CN116802283A - 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组氨酸导致的反馈抑制得到减少的大肠杆菌hisG来源的ATP‑磷酸核糖基转移酶的变体及表达该变体的菌株，即使在高组氨酸浓度下也维持活性，因此可以增加组氨酸的生产。

Description

组氨酸导致的反馈抑制得到减少的ATP-PRT变体及表达该变 体的组氨酸生产菌株
技术领域
本发明涉及组氨酸导致的反馈抑制得到减少的ATP-PRT变体及表达该变体的组氨酸生产菌株。
背景技术
ATP-磷酸核糖基转移酶(ATP-phosphoribsyltransferase，以下可以称为ATP-PRT)在细菌、真菌或植物中催化组氨酸的生物合成的第一步。
在存在一定浓度以上的L-组氨酸的环境下，ATP-磷酸核糖基转移酶(ATP-phosphoribsyltransferase)的活性因组氨酸而受到反馈抑制，因此难以将组氨酸生产量增加到一定水平以上。
因此，为了增加微生物的组氨酸生产量，需要组氨酸抗性得到增加的ATP-PRT变体。但是，没有已知的可以减少大肠杆菌的hisG基因中表达的ATP-PRT的组氨酸反馈抑制的变体。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)韩国公开公报第10-2017-0098205号(2017.08.02)
发明内容
根据一具体例，提供一种组氨酸导致的反馈抑制得到减少的ATP-磷酸核糖基转移酶变体。
在一个方式中，提供一种ATP-磷酸核糖基转移酶变体，是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的，其中，位于第252号的苏氨酸被置换为丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。
上述SEQ ID NO:1的氨基酸序列是由大肠杆菌的野生型hisG表达的ATP-磷酸核糖基转移酶的序列。ATP-磷酸核糖基转移酶可以称为ATP-PRT。ATP-PRT催化组氨酸生物合成的第一步即
的反应。在本申请中，上述ATP-磷酸核糖基转移酶可以与“hisG”混用。
根据一具体例，上述ATP-磷酸核糖基转移酶可以是由大肠杆菌(E.coli)的hisG基因表达的。
根据一具体例，上述变体可以减少组氨酸导致的反馈抑制。根据一实施例，导入了包含T252A或T252L突变的ATP-PRT的菌株与野生型相比，组氨酸生产量增加。
根据一具体例，上述变体还可以包含以下置换中的一种以上：(a)位于第232号的组氨酸(histidine，H)被置换为赖氨酸(lysine，K)或苏氨酸(threonine，T)；(b)位于第250号的精氨酸被置换为组氨酸；(c)位于第271号的谷氨酸被置换为赖氨酸；(d)位于第288号的丝氨酸被置换为脯氨酸。根据一实施例，确认了除了第252号苏氨酸突变以外还包含上述(a)至(d)的突变时，组氨酸生产量增加。
上述变体即使在组氨酸浓度5mM至25mM下也可以具有活性。
在另一方式中，提供编码上述ATP-磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸或包含其的载体。上述载体可以为质粒或噬菌体(phage)。
在另一方式中，提供表达上述ATP-磷酸核糖基转移酶变体的转化菌株。上述转化菌株可以为导入了编码ATP-磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸或包含其的载体的菌株。上述菌株即使组氨酸的浓度增加也维持ATP-磷酸核糖基转移酶的活性，因此可以增加组氨酸生产量。
表达上述ATP-磷酸核糖基转移酶变体的菌株可以使组氨酸的生产增加约22至92％。
上述转化可以通过公知的方法实施，例如，可以通过电穿孔方法(van der Restet al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,52,541-545,1999)等实施。
根据一具体例，上述菌株可以为埃希氏菌(Escherichia)属菌株，具体而言，可以为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、艾伯特埃希氏菌(Escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)或伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)菌株。
在另一方式中，提供包括培养上述转化菌株的步骤的组氨酸的生产方法。上述组氨酸的生产方法可以包括以下步骤：在培养基中培养上述转化菌株的步骤；从上述菌株或培养基中回收组氨酸的步骤。
上述培养基可以包含碳源、氮源和无机盐类。上述碳源例如可以包括葡萄糖、蔗糖、枸橼酸盐、果糖、乳糖、麦芽糖或糖蜜之类的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸，但并不特别限定，可以单独使用或以混合物的形式使用。优选地，在上述大肠杆菌突变株的培养基中可以包含葡萄糖。上述氮源例如可以使用蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、干燥的酵母、玉米浆、豆粕、尿素、硫脲、铵盐、硝酸盐及其它包含有机或无机氮的化合物，但并不特别限定。此外，上述无机盐类可以使用镁、锰、钾、钙、铁、锌、钴等，并且不限定于此。
另外，为了调节培养基的pH，可以通过适当的方式使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨之类的基础化合物或者磷酸或硫酸之类的酸化合物。此外，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生，为了维持有氧状态，可以向培养基内注入氧气或者含有氧气的气体(例如空气)。
