CN115667525A - 具有增强的l-支链氨基酸生产能力的微生物及使用该微生物生产l-支链氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：具有增强的L‑支链氨基酸生产能力的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物，其包含由X‑Z‑Y‑Z'的通式1表示的新多核苷酸，其中转座子序列Y被插入源于微生物的序列X和Z中；以及通过培养所述棒杆菌属(Corynebacterium)微生物来高效生产L‑支链氨基酸的方法。

Description

具有增强的L-支链氨基酸生产能力的微生物及使用该微生物 生产L-支链氨基酸的方法
【技术领域】
本申请涉及具有增强的L-支链氨基酸生产能力的微生物，包括新型多核苷酸和使用该微生物生产L-支链氨基酸的方法。
【背景技术】
L-氨基酸是蛋白质的基本结构单元，被用作医药原料和食品添加剂、动物饲料、营养补充剂、杀虫剂、杀菌剂等的重要原料。具体而言，支链氨基酸(BCAA)是必需氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的总称。已知支链氨基酸具有抗氧化作用和直接促进肌肉细胞中蛋白质合成的作用。
同时，支链氨基酸主要由埃希氏菌属(Escherichia)或棒杆菌属(Corynebacterium)微生物产生，已知其是以2-酮基异己酸为前体，从丙酮酸经过数个步骤后生物合成的(韩国专利10-0220018和10-0438146号)。然而，通过微生物生产L-支链氨基酸具有难以进行大规模工业生产的问题。
【发明详述】
【技术问题】
本发明人为制备包括新型多核苷酸在内的具有增强的L-支链氨基酸生产能力的微生物进行了广泛的努力，结果，他们证实了在导入多核苷酸的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物中可以提高L-氨基酸的生产能力，从而完成了本申请。
【技术方案】
本申请的一个目的是提供一种用于生产L-支链氨基酸的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物，包括多核苷酸序列。
本申请的另一个目的是提供一种用于生产L-支链氨基酸的组合物，包括多核苷酸序列。
本申请的再一个目的是提供一种用于生产L-支链氨基酸的方法，其包括：培养棒杆菌属(Corynebacterium)微生物；从培养基或其培养物中回收L-支链氨基酸。
本申请的再一个目的是提供一种增加L-支链氨基酸产量的方法，其包括：向微生物中添加多核苷酸序列。
本申请的另一个目的是提供所述多核苷酸序列用于生产L-支链氨基酸的用途。
本申请的再一个目的是提供所述微生物用于生产L-支链氨基酸的用途。
【发明效果】
当培养包括本申请的新型多核苷酸的用于生产L-支链氨基酸的微生物时，可以高效地生产L-支链氨基酸。此外，制备的氨基酸可应用于各种产品，如人类食品或食品添加剂、药品，以及动物饲料或动物饲料添加剂。
【优选实施方式的详细说明】
在下文中，将详细描述本申请。同时，本文公开的每个描述和实施方式可以应用于关于共同特征的其他描述和实施方式。也就是说，本文公开的各种元素的所有组合都落入本申请的范围内。此外，本申请的范围不受以下具体描述的限制。
此外，本领域普通技术人员仅使用常规实验就能够识别或确认本文所述的本发明的特定方面的许多等效物。此外，还旨在将这些等价物包括在本申请中。
本申请的一个方面提供了一种用于生产L-支链氨基酸的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物，其包括多核苷酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”是核苷酸单体通过共价键连接成长链的核苷酸的聚合物，是具有一定长度的DNA链。
就本申请而言，多核苷酸是指参与增加氨基酸，特别是支链氨基酸，更特别是包括亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸在内的氨基酸的产生或产量的多核苷酸，但不是仅限于此。
另外，所述多核苷酸可以是由X-Z-Y-Z'[通式1]表示的多核苷酸，在上述通式1中，X可以是SEQ ID NO：1或与其具有90％以上同源性的序列，Y可以是转座子，Z可以是SEQ IDNO：5的第0个核苷酸至第n个核苷酸的序列，并且Z'可以是SEQ ID NO：5的第n+1个核苷酸至SEQ ID NO：5的最后一个核苷酸即第188个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO：5的第188个核苷酸可以是“N”，其可为选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)中的任一种，具体地，可为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)，但不限于此。
n是指包括“0”的自然数。在上述中，当n为0时，这意味着Y紧随连接在X的3'侧。另外，Z和Z'可以是SEQ ID NO：5或与其具有90％以上同源性的序列，但不限于此。
另外，上述通式1中，Y为转座子，可以由SEQ ID NO：3组成，插入到SEQ ID NO：5的第n个核苷酸的下游，可以插入到Z和Z'的序列中的任意位置。具体而言，作为Y插入位点的Z和Z'是存在于靶基因上游位置的位点，Y可以插入其中以增加靶基因的表达，并且Z和Z'可内源性相互连接而构成一个上游，但不限于此。这些Z和Z'是构成插入的一个上游位置的一部分的一个连续的序列，以增强靶基因的表达，Y可位于Z的3'末端(当连接到Z的第0个核苷酸时是X的3'末端)和Z'的5'末端，从而相互分离为Z和Z'。例如，Z和Z'由SEQ ID NO：5的核苷酸序列组成，总共有188个核苷酸序列：(i)当转座子Y被插入到第1个核苷酸的下游时，SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的从5'末端起第1个核苷酸成为Z，而SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的除5'末端起第1个核苷酸之外的187个核苷酸的核苷酸序列成为Z'。此外，(ii)当转座子Y被插入到第11个核苷酸的下游时，SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的从5'末端起11个核苷酸的核苷酸序列成为Z，而SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的除5'末端起11个核苷酸的核苷酸序列之外的177个核苷酸的核苷酸序列成为Z'。此外，(iii)当转座子Y被插入到第187个核苷酸的下游时，SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的从5'末端起187个核苷酸的核苷酸序列成为Z，而SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的除5'末端起187个核苷酸的核苷酸序列之外的1个核苷酸的核苷酸序列成为Z'，但以上描述仅为示例，因此不限于此。
具体地，当转座子Y被插入到第11个核苷酸的下游时，核苷酸序列Z可以是SEQ IDNO：2或与其具有90％以上同源性的序列。此外，当Z'是SEQ ID NO：5的核苷酸序列中的除从5'末端起11个核苷酸的核苷酸序列之外的177个核苷酸的核苷酸序列时，Z'可以是SEQ IDNO：4或与其具有90％以上同源性的序列，但不限于此。SEQ ID NO：4的最后一个核苷酸是“N”，其可为选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)中的任何一种，具体地是A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)，但不限于此。
*X、Z或Z'只要是源自含有所述X、Z或Z'的微生物的序列，就无限制地包括在本发明的范围内。另外，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列可以在已知数据库NCBI Genbank中确认。
