CN110325642A

CN110325642A - 产生l-氨基酸的棒状杆菌属微生物和使用其生产l-氨基酸的方法

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Publication number: CN110325642A
Application number: CN201980000870.XA
Authority: CN
Inventors: 孙承珠; 尹炳勋; 李光雨; 金善慧; 卞效情; 张真淑; 金亨俊; 申容旭
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: US11180784B2; CA3086227A1; JP2021511009A; AU2019212400A1; RU2754781C1; MX2020007037A; TW201942129A; CL2020001740A1; JP7090159B2; ZA202003315B; BR112019019376A2; TWI771557B; CN113046288B; WO2019147059A1; IL275641A; AR114088A1; CA3086227C; PE20210105A1; PH12020551045A1; CN110325642B

Abstract

提供了产生L‑氨基酸的棒状杆菌属微生物，以及使用其生产L‑氨基酸的方法。

Description

产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物和使用其生产L-氨基酸的方法

[技术领域]

本公开内容涉及产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物，以及使用其生产L-氨基酸的方法。

[背景技术]

L-氨基酸是蛋白质的基本结构单元，并且用作药物、食品添加剂、动物饲料、营养素、杀虫剂、杀菌剂等的重要材料。在L-氨基酸中，L-赖氨酸是必需氨基酸，其不在生物体内生物合成并且已知对于促进生长、钙代谢、促进胃液分泌和抵抗疾病是必需的。L-赖氨酸广泛用于饲料、医疗产品、食品等。此外，L-缬氨酸也是必需氨基酸之一，并且已知具有抗氧化作用和直接促进肌细胞蛋白质合成的作用。L-缬氨酸用于保健品、医疗产品、食品、饲料、香水、头发和皮肤调理剂等。

同时，棒状杆菌属菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌是经常用于产生L-氨基酸和其他有用物质的革兰氏阳性微生物。已经进行了许多研究以开发具有高生产效率的微生物和用于生产氨基酸的发酵技术。例如，主要使用增加编码参与氨基酸生物合成的酶的基因的表达或去除棒状杆菌属菌株中氨基酸生物合成中不必要的基因的靶材料特异性方法(韩国专利号10-0924065和1208480)。除了这些方法之外，还使用了缺失不参与氨基酸产生的基因的方法和缺失在氨基酸产生中特定功能未知的基因的方法。然而，仍然需要研究能够以高产率有效生产L-氨基酸的方法。

在此背景下，本发明人进行了深入研究以开发能够以高产率产生L-氨基酸的微生物，结果，他们发现当特定基因被灭活时，L-氨基酸的产率增加，从而完成了本公开内容。

发明内容

[技术问题]

本公开内容的目的是提供产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物，其中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活。

本公开内容的另一个目的是提供使用该微生物生产L-氨基酸的方法。

本公开内容的仍另一个目的是提供微生物用于增强L-氨基酸生产率的用途。

本公开内容的仍另一个目的是提供增强L-氨基酸生产率的方法，包括：灭活棒状杆菌属微生物中由本公开内容的SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性。

[技术方案]

将如下详细描述本公开内容。同时，本文公开的描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。换句话说，本文公开的各种要素的所有组合都落入本公开内容的范围内。此外，本公开内容的范围不限于下面描述的具体描述。

为了实现上述目的，本公开内容的一个方面提供了产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物，其中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活。

如本文所用，术语“L-氨基酸”可包括所有L-氨基酸，其可通过代谢过程由微生物自许多不同种类碳源产生。具体地，L-氨基酸可包括碱性氨基酸，例如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸等；非极性氨基酸，例如L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸等；极性氨基酸，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺等；芳香族氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等；酸性氨基酸，例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸；脂肪族氨基酸，例如L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸等；以及支链氨基酸，例如L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸等。在本公开内容中，L-氨基酸可以更具体地为碱性氨基酸、脂肪族氨基酸、支链氨基酸等，并且更具体地为，L-赖氨酸或L-缬氨酸，但不限于此。L-氨基酸可包括任何氨基酸而没有限制，只要当由本公开内容的SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活时其生产率增加。

如本文所用，术语“由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质”是指由固有地存在于棒状杆菌属微生物中的NCgl0275基因编码的蛋白质，并且具体地，是由固有地存在于棒状杆菌属微生物中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的调节蛋白质。SEQ ID NO：1的氨基酸序列和编码蛋白质的基因的多核苷酸序列可以从已知的数据库获得，例如NCBI的基因库等，但不限于此。此外，蛋白质可以是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，但不限于此。