上述培养是指使微生物在人工调节的环境下生长，可以通过本领域中众所周知的培养方法实施。培养时温度可以为20至45℃，可以培养10至200小时，但并不限定于此。
上述回收组氨酸的步骤可以使用本领域中众所周知的各种方法。例如，可以使用离心分离、过滤、阴离子交换色谱、结晶化或HPLC，但并不限定于此。
根据一具体例的ATP-磷酸核糖基转移酶变体即使在高浓度的组氨酸环境下也可以维持活性。
根据一具体例的表达ATP-磷酸核糖基转移酶变体的菌株可以增加组氨酸生产量。
附图说明
图1是确认大肠杆菌来源的hisG_WT及其变体(hisG_SDM4、hisG_SDM7)的根据组氨酸浓度的酶活性变化的结果。
图2示出了对hisG六聚体与组氨酸的结合方式进行计算机模拟的结果。hisG的H232、S288、T252、R250、A248、E271、E240显示出与组氨酸相互作用。
具体实施方式
下面，将一个以上的具体例通过实施例而更详细地进行说明。但是，这些实施例用于对一个以上的具体例例示性地进行说明，本发明的范围不限定于这些实施例。
实施例1：具有TRA(1,2,4-triazole-3-alanine，1,2,4-三唑-3-丙氨酸)抗性的突变株选择
为了制作L-组氨酸导致的负反馈得到钝化的突变株，使用化学突变诱导剂即N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)(NTG)制作了对L-组氨酸的衍生物即1,2,4-三唑-3-丙氨酸(TRA)具有耐受性的突变株。
将E.coli MG1655(KCTC14419BP)在LB培养基中培养16小时(37℃，200rpm)。培养后，在4500rpm下离心分离10分钟，用saline/TM缓冲液(buffer)悬浮。向细胞加入缓冲液(buffer)而再悬浮后，添加100μg/ml的NTG，在37℃、200rpm下诱导了30分钟的突变。
反复上述突变诱导过程后，将细胞用3ml的D.W悬浮，将其涂抹在平板培养基(plate medium)(组成：葡萄糖8％、磷酸一氢钠0.6％、硫酸铵0.2％、硫酸镁0.02％、硝酸钙0.001％、硫酸亚铁10ppm、TRA 1％)中，进行了37℃、2天时间的一次培养。将形成了单菌落的菌株分离，将其在添加有TRA 1％的平板培养基中通过与一次培养相同的方法进行二次培养，从而选择了突变株。
对选择的突变株测定了在添加有0％、0.5％、1.0％或2.0％TRA的平板培养基中的生长度(细胞数增加)，比较了对TRA的耐受度。(参考下述表1)
[表1]
实施例2：TRA抗性突变株的ATP-PRT酶氨基酸序列分析比较分析了对TRA的耐受性增加的突变株H-1和H-2的ATP-PRT(ATP-磷酸核糖基转移酶(ATP-phosphoribosyltransferase)，hisG)酶的氨基酸序列。序列分析委托macrogen公司进行，使用下述表2的引物确认了序列。
[表2]
SEQ ID NO： 引物 核苷酸(5′-3′)
9 hisGW_CF AGTTCATTGTACAATGATGAGCG
10 hisGW_CR AGCCGCCAGGAATATACAAC
结果确认了位于ATP-PRT酶的C-末端部分的氨基酸的一部分被置换。
另外，利用分子间结合方式(mode)预测程序分析了E.coli来源的hisG六聚体(hexamer)与组氨酸分子对接(docking)时的三维结构，基于对接分析结果，对由E.colihisG表达的ATP-PRT的组氨酸进入及位于结合部位的氨基酸进行了分析。模拟结果显示hisG的H232、S288、T252、R250、A248、E271、E240与组氨酸相互作用的可能性高。(参考图2)
基于上述TRA耐受性增加突变株的ATP-PRT(hisG)氨基酸突变及对接分析结果，作为候选选定了14种组氨酸导致的负反馈得到减少从而组氨酸生产增加的可能性高的氨基酸的变体(H232T、H232E、H232K、E240K、A248F、R250H、R250E、T252A、T252L、T252P、T252Q、E271K、S288K和S288P)。
实施例3：具有一个突变的ATP-PRT变体表达菌株制作及其组氨酸生产率评价
为了将导入有点突变的hisG_H232K导入到E.coli DS9H菌株的染色体中，利用了一步钝化法(Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000))。首先，为了得到用于同源重组(homologous recombination)的hisG基因的前后片段，将E.coli DS9H genomic DNA作为模板，使用引物对hisG_HF-F/hisG_HF-R、hisG_HR-F/hisG_HR-R，将hisG_HF和hisG_HR片段分别进行了扩增。此外，为了得到包含卡那霉素抗生素标记和FRT的弹夹，由pKD13质粒，使用FR(hisG)-F/FR(hisG)-R进行了扩增，从而得到了弹夹片段。最后，为了得到hisG_H232K，由E.coli DS9H genomic DNA，分别使用hisG+FR-F/232K-R、232K-F/hisG+HR-R引物对，得到了两个片段。将得到的两个片段再次使用hisG+FR-F/hisG+HR-R引物连接成一个片段，从而得到了hisG_H232K片段。将最终扩增的这4个PCR片段作为模板，通过hisG_HF-F/hisG_HR-R引物对，利用重叠PCR(overlapping PCR)连接成一个片段。将连接成一体的DNA片段通过电穿孔法导入到具有pKD46质粒的E.coli DS9H菌株中。然后，以显示出卡那霉素耐受性的细胞株为对象，使用hisGW-CF/hisGW-CR引物实施PCR，从而确认了导入有hisG_H232K的菌株。以确认有导入的菌株为对象，实施了去除抗生素耐受性基因即卡那霉素标记的过程。向确认导入有hisG_H232K的菌株导入pCP20质粒而诱导FLP重组后，分别通过在添加和未添加抗生素(卡那霉素)的LB平板培养基中是否生长而确认了抗生素去除与否。利用去除了抗生素的菌株在LB平板培养基中生长而在添加有抗生素(卡那霉素)的LB平板培养基中无法生长来确认。并最终利用hisGW-CF/hisGW-CR引物对确认了序列。通过与上述方法相同的方法，将hisG_H232T、hisG_R250H、hisG_T252A、hisG_T252L、hisG_E271K、hisG_S288P、hisG_H232E、hisG_240K、hisG_A248F、hisG_R250E、hisG_T252P、hisG_T252Q和hisG_S288K分别导入到E.coli DS9H菌株中。