多核苷酸可以是：X可以是SEQ ID NO：1和/或与所述SEQ ID NO：1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性或同一性的核苷酸序列，并且Z和Z'可以是SEQ ID NO：5和/或与所述SEQ ID NO：5具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性或同一性的核苷酸序列，其中所述具有同源性或同一性的核苷酸序列可以是上述范围内的那些，不包括具有100％同一性的序列，或者可以是具有小于100％的同一性的序列。
就本申请而言，多核苷酸是指只要将转座子Y插入到来源于包含X、Z和Z'的微生物的序列中，就可以起到增加L-支链氨基酸产量的作用的多核苷酸。
此外，在Z'的3'末端还可包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或与它们具有90％以上同源性的序列，但不限于此。具体而言，多核苷酸只要是来源于微生物的序列，就不特别限定，所述来源于微生物的序列在Z'的3'末端包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或与它们具有90％以上同源性的序列。
在一个例子中，在上述通式1表示的多核苷酸序列中，包含除转座子Y之外的X-Z-Z'的序列及添加到Z'的3'末端的序列的序列可以对应于NCgl2472的上游序列，但不限于此。
具体地，上述通式1表示的多核苷酸序列可以是SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17，但不限于此。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。
术语同源性和同一性通常可以彼此互换使用。
保守多核苷酸序列的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以与所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，通常预期具有同源性或同一性的序列在中等或高度严格条件下与全长序列或全长序列的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。还考虑了包含简并密码子而不是杂交多核苷酸中的密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性可以例如通过使用默认参数，使用如“FASTA”程序这样的已知的计算机算法确定(Pearson et al(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444)。或者，可以通过使用如在EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或之后的版本)中运行的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定(GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research 12:387(1984))包括：BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，SF etal，J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，和CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073))。例如，同源性、相似性或同一性可以使用美国生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定。
如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所披露，多核苷酸的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如GAP计算机程序(例如Needleman et al.(1970),JMol Biol.48:443)比较序列信息来确定。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似对齐的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的序列中的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可能包括：(1)一元比较矩阵(包含值1代表同一，0代表非同一)和Gribskovet al(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(或EDNAFULL替代矩阵(EMBOSS版本的NCBI NUC4.4))(如在Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas OfProtein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中所披露)；(2)对每个间隙处以3.0的罚分，对每个间隙中的每个符号额外处以0.10的罚分(或10的空位打开罚分和0.5的空位扩展罚分)；(3)没有对末端间隙的惩罚。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”表示序列之间的相关性。
另外，本申请的多核苷酸可以在不改变多核苷酸序列的范围内，由于密码子简并性或考虑到在要表达多核苷酸的生物体中优选的密码子而在编码区中进行各种修饰。此外，本申请的多核苷酸可以包括可以从已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下可以与和全部或部分核苷酸序列互补的序列杂交的任何多核苷酸序列使得SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的核苷酸序列中的至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代，并且具有启动子活性，没有限制。“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(例如，J.Sambrook等人)。例如，严格条件可以包括这样的条件，在该条件下具有40％以上、具体地70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、更具体地95％以上、更具体地97％以上、更具体地99％以上的同源性或同一性的基因彼此杂交并且具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因彼此不杂交，或者是Southern杂交的洗涤条件，即，在对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS、具体为60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、更具体为68℃，0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤至少一次，具体为两次或三次。
杂交需要两个核酸包含互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请的多核苷酸可以包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段以及与其基本相似的核酸序列。
具体地，具有同源性或同一性的多核苷酸可以使用包括在上述条件下Tm值为55℃的杂交步骤的杂交条件来检测。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，本领域技术人员可以根据其目的适当调整。