此外，本公开内容的蛋白质可以由与SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成。由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的蛋白质可以包括由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有80％或更高，具体地83％或更高、84％或更高、88％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、或97％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。显然，还包括在部分序列中具有缺失、修饰、替换、保守替换或添加的任何氨基酸序列作为与本公开内容范围内的序列具有同源性或同一性的氨基酸序列，只要它是与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有基本相同或相应的生物活性的氨基酸序列。

在本公开内容中，虽然描述为“由特定SEQ ID NO组成的蛋白质或多肽”，但是显然属于本公开内容的范围，其可包含在部分序列中具有缺失、修饰、替换、保守替换或插入的氨基酸序列，只要该蛋白质与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽具有相同或相应的活性。甚至当多肽包含特定SEQ ID NO的氨基酸序列时，它显然属于本公开内容的范围。

此外，可以包括探针，而没有限制，该探针可以通过在严格条件下与全部或部分多核苷酸序列的互补序列杂交从已知基因序列制备，例如，该已知基因序列为编码这样的蛋白质的序列，该蛋白质具有由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性。

例如，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质可以由包含SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的基因编码。此外，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质可以由包括SEQ IDNO：2的多核苷酸序列的基因，基本上由SEQ ID NO：2的多核苷酸序列组成的基因，或由SEQID NO：2的多核苷酸序列组成的基因编码，但不限于此。

此外，SEQ ID NO：2的多核苷酸序列可包括与SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有至少80％同源性的多核苷酸序列。

具体地，任何多核苷酸序列都包括在本公开内容的范围内，只要它可以编码包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质可以由包括如下多核苷酸序列的基因编码，该多核苷酸序列与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有80％或更高，具体地83％或更高、84％或更高、88％或更高、90％或更高同源性，93％或更高、95％或更高，或97％或更高同源性或同一性。

还显而易见的是，在SEQ ID NO：2的多核苷酸序列中，还包括被翻译成由SEQ IDNO：1的氨基酸序列组成的蛋白质或由于密码子简并性而与其具有同源性的蛋白质的多核苷酸。也可以包括由已知核苷酸序列制备的探针而没有限制，例如，该已知核苷酸序列为在严格条件下与全部或部分多核苷酸序列互补的序列杂交以编码具有由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性的蛋白质的任何序列，。“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(例如，J.Sambrook et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。严格条件可包括，例如，具有高同源性、40％或更高同源性、具体地90％或更高同源性、更具体地95％或更高同源性、更具体地97％或更高同源性、仍然更具体地，99％或更高的同源性的基因彼此杂交，并且具有低于上述同源性的基因彼此不杂交的条件，或者Southern杂交的普通洗涤条件，即在对应于下列的盐浓度下和温度下洗涤一次，具体地两次或三次：60℃，1×SSC，0.1％SDS，具体地，60℃，0.1×SSC，0.1％SDS，更具体为68℃，0.1×SSC，0.1％SDS。杂交需要两个多核苷酸含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开内容还可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段以及与其基本相似的多核苷酸序列。

具体地，可以使用杂交条件检测具有同源性的多核苷酸，该杂交条件包括在上述条件下Tm值为55℃的杂交步骤。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且根据其目的由本领域技术人员适当地控制。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指与给定氨基酸序列或多核苷酸序列的匹配程度，并且同源性可以表示为百分比。术语“同源性”和“同一性”通常彼此互换使用。在本公开内容中，具有与给定氨基酸序列或多核苷酸序列相同或相似的活性的同源性序列表示为“％同源性”。

与氨基酸或多核苷酸序列的同源性或同一性可以通过例如算法BLAST[参见Karlin和Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或Pearson的FASTA[参见Methods Enzymol.,183,63(1990)]确定。基于该算法BLAST，已经开发了称为BLASTN或BLASTX的程序[参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。

此外，氨基酸或多核苷酸序列之间的同源性、相似性或同一性可以通过在严格条件下使用Southern杂交比较序列来确定。严格条件在相应技术的范围内，并且可以通过本领域技术人员理解的方法确定(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。

如本文所用，短语“由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活”是指蛋白质根本不被表达，或者蛋白质被表达但没有表现出活性，或与天然野生型菌株、亲本菌株或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质中没有修饰的菌株的活性相比活性降低。在这一点上，该降低指的是包括以下情况的概念：由于编码蛋白质的基因的修饰或缺失，蛋白质本身的活性低于微生物中最初具有的蛋白质的活性的情况；由于抑制编码蛋白质的基因的表达或翻译，细胞中总蛋白质活性水平低于天然菌株或修饰前的菌株；或其组合的情况。

