KR101270149B1 - Ｌ­이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Ｌ­이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자를 변이시켜 L-이소루신에 의한 피드백저해를 제거하고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자 및 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자들을 추가로 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, L-이소루신 생성능이 낮은 균주를 이용하여 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물을 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 변이미생물을 이용하면 산업적으로 유용한 L-이소루신을 고효율로 생산할 수 있다.

Description

Ｌ­이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물 및 이의 제조방법 {Mutant Microorganism having High Productivity of L­Isoleucine and Method for Preparing Thereof}
본 발명은 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자를 변이시켜 L-이소루신에 의한 피드백저해를 제거하고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소 및 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자를 추가로 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것이다.
아미노산 생산 균주의 대부분은 화학 약품을 통한 반복적인 무작위 돌연변이를 통해 제조되어 있으며, 이렇게 만들어진 균주는 원하지 않은 대사 내의 회로에 영향을 미쳐 생리적 특성 파악이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 이에 대사 회로 내 특정 유전자를 선택적으로 결실 및 증폭하여 필요한 아미노산을 생성하게 하는 rational design 기법이 요구되고 있다.
분지쇄 아미노산(Branched Chain Amino Acid)이라 하면, 9종의 필수아미노산 중 L-발린, L-루신 및 L-이소루신의 3종을 지칭하며 주로 근육단백질을 구성하여 활동시에 에너지원으로서 이용되는 아미노산을 말한다.
현재 분지쇄 아미노산의 시장 점유율은 전체 아미노산 시장의 약 1%에 불과 하지만, 최근 분지쇄 아미노산이 활동시 근육의 유지 및 증량에 중요한 역할을 한다고 알려지면서 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 특히 L-이소루신의 경우 체내 합성이 불가능하기 때문에 식품 및 사료 용품으로 각광받고 있으며 의학용 정맥 주입으로 사용한다고 알려지면서 의학 및 식품 산업에 응용 가능하다고 알려져 있다. 현재까지 대부분의 L-이소루신은 Brevibacterium 속, Corynebacterium 속 등의 균주로부터 생성되어 왔으나, 최근 배양 조건 및 유전자 조작 기술의 용이함을 가지고 있는 대장균에서의 생성이 보고되고 있다.
미생물을 이용한 L-이소루신의 제조는 주로 Corynebacterium glutamicum에서 ilvA, hom 유전자를 변이시켜, L-이소루신을 생성하였다는 내용이 발표되었다 (Morbach et al., Appl . Environ . Microbiol., 61:4315, 1995). 그러나 아직까지 대장균을 이용하여 rational design 방법으로 metabolic engineering 한 L-이소루신 생성 균주는 보고된 바 없다.
따라서 대사 회로를 분석하고, 필요로 하는 유전자만을 조작하여 결실, 증폭, 치환 등을 통해 세포 회로를 재구성함으로서 분지쇄 아미노산의 고생성능을 갖는 미생물, 특히, L-이소루신 고생성능을 갖는 대장균의 개발이 절실하게 요구되고 있다. 이는 계속적으로 증가하는 L-이소루신의 수요에 맞추어 산업적 공정에서 응용 가능할 수 있는 발판을 마련하게 될 것이다.
이에, 본 발명자들은 필요로 하는 최소한의 유전자만을 조작하여, L-이소루신에 대한 고생성능을 갖는 변이미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, L-쓰레오닌 생성 미생물에서 L-이소루신 생합성에 관여하는 유전자를 변이시켜 L-이소루신에 의한 피드백저해를 제거하고, L-이소루신 생합성에 관여하는 유전자를 추가로 도입시켜 제조된 미생물이 야생형 균주에서는 생성되지 않았던 L-이소루신을 고효율로 생성한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 필요로 하는 최소한의 유전자만을 조작하여, L-이소루신에 대한 고생성능을 갖는 변이미생물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 L-이소루신에 대한 고생성능을 갖는 변이미생물 및 상기 변이미생물을 이용한 L-이소루신의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-쓰레오닌 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자를 변이시켜 L-이소루신에 의한 피드백저해를 제거하고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자 및 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자들을 추가로 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 L-쓰레오닌 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자가 변이되어 L-이소루신에 의한 피드백저해가 제거되고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자 또는 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들이 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 지노믹 DNA에서 lacI , lysA, metA , tdh 및 iclR 유전자들이 결실되어 있어 있고, L-쓰레오닌에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자인 thrA의 1034번째 염기 C가 T로 치환되고, L-라이신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자인 lysC 유전자의 1055번째 염기 C가 T로 치환되어 각각 피드백 저해가 제거되어있고, ppc 유전자 및 thrABC 오페론의 프로모터가 각각 tac 및 trc 프로모터로 교체되어 있는 L-쓰레오닌 고생성능을 가지는 대장균 TH20 균주에서, 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 ilvA 유전자의 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T가 각각 T, T, G 및 C로 치환된 변이유전자가 상동재조합으로 삽입되어 있고; 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C가 각각 A 및 T로 치환된 변이유전자가 벡터로 형질전환 되어 있으며; 상기 ilvA 변이 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환 되어 있고; thrABC 오페론, ygaZH 및 ilvCED 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환 되어 있는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양액으로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는 L-이소루신의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, L-이소루신 생성능이 낮은 균주를 이용하여 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물을 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 변이미생물을 이용하면 산업적으로 유용한 L-이소루신을 고효율로 생산할 수 있다.
도 1은 L-쓰레오닌 생산 균주, TH20의 대사회로 및 조절 메커니즘과 피드벡 저해 및 repression이 제거된 유전자들을 나타낸 것이며, thrABC 오페론이 삽입된 pBRThrABC 과발현벡터를 나타낸 것이다.