用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量在本领域中是众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50～9.51、11.7～11.8)。
如本文所用，术语“含有多核苷酸的微生物”是指天然具有支链氨基酸生产能力的微生物，或将支链氨基酸生产能力赋予没有支链氨基酸的生产能力的亲本菌株的微生物。具体地，微生物可以是用于生产L-支链氨基酸的微生物，其包括X-Z-Y-Z'[通式1]的多核苷酸，但不限于此。具体地，在微生物中，多核苷酸由通式X-Z-Y-Z'[通式1]表示，在上述通式1中，X为SEQ ID NO：1或与其具有90％以上同源性的序列，Y为转座子，并且Z和Z'可以是SEQID NO：5或与其具有90％以上同源性的序列。
为了本申请的目的，微生物可以是能够产生支链氨基酸的任何微生物，包括多核苷酸。
在本申请中，“能够产生支链氨基酸的微生物”可以与“产生支链氨基酸的微生物”和“具有支链氨基酸生产能力的微生物”互换使用。
如本文所用，术语“支链氨基酸”是指在侧链上具有支链烷基的氨基酸，它包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具体地，在本申请中，支链氨基酸可以是L-支链氨基酸，L-支链氨基酸可以是L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，但不限于此。
如本文所用，术语“产生支链氨基酸的微生物”包括所有野生型微生物，或天然或人工遗传修饰的微生物，其可以是由于外源基因插入或内源基因活性增强的失活等原因而特定机制减弱或增强的微生物，是一种为了生产所需支链氨基酸而发生基因突变或增强了活性的微生物。就本申请而言，产生支链氨基酸的微生物的特征在于通过包含多核苷酸而提高了所需的支链氨基酸的生产能力，具体而言，它可以是棒杆菌属(Corynebacterium)微生物。具体地，在本申请中，产生支链氨基酸的微生物或具有支链氨基酸生产能力的微生物可以是支链氨基酸的生物合成途径中的基因的一部分被增强或减弱，或支链氨基酸降解途径中的部分基因被增强或减弱的微生物，但不限于此。
如本文所用，术语“用于生产L-支链氨基酸的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物”可以是天然或通过修饰具有支链氨基酸生产能力的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物。具体地，在本申请中，具有支链氨基酸生产能力的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物可以是指含有本申请的多核苷酸或用含有表达该多核苷酸的基因的载体转化的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物，从而具有增强的支链氨基酸生产能力。“具有增强的支链氨基酸生产能力的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物”可以指与转化前的亲本菌株或未修饰的微生物相比支链氨基酸生产能力增强的微生物。“未修饰的微生物”可以指天然菌株本身、不含本申请的多核苷酸的微生物或未用含有表达所述多核苷酸的基因和靶蛋白的载体转化的微生物。
在本申请中，“棒杆菌属(Corynebacterium)微生物”具体可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、高效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、静止棒杆菌(Corynebacterium stationis)等，但不限于此。
本申请的另一方面提供了用于生产L-支链氨基酸的组合物，其包括所述多核苷酸序列。
用于生产L-支链氨基酸的组合物是指能够通过本申请的多核苷酸生产L-支链氨基酸的组合物。例如，所述组合物包括所述多核苷酸，并且可以进一步包括但不限于能够操作所述多核苷酸的构成。所述多核苷酸可以是包含在载体中的形式，以允许可操作连接的基因在导入的宿主细胞中表达。
本申请的又一方面提供了一种生产L-支链氨基酸的方法，包括：在培养基中培养棒杆菌属(Corynebacterium)微生物；从培养基或其培养物中回收L-支链氨基酸。
在上述方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养法、连续培养法、分批补料培养法等进行，但不特别限于此。特别地，对于培养条件，可以使用碱性化合物(例如、氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)将培养物的pH调节至合适的pH(例如，pH 5～9，具体地pH 6～8，并且最具体地pH 6.8)，但不特别限于此。此外，可将氧气或含氧气体混合物注入培养物中以保持需氧状态。培养温度可维持在20℃～45℃，特别是25℃～40℃，培养可以进行10～160小时左右，但不限于此。培养产生的氨基酸可以分泌到培养基中，也可以保留在细胞中。
此外，作为待使用的培养基的碳源，可以单独使用或组合使用糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)，但不限于此。作为氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，但不限于此。作为磷源，可以单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其相应的含钠盐等，但不限于此。此外，培养基中可以含有其他金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等必需的生长促进物质。
在本申请的培养步骤中产生的氨基酸的回收方法中，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液中收集所需的氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中收集所需的氨基酸。
另外，回收步骤可以进一步包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，回收的氨基酸可能处于纯化状态或含有氨基酸的微生物发酵溶液的形式(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering，AJ Nair.，2008)。
另外，为了本申请的目的，含有具有启动子活性的多核苷酸的微生物的特征在于包括缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸在内的支链氨基酸的产量增加。与不能产生支链氨基酸或能以非常微量产生支链氨基酸的棒杆菌属(Corynebacterium)野生型菌株相比，通过本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以增加支链氨基酸的产生，这是很重要的。
本申请的又一方面提供了一种增加L-支链氨基酸产量的方法，包括：将多核苷酸序列添加到微生物中。
本申请的另一个方面提供了多核苷酸序列用于生产L-支链氨基酸的用途。
本申请的另一方面提供了微生物用于生产L-支链氨基酸的用途。
“L-支链氨基酸产量的增加”是指，与包括多核苷酸序列之前的微生物，即未修饰的微生物相比，L-支链氨基酸生产能力的增加。
“多核苷酸”和“L-支链氨基酸”与上述相同。
【本发明的实施方式】
在下文中，将通过实施例来详细描述本申请。然而，这些实施例仅出于说明性目的而给出，本发明的范围并不意在受限于这些实施例或受这些实施例的限制。
【实施例1：通过随机诱变选择用于提高缬氨酸生产能力的突变菌株】
【实施例1-1：通过UV照射诱导随机突变】
为了选择具有增加的缬氨酸生产能力的突变菌株，将作为缬氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P(韩国专利第10-1117022号)铺在含有琼脂的营养培养基上，并在30℃培养36小时。将由此获得的数百个菌落在室温下用UV照射，以诱导菌株基因组的随机突变。