在本公开内容中，可以通过本领域中的各种熟知方法实现灭活。方法的实例可包括1)缺失编码蛋白质的基因的全部或部分的方法；2)修饰表达控制序列以便编码蛋白质的基因的表达被降低的方法；3)修饰编码蛋白质的基因序列以便除去或减弱蛋白质的活性的方法；4)引入反义寡核苷酸(例如反义RNA)的方法，所述反义寡核苷酸互补地结合编码蛋白质的基因的转录物；5)通过在编码蛋白质的基因的Shine-Dalgarno序列的前端添加Shine-Dalgarno序列及其互补序列，形成二级结构，使核糖体不能附着的方法；6)逆转录工程(RTE)的方法，其在编码蛋白质的基因的多核苷酸序列的开放阅读框(ORF)的3'末端上添加逆转录的启动子，等等，也可以包括它们的组合，但不特别限于此。

具体地，缺失编码蛋白质的基因的部分或全部的方法可以通过如下进行：用缺失部分核苷酸序列的多核苷酸或标记基因替换编码染色体内的内源靶蛋白的多核苷酸，通过载体用于染色体插入微生物中。在缺失部分或全部多核苷酸的方法的示例性实施方式中，可以使用通过同源重组缺失多核苷酸的方法，但不限于此。在缺失部分或全部多核苷酸的方法的另一个示例性实施方式中，可以使用诸如UV的光或化学品诱导突变，并且从获得的突变体中选择具有缺失的靶基因的菌株。

缺失基因的方法可包括使用基因重组技术的方法。例如，将多核苷酸序列或包含与靶基因具有同源性的多核苷酸序列的载体导入微生物中以引起同源重组。此外，待引入的多核苷酸序列或载体可包括显性选择标记，但不限于此。

此外，修饰表达控制序列的方法可以通过应用本领域熟知的各种方法来实现。例如，该方法可以通过经由缺失、插入、非保守或保守替换或其组合诱导多核苷酸序列中的表达控制序列的修饰来进一步减弱表达控制序列的活性，或通过用具有较弱活性的多核苷酸序列替换表达控制序列。表达控制序列可包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合区的序列、以及控制转录和翻译终止的序列，但不限于此。

此外，修饰核苷酸序列的方法可以通过在核苷酸序列中通过缺失、插入、非保守或保守替换或其组合诱导序列中的修饰以进一步减弱酶活性，或通过用被改进为具有较弱活性的核苷酸序列或被改进为没有活性的核苷酸序列替代核苷酸序列来实施，但不限于此。

如本文所用，术语“产生L-氨基酸的微生物”可以指天然具有产生L-氨基酸的能力的微生物或通过向没有产生L-氨基酸的能力的亲本菌株赋予产生L-氨基酸的能力而制备的微生物。例如，产生L-氨基酸的微生物可以是其中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活的微生物。另外，产生L-氨基酸的微生物可以是这样的微生物，其中编码参与L-氨基酸的生物合成途径的酶的基因的表达被增强或参与降解途径的酶被灭活。可选地，产生L-氨基酸的微生物可以是通过灭活亲本菌株中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性而获得的微生物，其中编码参与L-氨基酸的生物合成途径的酶的基因的表达被增强或参与降解途径的酶被灭活。产生L-氨基酸的微生物可以通过应用各种已知方法来制备。

在本公开内容中，“棒状杆菌属微生物”可以包括棒状杆菌属的所有微生物，具体地，谷氨酸棒杆菌、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)、奇棒杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹状体棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌、污染棒状杆菌(Corynebacteriumpollutisoli)、亚胺棒杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸棒状杆菌(Corynebacteriumtestudinoris)或微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)，并且更具体地可以是谷氨酸棒杆菌。

产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物——其中由本公开内容的SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活——可以是其中提高了L-氨基酸生产率的微生物。具体地，微生物可以是与未修饰的菌株相比，具有提高的L-氨基酸生产率的微生物。未修饰的菌株可以是天然野生型菌株、亲本菌株或未修饰的菌株，其中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质未被灭活。

本公开内容的另一方面提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养根据本公开内容的微生物；和从微生物或培养基中回收L-氨基酸的步骤。