도 2은 대장균 야생균주 W3110와 L-쓰레오닌 생성 균주인 TH20을 바탕으로 L-이소루신 생성 미생물인 OJE 01의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 3은 L-이소루신 생성 미생물인 OJE 01 로부터 ilvCED 유전자가 추가로 증폭된 L-이소루신 생성 미생물 OJE 02의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 4은 L-이소루신 생성 미생물인 OJE 02 로부터 lrp 유전자가 추가로 증폭된 L-이소루신 생성 미생물 OJE 03의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 5는 L-이소루신 생산에 관한 대사회로 및 균주 내용을 나타낸 그림으로 피드백이 제거된 ilvA와 ilvIH 유전자를 증폭되었고, L-이소루신 생합성 경로에 해당하는 효소를 코딩하는 유전자들을 증폭하였으며 추가로 L-이소루신 엑스포터(exporter) 및 global regulator (Lrp) 증폭하였다.
도 6는 본 발명에서 사용한 pTac15k 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 7는 피드백이 제거된 쓰레오닌 디하이드로타아제 및 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자인 ilvA 유전자 및 ilvIH 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pTacilvAIH의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 8은 L-쓰레오닌 생산 오페론이 들어간 재조합 벡터 pBRThrABC 벡터에 ygaZH 유전자를 포함하는 pBRThrABCygaZH의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 9은 ilvCED 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pTacilvCED의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 10은 피드백이 제거된 쓰레오닌 디하이드로타아제 및 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자인 ilvA 유전자 및 ilvIH 유전자 및 ilvCED 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pTacilvAIHCED의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 11은 YgaZH 단백질이 L-이소루신의 엑스포터(exporter) 역할을 한다는 것을 밝히기 위해 L-이소루신 analog 인 DL-4-thiaisoleucine을 첨가한 R/2배지에 배양한 발효 그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 사용한 pmtrc9 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서 사용한 pKD46 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
일관 점에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자를 변이시켜 L-이소루신에 의한 피드백저해를 제거하고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자 또는 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자를 추가로 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소는 쓰레오닌 디하이드라타아제 또는 아세토하이드록시산 합성효소 III인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소인 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자 및 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자를 도입하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 추가로 도입되는 유전자는 아세토하이드록시산 이소머로리덕타아제를 코딩하는 유전자 및 다이하이드록시산 디하이드로타아제를 코딩하는 유전자 및 분지쇄아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L-쓰레오닌 생성 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자는 ilvA 유전자이고, 상기 ilvA 유전자의 변이는 ilvA 유전자의 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T를 각각 다른 염기로 치환한 것임을 특징으로 할 수 있다. (도 2 및 도 5)
본 발명의 일양태에서는, 상기 ilvA 유전자는 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T를 각각 T, T, G, C로 치환하였다.
본 발명에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자는 ilvH (acetohydroxy acid synthase isozyme III small subunit) 유전자 이고, 상기 ilvH 유전자의 변이는 ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C를 각각 다른 염기로 치환한 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 상기 ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C를 각각 A 및 T로 치환하였다.
본 발명에 있어서, 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 도입하는 것은 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자 를 강한 프로모터(strong promoter)를 가지는 발현벡터에 삽입하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 발현벡터는 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자 및 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자는 ilvH (acetohydroxy acid synthase isozyme III small subunit) 유전자 및 ilvI (acetohydroxy acid synthase isozyme III large subunit) 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 추가로 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자인 ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase)과 ilvE (branched chain amino acid aminotransferase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase) 및 상기 유전자가 치환된 ilvA (threonine dehydratase) 를 포함하는 ilvEDA 오페론을 추가로 증폭 및 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 상기 ilvC 유전자 및 ilvEDA 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 강한 프로모터(strong promoter) 로 치환하였다.
본 발명에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporter) 유전자의 역할을 하는 단백질을 추가로 확인하고 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 광역조절인자(global regulator)인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일양태에서, L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물은 대장균의 야생균주 W3110으로부터 유전자 조작을 통하여 제조된 L-쓰레오닌 생산균주 TH20 (대한민국 등록특허 제10-858913호 참조, Lee et al. Molecular systems biology, 3(149): 1-8, 2007)를 모균주로 하여 제작하였으며, L-이소루신을 생산하기 위해서는 L-쓰레오닌을 전구체로 사용해야 하므로 L-쓰레오닌 과량 생산 균주인 TH20(대한민국 등록특허 제10-858913호 참조)을 이용하였다. (도 1)
또한, 상기 제작된 L-쓰레오닌 미생물 변이 균주로부터 L-이소루신을 생산하기 위해 L-쓰레오닌 균주에 억제되어 있는 유전자 (ilvA)의 성능을 회복시키고, 상기 유전자(ilvA)를 추가로 선정하여 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T를 각각 T, T, G, C로 치환하여 피드백 제거시켜 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 미생물(OJE 01)를 도 2에 나타난 바와 같이 대장균의 L-쓰레오닌 변이균주 TH20으로부터 제작하였다.
또한, L-이소루신을 생산하기 위해 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자 중 하나인 ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C를 각각 A 및 T로 치환된 변이유전자가 벡터로 형질전환되어 있으며; 상기 ilvA 변이 유전자를 상기 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자가 벡터로 형질전환된 벡터에 추가로 증폭되었다. (도 7)
또한, 아미노산의 엑스포터(exporter)는 해당 아미노산의 생산에 필수적이며, 특히 L-이소루신의 경우 대장균이 기타 균주에 비해 charge율이 매우 낮기 때문에, 생산능력을 높이기 위해서는 엑스포터의 증폭이 요구된다. 그러나 현재까지 대장균의 L-이소루신 exporter가 아직 밝혀져 있지 않아서 L-이소루신 생산효율 향상에 한계가 있었다.