【实施例1-2：诱变菌株发酵滴度实验及菌株选择】
为了选择与用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P相比具有增加的L-缬氨酸生产能力的突变菌株，进行了其中已诱导随机突变的菌株的发酵滴度的实验。将每个菌落在营养培养基中继代培养，然后将每个菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。之后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，L-缬氨酸的分析浓度如下表1所示。
＜营养培养基(pH 7.2)＞
葡萄糖10g、肉提取物5g、多聚蛋白胨10g、氯化钠2.5g、酵母提取物5g、琼脂20g、尿素2g(基于1L蒸馏水)
＜生产培养基(pH 7.0)＞
葡萄糖100g，(NH4)2SO4 40g，大豆蛋白2.5g，玉米浆(Corn Steep Solids)5g，尿素3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1mg，泛酸钙2mg，烟酰胺3mg，CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)
【表1】
Figure BDA0003824030780000071
参考表1，与对照KCCM11201P菌株相比，选择缬氨酸产量增加最大的C10菌株。
【实施例2：通过基因测序确认突变】
对具有增加的缬氨酸生产能力的C10菌株的主要基因进行测序，并与KCCM11201P菌株和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067的野生型菌株的主要基因进行比较。结果证实C10菌株在特定位置含有转座子。
具体地，在C10中，确认了由SEQ ID NO：3表示的转座子被插入到SEQ ID NO：5的第11个核苷酸的3'末端。
在以下实施例中，试图确定插入特定位置的转座子是否影响棒杆菌属(Corynebacterium)微生物的支链氨基酸，即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的产量。
【实施例3：插入转座子的菌株的制备及其缬氨酸生产能力的评价】
【实施例3-1：从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P制备插入转座子的菌株及其L-缬氨酸生产能力评价】
为了将由SEQ ID NO：3表示的转座子插入谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)KCCM11201P中，制备了包含靶突变的载体。具体而言，使用G-spin总DNA提取微型试剂盒(iNtRON，货号：17045)，根据试剂盒中提供的流程提取C10菌株的基因组DNA，并以基因组DNA为模板进行PCR。PCR条件如下：在94℃变性5分钟，然后25个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃聚合150秒，然后72℃聚合7分钟，使用SEQ ID NO：8的引物1和SEQID NO：2的引物2得到1485bp的PCR产物(以下称为“突变导入片段1”)。
将获得的突变导入片段1用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)处理，然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接到经相同的限制酶处理的pDZ载体中(韩国专利10-0924065号和国际公开WO2008-033001号)。用制备的基因转化大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α，然后在含有卡那霉素的LB培养基上进行筛选。使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)获得DNA，制备含有突变导入片段1的pDZ-PNCgl2472(Tn)载体。
【表2】
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO：
引物1 CTATTCTAGA CAAAGGTTTG GCAGTTTC 8
引物2 CTATTCTAGA CTTCAGATTT CCTCCTGCTT 9
此后，将pDZ-PNCgl2472(Tn)通过染色体上的同源重组转化到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P中(van der Rest等人，Appl MicrobiolBiotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源重组在染色体上插入载体的菌株。然后，基于二次重组完成的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)转化体，使用SEQ ID NO：8的引物1和SEQ ID NO：9的引物2，通过PCR确认在SEQID NO：5的第11个核苷酸的3'末端插入了SEQ ID NO：3的转座子的菌株。将重组菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P-PNCgl2472-Tn命名为CA08-1533，并以保藏号KCCM12707P保藏。
进行烧瓶评估以比较作为产生缬氨酸的菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)KCCM11201P和CA08-1533的缬氨酸生产能力。将每个菌株在营养培养基中继代培养，然后将每个菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。之后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，L-缬氨酸的分析浓度如下表3所示。
＜营养培养基(pH 7.2)＞
葡萄糖10g、肉提取物5g、多肽胨10g、氯化钠2.5g、酵母提取物5g、琼脂20g、尿素2g(基于1L蒸馏水)
＜生产培养基(pH 7.0)＞
葡萄糖100g，(NH4)2SO4 40g，大豆蛋白2.5g，玉米浆5g，尿素3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1mg，泛酸钙2mg，烟酰胺3mg，CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)
【表3：KCCM11201P和CA08-1533的L-缬氨酸生产能力】
Figure BDA0003824030780000091
结果，证实CA08-1533菌株的L-缬氨酸生产能力与KCCM11201P相比增加了7.4％。
【实施例3-2：从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJ7V制备插入了转座子的菌株及其L-缬氨酸生产能力的评价】
为了检查在其他产生L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株中是否也显示增加L-缬氨酸生产能力的效果，将一种突变(ilvN(A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering，June 2014，Volume 19，第3期，pp.45-467)导入野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067，以制备具有提高的L-缬氨酸生产能力的菌株。