根据本公开内容的微生物与上述相同。

在本公开内容的方法中，可以使用本领域已知的任何培养条件和方法进行棒状杆菌属微生物的培养。

如本文所用，术语“培养”是指允许微生物在人工控制的环境条件下生长。在本公开内容中，使用产生L-氨基酸的微生物生产L-氨基酸的方法可以使用本领域公知的方法进行。具体地，培养可以通过分批法、补料方法或连续方式重复补料方法进行，但不限于此。可以使用任何用于培养的培养基而没有限制，例如，用于棒状杆菌菌株的培养基是本领域已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology by the American Societyfor Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。

适用于培养基的碳源可包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如乙醇和甘油；和有机酸，例如乙酸。这些物质可以单独使用或混合使用，但不限于此。

适用的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆饼和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独使用或混合使用，但不限于此。

适用的磷源可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应的含钠盐。另外，培养基可以包括生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。此外，除了上述物质之外，还可以使用必需的生长因子例如氨基酸和维生素，但不限于此。另外，可以使用适合于培养基的前体。这些物质可以在分批或连续方式培养期间适当地添加到培养物中，但不限于此。

在微生物的培养过程中，可以以合适的方式加入碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，从而调节培养物的pH。另外，可以使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制气泡的形成。为了维持需氧条件，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中，但不限于此。培养物的温度通常可以是20℃至45℃，特别是25℃至40℃。可以继续培养直至产生所需量的L-氨基酸，并且其通常可以在10小时至160小时内实现，但不限于此。

可以通过本领域已知的常规方法从培养物中回收L-氨基酸。回收方法可以包括离心、过滤、色谱法、结晶等。例如，通过以低速离心培养基并除去生物质获得的上清液可以通过离子交换色谱法分离，但不限于此。

回收步骤还可包括纯化过程。

本公开内容的又另一方面提供了棒状杆菌属微生物用于增强L-氨基酸生产率的用途，其中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活。

本公开内容的又另一方面提供了增强L-氨基酸生产率的方法，其包括：灭活棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性。

[有益效果]

产生L-氨基酸的本公开内容的微生物可以以高产率产生L-氨基酸。此外，制备的L-氨基酸可以应用于多种产品，例如用于人类或医疗产品的食品或食品添加剂以及用于动物的饲料或饲料添加剂。

[实施方式]

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本公开内容的范围不旨在受这些实施例的限制。

实施例1：使用转座子制备随机突变体库

为了获得具有提高的赖氨酸生产率的菌株，通过以下方法制备载体库。

首先，将通过使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM试剂盒(Epicentre)获得的质粒通过电脉冲方法(Appl.Microbiol.Biothcenol.52:541-545,1999)转化到谷氨酸棒杆菌KCCM11016P(韩国专利号10-0159812；该微生物公开为KFCC10881，并且根据布达佩斯条约(保藏号KCCM11016P)作为母株保藏于国际保藏机构(International Depositary Authority))，并涂抹在含有卡那霉素的复合培养基平板上(25mg/L)以获得约20,000个菌落。

<复合培养基平板(pH7.0)>

10g葡萄糖、10g蛋白胨、5g牛肉提取物、5g酵母提取物、18.5g脑心浸液、2.5gNaCl、2g尿素、91g山梨糖醇、20g琼脂(基于在1升蒸馏水)。

实施例2：使用转座子筛选随机突变体库

将实施例1中获得的约20,000个菌落中的每一个接种到300μL以下选择培养基中，并在96-深孔板中在32℃、1000rpm下培养约24小时。

<选择培养基(pH8.0)>

10g葡萄糖、5.5g硫酸铵、1.2g MgSO₄·H₂O、0.8g KH₂PO₄、16.4gK₂HPO₄、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、2mg烟酰胺(基于在1升蒸馏水)。

使用茚三酮法分析培养基中产生的L-赖氨酸的量(Moore,S.,Stein,W.H.,Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of aminoacids.J.Biol.Chem.1948,176,367-388)。

培养完成后，将10μL培养上清液和190μL茚三酮反应溶液在65℃反应30分钟。此后，使用分光光度计在570nm的波长下测量吸光度，并且选择与作为对照组的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株相比显示高吸光度的约60种菌落。证实其他菌落与用作对照组的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株相比显示出相似或降低的吸光度。

以与上述相同的方式培养60种所选菌株，并重复进行茚三酮反应。结果，选择与作为亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株相比具有提高的L-赖氨酸生产率的前10种突变菌株。

