KR100859088B1 - Ｌ-쓰레오닌 생산 변이주 및 이를 이용한 ｌ-쓰레오닌생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌(L-Threonine)의 생산능을 향상시킨 형질전환 미생물에 관한 것으로, 구체적으로는 아라비노스(arabinose)의 수송과 세포내 대사의 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 아라비노스 또는 크실로스(xylose) 등의 5탄당(pentose)을 탄소원으로 사용하여 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환된 미생물은 L-쓰레오닌을 고수율로 생산할 수 있어, 인간 의약 및 약학산업, 사료산업, 특히 동물 사료에 유용하게 사용할 수 있다.

쓰레오닌, 대장균, 아라비노스 (arabinose), 크실로스 (xylose), araC

Description

Ｌ-쓰레오닌 생산 변이주 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법 {A Modified Microorganism Producing L-Threonine and A Method for Producing L-Threonine Using thereof}

도 1은 본 발명에 따른 재조합 벡터 pCL-P_aroF-araC의 제작과정이다.

본 발명은 L-쓰레오닌 생산성이 향상된 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 구체적으로는 아라비노스의 수송과 대사의 조절을 담당하는 유전자의 활성을 증가시켜 아라비노스 또는 크실로스 등의 오탄당을 탄소원으로 사용하여 L-쓰레오닌 생산 효율을 증가시킨 L-쓰레오닌 생산 미생물에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로서 널리 사용되며 의약용으로 수액제 및 의약품의 합성 원료로도 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 동물성 단백질에는 부족하지 않으나 식물성 단백질에는 적게 들어 있어 채식 위주의 식습관을 가진 동물에게 부족되기 쉽다. L-쓰레오닌은 달걀에 들어 있는 단백질 의 5.3%, 우유 속에 들어 있는 단백질의 4%를 차지하며, 카세인(casein) 등의 단백질에 인산 에스테르 형태로도 존재한다. 효모 및 세균에서는, 아스파르트산(aspartic acid)에서 호모세린(homoserine)을 거치거나 글리신(Glycine)에 쓰레오닌 알돌라아제(threonine aldolase)가 작용하여 합성되며, 대사(代謝)되어서 글리신, α-케토부틸산(α?ketobutylic acid), 2-아미노아세토아세트산(2-aminoacetoacetic acid) 등이 된다.

L-쓰레오닌은 주로 인공변이법 또는 유전자 재조합 방법을 이용하여 개발된 대장균 또는 코리네형 세균(Corynebacterium)을 이용한 발효법으로 생산된다. 인공변이주에 관한 공지기술로는 대장균 속(Escherichia coli species)에 속하고, 디아미노피메르산 및 메티오닌(methionine) 요구성을 가지며, 그의 생합성계가 쓰레오닌의 피드백 저해작용(feedback inhibition)을 저지하는 미생물을 이용하는 방법(일본 특허공고 제10037/81호)이 있다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)에 속하며 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(S-(2-aminoethyl)-L-cysteine) 및 α-아미노-β-히드록시발레릭산(α-amino-β-hydroxyvalerate) 내성을 지니며 메티오닌 요구성을 특징으로 하는 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법이 공지되어 있다(Kangogaku Zasshi, et al, Agric. Biol. Chem., 36:1611, 1972).

유전자 재조합 균주를 이용한 발효법으로는, 예를 들면, 아스파르토키나아제(aspartokinase), 호모세린디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase), 호모세린 키나아제(homoserine kinase) 및 쓰레오닌 신타아제(threonine synthase)를 코딩하는 유전자 함유 쓰레오닌 오페론(operon)을 포함하는 DNA 단편이 플라스미드로 증폭된 재조합 대장균을 사용한 L-쓰레오닌 제조방법(일본 공개특허공보 제05-227977), 대장균 유래 쓰레오닌 오페론을 쓰레오닌 생산 균주인 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)에서 증폭하는 방법(TURBA E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:2269~2271, 1989) 등이 있다.

일본 공개특허평 제2-219582호에는 프로비덴시아(Providencia) 속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레르산, L-메티오닌, 티아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시티아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법이 기술되어 있으며, 한국특허공개 제1992-0012423호에는 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 속하는 미생물에 대하여 기술되어 있다.

상기와 같은, L-쓰레오닌을 생산하는 종래의 방법들은 무작위로 유전자를 변형시켜 유효한 미생물을 선별하는 것이었다. 하지만, 대장균 등의 전체 염색체 서열이 확인되고, 이후 다양한 생물 정보학 자료들이 축적되면서 이전까지 알지 못하였던 유전자들의 기능에 관한 연구가 가능해졌다. 주로 생합성 경로에 직접적으로 관여하는 효소들의 발현을 강화하여 높은 생산 수율로 아미노산을 생산할 수 있는 미생물이 다수 개발되고 있다. 하지만, 최근에는 포도당과 같은 탄소원의 가격이 상승하면서 아라비노스 또는 크실로스 등과 같은 저가의 오탄당을 이용하여 아미노산 생산능을 갖는 균주의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자는 L-쓰레오닌 생산성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대장균 내에서 아라비노스의 수송과 대사를 조절하는 전사 조절자(transcriptional regulator)로 알려진 araC의 발현량을 증가시키면 아라비노스 또는 크실로스 등의 오탄당을 탄소원으로 사용하여 L-쓰레오닌 생산성이 증가한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 세포내에서 아라비노스의 대사를 조절하는 유전자의 발현을 증가시켜 아라비노스 또는 크실로스 등의 오탄당을 탄소원으로 사용하여 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로 아라비노스의 수송 및 대사 조절을 담당하는 araC 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환되어 5탄당을 탄소원으로하여 L-쓰레오닌을 생산하는 능력이 증가된 미생물을 제공한다.

아라비노스는 5탄당 단당류(pentose monosaccharide)로, 박테리아의 ara 오페론의 탄소원으로 사용된다. araC 단백질은 ara 오페론의 프로모터 부분에서 특이적인 DNA 서열과 상호작용을 하여 아라비노스의 수송과 대사 오페론의 전사를 조절한다. 상기 프로모터에는 araFGH, araBAD, araJ 등이 있으며, 아라비노스 수송에 관여하는 효소들은 araB(L-ribulokinase), araA(L-arabinose isomerase) 및 araD(L-ribulose phosphate-4-epimerase) 등이 있다. 바람직하게 상기 araC 단백질을 발현하는 유전자는 서열번호 5로 표시될 수 있다.

본 발명에서는 대상이 되는 araC 유전자의 발현을 증가시키기 위해 유전자를 다복제수의 벡터를 이용하여 숙주세포로 도입하여 발현량을 증가시킬 수 있다. 통 상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 바람직하게는, 에세리키아(Escherichia) 속의 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는 카피 수가 적은 pCL1920 플라스미드 벡터(Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 재조합 벡터는 공지된 통상의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 프로모터와 터미네이터가 있는 적절한 벡터에 SmaI, HindIII 등의 제한효소 및 DNA 리가아제를 사용하여 상기 araC 유전자를 라이게이션 (ligation) 시킴으로써 제조할 수 있다. 발현을 위한 프로모터로는 trc, tac, lac 등이나 대장균 aroF 유전자의 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 또한 효과적인 발현을 위하여 터미네이터를 사용할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 실시예에서는, L-쓰레오닌 생산 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 PCR에 의해araC 유전자의 ORF 부위를 증폭하였다. araC 유전자의 과발현을 위한 재조합 벡터의 제작을 위해, pCL1920과 E.coli W3110을 주형으로 하여 각각 aroF 유전자의 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, 얻어진 araC 유전자의 염기서열을 통상적인 시퀀싱 방법에 의해 분석하였으며, 상기 수득한 프로모터 부위, 터미네이터 부위 및 araC 유전 자를 적합한 플라스미드 또는 기타 클로닝 벡터 내로 클로닝하여 적절한 적격세포(competent cell)에 형질전환하여 그로부터 재조합 벡터 pCL-ParoF를 제조하였다(도 1).

상기 재조합 벡터의 제조방법에 있어서, 클로닝 벡터는 원핵 또는 진핵세포에서 발현 가능한 임의의 벡터를 사용할 수 있으며, 본원 발명의 구체적 실시예에서는, 플라스미드 pCL1920 (Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631)을 사용하였다.

또한, 상기 L-쓰레오닌 생산 균주는 원핵 및 진핵을 포함한 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 모든 미생물일 수 있으며, 천연 미생물 뿐만 아니라, L-쓰레오닌 생산용 변이 미생물도 포함할 수 있다.

바람직하게는 엔테로박테라아시애 (Enterbacteriacea) 과에 속하는 세균으로 구성될 수 있으며, 보다 바람직하게는 L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성을 가진 에세리키아(Esherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속 및 프로비덴시아(Providencia) 속 세균으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성을 가진 대장균 TF5015(메티오닌 요구성, 아이소루이신 리키형, α-아미노-β-히드록시발레르산 내성, 2-아미노에틸-l-시스테인 내성, l-아제티딘-2-카르복시산 내성)를 사용할 수 있다. 상기 L-쓰레오닌 유사체는, 예를 들면, α-아미노-β-히드록시 발레릭산 및 D,L-쓰레오닌 히드록사메이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서는 상기 재조합 벡터 pCL-P_aroF-araC 를, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성을 가지며 L- 쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균 TF5015 (Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451) 에 도입하여 형질전환시킨 미생물 “CO01-0020”을 제조하였으며, 이를 2006년 12 월 15일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism, 이하 "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM 10827P로서 기탁하였다.

상기 형질전환체는 임의의 형질전환 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 실시예에서는, 전기천공법을 이용하여 상기 재조합 벡터 pCL-P_aroF-araC를 숙 주미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 제조하였고, 상기 미생물은 항생제 내성을 이용하여 균주를 분리할 수 있다.

상기 본 발명에 따라 제조된 형질전환된 미생물의 L-쓰레오닌 생성능을 더욱 증대시키기 위해, 통상적인 유전자 재조합 기술에 의해 상기 형질전환된 미생물의 염색체에 존재하는 araC 유전자를 발현(expression)시키거나 결손(deletion)시키는 방법을 추가로 수행할 수 있으며, 이들의 유전자 염기서열은 형광물질을 활용한 시퀀싱 방법에 의해서 분석될 수 있음은 본 발명의 기술분야에서 공지된 사실일 것이다.

본 발명의 방법으로 형질전환된 CO01-0020균주는 L-쓰레오닌의 생산 균주인 대장균 W3110의 염색체로부터 PCR을 통해 수득한 ara 오페론에서 아라비노스의 수송과 대사를 조절하는 단백질을 코딩하는 araC 유전자를 벡터에 삽입한 후, L-쓰레오닌 대장균 TF5015에 도입함으로써 araC 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환 미생물이다. 본 발명에 의한 방법으로 형질전환된 상기 CO01-0020균주는 araC 유전자의 과발현을 통해 L-쓰레오닌을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 미생물은 아라비노스의 수송 및 대사의 조절을 담당하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 통상의 방법으로 형질전환시킨 미생물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 서열번호 5의 araC 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 상기 재조합 벡터로 대장균 TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)를 형질전환시켜 수득된 대장균 일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 바람직한 실시예에 의하여 생산한 상기 대장균을 CO01-0020로 명명하고 기탁번호 KCCM 10827P로 기탁하였다.

상기와 같은 L-쓰레오닌 생성용 재조합 미생물은 대장균 내의 araC 유전자의 발현양을 증가시킴으로써 탄소원으로 아라비노스 또는 크실로스 등의 오탄당을 사용하여 L-쓰레오닌의 생산 농도가 변이 전의 L-쓰레오닌 생산 농도보다 증가함으로써 L-쓰레오닌을 고농도로 생산할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로, 상기 L-쓰레오닌 생산능력이 향상된 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 대량 생산하기 위해 그 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 목적하는 L-쓰레오닌을 분리하는 모든 공정은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에서, 상기 형질전환된 미생물의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예로는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.

구체적인 일 양태로, 본 발명의 L-쓰레오닌을 생산하는 방법은 (a) araC유전자의 발현에 필요한 프로모터를 벡터 pCL1920에 삽입하여 재조합 벡터 pCL-P_aroF를 제작하고, araC 유전자를 pCL-P_aroF 벡터에 삽입하여 재조합벡터 pCL-P_aroF-araC 를 제조하는 단계; (d) 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 5탄당을 탄소원으로 하여 배양하는 단계; (e) 배지 또는 미생물 내에 L-쓰레오닌을 농축하는 단계; 및 (f) 농축산물 중에 남아 있는 L-쓰레오닌과 임의의 발효 배지 및/또는 바이오매스의 성분 전체 또는 이들의 일부 (≥0 내지 100)를 단리하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다. 바람직하게, 상기 형질전환된 미생물이 기탁번호 KCCM 10827P 일 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 일반적으로 미생물 배양에 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당(glucose), 과당(fructose), 자당(sucrose), 유당(lactose), 맥아당(maltose), 전분(starch) 및 셀룰로스(cellulose)와 같은 탄수화물(carbohydrate), 대두유(Soybean Oil), 해바라기유(Regular sunflower oil), 피마자유(castor oil), 코코넛유(coconut oil)와 같은 지방, 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(Stearic acid) 및 리놀레산(Linoleic acid)과 같은 지방산, 글리세롤(glycerol) 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산(organic acids) 등이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명에서 바람직하게는, 상기 미생물을 배양함에 있어서 사용되는 탄소원은 5탄당이고, 보다 바람직하게, 상기 5탄당은 아리비노스 또는 크실로스일 수 있다.

5탄당은 펜토오스(pentose)라고도 하며, 화학식 C5H10O5?알데히드기를 가진 알도펜토오스(aldopentose)로서는 리보오스(ribose)·아라비노오스(arabinose) ·크실로오스(xylose)가 있고, 케토펜토오스(ketopentose)에는 크실로오스(xylose) ·리블로오스(ribulose) 등이 있다. 천연으로 동식물계에 널리 분포하는 것은 D-리보오스·D, L-아라비노오스·D-크실로오스 등이다. 이것들은 무기산과 가열하면 푸르푸랄(furfural)을 생성한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 본발명의 미생물의 배양배지에서 아라비노스와 크실로스를 탄소원으로 사용하여 L-쓰레오닌 생산능이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명에서 미생물 배양배지에 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효 모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액 (CSL: corn steep liquor) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소(urea, CO(NH₂)₂), 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH₄)₂SO₄), 염화암모늄(ammonium chloride, NH₄Cl), 인산암모늄(ammonium phosphate, (NH₄)₂HPO₄), 탄산암모늄(ammonium carbonate, (NH₄)₂CO₃) 및 질산암모늄(ammonium nitrate, NH₄NO₃)과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원(phosphorus source)으로서, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 및 대응되는 소듐(Na)-함유 염(salt)이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양기간은 원하는 L-쓰레오닌의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 L-쓰레오닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

상기한 바와 같은 본 발명에서는 아라비노스의 수송과 대사 조절을 담당하는 araC 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환 미생물을 5탄당을 탄소원으로 배양하여 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미생물을 이용하는 경우 저가의 5탄당을 탄소원으로 하여 높은 효율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있다

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : araC 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조

대장균의 araC 유전자의 발현량 증가에 따른 L-쓰레오닌 생산능의 향상을 확인하기 위하여 araC 유전자를 대장균에서 다복제수를 갖는 플라즈미드를 이용하여 과다 발현시켰다.

(1) aroF 프로모터의 클로닝 및 pCL-P_aroF 벡터제작

araC 발현에 필요한 프로모터를 벡터인 플라즈미드 pCL1920에 삽입하였다. 대장균의 염색체에 존재하는 aroF 유전자의 프로모터를 이용하기 위하여 각각 프라이머 1(서열번호 1) 및 프라이머 2 (서열번호 2)를 제작하였다.

대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA (Blattner, F. R., Plunkett, G 3rd, Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley. M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., Shao, Y. (1997), The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, Science, 277(5331), 1453-74.)를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=95℃, 30초/어닐링=53℃, 30초/중합=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 700 쌍의 aroF 유전자의 프로모터 부분을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI 과 EcoRV의 제한 효소로 절단하고 동일한 제한 효소로 절단된 pCL1920 플라즈미드를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하여 pCL-P_aroF를 제작하였다.

(2) araC 유전자의 클로닝

대장균 W3110으로부터 araC 를 클로닝하기 위하여 각각 프라이머 3(서열번호 3) 및 프라이머 4(서열번호 4) 를 제작하였다. araC 유전자 (NCBI GI_16128058)의 염기 서열은 이미 문헌에 보고되어 있다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=95℃, 30초/어닐링=53℃, 30초/중합=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 880 염기쌍의 araC 유전자(서열번호 5)를 증폭하였다.

(3) 재조합 벡터 pCL-P_aroF-araC 의 제조

수득된 araC DNA 단편을 SmaI 과 HindIII의 제한 효소로 절단하고 상기 DNA 단편과 EcoRV 및 HindIII 제한 효소로 절단된 pCL-P_aroF 플라즈미드를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하여 도 1과 같은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-araC를 제조하였다.

실시예 2 : 아라비노스로부터 araC 유전자가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 재조합 벡터(pCL-P_aroF-araC)로 쓰레오닌 생산능 대장균 (Escherichia coli) TF5015 (Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451) 를 전기충격법(electro-transformation)을 이용하여 형질전환시켰다. 구체적으로, TF5015를 LB 배지에서 초기 대수증식기까지 배양한 후 di-H₂O와 10% 글리세롤로 세척하고, 최소한 부피의 10% 글리세롤에 현탁시켜 형질 전환을 위한 전기적 적격 세포(electro-competent cell)를 제작하였다. 제작된 전기적 적격 세포(electro-competent cell)에 벡터(pCL-P_aroF-araC)를 넣고 유전자-펄서(gene-pulser)를 이용하여 형질전환시키고, 이 형질전환체 TF5015 pCL-P_aroF-araC를 CO01-0020라고 명명하였다. 아라비노스를 탄소원으로 사용하여 CO01-0020를 표 1에 나타낸 바와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 1: 아라비노스를 탄소원으로 사용한 플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
아라비노스	70
효모 추출물	2
황산 암모늄	28
황산 마그네슘	0.5
황산 제1철	0.005
황산 망간	0.005
L-메티오닌	0.15
탄산칼슘	30
인산 이수소칼륨	1

그 결과, 표 2와 같이 역가를 측정한 형질전환체(CO01-0020)의 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 11% 증가한 것을 확인하였다.

표 2: 아라비노스로부터 생산된 L-쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	7
CO01-0020	7.8

또한 표 3에 나타낸 바와 같이 탄소원으로 크실로스 70 g/L를 사용한 조건만 다르게 하고 다른 배지 조성물은 상기 표 1과 같은 조건으로 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, CO01-0020에서 얻어진 쓰레오닌 농도와 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 3: 크실로스를 탄소원으로 사용한 플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
크실로스	70
효모 추출물	2
황산 암모늄	28
황산 마그네슘	0.5
황산 제1철	0.005
황산 망간	0.005
L-메티오닌	0.15
탄산칼슘	30
인산 이수소칼륨	1

그 결과, 표 4와 같이 역가를 측정한 형질전환체 CO01-0020의 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 20.4% 증가한 것이 확인되었다.

표 4: 크실로스로부터 생산된 L-쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	10.3
CO01-0020	12.4

본 발명자들은 상기 실시예에서 제작된 대장균 CO01-0020를 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2006년 12월 15일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM 10827P).

아라비노스의 수송과 대사 조절을 담당하는 araC 유전자의 발현을 증가시킨 본 발명의 형질전환 미생물은 아라비노스 또는 크실로스와 같은 오탄당을 탄소원으로 사용하는 경우 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가된다. 따라서, 본 발명의 미생물을 이용하는 경우 저가의 5탄당을 탄소원으로 하여 높은 효율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있다

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.　　 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CJ Corporation <120> A Modified Microorganism Producing L-Threonine and A Method for Producing L-Thereonine Using thereof <130> PA9612-969KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1- A forward primer for PCR of aroF gene promoter <400> 1 cggggtacct gctggtcaag gttggcgcgt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 - A backward primer for PCR of aroF gene promoter <400> 2 ccggatatcg atcctgttta tgctcgtttg 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 - A forward primer for PCR of araC gene <400> 3 gggcccggga tggctgaagc gcaaaatga 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 - A backward primer for PCR of araC gene <400> 4 gggaagcttt tatgacaact tgacggcta 29 <210> 5 <211> 879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a sequence of araC gene <400> 5 atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaacgc ccatctggtg 60 gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120 ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180 ggacgagaat ttgtctgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat 240 cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300 cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac gggtttcttt 360 cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420 gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480 ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540 gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600 gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660 attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgcattagtc aggcgaagct gcttttgagc 720 actacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780 ttctcgcgag tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagtttcg tgccggttgt 840 gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879

Claims (6)

1. araC 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환되어 5탄당을 탄소원으로 하여 L-쓰레오닌을 생산하는 능력이 증가된 대장균.
2. 제1항에 있어서, 상기 대장균은 CO01-0020 (기탁번호 KCCM 10827P)인 대장균.
3. 제1항에 있어서, 상기 araC 유전자는 서열번호 5인 서열로 구성되는 대장균.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 생산 방법.
5. 제4항에 있어서, 대장균을 배양함에 있어서 탄소원으로 5탄당을 사용하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 5탄당은 아라비노스 또는 크실로스인 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산 방법.

Images