具体地，使用G-spin总DNA提取微型试剂盒(iNtRON，货号：17045)，根据试剂盒中提供的流程提取作为野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的ATCC14067菌株的基因组DNA。使用基因组DNA作为模板进行PCR。为了构建用于将A42V突变导入ilvN基因的载体，分别使用引物3(SEQ ID NO：10)和引物4(SEQ ID NO：11)的引物组和引物5(SEQ IDNO：12)的引物组和引物6(SEQ ID NO：13)获得基因片段(A，B)。PCR条件如下：在94℃变性5分钟，然后25个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃聚合60秒，然后在72℃聚合7分钟。
结果，获得了各自具有537bp多核苷酸的A和B片段。以这两个片段为模板，使用SEQID NO：10的引物3和SEQ ID NO：13的引物6进行重叠PCR，得到1044bp的PCR产物(以下称为“突变导入片段2”)。
将获得的突变导入片段2用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)处理，然后使用T4连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)连接到已经用相同限制酶处理的pDZ载体中。用制备的基因转化大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α，然后在含有卡那霉素的LB培养基上进行筛选。使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)获得DNA。将A42V突变导入ilvN基因的载体命名为pDZ-ilvN(A42V)。
【表4】
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO：
引物3 AATTTCTAGA GGCAGACCCT ATTCTATGAA GG 10
引物4 AGTGTTTCGG TCTTTACAGA CACGAGGGAC 11
引物5 GTCCCTCGTG TCTGTAAAGA CCGAAACACT 12
引物6 AATTTCTAGA CGTGGGAGTG TCACTCGCTT GG 13
此后，将pDZ-ilvN(A42V)通过染色体上的同源重组被转化到野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067中(van der Rest等人，Appl MicrobiolBiotechnol 52:541-545，1999)。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源重组在染色体上插入载体的菌株。
针对完成二次重组的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)转化体，通过使用SEQ ID NO：10的引物3和SEQ ID NO：13的引物6的PCR扩增基因片段后，并通过测序分析确认了突变导入菌株。将该重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CJ7V。
最后，制备以与实施例3-1相同的方式用pDZ-PNCgl2472(Tn)转化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJ7V的菌株，并命名为CJ7V-PNCgl2472-Tn。具体而言，确认了在CJ7V-PNCgl2472-Tn中，由SEQ ID NO：3表示的转座子被插入到SEQ ID NO：5的第11个核苷酸的3'末端。
为了比较制备的菌株的L-缬氨酸生产能力，将菌株按照与实施例3-1相同的方式培养，然后分析L-缬氨酸浓度，将分析的L-缬氨酸浓度示于下表5。
【表5：CJ7V和CJ7V-PNCgl2472-Tn的L-缬氨酸生产能力】
Figure BDA0003824030780000101
结果证实，CJ7V-NCgl2472(Tn)菌株的L-缬氨酸生产能力与CJ7V相比增加了9.4％。
【实施例3-3：从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJ8V制备插入转座子的菌株及其L-缬氨酸生产能力的评价】
为了检查在其他产生L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株中是否也显示增加L-缬氨酸生产能力的效果，将一种突变(ilvN(A42V))导入野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869而制备具有L-缬氨酸生产能力的菌株，将所述重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJ8V。
为了将由SEQ ID NO：3表示的转座子插入作为缬氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJ8V中，制备了包含靶突变的载体。具体而言，使用G-spin总DNA提取微型试剂盒(iNtRON，货号：17045)，根据试剂盒中提供的流程提取C10菌株的基因组DNA，并以基因组DNA为模板进行PCR。PCR条件如下：在94℃变性5分钟，然后是25个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃聚合150秒，然后在72℃聚合7分钟，使用SEQ ID NO：8的引物1和SEQ ID NO：14的引物7得到1082bp的PCR产物(片段A')。此外，使用G-spin总DNA提取微型试剂盒(iNtRON，货号：17045)，根据试剂盒中提供的流程提取ATCC13869菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR。PCR条件如下：在94℃变性5分钟，然后是25个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃聚合150秒，然后在72℃聚合7分钟，使用SEQ ID NO：9的引物2和SEQ ID NO：15的引物8获得328bp的PCR产物(片段B')。以这两个片段作为模板，使用引物1(SEQ ID NO：8)和引物2(SEQ ID NO：9)进行重叠PCR而得到1390bp的PCR产物(以下称为“突变导入片段3”)。
将获得的突变导入片段3用XbaI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)处理，然后使用T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)连接到已用相同的限制酶处理的pDZ载体中(韩国专利10-0924065号和国际公开WO2008-033001号)。用制备的基因转化大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α，然后在含有卡那霉素的LB培养基上进行筛选。使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)获得DNA，制备含有突变导入片段3的pDZ-PNCgl2472(Tn)-1载体。使用的引物序列如下表6所示。
【表6】
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO：
引物7 TACCGCAAAT GGGGGTAGCG G 14
引物8 CCGCTACCCC CATTGCGGT A 15
将pDZ-PNCgl2472(Tn)-1以与实施例3-1相同的方式通过在染色体上的同源重组转化到作为L-缬氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJ8V中，命名为CJ8V-PNCgl2472-Tn-1。具体而言，确认了在CJ8V-PNCgl2472-Tn-1中，由SEQ ID NO：3表示的转座子被插入到SEQ ID NO：5的第11个核苷酸的3'末端。
为了确认上述制备的CJ8V-PNCgl2472-Tn-1菌株的L-缬氨酸生产能力，按照与实施例3-1相同的方式培养该菌株，分析L-缬氨酸的浓度，并且将分析的L-缬氨酸浓度显示在下表7中。
【表7：CJ8V和CJ8V-PNCgl2472-Tn的L-缬氨酸生产能力】
