATCGACGCCCTCCTCC-3’
panBC-4:5’-GTCGAC CGATCAGGGCGCACCAAATTGAAC-3’
其余步骤，pk18ΔpanBC组件的构建方法与pk18ΔilvA组件构建方法相同。
pk18ΔpanBC载体为将序列表中序列5所示的ΔpanBC(内部基因缺失427bp片段的panBC)基因插入表达载体pk18mobsacB的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间得到的载体。
5)、pk18ΔltbR重组组件的构建
根据公布的谷氨酸棒杆菌的基因组信息，设计融合PCR引物，采用重叠延伸PCR的方法，获得部分基因缺失的ΔltbR基因。
LtbR-1：5’-GAATTC atgaccttgaaatacacggtgaag-3
LtbR-2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTA ATGCAGGGTCAGCAGCGCGC-3’
LtbR-3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT agcgccgcgtgcacccaatg-3’
LtbR-4：5’-GTCGAC ATATCGTTTCATGGGACAGTATAGC-3’
其余步骤，pk18ΔltbR组件的构建方法与pk18ΔilvA组件构建方法相同。
pk18ΔltbR载体为将序列表中序列6所示的ΔltbR(内部基因缺失169bp片段的ltbR)基因插入表达载体pk18mobsacB的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间得到的载体。
2、菌株的代谢修饰改造
1)、出发菌株ilvA基因的修饰
(1)、将获得的pk18ΔilvA重组载体通过电击转化的方法转入出发菌株感受态细胞ATCC13032，采用艾本德(Eppendorf)电转仪，电击条件为：1800V，电击时间4-5ms，电击结束后，马上加入30℃预热的电击复苏SOC培养基中，30℃，120-150rpm，震荡复苏1-2小时。
(2)、重组载体电击转入宿主之后，首先进行第一次重组，即通过单交换的方式整体插入线性插入染色体中，此步可通过含25μg/mL卡那霉素的LBG平板进行筛选，复苏培养液涂布含有抗性选择的LBG培养基平板中(硫酸卡那霉素抗性，抗生素终浓度25μg/mL)，30℃，倒置培养24-30小时。平板上生长的克隆既为成功进行一次重组的克隆，
(3)、挑选在抗性平板上生长的单克隆接入含有3mL LB液体培养基的18×180mm试管中30℃，200-250rpm培养18小时，培养结束后，取100μL培养液涂布于含10％蔗糖的LB平板，30℃，倒置培养16-20小时，待长出单克隆之后再分别点植LBG及LBG+卡那霉素(终浓度25μg/mL)平板，进行二次重组筛选，获得能够再LBG平板生长，不能在LBG+卡那霉素(25μg/mL)平板生长的克隆。
(4)、对获得的二次重组的平板阳性克隆进行菌落PCR筛选及验证，采用引物ilvA-1与ilvA-4进行菌落PCR验证(得到约为960bp，为ilvA基因缺失后的片段)，并进行测序验证染色体ilvA基因确被ΔilvA基因替换，从而获得出发菌株染色体ilvA基因修饰后的菌株，即为谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA，其为将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的ilvA基因替换为ΔilvA基因。
2、ilvA基因修饰菌株基础上的alaT基因的修饰
在上述步骤获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA菌株的基础上，进一步进行alaT基因的修饰。将获得的pk18ΔalaT重组组件通过电击转化的方式导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA菌株，其它具体方法同ilvA基因的修饰。
最终，获得ilvA基因修饰(ΔilvA)基础上alaT修饰的菌株(ΔilvA/ΔalaT)，即为谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT，经过测序，其为将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的ilvA基因替换为ΔilvA基因，且将alaT基因替换为ΔalaT基因。
3、ilvA基因与alaT基因修饰基础上ldh基因的修饰
在上述获得ΔilvA/ΔalaT修饰菌株的基础上，进一步进行ldh基因的修饰。将获得的pk18Δldh重组载体通过电击转化的方式导入修饰菌株ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT。具体方法同ilvA基因的修饰。
最终，获得ilvA基因、alaT基因及ldh基因修饰的菌株(ΔilvA/ΔalaT/Δldh)，即为谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh，经过测序，其为将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的ilvA基因替换为ΔilvA基因，且将alaT基因替换为ΔalaT基因，且将ldh基因替换为Δldh基因。
4、ilvA基因、alaT基因、ldh基因修饰基础上的panBC基因修饰
在上述获得ΔilvA/ΔalaT/Δldh修饰菌株的基础上，进一步进行panBC基因的修饰。将获得的pk18ΔpanBC重组载体通过电击转化的方式导入ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh。具体方法同ilvA基因的修饰。