上述实验中使用的引物如下述表3所示。
[表3]
根据下述表4，导入了hisG_H232K或hisG_H232T的菌株与对照组相比，组氨酸生产增加了约22％至26％左右。导入了hisG_T252A或T252L的菌株与对照组相比，组氨酸生产增加了约35％至39％左右。导入了hisG_E271K的菌株与对照组相比，组氨酸生产增加了约34％。特别是，导入了hisG_S288P的菌株与对照组相比，组氨酸生产增加了约46％，导入了hisG_R250H的菌株与对照组相比，组氨酸生产增加了约67％，增幅最高。
但是，H232E、E240K和A248F变体的组氨酸生产量反而减少，R250E、T252P、T252Q和S288K变体的组氨酸生产量没有明显增加。
[表4]
根据上述结果，上述7种(H232T、H232K、R250H、T252A、T252L、E271K和S288P)变体的组氨酸生产增加，认为这是由于组氨酸导致的反馈抑制(feedback inhibition)减少了。下面，确认了将这些突变组合是否可以使组氨酸的生产进一步提高。
实施例4：导入有hisG_SDM4(H232K、T252A、E271K和S288P)的质粒的制作
实施重叠PCR，制作了可以表达在大肠杆菌hisG来源的ATP-PRT酶中置换有H232K、T252A、E271K和S288P的氨基酸的变体的质粒。首先，使用引物hisG-F/232K-R、232K-F/252A-R、252A-F/hisG-R这三对引物，用pfu premix(bioneer)将基因分别进行了扩增。然后，将扩增的3个片段(fragment)分别用作模板(template)，用hisG-F/hisG-R引物对再进行一次PCR，从而将3个片段(fragment)连接成一个片段(以下称为SDM3片段(fragment))。此外，将SDM3片段(fragment)和pTRC99A质粒(plasmid)分别用EcoRI和HindIII(NEB)进行限制酶处理，使用T4连接酶(ligase)，向pTRC99A质粒导入SDM3片段(fragment)。用(pTRC99A-hisG_SDM3)pTRC99A-hisG_SDM3模板(template)和hisG-F/271K-R2引物对进行PCR，获得了导入有H232K、T252A、E271K和S288P四个突变的SDM4片段(fragment)。
另外，将SDM4片段(fragment)和pTRC99A-hisG_SDM3质粒分别用EcoRI和AfeI(NEB)进行限制酶处理，使用T4连接酶(Takara)，构建了pTRC99A-hisG_SDM4。最终使用hisG-CF/hisG-CR引物对确认了序列。(参照下述表5)将包含H232K、T252A、E271K和S288P突变的ATP-PRT变体命名为hisG_SDM4。
[表5]
实施例5：导入有hisG_SDM7(H232T、R250H、T252L、E271K和S288P)的质粒的制作
制作了将hisG_SDM4酶的氨基酸序列的一部分被置换为其它氨基酸的hisG_SDM7，将其导入到质粒(plasmid)中。将pTRC99A-hisG_SDM4用作模板(template)，将第232号氨基酸置换为T，将第250号氨基酸置换为H，将第252号氨基酸置换为L，两个突变(E271K和S288P)维持不变。(相较于hisG_WT，hisG_SDM7的突变位置为H232T、R250H、T252L、E271K和S288P)
首先，使用引物hisG-F/232T-R、232T-F/250H+252L-R、250H+252L-F/hisG-R这三对引物，用pfu premix(bioneer)将基因分别进行了扩增。此外，将扩增的3个片段(fragment)分别用作模板(template)，用hisG-F/hisG-R引物对再进行一次PCR，从而将3个片段(fragment)连接成一个片段。此外，将PCR片段(fragment)和pTRC99A质粒(plasmid)分别用EcoRI和HindIII(NEB)切断，用T4连接酶(Takara)连接，从而制作了pTRC99A-hisG_SDM7。最终使用hisG-CF/hisG-CR引物确认了序列。(参考下述表6)包含H232T、R250H、T252L、E271K和S288P突变的ATP-PRT变体命名为hisG_SDM7。
[表6]
实施例6：导入有hisG_SDM4或hisG_SDM7基因的突变株的制作
6-1.导入有hisG_SDM4基因的突变株的制作
为了将hisG_SDM4导入到E.coli DS9H菌株的染色体中，利用了一步钝化法(Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000))。首先，为了得到用于同源重组(homologousrecombination)的hisG基因的前后片段，将E.coli DS9H genomic DNA作为模板，使用引物对hisG_HF-F/hisG_HF-R、hisG_HR-F/hisG_HR-R，将hisG_HF和hisG_HR片段分别进行了扩增。此外，为了得到包含卡那霉素抗生素标记和FRT的弹夹，由pKD13质粒，使用FR(hisG)-F/FR(hisG)-R进行了扩增，得到了弹夹片段。最后，为了得到hisG_SDM4，由pTRC99A-hisG_SDM4质粒，使用hisG+FR-F/hisG+HR-R引物，得到了hisG_SDM4片段。将最终扩增的这4个PCR片段用作模板，通过hisG_HF-F/hisG_HR-R引物对，利用重叠PCR(overlapping PCR)连接成一个片段。将连接成一个的DNA片段用电穿孔法导入到具有pKD46质粒的E.coli DS9H菌株中。然后，以显示出卡那霉素耐受性的细胞株为对象，使用hisGW-CF/hisGW-CR引物实施PCR，确认了导入有hisG_SDM4的菌株。以确认有导入的菌株为对象，进行了去除抗生素耐受性基因即卡那霉素标记的过程。向确认导入有hisG_SDM4的菌株导入pCP20质粒，诱导了FLP重组后，分别通过在添加和未添加抗生素(卡那霉素)的LB平板培养基中是否生长而确认了抗生素去除与否。利用去除了抗生素的菌株在LB平板培养基中生长而在添加有抗生素(卡那霉素)的LB平板培养基中无法生长而进行了确认。并最终使用hisGW-CF/hisGW-CR引物对确认了序列。实验中使用的引物记载于下述表7。