Figure BDA0003824030780000111
结果证实，CJ8V-PNCgl2472-Tn-1菌株的L-缬氨酸生产能力与CJ8V相比增加了8.7％。
【实施例4：从作为L-亮氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)KCCM11661P、KCCM11662P制备插入转座子的菌株及其L-亮氨酸生产能力的评价】
将pDZ-PNCgl2472(Tn)-1和pDZ-PNCgl2472(Tn)分别通过染色体上的同源重组转化到作为产L-亮氨酸的菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11661P(韩国专利10-1851898号)和KCCM11662P(韩国专利10-1796830号)中(van der Rest等人，Appl Microbiol Biotechnol52:541-545，1999)。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源重组在染色体上插入载体的菌株。然后，针对二次重组完成的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)转化体，通过使用SEQ ID NO：8的引物1和SEQ ID NO：9的引物2的PCR确认了转座子插入到染色体上的菌株。将所述重组菌株分别命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11661P-PNCgl2472-Tn和KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1。
为了比较谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11661P-PNCgl2472-Tn-1和KCCM11662P-PNCgl2472-Tn的亮氨酸生产能力，进行了发酵滴度实验。将每个菌株在营养培养基中继代培养，然后将每个菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。之后，使用HPLC分析L-亮氨酸的浓度，分析的L-亮氨酸的浓度如下表7所示。
＜营养培养基(pH 7.2)＞
葡萄糖10g、肉提取物5g、多聚蛋白胨10g、氯化钠2.5g、酵母提取物5g、琼脂20g、尿素2g(基于1L蒸馏水)
＜生产培养基(pH 7.0)＞
葡萄糖50g、(NH4)2SO4 20g、玉米浆(Corn Steep Solids)20g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素-HCl 1mg、CaCO3 15g(基于1L蒸馏水)
【表8：KCCM11661P、KCCM11661P-PNCgl2472-Tn、KCCM11662P和KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1的L-亮氨酸生产能力】
Figure BDA0003824030780000121
结果证实，与KCCM11661P和KCCM11662P相比，KCCM11661P-PNCgl2472-Tn和KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1菌株的L-亮氨酸生产能力分别增加了约10％。
【实施例5：从作为L-异亮氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)KCCM11248P制备插入转座子的菌株及其L-异亮氨酸生产能力的评价】
以与上述实施例3-1相同的方法制备将pDZ-PNCgl2472(Tn)-1通过同源重组插入作为L-异亮氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11248P(韩国专利号10-1335789)的染色体上的菌株，并且将该菌株命名为KCCM11248P-PNCgl2472-Tn-1。
以下列方式培养KCCM11248P-PNCgl2472-Tn-1菌株，以评估异亮氨酸生产能力。
将每个菌株接种到含有25mL种培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃下以200rpm振摇培养20小时。然后，将1mL的种培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种培养基和生产培养基的组成如下所示。
＜种培养基(pH 7.0)＞
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO4 4g，K2HPO4 8g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(基于1L蒸馏水)
＜生产培养基(pH 7.0)＞
葡萄糖100g，(NH4)2SO4 12.5g，大豆蛋白2.5g，玉米浆(Corn Steep Solids)5g，尿素3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺3000μg，CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)。
培养完成后，通过HPLC测量L-异亮氨酸的浓度。测得的L-异亮氨酸浓度显示在下表9中。
【表9：KCCM11248P和KCCM11248P-PNCgl2472-Tn-1的L-异亮氨酸生产能力】
Figure BDA0003824030780000122
Figure BDA0003824030780000131
结果证实，与KCCM11248P相比，KCCM11248P-PNCgl2472-Tn菌株的L-异亮氨酸生产能力增加了约34％。
综上所述，本申请所属领域的技术人员能够理解，在不改变本申请的技术概念或本质特征的情况下，本申请可以以其他具体形式实施。就此而言，本文所公开的示例性实施例仅用于说明目的，不应被解释为限制本申请的范围。相反，本申请旨在不仅涵盖示例性实施例，而且涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本申请的精神和范围内的各种替代、修改、等效物和其他实施例。
【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】
国际表格
在原始保藏情况下的收条
细则第7.1款发给
至：希杰(CJ)第一制糖株式会社
韩国，首尔市，中区，东湖路330，CJ第一制糖中心，(邮)100-400
Figure BDA0003824030780000132
----------------------------
兹证明，上述翻译与原文内容无异。
2020年5月21日
特许法人HANOL
Figure BDA0003824030780000133
序列表
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> 具有增强的L-支链氨基酸生产能力的微生物及使用该微生物生产L-支链氨基酸的方法
<130> OPA21082-PCT
<150> KR 10-2020-0061174
<151> 2020-05-21
<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
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caaaggtttg gcagtttcgt ccaataattt cactttttcc acaaggaaaa aggtgttcta 60
tgacactaat ttcagcaaa 79
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
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cttgagttta g 11