实施例3：选择的突变菌株的L-赖氨酸生产率的分析

为了最终选择具有增加的L-赖氨酸生产率的菌株，对于实施例2中选择的10种突变菌株，通过以下方法进行培养。将每种菌株接种在含有25mL种子培养基的250mL三角震荡培养瓶(corner-baffled flask)中，并在30℃和200rpm振荡下培养20小时。然后，将1mL种子培养物接种到含有24mL生产培养基的250mL三角震荡培养瓶中，并在32℃和200rpm振荡下培养72小时。每种种子培养基和生产培养基具有以下组成。培养完成后，使用HPLC(Waters，2478)分析培养基中的L-赖氨酸浓度，每种突变菌株的L-赖氨酸浓度示于下表1中。

<种子培养基(pH7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、2mg烟酰胺(基于1升蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

100g葡萄糖、40g(NH₄)₂SO₄、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体、3g尿素、1g KH₂PO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺、30g CaCO₃(基于1升蒸馏水)

[表1]

由10种选择的随机突变菌株生产的L-赖氨酸浓度

在上述10种选择的突变体中，最终选择KCCM11016P/mt-3作为具有显著提高的L-赖氨酸生产率的菌株。

实施例4：鉴定最终选择的菌株中L-赖氨酸生产率增加的原因

在该实施例中，在实施例3中最终选择的突变菌株中鉴定了由于转座子的随机插入而缺失的基因。

提取显示最优异的L-赖氨酸生产率的KCCM11016P/mt-3的基因组DNA，然后消化。然后，将所得物连接、转化到大肠杆菌DH5α中，然后涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。在选择20种转化菌落后，获得含有部分未知基因的质粒，并使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM试剂盒中的引物1(SEQ ID NO：3)和引物2(SEQ ID NO：4)分析核苷酸序列。

结果，证实缺失了SEQ ID NO：2的多核苷酸序列。证实SEQ ID NO：2的多核苷酸序列编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且SEQ ID NO：2的多核苷酸序列是调节蛋白，其功能未明确揭示，基于美国NIH的基因库报道的核苷酸序列。

引物1(SEQ ID NO：3)：ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

引物2(SEQ ID NO：4)：CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

因此，为了检查蛋白质活性的灭活是否会影响L-赖氨酸生产率，选择该基因作为缺失候选基因。

实施例5：用于基因缺失的重组载体的构建

在该实施例中，为了确认由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的灭活是否会影响L-赖氨酸产生，构建了用于缺失产生L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物的染色体上的实施例4中选择的基因的重组质粒。为此，合成如下表2中所示的引物3至6。

[表2]

用于制备用于基因缺失的片段的引物3至6

详细地，为了缺失NCgl0275基因的ORF(SEQ ID NO：2)，合成引物3(SEQ ID NO：5)、引物4(SEQ ID NO：6)、引物5(SEQ ID NO：7)和引物6(SEQ ID NO：8)(表2)，以分别在5'-和3'-末端具有EcoRI和SalI限制性位点，并使用野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板以进行PCR(Sambrook et al,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,1989)。

结果，扩增了对应于基因上游和下游区域的500bp的DNA片段。在这一点上，PCR条件如下：30个循环，每个循环由下列组成：在95℃变性30秒；在50℃复性30秒；在72℃下伸长1分钟，然后在72℃下伸长7分钟。将不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)和通过PCR扩增的DNA片段用EcoRI和SalI限制酶处理用于染色体插入，使用DNA连接酶彼此连接，转化进入大肠杆菌DH5α，然后涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。

在选择用通过PCR插入所需基因的质粒转化的菌落后，使用质粒提取方法获得质粒，并命名为pDZ-△NCgl0275。

实施例6：从谷氨酸棒杆菌KCCM11016P制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-赖氨酸生产率

基于作为产生L-赖氨酸的代表性棒状杆菌属菌株的KCCM11016P菌株，制备选自上述的NCgl0275缺失菌株，并尝试评估其L-赖氨酸生产率。

详细地，通过染色体上的同源重组将实施例5中构建的重组质粒pDZ-△NCgl0275转化到产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中(van der Rest et al.,ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545,1999)。

此后，在含有4％蔗糖的固体培养基平板上进行二次重组。使用引物3和引物6通过PCR确认完成第二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体中SEQ ID NO：2的基因的染色体缺失。将重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11016P-NCgl0275。

为了分析制备的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P-NCgl0275菌株的L-赖氨酸生产率，还通过以下方法培养亲本菌株(即谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株)。