最终，获得ilvA基因、alaT基因、ldh基因及panBC基因修饰的菌株(ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC)，即为谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC，经过测序，其为将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的ilvA基因替换为ΔilvA基因，且将alaT基因替换为ΔalaT基因，且将ldh基因替换为Δldh基因，且将panBC基因替换为ΔpanBC基因。
5、ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC修饰基础上的ltbR基因修饰
在上述获得ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC修饰菌株的基础上，进一步进行ltbR基因的修饰。将获得的pk18ΔltbR重组组件通过电击转化的方式导入该修饰菌株。具体方法同ilvA基因的修饰。
最终，获得ilvA基因、alaT基因、ldh基因、panBC基因及ltbR基因修饰的菌株(ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR)，即为谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR，经过测序，其为将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的ilvA基因替换为ΔilvA基因，且将alaT基因替换为ΔalaT基因，且将ldh基因替换为Δldh基因，且将panBC基因替换为ΔpanBC基因，且将ltbR基因替换为ΔltbR基因。
三、产L-亮氨酸工程菌MD0032的构建
将上述一制备的高效表达质粒pZ8-1-leuA*电击转化上述二制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR，采用含卡那霉素抗性(终浓度25μg/mL)平板进行筛选，对阳性克隆进行质粒提取，并进行双酶切验证(EcoRⅠ和SalⅠ酶切，得到1750bp为阳性)，确认导入pZ8-1-leuA*高效表达质粒至菌株中，含pZ8-1-leuA*高效表达质粒的谷氨酸棒杆菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR-leuA*，即为产L-亮氨酸的工程菌。
将筛选获得的产L-亮氨酸的工程菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR-leuA*命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)MD0032。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)MD0032简称谷氨酸棒杆菌MD0032，已于2014年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014620，分类命名为Corynebacteriumglutamicum MD0032。
采用同样的方法，将空载体pZ8-1转入ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR中，得到重组菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR-pZ8-1。
实施例2、谷氨酸棒杆菌MD0032生产L-亮氨酸
一、培养基的制备
种子培养基(pH＝6.5-7.0)：取100g葡萄糖、5g玉米浆、10g赤砂糖，50g糖蜜，100ml豆粕水解液(购自于山东阳成生物科技有限公司，目录号DP001)、3g酵母膏、25g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.05g FeSO4·7H2O、0.3g KH2PO4·3H2O、0.025g单硫酸卡那霉素和10g碳酸钙用去离子水溶解并定容至1L；125℃灭菌25min。
发酵培养基(pH＝6.5-7.5)：取120g葡萄糖、150ml豆粕水解液、27g(NH4)2SO4、5.5gKH2PO4·3H2O、2.5g K2HPO4·3H2O、0.2g MgSO4·7H2O、0.05g FeSO4·7H2O、0.02gMnSO4·H2O、200μg维生素H、200μg维生素B1、100μg维生素B2、100μg维生素B6、0.025g单硫酸卡那霉素、30g CaCO3用去离子水溶解并定容至1L；125℃灭菌25min。
二、摇瓶发酵生产L-亮氨酸
1、应用谷氨酸棒杆菌MD0032生产L-亮氨酸
(1)种子培养
将一环谷氨酸棒杆菌MD0032斜面种子接种至装有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，4层纱布封口，28-31℃振荡培养(200-230r/min)至对数生长中后期(16-20小时)，得到种子液(种子液的ΔOD562nm＝15-25)。
(2)发酵培养
将3mL种子液接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，4层纱布封口，28-31℃，振荡培养(200-230r/min)45-55小时，具体为28℃，振荡培养200r/min、55小时。
(3)将步骤(2)的发酵体系离心(4℃、5000g、15min)，收集上清液(发酵液)。
2、对照液的制备
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032代替谷氨酸棒杆菌MD0032进行步骤1的实验，收集上清液(对照液1)；
将重组菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR代替谷氨酸棒杆菌MD0032进行步骤1的实验，收集上清液(对照液2)；
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032-pZ8-1代替谷氨酸棒杆菌MD0032进行步骤1的实验，收集上清液(对照液空载体1)；