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 3
agattgcgcg gatagaaaga tacagggggc cacggtgggg tggtgaacaa gagcaggcac 60
gaggcctggt agatacggat tcgaccaaga aaacgtacac cactcaggag cactcgtgcc 120
tgcccttcca tcctctatca tcgaccccct ctggtgccag ttcgccgcgc tgatcccacc 180
cgtgaccgac acccacccac ttcggtgcca ccgcccacgc atcccggacc ggatcatctt 240
cgacaagctc atccaggtcc tcgtcctcgg cgcctcctat gccaagatcg ccgacacgac 300
atgctcggcc accaccttgc gcacccgccg ggacgagtgg atcaccgctg gcatcttcga 360
gcagctggaa cagatctgtt tggaattcta cgaccgtatc gtcggactcg atctggaaaa 420
cttaagcgtg gacgggtgca tcgtcaaagc cccctgcggt ggtgaagccg ccgggcgatc 480
cccggttgac cggggcaaac aaggcacgaa acgctccctg ctggtcgacg gcgcaggtat 540
cccgcttggg tgcgtggtcg ccggtgccaa ccggcatgac tcaccgttgt tgcgcccgac 600
attggagaaa ctaggccggt tcggactcgc cctgcccgat caaatcaccg tgcatctgga 660
cgccggatac gactcaagca agacccgcag tctgttgacc gaacttggct gcgagtgggt 720
gatcagccag aaaggggtcc cgttgcaggc cggggcccgg tgggtggtgg aacggacgaa 780
ctcgtggcat aaccgcgggt tcaagaaact gcaggtgtgt accgaacgtc gcatccgggt 840
cattgaagcg ttcatttctt tagccaacgc cgtgatcgtt gttcgccggc tggtccggga 900
ggcctggtgc acctatcgct gggagactcg cccgacccaa caaccctgac ctatccgcgc 960
gatctcttag 970
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<213> 未知
<220>
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<220>
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ctaataccgc aaatgggggt agcgggtgtg ttgaggggtg gctggccgga cagggatttg 60
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
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acagggattt gagtttttct ctaaaaccgg cgtgaactgg gggttaacta cctcttcggg 120
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gggaagtaca ctgtaccctt gtcgaatgat tgttactcgt gacgcgccct atgggtgtac 120
cagcacgggt gtaaagcagg aggaaatctg aag 153
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<400> 11
agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5
<400> 12
gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物6
<400> 13
aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物7
<400> 14
taccgcaaat gggggtagcg g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物8
<400> 15
ccgctacccc catttgcggt a 21
<210> 16
<211> 1390
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 16
caaaggtttg gcagtttcgt ccaataattt cactttttcc acaaggaaaa aggtgttcta 60
tgacactaat ttcagcaaac ttgagtttag agattgcgcg gatagaaaga tacagggggc 120
cacggtgggg tggtgaacaa gagcaggcac gaggcctggt agatacggat tcgaccaaga 180
aaacgtacac cactcaggag cactcgtgcc tgcccttcca tcctctatca tcgaccccct 240
ctggtgccag ttcgccgcgc tgatcccacc cgtgaccgac acccacccac ttcggtgcca 300
ccgcccacgc atcccggacc ggatcatctt cgacaagctc atccaggtcc tcgtcctcgg 360
cgcctcctat gccaagatcg ccgacacgac atgctcggcc accaccttgc gcacccgccg 420
ggacgagtgg atcaccgctg gcatcttcga gcagctggaa cagatctgtt tggaattcta 480
cgaccgtatc gtcggactcg atctggaaaa cttaagcgtg gacgggtgca tcgtcaaagc 540
cccctgcggt ggtgaagccg ccgggcgatc cccggttgac cggggcaaac aaggcacgaa 600
acgctccctg ctggtcgacg gcgcaggtat cccgcttggg tgcgtggtcg ccggtgccaa 660
ccggcatgac tcaccgttgt tgcgcccgac attggagaaa ctaggccggt tcggactcgc 720
cctgcccgat caaatcaccg tgcatctgga cgccggatac gactcaagca agacccgcag 780
tctgttgacc gaacttggct gcgagtgggt gatcagccag aaaggggtcc cgttgcaggc 840
cggggcccgg tgggtggtgg aacggacgaa ctcgtggcat aaccgcgggt tcaagaaact 900
gcaggtgtgt accgaacgtc gcatccgggt cattgaagcg ttcatttctt tagccaacgc 960
cgtgatcgtt gttcgccggc tggtccggga ggcctggtgc acctatcgct gggagactcg 1020
cccgacccaa caaccctgac ctatccgcgc gatctcttag ctaataccgc aaatgggggt 1080
agcgggtgtg ttgaggggtg gctggccgga cagggatttg agtttttctc taaaaccggc 1140
