CN116547297A - 表达奥奈达湖希瓦氏菌衍生蛋白的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法 - Google Patents
表达奥奈达湖希瓦氏菌衍生蛋白的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种表达外源蛋白质的微生物和使用该微生物生产L‑氨基酸的方法。与其野生型相比，表达外源蛋白质的微生物可以具有提高的L‑氨基酸分泌和/或生产能力。
Description
技术领域
本发明提供了表达外源蛋白质的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法。与野生型相比，表达外源蛋白质的微生物可以具有提高的L-氨基酸输出能力和/或生产力。
背景技术
棒状杆菌属(Corynebacterium)微生物是广泛用于生产L-氨基酸的革兰氏阳性微生物。L-氨基酸用于动物饲料、人类制药和化妆品行业，是通过使用棒状杆菌属菌株发酵生产的。
已经进行了许多尝试来提高使用棒状杆菌属菌株生产L-氨基酸的方法。其中，已经有研究通过破坏特定基因或使用DNA重组技术降低表达来提高生产L-氨基酸的棒状杆菌属菌株。此外，已经有研究通过扩增参与每种L-氨基酸生物合成的基因来研究对L-氨基酸生产的影响，并且提高生产L-氨基酸的棒状杆菌属菌株。然而，仍然需要开发具有提高的L-氨基酸生产力的菌株。
发明内容
技术问题
一个实例提供了一种表达外源蛋白质的微生物。外源蛋白质是源自微生物的异源微生物的蛋白质，并且可以是在本说明书中新发现其赖氨酸输出功能的蛋白质。与不表达外源蛋白的同源微生物相比，表达外源蛋白的微生物可以具有提高的L-氨基酸输出能力和/或生产力。
另一个实例提供了一种用于生产L-氨基酸的组合物，其包含表达外源蛋白质的微生物。
其他实例提供了一种用于生产L-氨基酸的方法，包括培养表达外源蛋白质的微生物。
微生物可以是棒状杆菌属微生物。
技术方案
在本说明书中，为了增加棒状杆菌属微生物的L-氨基酸生产力，尝试通过寻找和引入新的L-氨基酸输出蛋白来改进菌株。使用L-赖氨酸作为代表性实例来说明，一般而言，为了提高赖氨酸生产力，存在提高菌株的L-赖氨酸产量或增加L-赖氨酸每小时生产量的方法。L-赖氨酸输出蛋白是通过生物合成生产的、输出赖氨酸的膜蛋白，该蛋白质的提高对增加赖氨酸产量和生产力是重要的。然而，棒状杆菌属微生物所具有的L-赖氨酸输出蛋白(lysE，Ncgl1214)的表达水平的提高，在提高赖氨酸生产力方面存在限制。
因此，在本说明书中，寻找具有高L-氨基酸输出活性的新外源L-氨基酸输出蛋白，并且将其引入赖氨酸生产菌株，提供具有提高的L-氨基酸输出能力和/或生产力的重组菌株。
在本说明书中，以新外源L-氨基酸输出蛋白为代表性实例，发现了源自奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)的新L-氨基酸输出蛋白以及编码该蛋白的基因，并且作为在生产L-氨基酸的微生物中表达该基因的结果，证实了与未表达该基因的微生物相比，L-氨基酸的输出能力/生产力显著提高。
一个实例提供了一种表达外源蛋白质的微生物。该外源蛋白质是来自微生物的异源微生物的蛋白质，可以是新发现的赖氨酸输出功能的蛋白质。表达外源蛋白质的微生物可以具有提高的L-氨基酸(例如，选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种氨基酸)的输出能力和/或生产力。
另一个实例提供了一种用于生产L-氨基酸的组合物，其包含表达外源蛋白质的微生物。
其他实例提供了一种用于生产L-氨基酸的方法，包括培养表达外源蛋白质的微生物。
微生物可以是棒状杆菌属微生物。
L-氨基酸可以包括选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种氨基酸。
下文中，将对本发明进行更详细的描述。
在本说明书中，外源蛋白质可以是源自与亲本菌株(突变前的微生物)属于不同属的微生物，或不同种的微生物的蛋白质，例如，它可以是源自棒状杆菌属微生物以外的微生物的膜蛋白，该膜蛋白是本说明书中新发现的具有选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种氨基酸输出能力的蛋白质。在一个实例中，外源蛋白质可以是源自希瓦氏菌属(Shewanella)微生物(例如奥奈达湖希瓦氏菌)的膜蛋白(例如，由SEQ IDNO：1的氨基酸序列表示)；与该蛋白质具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上或99.9％以上的序列同一性或同源性的蛋白质(例如，膜蛋白)。
微生物可以包含或表达一种或多种外源蛋白质。表达外源蛋白质的微生物可以是其中引入了编码上述外源蛋白质的多核苷酸的重组微生物。在一个实例中，编码SEQ IDNO：1的蛋白质的多核苷酸可以由SEQ ID NO：2的核酸序列表示，或由与SEQ ID NO：2的核酸序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上或99.9％以上的序列同一性或同源性的序列表示。
表达外源蛋白质的微生物可以是生产L-氨基酸的、具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物。
在本说明书中，术语“生产L-氨基酸的微生物”可以用来表示具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物突变以表达上述外源蛋白质时，具有增加的L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物；和/或不具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物突变以表达外源蛋白质时，具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物。在本说明书中，“微生物”包括单细胞细菌，并且可以与“细胞(cell)”互换使用。在本说明书中，为了区分突变以表达外源蛋白前的微生物与突变微生物，可以将其表述为“亲本微生物(或亲本菌株)或宿主细胞”。