1表7]
6-2.导入有hisG_SDM7基因的突变株的制作
为了将hisG_SDM7导入到E.coli DS9H菌株的染色体中，利用了一步钝化法(Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000))。首先，为了得到用于同源重组(homologousrecombination)的hisG基因的前后片段，将E.coli DS9H genomic DNA用作模板，使用引物对hisG_HF-F/hisG_HF-R、hisG_HR-F/hisG_HR-R，将hisG_HF和hisG_HR片段分别进行了扩增。此外，为了得到包含卡那霉素抗生素标记和FRT的弹夹，由pKD13质粒，使用FR(hisG)-F/FR(hisG)-R进行扩增，得到了弹夹片段。最后，为了得到hisG_SDM7，由pTRC99A-hisG_SDM7质粒，使用hisG+FR-F/hisG+HR-R引物，得到了hisG_SDM7片段。将最终扩增的这4个PCR片段用作模板，通过hisG_HF-F/hisG_HR-R引物对，利用重叠PCR(overlapping PCR)连接成一个片段。将连接成一个的DNA片段用电穿孔法导入到具有pKD46质粒的E.coli DS9H菌株中。然后，以显示出卡那霉素耐受性的细胞株为对象，使用hisGW-CF/hisGW-CR引物实施PCR，确认了导入有hisG_SDM7的菌株。以确认有导入的菌株为对象，进行了去除抗生素耐受性基因即卡那霉素标记的过程。向确认导入有hisG_SDM7的菌株导入pCP20质粒，诱导了FLP重组后，分别通过在添加和未添加抗生素(卡那霉素)的LB平板培养基中是否生长而确认了抗生素去除与否。利用去除了抗生素的菌株在LB平板培养基中生长而在添加有抗生素(卡那霉素)的LB平板培养基中无法生长而进行了确认。并最终使用hisGW-CF/hisGW-CR引物对确认了序列。导入有hisG_SDM7基因的突变株的制作中使用的引物序列与上述表6相同。
实施例7：由hisG_SDM4或hisG_SDM7基因表达的突变酶的组氨酸负反馈抗性测定
比较了ATP-PRT野生型(hisG_WT)、ATP-PRT变体(hisG_SDM4和hisG_SDM7)的组氨酸导致的负反馈抗性。
将LB培养基分别以50ml分注在500ml的烧瓶中，将DS9H、DS9H_△hisG::hisG_SDM4或DS9H_△hisG::hisG_SDM7三个菌株分别接种1％。培养条件为30℃、180rpm。OD600为0.6时，以1mM IPTG(最终浓度)诱导ATP-PRT表达，实施了4小时左右的进一步培养。将培养后获得的细胞进行超声(sonication)、离心分离。将获得的上清液用于ATP磷酸核糖基转移酶(ATP phosphoribosyltransferase)活性评价。用于评价酶活性的反应条件参照现有文献进行。(Microb Cell Fact.2018.Mar.17:42)对上层液进行蛋白质定量使浓度一致，以下述表8的反应组成来混合反应物后，测定了酶活性。
[表8]
特别是，为了确认组氨酸导致的活性抑制抗性，将组氨酸的浓度分别设为0mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、25mM、50mM浓度。活性测定在30℃、以UV波长290nm、以2分钟间隔测定了30分钟。
根据图1，hisG_WT酶从组氨酸浓度5mM开始ATP-PRT活性急剧下降。但是，hisG_SDM4(H232K、T252A、E271K、S288P)从组氨酸浓度25mM开始酶活性下降。此外，hisG_SDM7(H232T R250H T252L E271KS288P)与hisG_SDM4相似地从组氨酸浓度25mM开始酶活性下降，但各个组氨酸浓度下的酶活性与hisG_SDM4相比增加。结果，hisG_SDM7对组氨酸导致的活性抑制的抗性最优异。
实施例8：ATP-PRT突变酶表达菌株的组氨酸生产率评价
确认了导入有hisG_SDM4或hisG_SDM7的菌株的组氨酸生产率。将根据下述表9的组成的培养基分别以10ml分注到各个烧瓶中，将DS9H、DS9H_△hisG::hisG_SDM4或DS9H_△hisG::hisG_SDM7菌株分别接种1％，在34℃、200rpm的条件下培养了72小时。比较分析了培养后各个烧瓶的组氨酸生产量。
[表9]
成分 浓度
葡萄糖 8％
硫酸镁 0.1％
硫酸铵 2.0％
MSG 0.1％
磷酸二氢钾 0.1％
酵母提取物 0.1％
硫酸钾 0.02％
硫胺素-HCl 20ppm
烟酸 10ppm
硫酸亚铁 5ppm
硫酸锌 5ppm
硫酸锰 5ppm
碳酸钙(单独灭菌) 5.0％
hisG_SDM4表达菌株与对照组相比，组氨酸生产量增加了约53％左右，hisG_SDM7表达菌株与对照组相比，组氨酸生产量增加了约92％左右。(参考表10)
[表10]
根据上述结果，认为hisG_SDM4或hisG_SDM7与his_WT相比，组氨酸导致的反馈抑制(feedback inhibition)减少，组氨酸生产率增加。特别是，与hisG_SDM4表达菌株相比，hisG_SDM7表达菌株的组氨酸生产率进一步提高。
另外，综合上述表4和表8的结果，使大肠杆菌来源的hisG的第232、250、252、271和288号位置的氨基酸中的任一个突变时，组氨酸的生产量增加，使复数个突变时，与使一个突变时相比，组氨酸的生产量进一步增加。
[保藏号]
保藏机构名称：韩国典型培养物保藏中心
保藏号：KCTC14419BP
保藏日：20201228。
/>
<110> 大象株式会社
<120> 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的ATP-PRT变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
<130> PX210037PCT
<150> KR 2020-0184671
<151> 2020-12-28
<160> 53
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_WT
<400> 1
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 2
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_H232K/T
<220>
<221> VARIANT
<222> (232)
<223> Xaa (232) = K or T
<400> 2
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met Xaa Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 3
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_R250H
<400> 3
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu His Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 4
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_T252A/L
<220>
<221> VARIANT
<222> (252)
<223> Xaa (252) = A or L
<400> 4
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Xaa Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 5
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_E271K
<400> 5
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Lys Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 6
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_S288P
<400> 6
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Pro
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 7
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_SDM4
<400> 7
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met Lys Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Ala Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Lys Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Pro
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 8
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_SDM7
<400> 8
Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val
100 105 110
Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile
130 135 140
Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met Thr Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu
225 230 235 240
Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu His Pro Leu Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Lys Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Pro
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisGW_CF
<400> 9
agttcattgt acaatgatga gcg 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisGW_CR
<400> 10
agccgccagg aatatacaac 20
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 232K-R