将重组菌ATCC13032-ΔilvA/ΔalaT/Δldh/ΔpanBC/ΔltbR-pZ8-1代替谷氨酸棒杆菌MD0032进行步骤1的实验，收集上清液(对照液空载体2)。
3、检测L-亮氨酸含量
检测发酵液或对照液或对照液空载体上清液中的L-亮氨酸含量(采用日立L-8800型氨基酸自动分析仪进行测定)。
结果如下：发酵液中的L-亮氨酸浓度为12.5g/L(上清液)，对照液1中的L-亮氨酸浓度为0.1g/L，对照液2中L-亮氨酸浓度为3.3g/L；对照液空载体1中L-亮氨酸浓度为0.1g/L，对照液空载体2中L-亮氨酸浓度为3.1g/L。
可以看出，谷氨酸棒杆菌MD0032提高L-亮氨酸产量。
三、工业发酵生产L-亮氨酸
将谷氨酸棒杆菌MD0032和ATCC13032进行30L全自动发酵罐进行补料分批发酵，具体步骤如下：
1、第一阶段培养
采用30L发酵罐，种子培养基的装液量为15L，培养时间为16-20小时，溶氧(DO)25-45％，温度28-31℃；得到种子液(种子液的ΔOD562nm＝25-35)。
2、第二阶段培养
采用30L发酵罐，发酵培养基的装液量为15L，培养时间为45-55小时(通过控制流加75％的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.3-0.7g/100mL)，溶氧(DO)25-45％，温度28-31℃，具体为培养时间为45小时，溶氧(DO)25-45％，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.3-0.7g/100mL，温度28℃。
3、将步骤2的发酵体系(4℃、5000g、15min)，收集上清液(发酵液)。
检测L-亮氨酸浓度，结果如下：
谷氨酸棒杆菌MD0032发酵液中的L-亮氨酸浓度可达40.5g/L。
ATCC13032发酵液中的L-亮氨酸浓度为1.0g/L。

Claims (8)

1.一种制备重组菌的方法，包括如下步骤：将α-异丙基苹果酸合成酶突变体编码基因导入目的菌中，得到重组菌；
所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体为仅将α-异丙基苹果酸合成酶氨基酸序列第494位精氨酸突变为组氨酸、第497位甘氨酸突变为天冬氨酸、第499位亮氨酸突变为缬氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；
所述α-异丙基苹果酸合成酶的氨基酸序列为序列表中序列7；
所述目的菌为失活苏氨酸脱水酶编码基因、丙氨酸转氨酶编码基因、乳酸脱氢酶编码基因、D-泛酸合成酶编码基因和亮氨酸合成调节子编码基因活性的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述α-异丙基苹果酸合成酶突变体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述目的菌按照包括如下步骤的方法制备：将谷氨酸棒杆菌基因组中的苏氨酸脱水酶编码基因替换为苏氨酸脱水酶编码基因突变基因ΔilvA、丙氨酸转氨酶编码基因替换为丙氨酸转氨酶编码基因突变基因ΔalaT、乳酸脱氢酶编码基因替换为乳酸脱氢酶编码基因突变基因Δldh、D-泛酸合成酶编码基因替换为D-泛酸合成酶编码基因突变基因ΔpanBC和亮氨酸合成调节子编码基因替换为亮氨酸合成调节子编码基因突变基因ΔltbR，得到的谷氨酸棒杆菌突变菌；
所述ΔilvA的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述ΔalaT的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述Δldh的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述ΔpanBC的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述ΔltbR的核苷酸序列为序列表中序列6。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)MD0032,其保藏号为CCTCC NO:M 2014620。
7.权利要求5或6所述重组菌在制备L-亮氨酸中的应用。
8.一种制备L-亮氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求5或6所述重组菌，收集发酵产物上清液，即得到L-亮氨酸。
CN201410841171.7A 2014-12-30 2014-12-30 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用 Active CN104480058B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410841171.7A CN104480058B (zh) 2014-12-30 2014-12-30 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410841171.7A CN104480058B (zh) 2014-12-30 2014-12-30 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104480058A CN104480058A (zh) 2015-04-01
CN104480058B true CN104480058B (zh) 2017-07-21

Family