gtgaactggg ggttaactac ctcttcgggg gtggttgggg tggcgggggt agtccttgag 1200
gggtggggaa cttatttaaa tacccccgaa aaacaaagca aatggacacc cgtgccaaca 1260
tattagcgat ccgcctcgac tatgttcacc cccaaagggg aagtacactg tacccttgtc 1320
gaatgattgt tactcgtgac gcgccctatg ggtgtaccag cacgggtgta aagcaggagg 1380
aaatctgaag 1390
<210> 17
<211> 1390
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 17
caaaggtttg gcagtttcgt ccaataattt cactttttcc acaaggaaaa aggtgttcta 60
tgacactaat ttcagcaaac ttgagtttag agattgcgcg gatagaaaga tacagggggc 120
cacggtgggg tggtgaacaa gagcaggcac gaggcctggt agatacggat tcgaccaaga 180
aaacgtacac cactcaggag cactcgtgcc tgcccttcca tcctctatca tcgaccccct 240
ctggtgccag ttcgccgcgc tgatcccacc cgtgaccgac acccacccac ttcggtgcca 300
ccgcccacgc atcccggacc ggatcatctt cgacaagctc atccaggtcc tcgtcctcgg 360
cgcctcctat gccaagatcg ccgacacgac atgctcggcc accaccttgc gcacccgccg 420
ggacgagtgg atcaccgctg gcatcttcga gcagctggaa cagatctgtt tggaattcta 480
cgaccgtatc gtcggactcg atctggaaaa cttaagcgtg gacgggtgca tcgtcaaagc 540
cccctgcggt ggtgaagccg ccgggcgatc cccggttgac cggggcaaac aaggcacgaa 600
acgctccctg ctggtcgacg gcgcaggtat cccgcttggg tgcgtggtcg ccggtgccaa 660
ccggcatgac tcaccgttgt tgcgcccgac attggagaaa ctaggccggt tcggactcgc 720
cctgcccgat caaatcaccg tgcatctgga cgccggatac gactcaagca agacccgcag 780
tctgttgacc gaacttggct gcgagtgggt gatcagccag aaaggggtcc cgttgcaggc 840
cggggcccgg tgggtggtgg aacggacgaa ctcgtggcat aaccgcgggt tcaagaaact 900
gcaggtgtgt accgaacgtc gcatccgggt cattgaagcg ttcatttctt tagccaacgc 960
cgtgatcgtt gttcgccggc tggtccggga ggcctggtgc acctatcgct gggagactcg 1020
cccgacccaa caaccctgac ctatccgcgc gatctcttag ctaataccgc aaatgggggt 1080
agcgggtgtg ttgaggggtg gctggccgga cagggatttg agtttttctc taaaaccggc 1140
gtgaactggg ggttaactac ctcttcgggg gtggttgggg tggcgggggt agtccttgag 1200
gggtggggaa cttatttaaa tacccccgaa aaacaaggca aatggaaacc cgtgccaaca 1260
tattggcgat ccgcctcgac tatgttcacc cccaaagggg aagtacactg tacccttgtc 1320
gaatgattgt tactcgtgac gcgccctatg ggtgtaccag cacgggtgta aagcaggagg 1380
aaatctgaag 1390
PCT/RO/134表
Figure QDA0003824030820000011

Claims (12)

1.用于生产L-支链氨基酸的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物，其包含由以下通式1表示的多核苷酸序列：
【通式1】
X-Z-Y-Z'
在上述通式1中，
X是SEQ ID NO：1或与其具有90％以上同源性的序列，
Y是转座子，
Z是SEQ ID NO：5的第0个核苷酸至第n个核苷酸的序列，且
Z'是SEQ ID NO：5的第n+1个核苷酸至SEQ ID NO：5的最后一个即第188个核苷酸的序列。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述Y被插入到SEQ ID NO：5的第n个核苷酸的下游。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述Z和Z'是SEQ ID NO：5或与其具有90％以上同源性的序列。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述X、Z或Z'是来源于含有所述X、Z或Z'的微生物的序列。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中上述通式1的多核苷酸序列中的所述Y由SEQ IDNO：3组成。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中在所述Z'的3'末端进一步包含SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或与它们具有90％以上同源性的序列。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中在所述Z'的3'末端进一步包含的序列是来源于含有所述序列的微生物的序列。
8.根据权利要求1～7之任一项所述的微生物，其中所述棒杆菌属(Corynebacterium)微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
9.用于生产L-支链氨基酸的组合物，其包含由以下通式1表示的多核苷酸序列：
【通式1】
X-Z-Y-Z'
在上述通式中，
X是SEQ ID NO：1或与其具有90％以上同源性的序列，
Y是转座子，
Z是SEQ ID NO：5的第0个核苷酸至第n个核苷酸的序列，并且
Z'是SEQ ID NO：5的第n+1个核苷酸至SEQ ID NO：5的最后一个即第188个核苷酸的序列。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述Y被插入到SEQ ID NO：5的第n个核苷酸的下游。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述Z和Z'是SEQ ID NO：5或与其具有90％以上同源性的序列。
12.生产L-支链氨基酸的方法，其包括：
在培养基中培养根据权利要求1～7之任一项所述的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物；及
从所述培养基或其培养物中回收L-支链氨基酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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