L-氨基酸可以是选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种氨基酸，例如L-赖氨酸。
在一个实例中，微生物可以选自具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的所有微生物。在一个实例中，微生物，例如突变前的亲本菌株可以是(1)天然地具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物，或(2)由于突变被引入天然地具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物或具有显著低的L-氨基酸输出能力和/或生产力的菌株，而具有L-氨基酸输出能力和/或生产力或具有提高的L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物。
在一个具体实例中，微生物可以是选自由以下所组成的组中的一种或多种：(1)天然地具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物，或(2)由于突变被引入天然地具有L-氨基酸输出能力和/或生产力的微生物或具有显著低的L-氨基酸输出能力和/或生产力的菌株，而具有L-氨基酸输出能力和/或生产力或具有提高的L-氨基酸输出能力和/或生产力的所有棒状杆菌属的微生物。棒状杆菌属微生物可以包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。更具体地，棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在一个实例中，表达外源蛋白质的微生物可以是其中引入突变以表达外源蛋白质的微生物。因此，与同源未修饰的微生物相比，经突变以表达外源蛋白质的微生物可以具有增加的L-氨基酸输出能力和/或生产力。未修饰的微生物是指不表达外源蛋白质的微生物，并且可以指未引入突变以表达外源蛋白质的同源微生物，或引入突变前的微生物。
在本说明书中，“突变以表达外源蛋白质”可以表示使亲本菌株表达上述外源蛋白的所有操作。在一个实例中，表达外源蛋白质的突变可以将编码外源蛋白质的多核苷酸，或包含其的重组载体引入亲本菌株。
“引入突变以表达外源蛋白质的微生物”或“突变以表达外源蛋白质的微生物”可以是其中引入了编码外源蛋白质的多核苷酸或者包含该多核苷酸的重组载体的微生物，并且与未修饰的微生物相比，赋予或增加了L-氨基酸输出能力和/或生产力。
在一个实例中，亲本菌株可以是野生型或突变型，使得与野生型相比L-氨基酸的输出能力和/或生产力增加，例如，参与L-氨基酸的生物合成或代谢的蛋白质活性受到控制(增加(促进)或减少(抑制))，但不限于此。
在一个具体实例中，其中表达外源蛋白质的产生L-氨基酸的微生物可以是保藏号KCCM_12827P。
在本说明书中，多核苷酸(可与“基因”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”互换使用)“包含特定的核酸序列或氨基酸序列，由特定的核酸序列或氨基酸序列组成，或由特定的核酸序列或氨基酸序列表示”是具有等同含义的可互换表达，并且可以表示多核苷酸或多肽必然包含特定的核酸序列或氨基酸序列，并且可以解释为包括，其中在保持多核苷酸或多肽(或不排除突变)的原始功能和/或所需功能的范围内，突变(缺失、取代、修饰和/或添加)被添加到特定的核酸序列或氨基酸序列的“基本等同的序列”。
在一个实例中，本说明书中提供的核酸序列或氨基酸序列可以包括通过常见诱变修饰的核酸序列或氨基酸序列，例如，在保持其原始功能和/或所需功能的范围内，直接进化和/或定点诱变等。在本说明书中，除非另有说明，多核苷酸或多肽“包含特定的核酸序列或氨基酸序列、或由该序列组成”可以是指，该多核苷酸或多肽(i)必然包含特定的核酸序列或氨基酸序列，或(ii)由与特定的核酸序列或氨基酸序列具有60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上或99.9％以上的同源性并保持原始功能和/或所需功能的氨基酸序列组成。在本说明书中，原始功能可以是赖氨酸输出蛋白功能(在氨基酸序列的情况下)，或编码具有赖氨酸输出蛋白功能的蛋白质的功能(在核酸序列的情况下)，并且该所需功能可以指增加或赋予微生物L-氨基酸(例如，L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)的输出能力和/或生产力的功能。
本文中，术语“同源性”或“同一性”是指与两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列相关的程度，可以用百分比表示。术语同源性和同一性经常互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性由标准排列算法确定，并且由要使用的程序建立默认空位罚分。基本上，同源或同一性序列可以在中等或高度严格条件下沿整个序列或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。显然，杂交包括含有共同密码子或考虑到多核苷酸中的密码子简并性的密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可以使用已知的计算机算法例如“FASTA”程序来确定，例如使用Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444的默认参数。除此之外，可以使用Needleman-Wunsch算法确定(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，如EMBOSS包的Needleman程序进行的(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)(版本5.0.0或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，[S.][F.