ID=52754667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410841171.7A Active CN104480058B (zh) 2014-12-30 2014-12-30 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104480058B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11104924B2 (en) * 2016-12-28 2021-08-31 Cj Cheiljedang Corporation Isopropylmalate synthase variant and a method of producing L-leucine using the same
CN110387344B (zh) * 2018-04-23 2022-10-21 中国科学院微生物研究所 生产l-亮氨酸的重组菌、其构建方法及l-亮氨酸的生产方法
CN108841758B (zh) * 2018-07-13 2021-11-26 大连医诺生物股份有限公司 谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-亮氨酸生产中的应用
KR102075160B1 (ko) * 2018-12-13 2020-02-10 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
CN110551670B (zh) * 2019-09-19 2020-09-25 天津科技大学 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用
WO2021037190A1 (zh) * 2019-08-29 2021-03-04 天津科技大学 一种2-异丙基苹果酸合成酶及其工程菌与应用
CN110540976B (zh) * 2019-08-29 2020-07-24 天津科技大学 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用
CN116590202B (zh) * 2023-07-12 2023-09-12 欧铭庄生物科技(天津)有限公司滨海新区分公司 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-亮氨酸中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004013503A1 (de) * 2004-03-18 2005-10-06 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
JP2010130899A (ja) * 2007-03-14 2010-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104480058A (zh) 2015-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104480058B (zh) 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用
CN103243042B (zh) 具有增强的l-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法
CN107034250A (zh) 谷氨酸类l‑氨基酸的制造方法
CN102453691B (zh) 高产l-色氨酸的大肠杆菌工程菌
CN105734004B (zh) 重组菌株及其制备方法、应用
CN101600796B (zh) 具有增强的l-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法
CN103224964B (zh) 同时生产l‑氨基酸及核黄素的微生物及使用其生产l‑氨基酸及核黄素的方法
CN104561074B (zh) 一株高产l‑缬氨酸工程菌的构建及其应用
CN106754807A (zh) 生产l‑亮氨酸菌株和生产l‑亮氨酸的方法
CN105899664A (zh) 用于精细化学品的改进生产的重组微生物
CN107022515B (zh) 一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN106520655A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑缬氨酸的方法
CN110325642A (zh) 产生l-氨基酸的棒状杆菌属微生物和使用其生产l-氨基酸的方法
CN105593361A (zh) 用于改善的丙氨酸生产的经修饰的微生物
CN106459888A (zh) 产生腐胺的变异菌株和使用其的腐胺产生方法
CN103031265A (zh) 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用
CN106635944A (zh) 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
US10287558B2 (en) Microorganisms for succinic acid production
CN108250278A (zh) 生产l-谷氨酸的菌株和生产l-谷氨酸的方法
CN106701648A (zh) 一株高产l‑异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN105907692A (zh) 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
CN106701649B (zh) 生产l-谷氨酰胺的菌株和生产l-谷氨酰胺的方法
JPWO2015093467A1 (ja) セルラーゼ生産微生物
CN112251428A (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用
CN101993904A (zh) 5’-鸟苷酸的生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant