CN116888141A - Glxr蛋白变体或使用其生产苏氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种GlxR蛋白变体或使用其生产苏氨酸的方法，并且将根据一种实施方式的GlxR蛋白变体引入到微生物中，以减少副产物产出并显著增加苏氨酸生产能力。

Description

GLXR蛋白变体或使用其生产苏氨酸的方法

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求基于2021年1月11日提交的韩国专利申请第10-2021-0003609号的优先权的权益，并且相应的韩国专利申请文件中的全部内容作为本说明书的一部分并入。

本申请涉及一种GlxR蛋白变体或使用其的苏氨酸生产方法。

背景技术

L-苏氨酸是一种必需氨基酸，并且用作饲料或食品添加剂、药物合成原料和药物输输注溶液。L-苏氨酸主要通过微生物发酵技术生产，例如，可以使用埃希氏杆菌属(Escherichia)微生物、棒状杆菌属(Corynebacterium)微生物、沙雷氏菌属(Serratia)微生物或普罗维登斯菌属(Providencia sp.)微生物来生产。

近期，已经进行了许多尝试来改善使用棒状杆菌属菌株的L-苏氨酸制备方法。随着基因重组技术的发展，已经报道了用于开发进一步改善L-苏氨酸生产菌株的技术，该技术引入位点特异性基因取代、基因扩增和删除等用于通过随机诱变开发的L-苏氨酸生产菌株。此外，还有从其他细菌引入外源基因的尝试。

尽管做出了这些努力，仍然需要开发一种技术用于改善有用物质(例如L-苏氨酸)的生产力。

现有技术

专利文献

(专利文献1)美国专利公开第2016-0369310号

发明内容

技术问题

一个实例提供了一种新型GlxR蛋白变体。GlxR蛋白变体可以是多肽，其中，位于选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始第45位、第66位、第166位和第168位和/或其对应位置(上述所选位置的一个或多个)所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸被其他氨基酸取代。该多肽可以具有调节新陈代谢过程的主要转录调控因子的功能。

另一个实例提供了一种编码所述GlxR蛋白变体的多核苷酸。

其他实例提供了一种包含所述多核苷酸的载体。

其他实例提供了一种微生物，包含所述GlxR蛋白变体、所述多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体或其组合。

其他实例提供了一种生产苏氨酸的方法，包括在培养基中培养微生物。

所述微生物可以是棒状杆菌属微生物。

解决问题方法

本申请中提供的一种实例提供了一种涉及通过改善GlxR蛋白和/或编码该蛋白的glxR基因来开发具有改善(增加)苏氨酸产量的菌株的技术。在一种实例中，苏氨酸可以是L-苏氨酸。

为实现该目的，本申请的一个方面可以提供一种GlxR蛋白变体，其中，位于选自由GlxR蛋白的氨基酸序列中从N末端开始第45位、第66位、第166位和第168位和/或其相应位置所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸残基被其他种类的氨基酸残基取代。

在本文中，“GlxR(CRP样环AMP-依赖性全局转录调控因子；例如，Cg0350)”可以指不仅涉及碳代谢，而且还涉及各种细胞功能以调节各种基因的全局调控因子，例如，它可以调节编码乙醛酸旁路酶、异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的基因(例如，aceA(cg2560)和aceB(cg2559))的表达。

GlxR蛋白可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且编码GlxR蛋白的glxR基因可以包含SEQ ID NO:2的核酸序列或由SEQ ID NO:2的核酸序列组成。SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:2的核酸序列在下表1中描述。

GlxR蛋白的氨基酸序列和编码GlxR蛋白的基因(例如，glxR)的核苷酸序列(核酸序列)很容易从本领域已知的数据库中获得，所述数据库例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)，例如可以是GenBank登录号WP_003855810.1。

表1

本文中，术语“对应于”是指多肽中所列出的位置处的氨基酸残基，或者与多肽中所列出的残基类似、相同或同源的氨基酸残基。确认对应位置处的氨基酸可以是指确定序列中的特定氨基酸，该序列是指特定序列。本文所用的“对应区域”通常是指相关蛋白或参比(reference)蛋白中类似或对应的位置。

例如，将任意氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对(align)，并且基于此，可以参考SEQID NO:1的氨基酸残基和对应氨基酸残基的编号位置对上述氨基酸序列的每个氨基酸残基进行编号。例如，如本文所述的序列比对算法可以通过与查询序列(也称为“参比序列”)比较来确认氨基酸位置或修饰诸如取代、插入或缺失发生的位置。

针对此类比对，例如，可使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)、EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)等，但不限于此，并且可适当使用本领域中已知的序列比对程序、成对序列比较算法等。

本文中，多核苷酸或多肽“包含特定的核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列或由该序列组成”可以指该多核苷酸或多肽必然包含特定的核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列，并且可以解释为包括，其中在保持多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内，突变(缺失、取代、修饰和/或插入)添加到特定核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列(或不排除此类突变)的“基本等同的序列”。在一个实例中，多核苷酸或多肽“包含特定的核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列、或由该序列组成”可以是指，该多核苷酸或多肽(i)必然包含特定的核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列，或(ii)由与特定的核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列具有70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高的同源性或同一性核酸序列或氨基酸序列组成或必然包含该序列，并保持原始功能和/或所需功能。在一个实例中，该所需功能可以指增加或赋予微生物L-苏氨酸生产能力的功能。

本文中，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。从一个部分从另一个部分的序列之间的同源性可以通过现有技术来确定。例如，可以通过使用容易获得的计算机程序比对序列信息，例如评分、同一性和相似性等参数，直接地比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。计算机程序可以是BLAST(NCBI)、CLC综合性工作平台(CLC bio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc)等。此外，多核苷酸之间的同源性可以通过在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶降解它们以确认降解片段的大小来确定。

本文中，“同源性(homology)或同一性(identity)”指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的类似程度且可以百分比的形式表示。术语同源性和同一性可以常常互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性由标准排列算法确定，并且可以一起使用由所用程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或同一性序列可以在中等或高度严格条件下与整个或部分的序列杂交。显然，杂交还包括与含有考虑到多核苷酸中的通用密码子或密码子简并性的密码子的多核苷酸杂交。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可以例如使用已知的计算机算法如“FASTA”程序来确定，其使用Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444的默认参数。除此之外，可以使用Needleman-Wunsch算法来确定(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，如EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)(版本5.0.0或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，[S.][F.，][ETAL，J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop编，Academic Press，San Diego，1994，以及[CARILLO ETA/.](1988)SIAMJApplied Math 48：1073)中所进行的。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息数据库中心的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过比较序列信息来确定，例如使用GAP计算机程序例如Needleman等人(1970)，J Mol Biol.48：443，例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2：482中已知的。概括地说，GAP程序可以定义为通过两个序列的较短序列中符号的总数除以类似比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)二元系统比较矩阵(包括同一性为1的值和非同一性为0的值)和Gribskov等人，(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较矩阵，通过Schwartz和Dayhoff编，Atlas Of Protein Sequence And Structure，National Biomedical ResearchFoundation，第353-358页(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵)所描述的；(2)每个空位的罚分为3.0并且每个空位的每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5)；以及(3)末端空位没有罚分。