，][ETAL，J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，MartinJ.Bishop编，Academic Press，San Diego，1994，以及[CARILLO ETA/.](1988)SIAM JApplied Math48：1073)。例如，使用国家生物技术信息数据库中心的BLAST或ClustalW，可以确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过比较序列信息来确定，如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2：482中已知的，例如，使用GAP计算机程序，诸如Needleman等人(1970)，J Mol Biol.48：443。总之，GAP程序可以定义为两个序列中较短序列中的符号总数除以排列相似的符号数(即核苷酸或氨基酸)的数值。GAP程序的默认参数可以包括(1)二元系统比较矩阵(包括同一性为1的值和非同一性为0的值)和Gribsko等人，(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较矩阵，通过Schwartz和Dayhoff编，Atlas OfProtein Sequence And Structure，National Biomedical Research Foundation，第353-358页(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵)所描述的；(2)每个空位的罚分为3.0并且每个空位的每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5)；以及(3)末端空位没有罚分。
另外，任意两条多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可以通过在限定的严格条件下进行southern杂交实验来比较序列，可以通过在相应技术范围内的本领域技术人员已知的方法确定合适的杂交条件(例如，J.Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，纽约，1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，Inc.，纽约)。本说明书中描述的核酸序列，考虑由于密码子的简并性(degeneracy)而表达蛋白质(赖氨酸输出蛋白质)的微生物中的优选密码子，在不改变氨基酸序列和/或由编码区表达的蛋白质功能的范围内，可以在编码区进行各种修饰。
在一个实例中，本说明书中提供的包含特定核酸序列的多核苷酸可以被解释为不仅包含特定核酸序列或与其基本等同的核酸序列，而且还包含含有与特定核酸序列互补的核酸序列的多核苷酸片段。具体地，具有互补性的多核苷酸可以由本领域技术人员根据目的以适当调整的Tm值进行杂交，例如Tm值为55℃、60℃、63℃或65℃，并在下述条件下进行分析：这种条件在已知文献中有具体描述。例如，具有60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98％以上、99.5％以上、99.9％以上的高互补性的基因被杂交，且具有较低互补性的基因不杂交的条件，或Southern杂交常用的洗涤条件，洗涤条件为：在对应于以下的盐浓度和温度下洗涤1次，具体来说，洗涤2～3次：60℃，1×SSC(盐水-柠檬酸钠缓冲液)和0.1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)；60℃，0.1×SSC和0.1％ SDS；或68℃，0.1×SSC和0.1％ SDS等，但不限于此。在杂交中，可以要求两个核苷酸具有互补序列，或者可以根据杂交的严重程度允许碱基之间的错配。术语“互补性”可用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，在DNA的情况下，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。杂交多核苷酸的适宜严重程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，这是相关技术领域众所周知的(参考Sambrook等人，supra，9.50-9.51，11.7-11.8)。
可以通过本领域技术人员选择已知的转化方法来进行多核苷酸或载体的引入。在本说明书中，术语“转化”是指将编码靶蛋白(外源蛋白)的多核苷酸，或包含该多核苷酸的载体，引入宿主细胞，以在宿主细胞中表达由该多核苷酸编码的蛋白。只要它可以在宿主细胞中表达，无论是插入并定位于宿主细胞的染色体中，还是定位于染色体外，转化的多核苷酸都可以包括它们。此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和/或RNA。只要将多核苷酸引入宿主细胞并在宿主细胞中表达，其引入的形式不受限制。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，该表达盒是一种基因结构，包含其自身表达需要的所有元件。表达盒通常可以包含调节元件，如与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号等。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，可以将多核苷酸以其自身的形式引入宿主细胞中，并且可操作地连接到在宿主细胞中表达所需的序列。在上文中，术语“可操作地连接”可以表示表达调控元件(例如，启动子)和多核苷酸在功能上连接，以便表达调控元件对编码靶蛋白(外源蛋白)的多核苷酸的转录(例如，转录起始)进行调节。可操作地连接可以使用本领域已知的基因重组技术完成，例如，可以通过常规的位点特异性DNA切割和连接进行，但不限于此。