将作为亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P和实施例6中制备的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P-NCgl0275中的每个接种于含有25mL以下种子培养基的250mL三角震荡培养瓶中，并在30℃和200rpm振荡下培养20个小时。然后，将1mL种子培养物接种到含有24mL生产培养基的250mL三角震荡培养瓶中，并在30℃和200rpm振荡下培养72小时。种子培养基和生产培养基的组成分别如下。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH 7.0)>

培养完成后，使用HPLC测定L-赖氨酸产生，如此分析的L-赖氨酸浓度显示在下表3中。

[表3]

KCCM11016P和KCCM11016P-NCgl0275的L-赖氨酸生产率分析

如上述结果所示，当在产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中缺失NCgl0275时，与亲本菌株相比，L-赖氨酸生产率平均增加了17.2％。

因此，证实了通过灭活棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质来提高L-赖氨酸的生产率。

此外，KCCM11016P-NCgl0275菌株命名为CA01-7512，并于2017年11月7日根据布达佩斯条约下保藏于国际保藏机构韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)(KCCM)，保藏号为KCCM12153P。

实施例7：从谷氨酸棒杆菌KCCM11347P制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-赖氨酸生产率

为了检查在其他产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中是否也显示出上述效果，从产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11347P(韩国专利号10-0073610；该微生物公开为KFCC10750，并根据布达佩斯条约以保藏号KCCM11347P重新保藏于国际保藏机构)以与实施例6相同的方式制备了NCgl0275-缺失的菌株，并命名为KCCM11347P-NCgl0275。

此后，以与实施例6相同的方式培养菌株。培养完成后，使用HPLC测定L-赖氨酸产生，如此分析的L-赖氨酸浓度示在下表4中。

[表4]

KCCM11347P和KCCM11347P-NCgl0275的L-赖氨酸生产率分析

如上述结果所示，证实了当产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11347P中的NCgl0275基因缺失时，L-赖氨酸生产率平均增加了13.6％。

因此，如在实施例6的结果中，证实了通过灭活棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，与未修饰的微生物相比，L-赖氨酸生产率提高。

实施例8：从谷氨酸棒杆菌KCCM10770P制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-赖氨酸生产率

为了检查上述效果是否也在其他产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中显示，从产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)以与实施例6中相同的方式制备了NCgl0275-缺失的菌株，并命名为KCCM10770P-NCgl0275。

此后，以与实施例6相同的方式培养菌株。培养完成后，使用HPLC测定L-赖氨酸产生，如此分析的L-赖氨酸浓度示于下表5中。

[表5]

KCCM10770P和KCCM10770P-NCgl0275的L-赖氨酸生产率分析

如上述结果所示，证实了当产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM10770P中的NCgl0275基因缺失时，L-赖氨酸的生产率平均增加了14.6％。

因此，如在实施例7的结果中，证实了通过灭活产生L-赖氨酸的各种棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，与亲本菌株相比，可以提高L-赖氨酸的生产率。

实施例9：从谷氨酸棒杆菌CJ3P制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-赖氨酸生产率

为了检查上述效果是否也在其他产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中显示，从产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CJ3P以与实施例6中相同的方式制备NCgl0275-缺失的菌株(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)，并命名为CJ3P-NCgl0275。

此后，以与实施例6相同的方式培养菌株。培养完成后，使用HPLC测定L-赖氨酸产生，如此分析的L-赖氨酸浓度示于下表6中。

[表6]

CJ3P和CJ3P-Ncgl0275的L-赖氨酸生产率分析

如上述结果所示，证实了当产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌CJ3P中缺失NCgl0275基因时，L-赖氨酸生产率平均增加了15.8％。

因此，如在实施例6至8的结果中，证实了通过灭活产生L-赖氨酸的各种棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，可以提高L-赖氨酸的生产率。

实施例10：从谷氨酸棒杆菌KCCM11201P制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-缬氨酸生产率

通过缺失具有除L-赖氨酸生产率之外的L-缬氨酸生产率的谷氨酸棒杆菌中的NCgl0275基因，检查缬氨酸生产率是否也得到提高。

通过染色体上的同源重组将实施例5中构建的重组质粒pDZ-△NCgl0275转化到产生L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11201P(韩国专利号10-1117022)中(van der Rest etal.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999)。此后，在含有4％蔗糖的固体培养基平板上进行二次重组。使用引物3和引物6通过PCR，从完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体中制备其中在染色体上缺失NCgl0275基因的菌株。将重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11201P-NCgl0275。

为了分析制备的菌株的L-缬氨酸生产率，通过以下方法培养菌株，并分析培养基的组分。将菌株接种于含有25mL生产培养基的250mL三角震荡培养瓶中，并在30℃和200rpm振荡下培养72小时。此后，使用HPLC测定L-缬氨酸浓度，由此分析的L-缬氨酸浓度显示在下表7中。

<生产培养基(pH 7.0)>

100g葡萄糖、40g硫酸铵、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体、3g尿素、1g磷酸氢二钾、0.5g七水合硫酸镁、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺、30g碳酸钙(基于1升蒸馏水)

[表7]

KCCM11201P和KCCM11201P-NCgl0275的L-缬氨酸生产率

如上述结果所示，证实了当KCCM11201P-NCgl0275菌株的L-缬氨酸生产率与对照组相比增加了25.0％时。也就是说，证实了通过缺失棒状杆菌属微生物中的NCgl0275基因可以提高L-缬氨酸的生产率。

还证实了，通过灭活棒状杆菌属微生物中的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，可以提高各种L-氨基酸的生产率。

实施例11：从谷氨酸棒杆菌CJ7V制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-缬氨酸生产率

为了检查上述效果是否也在其他产生L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中显示，将一种突变[ilvN(A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering,June2014,Volume19,Issue 3,pp 456-467]引入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中以制备具有提高的L-缬氨酸生产率的菌株。

详细地，根据试剂盒中提供的方案，使用G-旋转总DNA提取微型试剂盒(G-spinTotal DNA Extraction mini kit)(Intron，目录号17045)提取野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067菌株的基因组DNA。将基因组DNA用作模板以进行PCR。为了构建用于将A42V突变引入ilvN基因的载体，使用引物7(SEQ ID NO：9)和引物8(SEQ ID NO：10)的引物组，以及引物9(SEQ ID NO：11)和引物10(SEQ ID NO：12)的引物组以获得DNA片段(A，B)。PCR条件如下：94℃变性5分钟，25个循环，每个循环由下列组成：在94℃变性30秒；在55℃复性30秒；在72℃伸长60秒，然后在72℃伸长7分钟。

结果，获得了各自具有537bp的多核苷酸的A和B片段。使用这两个片段作为模板，以及引物7(SEQ ID NO：9)和引物10(SEQ ID NO：12)以进行重叠PCR。获得1044bp的PCR产物(下文称为“突变引入片段”)。

用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)处理获得的突变引入片段，然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接到已经用相同限制酶处理的pDZ载体。将制备的基因转化到大肠杆菌DH5α中，并且然后在含有卡那霉素的LB培养基上进行选择。使用DNA-旋转质粒DNA纯化试剂盒(DNA-spin plasmid DNA purification kit)(iNtRON)获得DNA。将A42V突变引入ilvN基因的载体命名为pDZ-ilvN(A42V)。

[表8]

用于制备用于将A42V突变引入ilvN基因的片段的引物7至10

此后，通过染色体上的同源重组将制备的重组质粒pDZ-ilvN(A42V)转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999)。然后，在含有4％蔗糖的固体培养基平板上进行二次重组。使用引物7和引物10通过PCR，从完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化体中扩增基因片段。通过测序分析确认引入突变的菌株。将重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ7V。

最后，从具有L-缬氨酸生产率的谷氨酸棒杆菌CJ7V中，以与实施例9相同的方式制备NCgl0275-缺失的菌株，并命名为CJ7V-NCg100275。为了比较制备的菌株的L-缬氨酸生产率，以与实施例9相同的方式培养菌株，然后分析L-缬氨酸浓度，如此分析的L-缬氨酸浓度示于下表9中。

[表9]

CJ7V和CJ7V-NCgl0275的L-缬氨酸生产率

如上述结果所示，证实了当CJ7V-NCgl0275菌株的L-缬氨酸生产率与对照组相比增加了17.6％时。也就是说，证实了通过在具有L-缬氨酸生产率的棒状杆菌属的各种微生物中缺失NCgl0275基因，可以提高L-缬氨酸的生产率。

如在实施例6至10中，证实了通过灭活棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，可以提高各种L-氨基酸的生产率。

实施例12：从谷氨酸棒杆菌CJ8V制备NCgl0275-缺失的菌株并评估其L-缬氨酸生产率

为了检查上述效果是否也在其他产生L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中显示，以与实施例10相同的方式将一种突变[ilvN(A42V)]引入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中，以制备具有提高的L-缬氨酸生产率的突变菌株。将该重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ8V。