一方面可以提供一种GlxR蛋白变体，其中，位于选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始第45位、第66位、第166位和第168位和/或其对应位置(与上述所选的一个或多个位置对应)所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸被其他氨基酸取代。“其他氨基酸”可以指除位于选自由SEQ ID NO:1的第45位、第66位、第166位和第168位和/或其对应位置所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸之外的其他氨基酸。

根据一个实例的变体可以包含多肽，其中，位于选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第45位、第66位、第166位和第168位和/或其相应位置(在上述所选的一个或多个位置)所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸被氨基酸序列中的其他种类的氨基酸残基取代，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高的同源性或同一性。此外，显然，如果蛋白质与GlxR蛋白质具有这样的同源性或同一性并且具有相同或相应的活性，则氨基酸序列中一些序列被缺失、修饰、取代、保守取代或添加的变体也包括在本申请的范围内。

在一个实例中，GlxR(乙醛酸旁路调控因子)蛋白变体，包含选自由以下(1)至(4)所组成的组中的突变：

(1)SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第45位氨基酸位置所对应的残基(例如，谷氨酸或谷氨酸盐)被丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代；

(2)SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第66位氨基酸位置所对应的残基(例如，天冬氨酸或天冬氨酸盐)被丙氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代；

(3)SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第166位氨基酸位置所对应的残基(例如，苏氨酸)被天冬氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代；以及

(4)SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第168位氨基酸位置所对应的残基(例如，谷氨酸或谷氨酸盐)被丙氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代。

此外，本申请的变体可以包含氨基酸，其中，选自由基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第45位、第66位、第166位和第168位和/或其相应位置(上述所选的一个或多个位置)所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸残基被其他种类的氨基酸残基取代，其与选自SEQID NO:3至5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高的同源性或同一性。此外，如果氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并对本申请的变体表现出相应功效，则显然具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加了一些序列的氨基酸序列的变体也包括在本申请的范围内。

例如，存在具有在氨基酸序列的N末端、C末端和/或氨基酸序列内不改变本发明变体的功能的序列插入或缺失、天然存在的突变、沉默突变(silent mutation)或保守取代的情况。

“保守取代(conservative substitution)”是指一种氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代可以通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质(amphipathic nature)的类似性而发生。通常，保守取代可以对蛋白质或多肽的活性影响很小或没有影响。

本文中，术语“变体”是指一个或多个氨基酸被保守取代和/或修饰，以不同于变体突变前的氨基酸序列，但功能或性质得以保留的多肽。这种变体通常可以通过修饰多肽氨基酸序列中的一个或多个氨基酸并评估修饰多肽的性质来鉴别。换句话讲，与突变之前的多肽相比，变体的能力可能增加、不变或降低。此外，一些变体可以包括除去了一个或多个部分，例如N末端前导序列或跨膜结构域(transmembrane domain)的变体。其他变体可包括从成熟蛋白(mature protein)的N末端和/或C末端去除一部分的变体。术语“变体”与术语例如突变体、修饰、突变多肽、突变蛋白质、突变和变体等(在英语中，修饰、修饰多肽、修饰蛋白、变体、突变蛋白、趋异等)可以互换使用，只要是突变含义上使用的术语，就不限于此。此外，变体可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或插入。例如，参与共翻译或翻译后蛋白易位(translocation)的信号(或前导)序列可以缀合在变体的N末端。此外，变体可以与其他序列或接头缀合来鉴定、纯化或合成。

根据一个实例，GlxR蛋白变体可以包含选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:15所组成的组中的氨基酸序列或由该氨基酸序列所组成。SEQ ID NO:3至SEQ ID No:15的氨基酸序列在下表2中描述。

表2

根据一个实例的GlxR蛋白变体是全局转录调控因子，如突变前的GlxR蛋白(例如，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的GlxR蛋白)，并且例如，它可以具有乙醛酸旁路基因(例如，ace A和/或ace B)调控因子的功能。

根据一个实例的GlxR蛋白变体可以具有比突变前的GlxR蛋白(野生型蛋白(例如，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的GlxR蛋白))减弱的活性。“GlxR蛋白的活性减弱”可以指细胞内全局转录调控因子的活性水平与突变前的蛋白质相比降低。减弱是指与原始微生物(例如野生型、亲本菌株、宿主微生物、未修饰的微生物等)所具有的蛋白质活性相比，由于编码GlxR蛋白的基因突变使蛋白质本身的活性降低时，和由于编码GlxR蛋白的基因的转录抑制和/或翻译抑制使酶的表达水平降低时，并因此细胞中酶活性的总体水平低，也可以包括它们的组合。

本文中，GlxR蛋白变体可以与突变GlxR蛋白、GlxR变体和突变GlxR用作相同含义。

另一方面，可以提供一种编码GlxR蛋白变体的多核苷酸。

本文中，“多核苷酸”是指具有一定长度以上的DNA或RNA链，为核苷酸聚合物，其中核苷酸单体通过共价键以长链形式连接，更具体地，指编码变体的多核苷酸片段。

可以不受限制地包括多核苷酸，只要它是编码根据一个实例的GlxR蛋白变体的多核苷酸序列即可。根据一个实例的多核苷酸可以包含编码GlxR蛋白变体的核酸序列或由所述核酸序列组成，该GlxR蛋白变体中，位于选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N-末端开始的第45位、第66位、第166位和第168位和/或其相应位置(上述所选的一个或多个位置)所组成的组中的一个或多个位置的氨基酸被其他氨基酸取代，并且例如，其可以包含编码选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:15所组成的组中的氨基酸序列的核酸序列，或由所述核酸序列组成。

考虑密码子简并性(degeneracy)或在希望表达根据一个实例的变体的生物体中优选的密码子，在不改变根据一个实例的变体的氨基酸序列的范围内，可在编码区中进行各种修饰。因此，通过密码子简并性，还可以包括由SEQ ID NO:3至SEQ ID No:15的氨基酸序列所组成的多肽或能够编码与其具有同源性(或同一性)的多肽的多核苷酸。

可以无限制的包括根据一个实例的多核苷酸，只要其是可由已知基因序列制备的探针，例如能够在严格条件下与根据一个实例的多核苷酸序列的整体或部分的互补序列杂交的序列。“严格条件(stringent condition)”是指实现多核苷酸之间的特异性杂交的条件。这些条件明确描述于文献中(参见J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。例如，具有高度同源性或同一性的多核苷酸，具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同源性或同一性的多核苷酸被杂交，并且具有低同源性或同一性的多核苷酸不杂交的条件，或在对应于常用的Southern杂交洗涤条件的盐浓度和温度下洗涤1次，具体来说，洗涤2次或3次的条件，常用的Southern杂交洗涤条件为：60℃，1×SSC和0.1％ SDS，具体来说，60℃，0.1×SSC和0.1％S DS；或更具体地，68℃，0.1×SSC和0.1％SDS。

杂交要求两个核酸具有互补序列，但碱基之间可能根据杂交的严格性而存在错配(mismatch)。本文中，“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，根据一个实例的多核苷酸还可包含基本上类似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。