将多核苷酸转化到宿主细胞中的方法可以通过将核酸引入细胞(微生物)的任何方法进行，并且可以通过根据宿主细胞适当地选择本领域已知的转化技术来进行。作为已知的转化方法，可以举例说明电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、显微注射法、聚乙二醇(PEG)沉淀法(聚乙二醇介导摄取)、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、脂质转染法和醋酸锂-DMSO法等，但不限于此。
可以通过适当地选择本领域技术人员已知的方法，将多核苷酸引入(插入)到宿主细胞基因组(染色体)中，例如，可以使用RNA引导的核酸内切酶系统(或CRISPR系统；例如，选自以下中的一种或多种：(a)RNA引导的核酸内切酶(例如，Cas9蛋白等)，其编码基因，或包含该基因的载体；和(b)包含向导RNA(例如，单向导RNA(sgRNA)等)，其编码DNA，或包含该DNA的载体的混合物(例如，RNA引导的核酸内切酶蛋白和向导RNA的混合物等)，复合物(例如，核糖核酸融合蛋白(RNP))、重组载体(例如，同时包含RNA引导的核酸内切酶编码基因和编码DNA的向导RNA等的载体)进行，但不限于此。
本文中，术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA产物，该编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列与合适的调节序列可操作地连接，从而在合适的宿主中表达靶蛋白。调节序列可以包含能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和/或调节转录和/或翻译终止的序列。载体在转化到适当的宿主细胞之后，可以独立于宿主细胞基因组进行表达，或者可以被整合到宿主基因组中。
本文中可使用的载体只要能够在宿主细胞中复制就没有特别限制，可以选自所有常用的载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体等。例如，对于载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL、基于pET的载体等作为质粒载体。具体来说，可以举例说明pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但不限于此。
本文中可用的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体。多核苷酸向宿主细胞染色体中的插入可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组或CRISPR系统，但不限于此。载体可以进一步包含选择标记以确认插入到染色体中。选择标记是通过载体选择转化的细胞，以确认多核苷酸的插入，并且可以选择提供可选择表型的基因，例如药物抗性、营养缺陷型需求、对细胞毒剂的抗性或表面蛋白的表达和使用。由于只有表达选择标记的细胞在用选择性试剂处理的环境中存活或表现出其他表达性状，因此可以选择转化的细胞。
其他实例提供了增加微生物的L-氨基酸输出活性和/或生产力的方法或赋予微生物L-氨基酸输出活性和/或生产力的方法，包括将上述外源蛋白、其编码多核苷酸、或包含该多核苷酸的重组载体引入(转化)到微生物中。
外源蛋白、多核苷酸和微生物与上述相同。
其他实例提供了一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养上述生产L-氨基酸的微生物。该方法还可以包括在培养后，从培养的微生物、培养基或两者中回收L-氨基酸。
在该方法中，微生物的培养可以通过已知的分批培养法、连续培养法、分批补料培养法等方法进行，但不特别限定于此。然后，培养条件可以使用碱性化合物(例如：氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如：磷酸或硫酸)调节至最适pH(例如，pH 5～9，具体地，pH 6～8，最具体地，pH 6.8)，但不特别限定于此，并且可通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物中来维持需氧条件。培养温度可维持在20℃～45℃，或25℃～40℃，可培养约10小时～160小时，但不限于此。通过培养生产的L-氨基酸可以分泌到培养基中或保留在细胞中。
用于培养的培养基可以单独地使用选自由以下组成的组中的一种或多种：糖和碳水化合物(例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如：大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如：棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如：甘油和乙醇)、有机酸(例如：乙酸)等，或混合并使用它们中的两种或更多种作为碳源，但不限于此。作为氮源，选自由以下组成的组中的一种或多种：含氮有机化合物(例如：蛋白胨、酵母提取物、蜜汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆花和尿素)、无机化合物(例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等，可以单独使用或以两种或更多种的混合物使用，但不限于此。作为磷源，选自由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐等所组成的组中的一种或多种，可以单独使用或以两种或更多种的混合物使用，但不限于此。此外，培养基可包含必需的生长促进物质，例如其他金属盐(例如：硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和/或维生素。
回收L-氨基酸可以使根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养基、培养液或微生物中收集所需的氨基酸。例如，可以通过选自离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等中的一种或多种方法来进行回收。用于回收L-氨基酸的方法可以另外包括在回收之前、同时或之后进行的纯化。