Nicole Kennerknecht 등은 Corynebacterium glutamicum에서 L-이소루신을 비롯한 분지쇄 아미노산의 엑스포터(exporter) 역할을 하는 단백질(BrnFE)을 보고하였다 (Nicole et al., J. Bacteriol ., 184:3947, 2002, US 6,841,360 B2). 또한, Ekaterina Alexsandrovna Tabolina 등은 상기 상동 단백질이 대장균에서도 L-발린의 엑스포터 역할을 하는 것을 보고하였다 (US Patent 2005/0239175)
본 발명자들은 상기 상동단백질에서 L-이소루신의 엑스포터 역할을 하는지 알아보기 위하여 YgaZH 단백질을 암호화하는 ygaZH 오페론을 증폭시킨 벡터인 pACYCygaZH (Park et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:7797-7802, 2007)를 대장균 W3110(ATCC 39936)에 형질전환시켰고, 대장균 야생균주 W3110 및 ygaZH 오페론을 결실시킨 대장균 균주 WygaZH를 L-이소루신의 analog 인 DL-4-thiaisoleucine이 첨가된 R/2 배지에 배양한 결과 L-이소루신의 엑스포터 역할을 확인하였다. (도 11)
상기 YgaZH 단백질이 L-이소루신의 엑스포터 역할을 한다는 결과로부터 L-이소루신 엑스포터를 본 발명에서 제조한 L-이소루신 생성 변이균주에 벡터로 형질전환하였다. 상기 YgaZH 단백질을 암호화하는 ygaZH 오페론을 thrABC 오페론이 삽입된 pBRThrABC 과발현벡터에 클로닝 하고, 상기 thrABC 오페론 및 ygaZH 오페론을 함유하는 벡터 (도 8)를 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 미생물(OJE 01+pTacilvAIH)에 도입할 경우, L-이소루신의 생성능이 월등히 증가하는 것을 확인했다.
본 발명자들은 추가로 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자인 ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase)과 ilvE (branched chain amino acid aminotransferase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase) 및 상기 유전자가 치환된 ilvA (threonine dehydratase) 를 포함한 ilvEDA 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 강한 프로모터(strong promoter) 로 치환하여 추가로 증폭 및 도입시켰다. (도 3)
또한 global regulator인 lrp 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 강한 프로모터(strong promoter)로 치환하여 추가로 증폭 또는 도입시켰다. (도 4)
다른 관점에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소 중 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자가 변이되어 L-이소루신에 의한 피드백저해가 제거되고, 상기 피드백 저해가 제거된 효소를 코딩하는 유전자 및 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자들을 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 지노믹 DNA에서 lacI, lysA , metA , tdh 및 iclR 유전자가 결실되어 있어 있고, L-쓰레오닌에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자인 thrA의 1034번째 염기 C가 T로 치환되고, L-라이신에 의해 피드백 저해를 받는 효소를 코딩하는 유전자인 lysC 유전자의 1055번째 염기 C가 T로 치환되어 각각 피드백 저해가 제거되어있고, ppc 유전자 및 thrABC 오페론의 프로모터가 각각 tac 및 trc 프로모터로 교체되어 있는 L-쓰레오닌 고생성능을 가지는 대장균 TH20 균주에서, 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 ilvA 유전자의 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 C, 1352번째 염기 T가 각각 T, T, G 및 C로 치환된 변이유전자가 상동재조합으로 삽입되어 있고; 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C가 각각 A 및 T로 치환된 변이유전자가 벡터로 형질전환되어 있으며; 상기 ilvIH 변이 유전자를 함유하는 벡터에 ilvA 변이 유전자를 추가로 벡터로 형질전환되어 있고; 상기 ilvA 변이 유전자가 삽입된 OJE 01 지노믹 DNA에서 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자인 ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase)과 ilvE (branched chain amino acid aminotransferase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase) 및 상기 유전자가 치환된 ilvA (threonine dehydratase) 를 포함한 ilvEDA 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 강한 프로모터(strong promoter)로 치환되었으며; thrABC 오페론 및 ygaZH 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환 되어 있는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 변이미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물의 배양액으로 부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는 L-이소루신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 배양액으로부터의 L-이소루신의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그라피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 대장균 W3110 유래의 L-이소루신 생성 미생물에 결실 대상 유전자를 도입하여, 분지쇄 아미노산 중, L-이소루신을 고농도로 제조하는 방법에 대하여 기재하였으나, 다른 대장균 및 미생물을 사용하여 동일 결실 대상 유전자를 도입하고, 이를 이용하여 L-이소루신을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 대장균 W3110으로부터 분리 및 정제된 ygaZH를 이용하여, 분지쇄 아미노산 중, L-이소루신의 엑스포터 유전자의 역할을 하는 단백질을 추가로 확인하고 ygaZH를 함유하는 벡터 제조방법에 대하여 기재하였으나, 다른 대장균을 사용하여 L-이소루신 엑스포터를 분리 및 정제하고, 이를 이용하여 L-이소루신을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 대장균 유래 L-이소루신 엑스포터(exporter) 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 대장균 W3110에 기반하여 제조된 L-이소루신 생성 미생물(OJE 01+pTacilvAIH)에 도입하여 형질전환 미생물을 제조하는 방법 및 L-이소루신을 수득하는 방법에 대하여만 기재하였으나, 본 발명의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 L-이소루신 생성능을 가지는 숙주세포에 도입하여 제조되는 형질전환된 미생물 및 이로부터 L-이소루신을 수득하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al ., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26:63, 2003; Lee et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 58:663, 2002; Lee et al ., Biotechnol . Lett., 25:111, 2003; Lee et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 54:23, 2000; Lee et al ., Biotechnol . Bioeng ., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: L- 이소루신 생성능이 향상된 변이 미생물의 제조
1-1: L-이소루신 고생성 미생물의 제작
1-1-1: ilvA의 피드백저해 제거
L-이소루신을 과량생산하는 균주를 제작하기 위하여 L-이소루신에 의한 피드백 저해를 받는 ilvA 유전자의 염기서열을 치환하였다.
먼저, L-쓰레오닌 생성능을 가지는 TH20 (대한민국 등록특허 제10-858913호 참조, Lee et al . , Molecular systems biology, 3: 1-8, 2007)의 지노믹 DNA에서 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자인 ilvA(서열번호 25)의 피드백 저해를 제거하기 위하여, ilvA의 1339번째 염기(C)와 1341번째 염기(G)를 각각 T로 치환하고(US7192753 참조), ilvA의 1351번째 염기(C)와 1352번째 염기(T)를 각각 G와 C로 치환하였다(Chinchilla et al., Journal of biologicla chemistry, 36:23219, 1998).
즉, 대장균 W3110 지노믹 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하고(Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989), 상기 분리된 대장균 W3110 지노믹 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍과 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 사용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다. 얻어진 2115bp의 PCR 절편을 BamHI 및 PstI 효소로 절단하고, 역시 BamHI 및 PstI 효소로 절단한 sacB 상동재조합(homologous recombination)용 벡터인 pSacHR06(Park et al . Proc . Nat . Acad . Sci . (PNAS), 104: 7797, 2007)에 삽입한 다음 pSacilvA*라고 명명하였고 이를 시퀀싱하여, ilvA의 1339번째 염기(G)와 1341번째 염기(G), 1351번째 염기(C) 및 1352번째 염기(T)가 각각 T, T, G 및 C로 치환되었음을 확인하였다.
ilvA1:5'-ATACGGATCCTGGTGACCTGATCGCTATCG-3'(서열번호 1)
ilvA2:5'-TGTTGGCGAAGCGCAGAAACGCGCCCGGTGATTCCGGGAATTCGAAGCTGTAGA-3'(서열번호 2)
ilvA3:5'-TCTACAGCTTCGAATTCCCGGAATCACCGGGCGCGTTTCT GCGCTTCGCCAACA -3'(서열번호 3)
ilvA4:5'-AGTCCTGCAGGTGGTTTCGACGCAATAAAA-3'(서열번호 4)
상기 제작된 pSacilvA*를 NheI 효소로 절단하여, 복제기점(replication origin)을 결실시킨 다음, self-ligation시키고, lacI 유전자 및 lysA , metA , tdh , iclR 유전자가 결실된 대장균 TH20(대한민국 등록특허 제10-858913호 참조, Lee et al. Molecular systems biology, 3:1, 2007)의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로, sacB positive selection (Wohlleben et al., J. Bacteriol ., 174:5462, 1992) 방법에 의해 L-이소루신에 대한 피드백 저해가 제거된 균주 OJE 01을 수득하였다 (도 2).
상기 대장균 TH20 균주는 락토오스 리프레서를 encoding하는 lacI 및 전사요소인 IclR이 제거된 균주로서, 대장균 유전자 내에 경쟁관계에 있는 L-라이신 합성경로에 관여하는 유전자인 lysA와 L-메티오닌 합성경로에 관여하는 유전자인 metA 및 L-글리신 합성경로에 관여하는 유전자인 tdh가 결실되어 있는 균주이다. 또한 L-쓰레오닌 합성경로를 구성하고 있는 효소들 중 aspartate kinase I를 발현시키는 thrA 유전자, aspartate kinase III를 발현시키는 lysC 유전자는 site-directed mutagenesis를 통해 L-이소루신에 의한 피드백 저해가 제거되어있고, phosphoenolpyruvate을 encoding하는 유전자인 ppc 유전자 및 thrABC 오페론의 프로모터는 각각 tac , trc 프로모터로 교체되어 있다. 그리고 L-쓰레오닌을 생산하기 위해서 thrABC 오페론이 증폭된 pBRThrABC 발현벡터(대한민국 등록특허 제10-858913호)를 도입한 균주이다 (도 1).
1-1-2: ilvH의 피드백저해 제거
Acetohydroxy acid synthase isozyme III의 L-이소루신에 대한 피드백 저해를 제거하기 위하여, 대장균 W3110(ATCC 39936)의 지노믹 DNA에서 acetohydroxy acid synthase isozyme III을 코딩하는 유전자인 ilvH(서열번호 26)의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)를 각각 A와 T로 치환하였다(US 6737255 참조).
즉, 대장균 W3110의 지노믹 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍과 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 5 및 서열번호 8의 프라이머쌍을 사용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다. 상기 방법으로 수득한 2439bp의 PCR 절편을 SacI 및 XbaI 효소로 절단하고, 역시 SacI 및 XbaI 효소로 절단한 pTac15k 벡터(KmR, p15A ori, PciI-and SphI-digested 2.5 kb fragment of pKK223-3 ligated with PciI-and SphI-digested 1.9 kb fragment of the pBR322, 4.0 kb, 도 6 참조)에 삽입하여, pTacilvIH*(*는 피드백저해가 제거되었음을 표시)를 제작하고, 이를 시퀀싱하여, ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)가 각각 A와 T로 치환되었음을 확인하였다.
ilvIH1:5'-AGTCGAGCTCAAATTGCTGTAAGTTGTGGG-3'(서열번호 5)
ilvIH2:5'-GGAAAAAAGGCCAATCACGCGGAATAACGCGTCTGATTCATTTTCGAGTAAG-3'(서열번호 6)
ilvIH3:5'-CTTACTCGAAAATGAATCAGACGCGTTATTCCGCGTGATTGGCCTTTTTTCC-3'(서열번호 7)
ilvIH4:5'-ACTGTCTAGAAGATCACTAGATCAACGCATTATTTTATCGC-3' (서열번호 8)
1-1-3: pTacilvAIH vector의 제작
상기 1-1-2에서 제작한 pTacilvIH 발현벡터를 SacI 효소로 절단하고, 1-1-1에서 제작한 OJE 01균주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머쌍을 이용하여 피드백 저해를 제거시킨 쓰레오닌 디하이드로타아제를 코딩하는 유전자인 ilvA를 PCR하여 얻어진 산물을 SacI으로 절단한 후, pTacilvIH에 삽입하여, 피드백저해가 제거된 ilvA 유전자, 피드백저해가 제거된 ilvH 유전자와 ilvI 유전자(acetohydroxy acid synthase isozyme III large subunit, 서열번호 27)를 함유하는 pTacilvAIH를 제작하였다 (도 7).
ilvAsac1: 5'-AGTCGAGCTCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3'(서열번호 9)
ilvAsac2: 5'-ACTGGAGCTCTCCCTAACCCGCCAAAAAGA-3'(서열번호 10)
1-1-4: L-이소루신 생성 미생물의 제작
상기 1-1-1에서 제작된 대장균 OJE 01에 상기 1-1-3에서 제작된 pTacilvAIH 벡터를 도입하여 L-이소루신 생성 미생물(OJE 01+pTacilvAIH)를 제작하였다.
실시예 2: L- 이소루신 생성 변이균주의 L- 이소루신의 생성능 측정
실시예 1에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물(OJE 01+pTacilvAIH)에 thrABC 오페론이 삽입되어 이는 벡터 pBRThrABC(대한민국 등록특허 제10-858913호)를 도입시키고, 엠피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin) 각 50㎍/ml, 40㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다.
상기 형질전환 균주 (OJE 01+pTacilvAIH+pBRThrABC) 를 5g/ℓ 글루코오스를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 2g KH2PO4, 2g MgSO4ㆍ7H2O, 15g (NH4)2SO4, 0.04g MnSO4ㆍ5H2O, 3g yeast extract, 0.2g L-lysine, 0.2g L-methionine, 1g betaine hydrochlroride, 0.1g nicotinic acid, 0.1g thiamine hydrochloride, 10ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다.
pH는 25%(v/v) NH4OH의 자동공급에 의해 6.0으로 유지시켰고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다.
상기 배지 중의 글루코오스를 글루코오스 분석기(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코오스가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-이소루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.
그 결과, W3110 야생균주에서 생산되지 않았던 L-이소루신이 표 1에 나타난 바와 같이 OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABC 균주에서는 0.322 g/L의 농도로 생성되었다.
Strain W3110 OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABC
L-이소루신 (g/ℓ) ND1 0.322
1 Not detected.
실시예 3: ygaZH 오페론이 도입된 L- 이소루신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조
L-이소루신의 엑스포터역할을 할 것으로 추정되는 YgaZH 단백질을 암호화하는 ygaZH 오페론을 증폭시킨 벡터인 pACYCygaZH (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7797-7802, 2007)를 대장균 W3110(ATCC 39936)에 형질전환시켰고, 대장균 야생균주 W3110 및 ygaZH 오페론을 결실시킨 대장균 균주 WygaZH를 L-이소루신의 analog인 DL-4-thiaisoleucine이 0mM, 0.1mM, 0.5mM, 1mM이 각각 첨가된 R/2 배지(증류수 1리터당 5g 글루코오스, 0.7g MgSO4ㆍ7H2O, 2g (NH4)2HPO4, 6.75g KH2PO4, 8.5g Citric acid, 5ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)에 배양한 결과 L-이소루신의 엑스포터 역할을 확인하였다. (도 11) 상기 YgaZH 단백질이 L-이소루신의 엑스포터 역할을 한다는 결과로부터 ygaZH 오페론을 ( ygaZ: 서열번호 28, ygaH :서열번호 29)이 도입된 L-이소루신 생성능을 가지는 변이미생물을 제조하였다. (도 8)
대장균 W3110(ATCC 39936)의 지노믹 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다(Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 상기 정제된 지노믹 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머쌍으로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.
ygaZH_up:5'-ATGCAAGCTTCTAATTTCAGCCTCAGCCTG-3'(서열번호 11)
ygaZH_do:5'-AGTCAAGCTTGAAAAATGATTCTTGTGGGT-3'(서열번호 12)
상기 증폭된 PCR 절편(ygaZH 유전자)을 HindIII로 절단하고, thrABC 오페론이 클로닝된 재조합 발현벡터 pBRThrABC(대한민국 등록특허 제0039971호)에 삽입하여, pBRThrABCygaZH를 제작하였다 (도 8).
실시예 1에서 제작된 L-이소루신 생성 미생물 OJE 01 + pTacilvAIH에, 상기pBRThrABCygaZH를 도입하여, 재조합 대장균 (OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH)을 제작하였다.
상기 제작된 L-이소루신 생성 대장균(OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH)를 엠피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin) 각 50㎍/ml, 40㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다.
상기 형질전환 균주 (OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH)를 5g/ℓ glucose를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 2g KH2PO4, 2g MgSO4ㆍ7H2O, 15g (NH4)2SO4, 0.04g MnSO4ㆍ5H2O, 3g yeast extract, 0.2g L-lysine, 0.2g L-methionine, 1g betaine hydrochlroride, 0.1g nicotinic acid, 0.1g thiamine hydrochloride, 10ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다.
pH는 25%(v/v) NH4OH의 자동공급기에 의해 6.0으로 유지시켰고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다. 상기 배지중의 글루코오스 농도를 글루코오스 분석기(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코오스가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하였다. 이로부터 생성되는 L-이소루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 OJE 01 +pTacilvAIH+pBRThrABC에 비해, 엑스포터(exporter)를 도입시킨 OJE 01 +pTacilvAIH+pBRThrABCygaZH의 경우, L-이소루신의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.
상기와 같은 결과로부터, ygaZH 유전자의 과발현이 L-이소루신의 생성능 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
Strain OJE 01 pTacilvAIH + pBRThrABC OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH
L-이소루신 (g/ℓ) 0.322 1.11
실시예 4: ilvCDE gene 이 도입된 L- 이소루신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조
실시예 1에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물(OJE 01 + pTacilvAIH)에 ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase)과 ilvE (branched chain amino acid aminotransferase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase)를 증폭시켜 상기 1-1-3에서 제작한 pTacilvAIH벡터에 ilvC , ilvE , ilvD를 각각 도입시켰다.
자세한 제조 방식은 상기 분리된 대장균 W3110 지노믹 DNA를 주형으로 하고, ilvED operon을 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 수득된 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고, 마찬가지로 SacI과 XbaI으로 절단한 pTac15k 벡터 (KmR, p15A or,PciI-and SphI-digested 2.5 kb fragment of pKK223-3 ligated with PciI-and SphI-digested 1.9 kb fragment of the pBR322, 4.0 kb, 도 6 참조)에 삽입하여 먼저 pTacilvED 벡터를 획득하였다. (도 9)
ilvCED3: 5'-AGTCGAGCTCAACCTTAGAACGTGTTTTAC-3' (서열번호 13)
ilvCED4: 5'-GCTATCTAGATTAACCCCCCAGTTTCGATT-3' (서열번호 14)
ilvC gene(acetohydroxy acid isomeroreductase)을 삽입하기 위해 W3110 균주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍을 이용하여 수득된 PCR 절편을 SacI으로 처리하였고, 상기 획득한 pTacilvED 벡터를 마찬가지로 SacI으로 자른 후, ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase)를 삽입하여 pTacilvCED 벡터를 획득하였다. (도 9)
ilvCED1: 5'-ATGCGAGCTCATGGCTAACTACTTCAATAC -3' (서열번호 15)
ilvCED2: 5'-TCATGAGCTCTTAACCCGCAACAGCAATAC -3' (서열번호 16)
상기 제작한 pTacilvCED 벡터를 주형으로 하여 서열번호 17번과 서열번호 18번을 이용하여 PCR 절편을 획득하였고, 이를 다시 XbaI 으로 절단시킨 후, 마찬가지로 XbaI으로 절단시킨 pTacilvAIH 벡터에 이 PCR 절편을 삽입하여 pTacilvAIHCED 벡터를 획득하였다. (도 10)
tac2CED_XbaI(up): 5'-GACTCTCTAGATCGGAAGCTGTGGTATGGCT-3'(서열번호 17)
tac2CED_XbaI(do): 5'-AATTTCTAGATCCGCCAAAACAGCCAAGCT-3'(서열번호 18)
실시예 5: L- 이소루신 생성 변이균주의 L- 이소루신의 생성능 측정
실시예 1과 3에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물(OJE+pBRygaZH)에 상기 pTacilvAIHCED 발현벡터를 도입시키고, 엠피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin) 각 50㎍/ml, 40㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다.
상기 형질전환 균주 (OJE 01 +pTacilvAIHCED + pBRThrABC) 를 5g/ℓ 글루코오스를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 2g KH2PO4ㆍ7H2O, 2g MgSO4ㆍ7H2O, 15g (NH4)2SO4, 0.04g MnSO4ㆍ5H2O, 3g yeast extract, 2mM L-lysine, 2mM L-methionine, 1g betaine hydrochlroride, 0.1g nicotinic acid, 0.1g thiamine hydrochloride, 10ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다.
pH는 25%(v/v) NH4OH의 자동공급에 의해 6.0으로 유지시켰고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다.
상기 배지 중의 글루코오스를 글루코오스 분석기(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코오스가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-이소루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.
그 결과, W3110 야생균주에서 생산되지 않았던 L-이소루신이 표 3에 나타난 바와 같이 OJE+ pTacilvAIHCED+pBRThrABC 균주에서는 0.159 g/L의 농도로 생성되었다.
Strain W3110 OJE 01 + pTacilvAIHCED + pBRygaZH
L-이소루신 (g/ℓ) ND1 0.159
1 Not detected.
실시예 6: ilvEDA 오페론과 ilvC 유전자가 증폭된 L- 이소루신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조
실시예 1의 1-1-1 에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물 OJE 01 (도 2) 에 L-이소루신 생합성에 관련된 효소들을 코딩하는 유전자인 ilvC (acetohydroxy acid isomeroreductase)과 ilvE (branched chain amino acid aminotransferase), ilvD (dihydroxy acid dehydratase) 및 상기 1-1-1에서 유전자가 치환된 ilvA (threonine dehydratase) 를 포함한 ilvEDA 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 강한 프로모터(strong promoter) 로 치환하여 추가로 증폭 및 도입시켰다.
자세한 제조 방식은 pmtrc9 벡터(lox66-CmR-lox71,4.7-kb, 도 12 참조)를 주형으로 하고, ilvEDA 오페론의 프로모터를 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍을 이용하여 수득된 PCR 절편을 pKD46 (ApR, lamda red recombinase expression plasmid, ara-inducible expression, temperature sensitive, 6.3kb, 도 13 참조)이 포함된 상기 제조된 OJE 01 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로 resistant marker (CmR)가 포함된 LB 평판배지를 이용하여 ilvEDA 오페론의 native promoter가 trc 프로모터로 교체된 것을 확인하였다.
EDA_trcf:5'-TTTCCACGTCTGCTCAATGAATATGGCCGCCGCCAGCGATGCACAAAATACGCGTCATACACATACGATT-3' (서열번호 19)
EDA_trcr:5'-CAGCGAACCATCTCCCCATTGAACCAAATGTAATCAGCTTTCTTCGTGGTCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3' (서열번호 20)
ilvC 유전자(acetohydroxy acid isomeroreductase)를 증폭하기 위해 상기 제조방식과 동일하게 pmtrc9 벡터(lox66-CmR-lox71,4.7-kb, 도 12 참조)를 주형으로 하고, ilvC 유전자의 프로모터를 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍을 이용하여 수득된 PCR 절편을 pKD46 (ApR, lamda red recombinase expression plasmid, ara-inducible expression, temperature sensitive, 6.3kb, 도 13 참조)이 포함된 상기 제조된 ilvEDA 오페론이 trc 프로모터로 교체된 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로 resistant marker (CmR)가 포함된 LB 평판배지를 이용하여 ilvC 유전자가 trc 프로모터로 교체된 것을 확인하여 대장균 OJE 02 균주를 제작하였다 (도 3) .
ilvC_trcf:5'-GCGGCTTTCCGCCAGATGCAGGAAGGTTTTCAGATCGCGTAAATCCACAGCGCGTCATACACATACGATT-3' (서열번호 21)
ilvC_trcr:5'-CCCAGCTGTGCCAGCTGCTGGCGCAGATTCAGTGTATTGAAGTAGTTAGCCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3' (서열번호 22)
실시예 7: L- 이소루신 생성 변이균주 OJE 02 균주의 L- 이소루신의 생성능 측정
실시예 4에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물(OJE 02) 에 상기 실시예 1과 3에서 제작한 pTacilvAIH 발현벡터와 pBRThrABCygaZH를 도입시키고, 엠피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin) 각 50㎍/ml, 40㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다.
상기 형질전환 균주 (OJE 02 + pTacilvAIH +pBRThrABCygaZH) 를 5g/ℓ 글루코오스를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 2g KH2PO4, 2g MgSO4ㆍ7H2O, 15g (NH4)2SO4, 0.04g MnSO4ㆍ5H2O, 3g yeast extract, 0.2g L-lysine, 0.2g L-methionine, 1g betaine hydrochlroride, 0.1g nicotinic acid, 0.1g thiamine hydrochloride, 10ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다.
pH는 25%(v/v) NH4OH의 자동공급에 의해 6.0으로 유지시켰고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다.
상기 배지 중의 글루코오스를 글루코오스 분석기(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코오스가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-이소루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.
그 결과, W3110 야생균주에서 생산되지 않았던 L-이소루신이 표 4에 나타난 바와 같이 OJE 02 + pTacilvAIH +pBRThrABCygaZH 균주에서는 2.11 g/L의 농도로 생성되었다.
Strain W3110 OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH OJE 02 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH
L-이소루신 (g/ℓ) ND1 1.11 2.11
1 Not detected.
실시예 8: Global regulator 가 증폭된 L- 이소루신 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조
실시예 4 에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물 OJE 02 (도 3) 에 대장균의 Global regulator인 lrp 유전자의 native promoter를 강한 프로모터(strong promoter) 롤 치환하여 추가로 증폭 및 도입시켜 L-이소루신 생성 변이미생물 OJE 03 (도 4)를 제작하였다.
자세한 제조 방식은 pmtrc9 벡터(lox66-CmR-lox71,4.7-kb, 도 12 참조)를 주형으로 하고, lrp 유전자의 프로모터를 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 쌍을 이용하여 수득된 PCR 절편을 pKD46 (ApR, lamda red recombinase expression plasmid, ara-inducible expression, temperature sensitive, 6.3kb, 도 13 참조)이 포함된 상기 제조된 OJE 02 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로 resistant marker (CmR)가 포함된 LB 평판배지를 이용하여 lrp 유전자의 프로모터가 trc 프로모터로 교체된 것을 확인하여 대장균 OJE 03 균주를 제작하였다. (도 4)
Lrp_1st:5'-GTTTTGCTTTGACAATCCCCTGGTGTTTTGCGAAAACATTCGAGGAAGAACGCGTCATACACATACGATT-3' (서열번호 23)
Lrp_2st:5'-TTACGATCGATACGGTCGAGATCTTTGCCAGGGCGCTTCTTGCTATCTACCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3' (서열번호 24)
실시예 9: L- 이소루신 생성 변이균주 OJE 03 균주의 L- 이소루신의 생성능 측정
실시예 8에서 제작한 L-이소루신 생성 변이미생물(OJE 03) 에 상기 실시예 1과 3에서 제작한 pTacilvAIH 발현벡터와 pBRThrABCygaZH를 도입시키고, 엠피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin) 각 50㎍/ml, 40㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다.
상기 형질전환 균주 (OJE 03 + pTacilvAIH +pBRThrABCygaZH) 를 5g/ℓ 글루코오스를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 2g KH2PO4, 2g MgSO4ㆍ7H2O, 15g (NH4)2SO4, 0.04g MnSO4ㆍ5H2O, 3g yeast extract, 0.2g L-lysine, 0.2g L-methionine, 1g betaine hydrochlroride, 0.1g nicotinic acid, 0.1g thiamine hydrochloride, 10ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다.
pH는 25%(v/v) NH4OH의 자동공급에 의해 6.0으로 유지시켰고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다.
상기 배지 중의 글루코오스를 글루코오스 분석기(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코오스가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-이소루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.
그 결과, W3110 야생균주에서 생산되지 않았던 L-이소루신이 표 4에 나타난 바와 같이 OJE 03+ pTacilvAIH +pBRThrABCygaZH 균주에서는 2.83 g/L의 농도로 생성되었다.
Strain W3110 OJE 01 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH OJE 02 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH OJE 03 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH
L-이소루신 (g/ℓ) ND1 1.11 2.11 2.83
1 Not detected.
실시예 10: Fed - batch 발효를 통한 L- 이소루신 생성 변이균주 OJE 03 균주의 L- 이소루신의 생성능 측정
실시예 9에서 L-이소루신 생성 변이미생물(OJE 03) + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH를 도입시켜 확인한 2.83 g/L 의 L-이소루신의 생산능을 증가시키고자 Fed-batch 발효하였다.
자세한 발효 방법은 상기 형질전환된 균주(OJE 03 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH)를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 2g KH2PO4, 2g MgSO4ㆍ7H2O, 15g (NH4)2SO4, 0.04g MnSO4ㆍ5H2O, 3g yeast extract, 0.2g L-lysine, 0.2g L-methionine, 1g betaine hydrochlroride, 0.1g nicotinic acid, 0.1g thiamine hydrochloride, 10ml trace metal element (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다.
초기 증류수 1리터당 20g 글루코오스가 고갈되어, pH가 올라가면, 증류수 1리터당 20g 글루코오스, 1g KH2PO4, 1mM L-lysine, 1mM L-methionine의 성분으로 구성된 feeding solution에 각각 0mM, 0.5 mM, 1mM pyruvate을 첨가하여 상기 전배양액에 각각 접종하여, 31℃에서 pyruvate feeding 여부에 따라 총 3번 배양하였다.
pH는 25%(v/v) NH4OH의 자동공급에 의해 6.0으로 유지시켰고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다.
상기 형질전환된 균주의 생장이 증가하지 않을 때까지 상기 배지 중의 글루코오스를 글루코오스 분석기(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코오스가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-이소루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.
그 결과, W3110 야생균주에서 생산되지 않았던 L-이소루신이 OJE 03+ pTacilvAIH +pBRThrABCygaZH 균주에서 표 6에 나타난 바와 같이 pyruvate feeding을 달리하여 Fed-batch 발효한 결과 pyruvate이 첨가되지 않았을 때 8.72 g/L, 1mM pyruvate 첨가시 8.95 g/L, 0.5mM pyruvate 첨가시 9.46 g/L 의 농도로 생성되었다.
pyruvate feeding 여부 No pyruvate 1mM pyruvate 0.5mM pyruvate
Strain OJE 03 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH OJE 03 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH OJE 03 + pTacilvAIH + pBRThrABCygaZH
L-이소루신 (g/ℓ) 8.72 8.95 9.46
1 Not detected.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (41)

  1. L-쓰레오닌 생성능을 가지는 박테리아에서, 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA) 또는 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III를 코딩하는 유전자(ilvIH)를 변이시켜 L-이소루신에 의한 피드백 저해를 제거하고, 피드백 저해가 제거된 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA) 및 피드백 저해가 제거된 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III을 코딩하는 유전자(ilvIH)로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 하나 이상 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA)의 변이는 ilvA 유전자의 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T를 각각 다른 염기로 치환한 것임을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III를 코딩하는 유전자(ilvIH)의 변이는 ilvIH 오페론에서, ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C를 각각 다른 염기로 치환한 것임을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 피드백 저해가 제거된 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA) 및 피드백 저해가 제거된 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III을 코딩하는 유전자(ilvIH)로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 하나 이상 도입하는 것은 강한 프로모터(strong promoter)를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III를 코딩하는 유전자(ilvIH)는 ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III small subunit) 유전자 및 ilvI(acetohydroxy acid synthase isozyme III large subunit) 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporter) 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 아세토하이드록시산 이소머로리덕타아제를 코딩하는 유전자, 디하이드록시산 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자 및 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 아세토하이드록시산 이소머로리덕타아제를 코딩하는 유전자는 ilvC 유전자이고, 디하이드록시산 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자는 ilvD 유전자이며, 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자는 ilvE 유전자인 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 디하이드록시산 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자 및 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자는 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자와 오페론 형태로 도입되며, 상기 오페론의 프로모터를 강한 프로모터(strong promoter)로 치환하는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 오페론은 ilvEDA오페론이고, 상기 강한 프로모터(strong promoter)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  17. 제12항에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporter) 유전자는 ygaZH인 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporer)를 코딩하는 유전자의 프로모터를 강한 프로모터(strong promoter)로 치환하는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  19. 제1항에 있어서, 광역조절인자(global regulator)인 lrp 유전자의 프로모터를 강한 프로모터(strong promoter)로 치환하는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 강한 프로모터(strong promoter)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아의 제조방법.
  21. L-쓰레오닌 생성능을 가지는 박테리아에서, 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA) 또는 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III를 코딩하는 유전자(ilvIH)가 변이되어 L-이소루신에 의한 피드백 저해가 제거되고, 피드백 저해가 제거된 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA) 및 피드백 저해가 제거된 아세토하이드록시산 합성효소 이소자임 III을 코딩하는 유전자(ilvIH)로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 하나 이상 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제21항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  26. 제25에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  27. 제21항에 있어서, 상기 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA)의 변이는 ilvA 유전자의 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T가 각각 다른 염기로 치환된 것임을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  28. 제21항에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자(ilvIH)의 변이는 ilvIH 오페론에서, ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C가 각각 다른 염기로 치환된 것임을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  29. 제21항에 있어서, 상기 피드백 저해가 제거된 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자(ilvA) 및 피드백 저해가 제거된 아세토하이드록시산 합성효소 III을 코딩하는 유전자(ilvIH)로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 하나 이상 도입되어 있는 것은 강한 프로모터(strong promoter)를 함유하는 발현벡터 형태로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  30. 삭제
  31. 제21항에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소 III를 코딩하는 유전자(ilvIH)는 ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III small subunit) 유전자 및 ilvI(acetohydroxy acid synthase isozyme III large subunit) 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  32. 제21항에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporter) 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  33. 제21항에 있어서, 아세토하이드록시산 이소머로리덕타아제를 코딩하는 유전자, 디하이드록시산 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자 및 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  34. 제33항에 있어서, 아세토하이드록시산 이소머로리덕타아제를 코딩하는 유전자는 ilvC 유전자이고, 디하이드록시산 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자는 ilvD 유전자이며, 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자는 ilvE 유전자인 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  35. 제33항에 있어서, 상기 디하이드록시산 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자 및 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자는 쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자와 오페론 형태로 도입되어 있으며, 상기 오페론의 프로모터가 강한 프로모터(strong promoter)로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  36. 제35항에 있어서, 상기 오페론은 ilvEDA오페론이고, 상기 강한 프로모터(strong promoter)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  37. 제32항에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporter) 유전자는 ygaZH인 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  38. 제37항에 있어서, L-이소루신의 엑스포터(exporer)를 코딩하는 유전자의 프로모터가 강한 프로모터(strong promoter)로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  39. 제21항에 있어서, 광역조절인자(global regulator)인 lrp 유전자의 프로모터가 강한 프로모터(strong promoter)로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이 박테리아.
  40. 대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 지노믹 DNA에서 lysA , metA , tdh 및 iclR이 결실되어 있어 있고, thrA , lysC의 피드백 저해가 제거되어있고, ppc 유전자 및 thrABC 오페론의 프로모터가 각각 tac 및 trc 프로모터로 교체되어 있는 L-쓰레오닌 고생성능을 가지는 대장균 TH20 균주에서,
    대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 ilvA 유전자의 1339번째 염기 C, 1341번째 염기 G, 1351번째 염기 C, 1352번째 염기 T가 각각 T, T, G 및 C로 치환된 변이유전자가 상동재조합으로 삽입되어 있고;
    대장균 W3110균주(ATCC 39936)의 ilvH 유전자의 41번째 염기 G 및 50번째 염기 C가 각각 A 및 T로 치환된 변이유전자가 벡터로 형질전환되어 있으며;
    상기 ilvA 변이 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되어 있고;
    thrABC 오페론 및 ygaZH 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되어 있고;
    ilvC 유전자의 프로모터가 강한 프로모터(strong promoter)로 삽입되어 있고;
    ilvE , ilvD , ilvA(피드백 저해가 제거된 쓰레오닌 디하이드라타아제 코딩) 유전자가 포함된 ilvEDA 오페론의 프로모터가 강한 프로모터(strong promoter)로 치환되어 있는 L-이소루신 고생성능을 가지는 변이미생물.
  41. 제21항, 제25항 내지 제29항, 제31항 내지 제39항중 어느 한 항의 변이 박테리아를 배양하는 단계; 및 상기 변이 박테리아의 배양액으로 부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는 L-이소루신의 제조방법.
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