特别是，与根据一个实例的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可使用包括用上文所述条件在Tm值为50℃～65℃(例如，55℃)下杂交的杂交条件来检测。此外，Tm值可为60℃、63℃或65℃，但不限于此，且可以由本领域的技术人员根据目的进行适当调整。

用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且参数是本领域中熟知的(例如，参见J.J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。

另一个方面，可以提供一种载体，其包含所述多核苷酸。载体可以为用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。

本文中，“载体”可以包括DNA产物，该DNA产物包含编码目标多肽的多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸的核苷酸序列可操作性地连接至合适的表达调控区(或表达调控序列)，以使得目标多肽在合适的宿主中表达。表达调控区可以包含能够起始转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。可以将载体转化到合适的宿主细胞中后，载体独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合到基因组本身中。

本文中所用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。通常使用的载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以将pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等用作噬菌体载体或粘粒载体，并且可以将pDZ类、pBR类、pUC类、pBluescriptII类、pGEM类、pTZ类、pCL类和pET类载体等用作质粒载体。具体地说，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体等。

在一个实例中，染色体中编码蛋白质(例如，GlxR蛋白质)的多核苷酸可以通过载体被突变的多核苷酸取代，用于细胞内染色体插入。将多核苷酸插入到染色体中可以通过本领域中已知的任何方法实现，例如，同源重组(homologous recombination)，但不限于此。可以进一步包含选择标记物(selection marker)，用于确认染色体插入与否。选择标记物用于选择载体转化的细胞，即，用于确认靶核苷酸分子插入与否，可以使用赋予可选择表型例如抗药性、营养缺陷型、细胞毒剂抗性或表面多肽的表达的标记物。在用选择剂(selective agent)处理的环境中，只有表达选择标记物的细胞存活或表现出其他表达性状，因此可以选择转化的细胞。

在本文中，“转化”是指将包含编码靶多肽的多核苷酸的载体引入到宿主细胞或微生物中，以使得由多核苷酸编码的多肽可以在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以包括所有多核苷酸，无论它们是插入到宿主细胞的染色体中，或位于染色体外，只要它们可以在宿主细胞中表达即可。此外，多核苷酸包含编码目标多肽(例如，GlxR变体)的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要其可以引入并表达到宿主细胞中即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入到宿主细胞，表达盒为包含自我表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒可以包含通常与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其自身的形式被引入到宿主细胞中并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。转化方法被包括而没有限制，只要其是将基因引入细胞中的方法，并且可以通过根据宿主细胞选择在本领域已知的合适的标准技术来进行即可。例如，可以使用电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、显微注射法、逆转录病毒感染法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、DEAE-葡聚糖转染法、阳离子脂质体法和/或醋酸锂-DMSO法等，但不限于此。

载体可以是指含有编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA产物，该编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列与合适的调控序列可操作地连接，以允许在合适的宿主中表达靶蛋白(例如，GlxR变体)。调控序列可以包含能够起始转录的启动子、用于调控此种转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。载体转化到合适的宿主细胞中后，可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以整合到基因组本身中。

在本文中，“可操作地连接”是指多核苷酸序列与启动子序列功能性地连接，所述启动子序列起始并介导编码本申请的目标变体的多核苷酸的转录。

其他方面，可以提供一种微生物(或菌株、重组细胞)，其包含选自由GlxR蛋白变体、编码该GlxR蛋白变体的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体所组成的组中的一种或多种。本文中，“微生物”可以包括单细胞细菌。

本文中，“菌株(或微生物)”包括野生型微生物和经历天然或人工遗传修饰的微生物，并且该菌株可为特定机制由于例如外部基因的插入或内源性基因的活性增强或失活而削弱或加强的微生物，并且该菌株可以是包含用于生产所需多肽、蛋白质或产物的遗传修饰的微生物。

微生物(或菌株、重组细胞)可以是：包括选自GlxR蛋白变体、根据一个实例的多核苷酸或包含根据一个实例的多核苷酸的载体中的一种或多种的菌株；经修饰以表达GlxR蛋白变体或根据一个实例的多核苷酸的菌株；表达GlxR蛋白变体或根据一个实例的多核苷酸的菌株(例如，重组菌株)；或具有GlxR蛋白变体活性的菌株(例如，重组菌株)，但不限于此。

在一个实例中，微生物(或菌株、重组细胞)可以具有苏氨酸(例如，L-苏氨酸)生产能力。微生物(或菌株、重组细胞)可以具有比未经修饰的微生物、重组前的细胞、亲本菌株和/或野生型菌株增强的苏氨酸生产能力，或者可以赋予与不具有苏氨酸生产能力的未经修饰的微生物、重组前的细胞、亲本菌株和/或野生型菌株不同的苏氨酸生产能力。

本文中，“具有苏氨酸(例如，L-苏氨酸)生产能力”是指天然具有苏氨酸生产能力的细胞和/或微生物，或者其中将苏氨酸生产能力赋予不具有苏氨酸生产能力的亲本菌株的微生物。它可以用于表示微生物通过引入根据一个实例的GlxR蛋白变体而具有L-苏氨酸生产能力的情况和/或微生物在通过将GlxR蛋白变体引入到不具有L-苏氨酸生产能力的微生物中具有L-苏氨酸生产能力的情况。例如，具有L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物可以指天然微生物本身，或具有增强的L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，该微生物中插入了与苏氨酸生产机制相关的外源基因或者固有基因的活性被增强、或减弱、或失活。

与同种未经修饰的微生物相比，其中引入根据一个实例的GlxR蛋白突变的微生物可以具有增加的苏氨酸(例如，L-苏氨酸)。本文中，“未经修饰的微生物”不排除包含微生物中可以天然存在的突变的菌株，并且可以指野生型菌株或天然型菌株本身，或由自然或人工因素引起的基因突变而导致性状改变前的菌株。例如，未经修饰的微生物可以指其中未引入根据一个实例的GlxR变体或引入前的菌株。“未经修饰的微生物”可以与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“未突变的菌株”、“未经修饰菌株”、“未突变的微生物”或“标准微生物”互换使用。上述引入微生物中的GlxR蛋白突变可以指GlxR蛋白变体、编码GlxR蛋白变体的多核苷酸和/或包含该多核苷酸的载体。在一个实例中，蛋白质未经修饰的微生物是比较苏氨酸生产能力增加的主要菌株，该微生物可以是ATCC13032菌株、KCCM12000P菌株和/或KCCM12120P菌株，但不限于此。

在一个实例中，与突变前的亲本菌株或未经修饰的微生物相比，生产力增加的重组菌株的苏氨酸生产力可以增加约1％或更多、约2.5％或更多、约5％或更多、约6％或更多、约7％或更多、约8％或更多、约9％或更多、约10％或更多、约10.5％或更多、约11％或更多、约11.5％或更多、约12％或更多、约12.5％或更多、约13％或更多、约13.5％或更多、约14％或更多、约14.5％或更多、约15％或更多、约15.5％或更多、约16％或更多、约16.5％或更多、约17％或更多、约17.5％或更多、约18％或更多、约18.5％或更多、约19％或更多、约19.5％或更多、约20％或更多、约20.5％或更多、约21％或更多、约21.5％或更多、约22％或更多、约22.5％或更多、约23％或更多、约23.5％或更多、约24％或更多、约24.5％或更多、约25％或更多、约25.5％或更多、约26％或更多、约26.5％或更多、约27％或更多(上限不进行具体限制，并且例如约200％或更少、约150％或更少、约100％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少或约35％或更少)。在其他实例中，与突变前的亲本菌株或未经修饰的微生物相比，生产力增加的重组菌株的苏氨酸生产力可增加约1.1倍或更多、约1.12倍或更多、约1.13倍或更多、1.15倍或更多、1.16倍或更多、1.17倍或更多、1.18倍或更多、1.19倍或更多、约1.2倍或更多、约1.25倍或更多、约1.26倍或更多或约1.3倍或更多(上限不进行具体限制，并且例如约10倍或更少、约5倍或更少、约3倍或更少或约2倍或更少)。在另一个实例中，与突变前的亲本菌株或未经修饰的微生物相比，生产力增加的重组菌株的苏氨酸生产力可增加约1.1倍或更多、约1.12倍或更多。术语“约”为包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等所有的范围，并且其包括等于或类似于在术语“约”之后的数值的范围中的所有数值。

将多核苷酸插入宿主细胞基因组(染色体)或引入突变以使宿主细胞内源基因(例如，glxR基因)编码GlxR蛋白变体，可以通过本领域技术人员适当选择已知的方法来进行，并且例如，可以使用RNA引导的核酸内切酶系统来进行；例如，(a)RNA引导的核酸内切酶(例如，Cas9蛋白等)，其编码基因或包含该基因的载体；(b)向导RNA(例如，单向导RNA(sgRNA)等)，其编码DNA，或包含该DNA的载体的混合物(例如，RNA引导核酸内切酶蛋白和向导RNA的混合物等)，或复合物(例如，选自由核糖核酸融合蛋白(RNP)、重组载体(例如，同时包含RNA引导的核酸内切酶编码基因和编码DNA的向导RNA的载体等)等所组成的组中的一种或多种)，但不限于此。根据一个实例的微生物中，多核苷酸的部分或整体的修饰(例如，用于编码上述蛋白变体的修饰)可以通过以下来诱导：(a)使用将染色体插入至微生物的载体的同源重组或使用基因剪刀(工程化核酸酶，例如，CRISPR-Cas9)的基因组编辑，和/或(b)用光(例如紫外线和辐射)和/或化学物质进行处理等，但不限于此。用于修饰部分或全部基因的方法可以包括通过DNA重组技术的方法。例如，通过注射核苷酸序列或包含与靶基因具有同源性的核苷酸序列的载体来引起同源重组，可以删除部分或全部基因。注射的核苷酸序列或载体可包含显性选择标记，但不限于此。

微生物(或菌株、重组细胞)可以进一步包含突变以增加苏氨酸产量，并且可以包含突变的位置和/或待突变的基因和/或蛋白质的种类而不受限制，只要其增加苏氨酸产量即可。可以不受限制地使用重组细胞，只要其是可转化细胞即可。

为了与苏氨酸生产力提高或通过引入GlxR蛋白突变而赋予苏氨酸生产力的微生物区别，引入GlxR蛋白突变之前的微生物可以由宿主微生物(或亲本菌株、未经修饰的微生物)表示。

在一个实例中，包含GlxR蛋白变体、编码该变体的多核苷酸和/或包含该多核苷酸的载体可以：

(i)除了基因组之外，还包含多核苷酸和/或重组载体，和/或

(ii)包含多核苷酸，作为内源GlxR蛋白编码基因(例如，glxR基因)。

上述(ii)“包含多核苷酸，作为内源GlxR蛋白编码基因(例如，glxR基因)”可以指(a)通过取代内源GlxR蛋白编码基因(例如，glxR基因)来包含(插入)多核苷酸，和/或(b)通过基因编辑技术，将内源GlxR蛋白编码基因(例如，glxR基因)突变为具有所述多核苷酸的核酸序列(即，编码GlxR蛋白变体的核酸序列)。

在一个实例中，GlxR蛋白或编码其的基因可以源自宿主微生物(固有的)或源自不同的微生物(外源的)。

在一个实例中，在微生物(或菌株、重组细胞)中，根据一个实例的多核苷酸可以整合在染色体中，例如，根据一个实例的多核苷酸可以在染色体中的glxR基因位点处被天然基因取代，或者可以在另外的基因位点处整合。

该微生物可以是棒状杆菌属微生物。

棒状杆菌属微生物可以包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、乙酰谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacteriumcallunae)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)、单一棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、龟口腔棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)和/或微黄棒状杆菌(Corynebacteriumflavescens)等

微生物(或菌株、重组细胞)可以包括通过转化人工制备，或天然地存在的微生物(或菌株、重组细胞)。例如，微生物(或菌株、重组细胞)可以用包含编码根据一个实例的GlxR蛋白变体的多核苷酸的载体来转化。

微生物(或菌株、重组细胞)可以是其中将根据一种实施方式的多核苷酸序列整合在染色体中的微生物(或菌株、重组细胞)。同源重组允许与根据一个实例的载体的应用相结合，将染色体上的DNA片段交换为通过载体递送至细胞中的根据一个实例的多核苷酸。为了使载体的环状DNA分子与染色体上的目标DNA之间有效重组，在含有根据一个实例的多核苷酸的待交换DNA区域中，提供在末端与目标位点同源的核苷酸序列；并且它们确定载体整合和DNA交换的位点。例如，根据一个实例的多核苷酸可以在染色体中的天然基因位点处被交换为天然glxR基因，或者可以整合在另外的基因位点。

其他方面，可以提供一种用于生产苏氨酸的方法，包括在培养基中培养微生物(或菌株、重组细胞)。苏氨酸可以是L-苏氨酸。微生物(或菌株、重组细胞)如上所述。

在本文中，“培养”是指使微生物(或菌株、重组细胞)在适当控制的环境条件下生长。培养可以根据本领域已知的合适的培养基和培养条件进行，该培养应当以合适的方式满足特定菌株的要求，并且可以由本领域技术人员进行适当的修改。培养方法可以包括例如分批培养、连续培养、分批补料培养或其组合，但不限于此。

在本文中，“培养基”是指其中培养本申请的谷氨酸棒状杆菌菌株所需的营养物质作为主要组分，并且供应存活和生长不可缺少的包括水的营养物质、生长因子等。具体地说，作为用于培养根据一个实例的微生物的培养基和其他培养条件，可以没有特别限制地使用，只要其为用于微生物的普通培养的培养基即可，但根据一个实例的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的普通培养基中在有氧条件下调节温度、pH等的同时进行培养。

在一个实例中，用于培养微生物(或菌株、重组细胞)的培养基可以参见美国细菌学学会的文件“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.,USA,1981)。

作为碳源，可以包括：碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、果糖、蔗糖(sucrose)和麦芽糖；糖醇，例如甘露醇和山梨糖醇；有机酸，例如丙酮酸、乳酸和柠檬酸；以及氨基酸，例如谷氨酸、蛋氨酸和赖氨酸等。此外，可以使用天然有机营养物质，例如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆，并且具体地说，可以使用碳水化合物，例如葡萄糖和经灭菌的预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)等，并且可以以各种方式使用适当量的其他碳源而没有限制。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种组合使用，但不限于此。

作为氮源，可以使用无机氮源，例如氨、硫酸铵、柠檬酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵等；和有机氮源，包括氨基酸(例如谷氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺)、蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆液、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物。这些氮源可以单独使用或以两种或更多种组合使用，但不限于此。

作为磷源，可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐等。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，并且此外，可以包括氨基酸、维生素和/或合适的前体等。这些组分或前体可以分批或连续的方式添加到培养基中。但该添加不限于此。

此外，培养基可以含有生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，但不限于此。此外，可以包括必需生长物质，例如氨基酸和维生素。此外，可以使用适合于培养基的前体。在培养过程中，可以通过合适的方法将培养基或单个组分以分批或连续的方式添加到培养液中，但不限于此。

根据一个实例，在培养过程中，可以通过以适当方式向培养基中添加化合物诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸盐和硫酸盐来调节培养基的pH。此外，在培养过程中，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制起泡。此外，可以向培养基中注入氧气或含氧气体以维持培养基的好氧状态，或可以不注入气体或可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体以维持厌氧和微氧状态，但不限于此。

根据一个实例，培养温度可维持在20℃～45℃、25℃～40℃或30℃～37℃。培养时间可以持续到获得所需量的有用物质(例如，L-苏氨酸)为止，例如可以为约10小时～160小时。

根据一个实例的苏氨酸的生产方法可以例如在培养之前进一步包括制备根据一个实例的微生物(或菌株、重组细胞)、制备用于微生物培养的培养基、或其组合(以任何顺序)。

根据一个实例的苏氨酸的生产方法可以进一步包括从培养的培养基(培养基)和/或微生物(或菌株、重组细胞)中分离和/或回收苏氨酸。在培养之后可以进一步包括分离和/或回收。培养基可以指培养微生物(或菌株、重组细胞)的培养基。

分离和/或回收苏氨酸可以根据培养方法(例如，分批、连续或分批补料培养方法)，使用本领域已知的合适方法从培养基、培养液或微生物中收集所需氨基酸(例如，L-苏氨酸)。例如，可以使用例如离心、过滤、用结晶蛋白质沉淀剂处理(盐析法)、萃取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、超声分解、超滤、渗析、电泳、分级溶解法(例如，硫酸铵沉淀)、HPLC和/或色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、液相色谱法和尺寸排阻色谱法)等方法，但不限于此。

根据一个实例的苏氨酸的生产方法可以进一步包括纯化。纯化可以使用本领域已知的合适方法进行。在一个实例中，当苏氨酸的生产方法包括分离和/或回收和纯化时，可以在分离和/或回收之前或之后另外包含苏氨酸的纯化，分离和/或回收和纯化可以在不同时间(或连续地)以任何顺序进行，或者可以同时进行或通过合并成一个步骤来进行，但不限于此。

另一个方面，可以提供一种用于生产苏氨酸(例如，L-苏氨酸)的组合物，其包含选自由GlxR蛋白变体、编码该GlxR蛋白变体的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和包含该多核苷酸或该载体的微生物(或菌株、重组细胞)所组成的组中的一种或多种。变体、多核苷酸、载体、微生物、培养基和苏氨酸等如上文所述。

在一个实例中，用于生产的组合物可以进一步包含通常用于生产氨基酸的组合物中的任何合适的赋形剂，并且此类赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或张力剂等，但不限于此。

其他方面，可以提供一种增加微生物的苏氨酸(例如，L-苏氨酸)生产力的方法或赋予微生物苏氨酸(例如，L-苏氨酸)生产力的方法，包括将GlxR蛋白变体、编码其的多核苷酸和/或包含该多核苷酸的重组载体引入(例如，转化)到微生物中。

有益效果

将根据一个实例的GlxR蛋白变体引入微生物中，从而可以减少副产物的生产并显著增加苏氨酸的生产力。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例和实验例更详细地描述本申请。然而，这些实施例和实验例旨在示例性地说明本申请，但本申请的范围不限于这些实施例和实验例。

实施例1：在glxR基因ORF中引入突变的载体库的构建

为了发现其中谷氨酸棒状杆菌的GlxR蛋白(SEQ ID NO:1)的表达或其活性改变的变体，通过以下方法构建载体文库。

首先，合成SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的引物，该引物中使用从WT菌株(ATCC13032)提取的基因组DNA作为模板，限制性内切酶SmaI识别位点插入到，，距离glxR基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)中的第133位～第135位、第196位～第198位、第496位～第498位、以及第502位～504位约1000bp的位置处(分别在其之后和之前)的5'片段和3'片段中。

具体地，以连接到pDZ载体的形式构建位于glxR基因的5'和3'末端的DNA片段(各1000bp)(韩国专利公开第10-2008-0025355号)。使用WT菌株的染色体为模板，通过PCR使用SEQ ID NO:16和18引物构建5’末端基因片段，以及使用SEQ ID NO：17和19引物构建3’末端基因片段。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟，进行24个循环，然后72℃进行聚合10分钟。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段后，将其用作插入DNA片段用于载体的构建。

另一方面，用限制性酶SmaI处理后并在65℃下热处理60分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段使用Infusion克隆试剂盒(Infusion Cloning Kit)连接，然后转化至大肠杆菌DH5α中。将菌株接种于含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。在选择用载体转化的菌落后，该载体中使用SEQ ID NO:20和21的引物通过PCR插入有所需基因，使用公知的质粒提取方法获得质粒。该质粒被命名为pDZ-glxR(E45A)。

通过相同的方法，使用SEQ ID NO:16和28、17和29的引物构建pDZ-glxR(D66A)，使用SEQ ID NO:16和34、17和35的引物构建pDZ-glxR(T166D)，以及使用SEQ ID NO:16和40、17和41的引物构建pDZ-glxR(E168A)。

本实施例中使用的引物的核酸序列如下表3所示。

表3

如上构建包含变体多肽的共4种载体pDZ-glxR(E45A)、pDZ-glxR(D66A)、pDZ-glxR(T166D)和pDZ-glxR(E168A)的，该多肽中SEQ ID NO:1的第45位、第66位、第166位和第168位氨基酸被其他氨基酸取代，并且这些载体是能够分别将GlxR蛋白的第45位氨基酸谷氨酸(谷氨酸，E)取代为丙氨酸(A)、将第66位氨基酸天冬氨酸(天冬氨酸，D)取代为丙氨酸(A)、将第166位氨基酸苏氨酸(T)取代为天冬氨酸(D)、将第168位氨基酸谷氨酸(E)取代为丙氨酸(A)的载体。

实施例2：基于野生型棒状杆菌属微生物评价glxR变体菌株的L-苏氨酸生产力

在本实施例中，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，尝试评价glxR变体菌株的L-苏氨酸生产力，该glxR变体菌株中，ATCC13032菌株内在地具有的野生型GlxR蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中第45位氨基酸谷氨酸、第66位氨基酸天冬氨酸、第166位氨基酸苏氨酸和第168位氨基酸谷氨酸分别被丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸取代。

通过电脉冲法，转化实施例1中构建的pDZ-glxR(E45A)、pDZ-glxR(D66A)、pDZ-glxR(T166D)和pDZ-glxR(E168A)载体。以这种方式将异源核苷酸取代突变引入glxR基因中的菌株被分别命名为ATCC13032△glxR::glxR(E45A)、ATCC13032△glxR::glxR(D66A)、ATCC13032△glxR::glxR(T166D)、ATCC13032△glxR::glxR(E168A)。使用ATCC13032菌株构建的4种菌株[ATCC13032△glxR::glxR(E45A)、ATCC13032△glxR::glxR(D66A)、ATCC13032△glxR::glxR(T166D)、ATCC13032△glxR::glxR(E168A)]作为对照组，按照以下方法培养，以测量糖消耗率以及苏氨酸和赖氨酸生产量。

首先，将每种菌株接种到含有25ml种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml种子培养液接种于含有24ml生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养24小时。种子培养基和生产培养基的组成分别在下表4中描述。培养完成后，使用HPLC(Waters 2478)测量L-赖氨酸和L-苏氨酸的浓度，并使用生化分析仪(YSI 2900)分析残留在培养基中的当量(残余当量)，以测量糖消耗的速率，结果如表5所示。

表4

表5

如表5所示，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株相比，当GlxR蛋白的第45位、第66位、第166位和第168位氨基酸分别被取代时，产生的L-苏氨酸的浓度增加，副产物L-赖氨酸的浓度降低。

另外，如表5所示，可以确认，当Glx蛋白的第45位或第66位氨基酸被丙氨酸取代时，糖消耗的速率也得到改善。因此，与母本菌株(E45A或D66A)相比，其中第45位或第68位氨基酸被丙氨酸取代的变体的菌株具有更快的糖消耗速率，缩短了生产相同量的L-苏氨酸所花费的时间，并且提高了L-苏氨酸的生产力。

实施例3：glxR基因的第45位、第66位、第166位和第168位氨基酸被不同性质的氨 基酸取代的载体文库的构建

证实了当实施例2中GlxR蛋白的第45位、第66位、第166位和第168位氨基酸分别被取代为其他氨基酸时，改善了糖消耗的速率和L-苏氨酸的生产力。为了进一步确认该效果，当GlxR蛋白(SEQ ID No:1)的第45位、第66位、第166位和第168位氨基酸被其他性质的氨基酸取代时，尝试用包含突变的氨基酸取代野生型氨基酸。为了引入实施例2中确认的包括E45A、D66A、T166D和E168A突变的共13种异源核苷酸取代突变，通过与实施例1相同的方法构建各重组载体。

分别使用SEQ ID NO:16和22、17和23的引物构建pDZ-glxR(E45S)，使用SEQ IDNO:16和24、17和25的引物构建pDZ-glxR(E45F)，使用SEQ ID NO:16和26、17和27的引物构建pDZ-glxR(E45K)，使用SEQ ID NO:16和30、17和31的引物构建pDZ-glxR(D66F)，使用SEQID NO:16和32、17和33的引物构建pDZ-glxR(D66K)，使用SEQ ID NO:16和36、17和37的引物构建pDZ-glxR(T166F)，使用SEQ ID NO:16和38、17和39的引物构建pDZ-glxR(T166K)，使用SEQ ID NO:16和42、17和43的引物构建pDZ-glxR(E168F)，使用SEQ ID NO：16和44、17和45的引物构建pDZ-glxR(E168K)。本实施例中使用的引物的核酸序列如上表3所示。

实施例4：基于野生型棒状杆菌属微生物分析glxR基因第45位、第66位、第166位和 第168位氨基酸变体的L-苏氨酸生产力

通过电脉冲法，将实施例3中构建的载体文库转化至ATCC13032菌株中。以这种方式将异源核苷酸取代突变引入glxR基因中的菌株被命名为ATCC13032△glxR::glxR*(E45S)、ATCC13032△glxR::glxR*(E45F)、ATCC13032△glxR::glxR*(E45K)、ATCC13032△glxR::glxR*(D66F)、ATCC13032△glxR::glxR*(D66K)、ATCC13032△glxR::glxR*(T166F)、ATCC13032△glxR::glxR*(T166K)、ATCC13032△glxR::glxR*(E168F)和ATCC13032△glxR::glxR*(E168K)。

将ATCC13032菌株用作对照组，并通过与实施例2相同的方法进行培养，以测定L-苏氨酸和L-赖氨酸的生产力以及糖消耗的速率，结果在表6中描述。

表6

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作为实验结果，当GlxR蛋白(SEQ ID NO:1)中的第45位氨基酸谷氨酸被丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代时，赋予了该菌株L-苏氨酸(Thr)生产能力，改善了糖消耗的速率，并减少了副产物(例如，赖氨酸)的生产。此外，当GlxR蛋白(SEQ ID NO:1)中的第66位氨基酸天冬氨酸被丙氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代时，赋予了该菌株L-苏氨酸生产能力，改善了糖消耗的速率，并减少了副产物(例如，赖氨酸)的生产。此外，当GlxR蛋白(SEQ ID NO:1)中的第166位氨基酸苏氨酸被天冬氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代时，赋予了该菌株L-苏氨酸生产能力，改善了糖消耗的速率，并减少了副产物(例如，赖氨酸)的生产。此外，当GlxR蛋白(SEQ ID NO:1)中的第168位氨基酸谷氨酸被丙氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代时，赋予了该菌株L-苏氨酸生产能力，改善了糖消耗的速率，并减少了副产物(例如，赖氨酸)的生产。

实施例5：基于苏氨酸生产菌株分析glxR变体菌株的L-苏氨酸生产能力和生长速 率

在本实施例中，为了根据glxR突变的引入清楚地检验苏氨酸浓度和生长速率，试图通过将实施例1中构建的4种载体引入L-苏氨酸生产菌株，来评估L-苏氨酸的生产能力。为了构建L-苏氨酸生产菌株，通过将编码野生型LysC蛋白的基因的第1128位至第1131位核苷酸序列从常规TTG改变为AAG，以解决野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的苏氨酸合成途径中充当第一个重要酶的LysC(天冬氨酸激酶)的反馈抑制，构建了其中引入从野生型LysC蛋白的N-末端开始的第377位氨基酸亮氨酸被赖氨酸取代的变体LysC(L377K)突变的菌株。LysC(L377K)的氨基酸序列在下表7中描述为SEQ ID NO:46。

通过以下方法构建用于引入突变的重组载体。为了构建其中引入了LysC(L377K)突变的菌株，合成了SEQ ID NO:47和48的引物，该引物中使用从ATCC13032菌株提取的基因组DNA，将限制性酶SmaI识别位点分别插入到距离lysC基因第1128位～第1131位大约500bp的位置处(分别在其之后和之前)的5’片段和3’片段中。为了引入LysC(L377K)异源核苷酸取代突变，合成了SEQ ID NO:49和50的引物，来取代lysC基因的第1128位～第1131位核苷酸序列。

具体地说，pDZ-lysC(L377K)质粒以这样的形式构建，其中位于lysC基因的5’和3’末端的DNA片段(各515bp、538bp)与pDZ载体连接。通过PCR，使用ATCC13032菌株的染色体作为模板，使用SEQ ID NO:47和49的引物，构建5’末端的基因片段。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟、55℃退火1分钟和72℃聚合40秒，进行30个循环，然后72℃进行聚合10分钟。通过同样的方法，使用SEQ ID NO:48和50，通过PCR构建位于lysC基因的3’末端的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段后，将其用作插入DNA片段用于载体的构建。

另一方面，用限制性酶SmaI处理后在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段使用Infusion克隆试剂盒连接，然后转化至大肠杆菌DH5α中。将菌株接种于含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。选择用载体转化的菌落后，该载体中使用SEQID NO:47和48的引物通过PCR插入有所需基因，使用公知的质粒提取方法获得质粒。该质粒被命名为pDZ-lysC(L377K)。本实施例中使用的引物的核酸序列如下表7所示。

表7

通过电脉冲方法，将以上构建的pDZ-lysC(L377K)转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株。菌株中以这种方式将异源核苷酸取代突变引入lysC基因中的菌株被命名为CJP1。CJP1被命名为CA01-2307，并被保藏在根据布达佩斯条约的国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)，给予的保藏号为KCCM12000P。

在以上构建的KCCM12000P菌株中，将突变引入编码高丝氨酸脱氢酶(Hom)的基因中，生产高丝氨酸，该高丝氨酸是L-苏氨酸和L-异亮氨酸生物合成途径的常见中间体。具体地，通过将编码野生型高丝氨酸脱氢酶的基因的第1218位～第1221位核苷酸序列从TTG替换为AAG，构建了以下形式的其中变体Hom(R407H)突变的菌株，该突变中从野生型高丝氨酸脱氢酶的N-末端开始的第407位氨基酸精氨酸被组氨酸取代。Hom(R407H)的氨基酸序列在下表8中描述为SEQ ID NO:51。通过以下方法构建用于引入突变的重组载体。

首先，合成了SEQ ID NO:52和53的引物，该引物中使用从ATCC13032菌株提取的基因组DNA作为模板，将限制性酶SalI识别位点分别插入到距离hom基因第1219位～第1221位大约600bp的位置处(分别在其之前和之后)的5’片段和3’片段中。为了引入Hom(R407H)异源核苷酸取代突变，合成了SEQ ID NO:54和55的引物，将取代hom基因的第1219位～第1221位核苷酸序列。

具体地说，pDZ-hom(R407H)质粒以这样的形式构建，其中DNA片段(各600bp)位于hom基因的5’和3’末端。通过PCR，使用WT菌株的染色体，使用SEQ ID NO:52和54的引物，构建5’末端的基因片段。PCR条件为：94℃变性2分钟，94℃变性1分钟、56℃退火1分钟、72℃聚合40秒，进行30个循环，然后72℃进行聚合10分钟。通过同样的方法，通过PCR使用SEQ IDNO:53和55，构建位于hom基因的3’末端的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段后，将其用作插入DNA片段用于载体的构建。

另一方面，用限制酶SalI处理后在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段使用Infusion克隆试剂盒连接，然后转化至大肠杆菌DH5α中。将菌株接种于含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。选择用载体转化的菌落后，该载体中使用SEQID NO:52和53的引物通过PCR插入有所需基因，使用公知的质粒提取方法获得质粒。该质粒被命名为pDZ-hom(R407H)。本实施例中使用的引物的核酸序列如下表8所示。

表8

通过电脉冲方法，将以上构建的pDZ-hom(R407H)转化到KCCM12000P中。起着以这种方式将异源核苷酸取代突变引入hom基因中的菌株被命名为KCCM12000P-R398Q，并且将其保藏于布达佩斯条约下的国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)，该菌株的保藏号为KCCM12120P(韩国专利第10-1947959号)。

通过电脉冲法，将实施例1中构建的pDZ-glxR(E45A)、pDZ-glxR(D66A)、pDZ-glxR(T166D)和pDZ-glxR(E168A)载体分别转化到KCCM12120P菌株。构建了其中核苷酸取代突变引入到glxR基因中的菌株，并且分别将KCCM12120P△glxR::glxR*(E45A)命名为CA09-2373、KCCM12120P△glxR::glxR*(D66A)命名为CA09-2374、KCCM12120P△glxR::glxR*(T166D)命名为CA09-2325和KCCM12120P△glxR::glxR*(E168A)命名为CA09-2324。

使用L-苏氨酸生产菌株KCCM12120P菌株，通过以下方法培养总共4种glxR变体，以测量L-苏氨酸生产量、糖消耗的速率和副产物(例如L-赖氨酸)的生产浓度。

将每种菌株接种到含有25ml种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml种子培养液接种于含有24ml生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成分别于下表9中描述。培养完成后，用HPLC和生化分析仪(YSI 2900)测定L-赖氨酸和L-苏氨酸的浓度以及糖消耗的速率，结果见表10。

表9

表10

如表10所示，作为使用L-苏氨酸生产菌株KCCM12120P菌株为对照组，通过培养4种glxR变体菌株(CA09-2373、CA09-2374、CA09-2325、CA09-2324)，测定L-苏氨酸和副产物(L-赖氨酸)的生产浓度的结果，可以证实，与对照组相比，起着将取代突变引入到glxR基因的4种菌株都减少了包括L-赖氨酸在内的其他副产物的生产或没有大的变化，但L-苏氨酸的生产显著增加。另外，可以确认，与对照组相比，全部CA09-2373、CA09-2374、CA09-2325和CA09-2324菌株中，改善了糖消耗速率，缩短了生产相同量L-苏氨酸所花费的时间，并且改善了L-苏氨酸的生产能力。

CA09-2373、CA09-2374、CA09-2325和CA09-2324菌株保藏于布达佩斯条约下的国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)，并且它们分别被赋予保藏号KCCM12901P、KCCM12902P、KCCM12900P和KCCM12899P。

保藏单位：韩国微生物保藏中心(国外)

保藏号：KCCM12899P

保藏日期：2020年12月17日

保藏单位：韩国微生物保藏中心(国外)

保藏号：KCCM12900P

保藏日期：2020年12月17日

保藏单位：韩国微生物保藏中心(国外)

保藏号：KCCM12901P

保藏日期：20201217

保藏单位：韩国微生物保藏中心(国外)

保藏号：KCCM12902P

保藏日期：2020年12月17日(中文译文)

国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格

至：CJ第一制糖株式会社

韩国首尔市中区东湖路330号

CJ第一制糖中心

(邮编)100-400

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(中文译文)

国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格

至：CJ第一制糖株式会社

韩国首尔市中区东湖路330号

CJ第一制糖中心

(邮编)100-400

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至：CJ第一制糖株式会社

韩国首尔市中区东湖路330号

CJ第一制糖中心

(邮编)100-400

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至：CJ第一制糖株式会社

韩国首尔市中区东湖路330号

CJ第一制糖中心

(邮编)100-400

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<110> CJ第一制糖株式会社(CJ CheilJedang Corporation)