有益效果
在本说明书中，提供了增加微生物的L-氨基酸输出能力和/或生产力的技术，为此，新发现了具有L-氨基酸输出能力的外源蛋白质，提供一种通过将外源蛋白质引入微生物，与亲本菌株相比能够提高L-氨基酸的生产力的技术。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例的方式更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅为示例性的，并不旨在限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的基本要点的情况下可以修改下述实施例。
实施例1：L-赖氨酸输出基因的搜索和选择
为了搜索与棒状杆菌属微生物固有的L-赖氨酸输出基因(lysE，Ncgl1214)相比具有高L-赖氨酸输出活性的输出基因，使用NCBI CDD(公共域数据库)进行RPS-BLAST搜索和使用KEGG蛋白质数据库进行BLAST搜索。选择被认为能够输出L-赖氨酸的膜蛋白的候选蛋白。
表1
输出L-赖氨酸的膜蛋白候选组
实施例2：导入外源膜蛋白基因的载体的生产
实施例1中选择的源自奥奈达湖希瓦氏菌(Son)的膜蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。编码膜蛋白的基因和周围核酸序列的信息(登记号NZ_RXNV01000002.1)获自美国国立卫生研究院(NIH GenBank)。基于相应的基因序列(Cosmo genetech，韩国)进行DNA合成。为了扩增基因，使用合成的DNA作为模板和SEQ ID NO：3和4的引物(表2)进行PCR(SolgTM Pfu-X DNA聚合酶)(表3)。结果，获得了包含621bp基因(SEQ ID NO：2)的651bp的基因片段。
表2
引物序列
表3PCR实施条件
| 阶段 | 温度 | 时间 |
| 初始化 | 95℃ | 2分钟 |
| 变性 | 95℃ | 20秒 |
| 退火 | 62℃ | 40秒 |
| 延伸 | 72℃ | 0.5～1分钟 |
| 延伸后 | 72℃ | 5分钟 |
为了确保源自谷氨酸棒状杆菌的gapA启动子，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO：5和6的引物(表2)进行PCR(SolgTM Pfu-X DNA聚合酶)(表3)。将扩增的gapA启动子位点、获得的奥奈达湖希瓦氏菌衍生的基因片段和用NdeI限制性内切酶(韩国专利第10-1126041号)切割的载体pDZTn，使用Gibson Assembly法(DGGibson等人，NATURE METHODS,VOL.6NO.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix)连接，然后转化至大肠杆菌DH5α，涂布在含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基中。为了选择用连接了所需基因和pDZTn的载体转化的菌落，使用SEQ ID NO：7和8的引物(表2)进行PCR。使用公知的质粒提取方法从选择的菌落中获得质粒，并将该质粒命名为pDZTn-PgapA-Son。
实施例3：导入外源膜蛋白的菌株的生产
使用生产的pDZTn-PgapA-Son载体通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)转化生产L-赖氨酸(韩国专利第10-0159812号)的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株后，通过二次杂交过程，获得在转座子基因之间插入PgapA-Son的菌株。使用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引物(表4)(能够扩增包括插入相应基因的位置在内的相邻位点)进行PCR和测序，并确认相应的基因操作。以这种方式获得的菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P::PgapA-Son。
表4
引物序列
| 编号 | 名称 | DNA序列 |
| SEQ ID NO：9 | Tn-1 | TAAGGCACCGCAGAATGTAG |
| SEQ ID NO：10 | Tn-2 | TAGGACTCACCATCACCGGC |
实施例4：引入外源膜蛋白的KCCM11016P菌株中L-氨基酸生产力的比较
通过以下方法培养KCCM11016P::PgapA-Son菌株和对照组KCCM11016P，比较微生物细胞量、葡萄糖消耗能力和氨基酸生产力。
首先，将每个菌株接种在含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃，200rpm下振荡培养20小时。将1ml种子培养液接种于含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，在37℃，200rpm下振荡培养42小时。培养结束后，通过HPLC测定L-氨基酸的产量。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素0.1mg、盐酸硫胺素1mg、泛酸钙22mg、烟酰胺2mg(基于1升蒸馏水)。
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖45g、(NH4)2SO4 15g、大豆蛋白10g、糖蜜10g、KH2PO4 0.55g、MgSO4·7H2O0.6g、生物素0.9mg、盐酸硫胺素4.5mg、泛酸钙4.5mg、烟酰胺30mg、MnSO4 9mg、FeSO4 9mg、ZnSO4 0.45mg、CuSO4 0.45mg、CaCO3 30g(基于1升蒸馏水)。
实验重复3次，培养结果(平均值)见表5。
表5L-氨基酸生产力的比较(KCCM11016P)
如表5所示，与对照菌株KCCM11016P相比，KCCM11016P::PgapA-Son菌株显示出增加的氨基酸生产力。KCCM11016P::PgapA-Son菌株(谷氨酸棒状杆菌CA03-1359)在2020年10月29日国际保藏于《布达佩斯条约》下的国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms，KCCM)，给予的保藏号为KCCM12827P。
实施例5：引入外源膜蛋白的KCCM10770P菌株中L-氨基酸生产力的比较
使用实施例3所述的方法，获得在谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国专利第10-0924065号)菌株的基因组中的转座子位置插入了PgapA-Son基因的菌株。以这种方式获得的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P::PgapA-Son。
通过培养KCCM10770P::PgapA-Son菌株和对照组KCCM10770P，对微生物细胞量、葡萄糖消耗能力和氨基酸生产力进行比较(评价方法见实施例4)。实验重复3次，培养结果(平均值)见表6。
表6L-氨基酸生产力的比较(KCCM10770P)
如表6所示，与对照菌株KCCM10770P相比，KCCM10770P::PgapA-Son菌株显示出增加的氨基酸生产力。
实施例6：引入外源膜蛋白的CJ3P菌株中L-氨基酸生产力的比较
采用实施例3所述的方法获得在谷氨酸棒状杆菌CJ3P(US 9556463 B2)菌株的基因组中的转座子位置插入PgapA-Son基因的菌株，通过将3种突变体[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]引入野生型菌株，该谷氨酸棒状杆菌CJ3P菌株具有L-赖氨酸生产力。以这种方式获得的菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌CJ3P::PgapA-Son。
通过培养CJ3P::PgapA-Son菌株和对照组CJ3P，比较微生物细胞量、葡萄糖消耗能力和氨基酸生产力(评价方法见实施例4)。实验重复3次，培养结果(平均值)见表7。
表7L-氨基酸生产力的比较(CJ3P)
如表7所示，与对照菌株CJ3P相比，CJ3P::PgapA-Son菌株显示出增加的氨基酸生产力。
根据以上描述，本发明所属技术领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以以其他具体形式实施本发明。在这点上，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。本发明的范围应被解释为包括源自下述的权利要求书的含义和范围的所有变化或修改形式及其等效概念，而不是以上详细描述。
保藏信息
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心
保藏号：KCCM12827P
保藏日期：2020年10月29日(中文译文)
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格
至：CJ第一制糖株式会社
韩国首尔市中区东湖路330号
CJ第一制糖中心
(邮编)100-400
上述翻译文本与原文没有相违之处。
<110> CJ第一制糖株式会社(CJ CheilJedang Corporation)
<120> 表达奥奈达湖希瓦氏菌衍生蛋白的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法
<130> OPP20214408KR
<150> 10-2020-0171738
<151> 2020-12-09
<160> 10
<170> koPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 源自奥奈达湖希瓦氏菌（Shewanella oneidensis，Son）的膜蛋白
<400> 1
Met Gln Thr Ala Phe Ile Gln Gly Met Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Ala Gln Asn Ala Phe Val Leu Lys Gln Gly Ile Lys
20 25 30
Arg Ala Tyr Pro Leu Pro Ile Ala Leu Leu Cys Ser Ile Ile Asp Ala
35 40 45
Leu Met Ile Thr Ala Gly Val Ala Gly Leu Gly His Ile Ile Glu Thr
50 55 60
Phe Pro Thr Ile Lys His Val Ala Ser Phe Gly Gly Ala Ala Phe Leu
65 70 75 80
Ile Trp Tyr Gly Ala Asn Ala Leu Lys Ala Ser Phe Val Thr Lys Gly
85 90 95
Met Glu Met Asp His Ala Gln Asn Ala Asp Thr Leu Arg Lys Ala Ile
100 105 110
Leu Thr Thr Leu Gly Ile Ser Leu Leu Asn Pro His Leu Tyr Leu Asp
115 120 125
Thr Val Val Leu Leu Gly Ser Ile Ser Thr Gln Phe Glu Asp Ala His
130 135 140
Arg Pro Trp Phe Gly Ala Gly Ala Val Leu Ala Ser Phe Ile Trp Phe
145 150 155 160
Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ala Arg Leu Leu Ala Pro Ile Phe Ser Arg
165 170 175
Pro Ala Ala Trp Arg Tyr Leu Asp Arg Phe Ile Trp Leu Thr Met Trp
180 185 190
Ser Ile Ala Ala Ala Ile Ile Trp Pro Tyr Leu Ala Ala Ile
195 200 205
<210> 2
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Son编码核苷酸序列
<400> 2
atgcaaacgg cgtttattca aggtatgggc attggtggta gtttgattat tgccgtaggg 60
gcgcaaaatg ctttcgtgct aaagcaaggg attaagcgtg cttacccttt gccgattgcg 120
ctgctttgtt cgattatcga tgccttgatg attaccgcgg gtgtggcagg gcttgggcat 180
attattgaga cctttccgac cattaagcac gtggcgagtt ttggtggtgc ggcttttttg 240
atttggtacg gtgccaatgc gcttaaggcc tcttttgtta ccaaggggat ggagatggat 300
cacgcgcaaa atgctgatac tctgcgtaaa gccatcttga ccaccctagg cataagtcta 360
ctcaatccac acctttattt agatactgtg gtgttgcttg gtagtatcag tactcagttt 420
gaagatgctc accgtccttg gtttggcgcc ggtgcagtat tggcttcttt tatttggttc 480
tttagcctaa gttttggtgc acgtttgttg gcgcctattt ttagtcgtcc agcggcatgg 540
cgttatttag accgctttat ttggctgacg atgtggagca ttgctgcggc cattatctgg 600
ccataccttg ccgcaattta a 621
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Son-F_引物
<400> 3
tagaggagac acaacatgca aacggcgttt attca 35
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Son-R_引物
<400> 4
tagatgtcgg gcccattaaa ttgcggcaag gtatgg 36
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PgapA-F_引物
<400> 5
aatgagttcc tcgagaaacg accgagccta ttggg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PgapA-R_引物
<400> 6
acgccgtttg catgttgtgt ctcctctaaa gattg 35
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pDZTn-2_引物
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tgattgtcga tatgaccggg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 9
taaggcaccg cagaatgtag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tn-2_引物
<400> 10
taggactcac catcaccggc 20
Claims (10)
1.一种棒状杆菌属微生物，其表达SEQ ID NO：1的源自奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)的膜蛋白或与其具有至少75％以上序列同源性的膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中，在所述棒状杆菌属微生物中引入编码所述膜蛋白的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的棒状杆菌属微生物，其中，所述多核苷酸由SEQ ID NO：2或与其具有至少75％以上的序列同源性的核酸序列表示。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的棒状杆菌属微生物，其中，与不表达所述膜蛋白的棒状杆菌属微生物相比，L-氨基酸的生产力增加。
5.根据权利要求4所述的棒状杆菌属微生物，其中，所述L-氨基酸是选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的棒状杆菌属微生物，其中，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.一种用于生产L-氨基酸的组合物，包含根据权利要求1至3中任一项所述的棒状杆菌属微生物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述L-氨基酸是选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种。
9.一种用于生产L-氨基酸的方法，包括：
在培养基中培养根据权利要求1至3中任一项所述的棒状杆菌属微生物，以及
从培养的微生物、培养基或两者中回收L-氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自由L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸所组成的组中的一种或多种。
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