从具有L-缬氨酸生产率的谷氨酸棒杆菌CJ8V，以与实施例9中相同的方式制备NCgl0275-缺失的菌株，并命名为CJ8V-NCg100275。

为了比较制备的菌株的L-缬氨酸生产率，以与实施例9相同的方式培养菌株，并且然后分析L-缬氨酸浓度，并且如此分析的L-缬氨酸浓度显示在下表10中。

[表10]

CJ8V和CJ8V-NCgl0275的L-缬氨酸生产率

如上述结果所示，证实了当CJ8V-NCgl0275菌株的L-缬氨酸生产率与对照组相比增加了25.9％时。也就是说，如在实施例10至11中，证实了通过缺失具有L-缬氨酸生产率的棒状杆菌属的各种微生物中的NCgl0275基因，可以提高L-缬氨酸的生产率。

因此，如在实施例6至11中，证实了通过灭活棒状杆菌属微生物中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质，可以提高各种L-氨基酸的生产率。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开内容可以以不同的特定形式实现，而不改变其技术精神或本质特征。因此，应该理解，上述实施例不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开内容的范围由所附权利要求限定，而不是由说明书限定，因此，落入权利要求的范围和界限内的所有变化和修改，或者这些范围和界限的等同物因此旨在被包含在权利要求中。

[保藏号]

保藏机构：韩国微生物培养中心(KCCM)(国际保藏机构)

保藏号：KCCM12153P

保藏日期：2017年11月7日

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物和使用其生产L-氨基酸的方法

<130> OPA18432

<150> KR 10-2018-0009633

<151> 2018-01-25

<160> 12

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 1

Met Thr Ser Val Ile Pro Glu Gln Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Ser Ala Thr Ile Ala Ser Ser Asp His Thr Glu Arg Gly Glu Trp Val

20 25 30

Thr Gln Ala Lys Cys Arg Asn Gly Asp Pro Asp Ala Leu Phe Val Arg

35 40 45

Gly Ala Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Ile Cys Arg His Cys Pro Val

50 55 60

Ala Met Gln Cys Cys Ala Asp Ala Leu Asp Asn Lys Val Glu Phe Gly

65 70 75 80

Val Trp Gly Gly Leu Thr Glu Arg Gln Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys

85 90 95

Lys Pro His Ile Thr Asn Trp Ala Glu Tyr Leu Ala Gln Gly Gly Glu

100 105 110

Ile Ala Gly Val

115

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 2

atgacgtctg tgattccaga gcagcgcaac aacccctttt atagggacag cgccacaatt 60

gcttcctcgg accacacaga gcgtggtgag tgggtcactc aggcaaagtg tcgaaatggc 120

gacccagatg cattgtttgt tcgtggtgca gcgcaacgcc gagcagcagc aatttgccgc 180

cactgccctg tagccatgca gtgctgcgcc gatgccttag ataacaaggt ggaattcgga 240

gtctggggag gcctgaccga gcgccagcgc cgtgcattgc ttcgaaagaa gccgcacatt 300

actaactggg ctgaatattt ggctcagggg ggcgagatcg ccggggttta a 351

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物1

<400> 3

acctacaaca aagctctcat caacc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物2

<400> 4

ctaccctgtg gaacacctac atct 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3

<400> 5

gaattcgcgc cccactggcc cttc 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物4

<400> 6

accccggcgg cgctgctctg gaatcac 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5

<400> 7

gagcagcgcc gccggggttt aattaat 27

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物6

<400> 8

gcaggtcgac ctggttaccg gtctgaatc 29

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物7

<400> 9

aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物8

<400> 10

agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物9

<400> 11

gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物10

<400> 12

aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32

Claims

1.产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物，其中由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性被灭活。

2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述L-氨基酸是碱性氨基酸、脂肪族氨基酸或支链氨基酸。

3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸或L-缬氨酸。

4.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒杆菌。

5.一种生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：

在培养基中培养权利要求1至4中任一项所述的微生物；和

从所述微生物或所述培养基中回收所述L-氨基酸。

6.根据权利要求5所述的生产L-氨基酸的方法，其中所述L-氨基酸为碱性氨基酸、脂肪族氨基酸或支链氨基酸。

7.根据权利要求5所述的生产L-氨基酸的方法，其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸或L-缬氨酸。