<120> GLXR蛋白变体或使用其生产苏氨酸的方法

<130> OPP20213678KR

<150> KR 10-2021-000369

<151> 2021-01-11

<160> 55

<170> koPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_氨基酸

<400> 1

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR_核酸

<400> 2

gtggaaggtg tacaggagat cctgtcgcgc gccggaattt ttcaaggcgt tgacccaacg 60

gcagtcaata acctcatcca ggatatggag accgttcgct tcccacgcgg agcaaccatc 120

ttcgacgagg gcgagccagg tgaccgcctt tacatcatca cctccggcaa agtgaagctt 180

gcgcgccacg caccggacgg ccgcgaaaac ctgctgacca tcatgggtcc ttccgacatg 240

ttcggtgagc tctccatctt cgacccaggc ccacgcacct cctctgcagt gtgtgtcacc 300

gaagttcatg cagcaaccat gaactctgac atgctgcgca actgggtagc tgaccaccca 360

gctatcgctg agcagctcct gcgcgttctg gctcgtcgtc tgcgtcgcac caacgcttcc 420

ctggctgacc tcatcttcac cgacgtccca ggccgcgttg ctaagaccct tctgcagctg 480

gctaaccgct tcggcaccca agaagctggc gcgctgcgcg tgaaccacga cctcactcag 540

gaagaaatcg cacagctcgt cggtgcttcc cgtgaaactg tgaataaggc tcttgcaacg 600

ttcgcacacc gtggctggat tcgcctcgag ggcaagtccg tcctcattgt ggacaccgag 660

catttggcac gtcgcgctcg ataa 684

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_E45A

<400> 3

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Ala Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 4

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_E45S

<400> 4

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Ser Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

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180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 5

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_E45F

<400> 5

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Phe Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 6

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_E45K

<400> 6

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Lys Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

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Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

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Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

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Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

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225

<210> 7

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_D66A

<400> 7

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

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Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

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180 185 190

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195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

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Arg Ala Arg

225

<210> 8

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_D66F

<400> 8

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

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Pro Phe Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

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Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

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100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

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Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

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<210> 9

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_D66K

<400> 9

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

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Pro Lys Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

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100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

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Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

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Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

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Arg Ala Arg

225

<210> 10

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_T166D

<400> 10

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

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100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Asp Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 11

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_T166F

<400> 11

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Phe Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 12

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_T166K

<400> 12

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Lys Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 13

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_E168A

<400> 13

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1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

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Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Ala Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 14

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 14

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Phe Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 15

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GlxR_E168K

<400> 15

Met Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly

1 5 10 15

Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val

20 25 30

Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp

35 40 45

Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala

50 55 60

Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met

65 70 75 80

Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu

100 105 110

Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg

115 120 125

Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Lys Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His

165 170 175

Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu

180 185 190

Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg

210 215 220

Arg Ala Arg

225

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> DNA

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<220>

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pDZ_R (pDZ载体测序引物_反向)

<400> 21

ttccggctcg tatgttgtgt g 21

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 22

gtaaaggcgg tcacctggag agccctcgtc gaagatgg 38

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E45S) R1

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ccatcttcga cgagggctct ccaggtgacc gcctttac 38

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E45F) L2

<400> 24

gtaaaggcgg tcacctggaa agccctcgtc gaagatgg 38

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E45F) R1

<400> 25

ccatcttcga cgagggcttt ccaggtgacc gcctttac 38

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 26

gtaaaggcgg tcacctggct tgccctcgtc gaagatgg 38

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E45K) R1

<400> 27

ccatcttcga cgagggcaag ccaggtgacc gcctttac 38

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 29

gcgccacgca ccggcaggcc gcgaaaacct gctg 34

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(D66F) L2

<400> 30

cagcaggttt tcgcggccaa acggtgcgtg gcgc 34

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(D66F) R1

<400> 31

gcgccacgca ccgtttggcc gcgaaaacct gctg 34

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(D66K) L2

<400> 32

ggttttcgcg gcctttccgg tgcgtggcgc gcaag 35

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(D66K) R1

<400> 33

gcgccacgca ccgaaaggcc gcgaaaacct gctg 34

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(T166D) L2

<400> 34

gccagcttct tggtcgccga agcggttagc cagc 34

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(T166D) R1

<400> 35

aaccgcttcg gcgaccaaga agctggcgcg ctg 33

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 36

gccagcttct tggaagccga agcggttagc cagc 34

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(T166F) R1

<400> 37

aaccgcttcg gcttccaaga agctggcgcg ctg 33

<210> 38

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(T166K) L2

<400> 38

gccagcttct tgtttgccga agcggttagc cagc 34

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(T166K) R1

<400> 39

aaccgcttcg gcaaacaaga agctggcgcg ctg 33

<210> 40

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E168A) L2

<400> 40

agcgcgccag cagcttgggc gccgaagcgg ttag 34

<210> 41

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E168A) R1

<400> 41

cttcggcgcc caagctgctg gcgcgctgcg cgtg 34

<210> 42

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E168F) L2

<400> 42

agcgcgccag caaattgggc gccgaagcgg ttag 34

<210> 43

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E168F) R1

<400> 43

cttcggcgcc caatttgctg gcgcgctgcg cgtg 34

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E168K) L2

<400> 44

agcgcgccag ccttttgggc gccgaagcgg ttag 34

<210> 45

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glxR(E168K) R1

<400> 45

cttcggcgcc caaaaggctg gcgcgctgcg cgtg 34

<210> 46

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LysC_L377K

<400> 46

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 47

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lysC L1

<400> 47

tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lysC R2

<400> 48

ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lysC(L377K) L2

<400> 49

tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lysC(L377K) R1

<400> 50

atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca 30

<210> 51

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hom_R407H

<400> 51

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala His Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 52

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hom L1

<400> 52

atcctctaga gtcgacccaa ctgcagacgt cgaa 34

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hom R2

<400> 53

atgcctgcag gtcgacatag acagatttgt ccacg 35

<210> 54

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hom(R407H) L2

<400> 54

gtgaccacga tcagatgtgc atcatcatcg cgctc 35

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hom(R407H) R1

<400> 55

gcgatgatga tgcacatctg atcgtggtca cccac 35

Claims (8)

1.一种GlxR(乙醛酸旁路调控因子)蛋白变体，包含选自由以下(1)至(4)所组成的组中的突变：

(1)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第45位氨基酸位置所对应的残基被丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代；

(2)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第66位氨基酸位置所对应的残基被丙氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代；

(3)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第166位氨基酸位置所对应的残基被天冬氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代；以及

(4)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第168位氨基酸位置所对应的残基被丙氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸取代。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的GlxR蛋白变体。

3.一种微生物，其包含选自由权利要求1所述的GlxR蛋白变体和编码所述GlxR蛋白变体的多核苷酸所组成的组中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的微生物，其中，所述微生物具有L-苏氨酸生产能力。

5.根据权利要求3所述的微生物，其中，所述微生物是棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)微生物。

6.根据权利要求5所述的微生物，其中，所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

7.一种生产L-苏氨酸的方法，包括在培养基中培养权利要求3至6中任一项所述的微生物的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法还包括从培养的培养基或微生物中回收L-苏氨酸的步骤。