<400> 11
tttcatcatg atgtattttg attcgcgc 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 232K-F
<400> 12
gcgcgaatca aaatacatca tgatgaaa 28
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 232E-R
<400> 13
ttccatcatg atgtattttg attcgcgc 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
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<220>
<223> 232E-F
<400> 14
gcgcgaatca aaatacatca tgatggaa 28
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
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tttatccaga cgttcggtcg gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 240K-F
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accgaccgaa cgtctggata aa 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 248F-R
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gaaacctggc agcagggcga 20
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<220>
<223> 248F-F
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tcgccctgct gccaggtttc 20
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<220>
<223> 252A-R
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cccgccagcg gcagaatcgc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 252A-F
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gcgattctgc cgctggcggg 20
<210> 21
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<212> DNA
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<220>
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ccgccagcgg cagaatagtt ggatg 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 250H-F
<400> 22
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<210> 23
<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 250E-R
<400> 23
ccgccagcgg cagaatagtt ggttc 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 250E-F
<400> 24
gaaccaacta ttctgccgct ggcgg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 252L-R
<400> 25
ccgccagcgg cagaatcaat gggcg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
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<220>
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cgcccattga ttctgccgct ggcgg 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 252P-R
<400> 27
ccgccagcgg cagaatcggt gggcg 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 252P-F
<400> 28
cgcccaccga ttctgccgct ggcgg 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 252Q-R
<400> 29
ccgccagcgg cagaatctgt gggcg 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 252Q-F
<400> 30
cgcccacaga ttctgccgct ggcgg 25
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 271K-R
<400> 31
tttgctgctg accatgtgca 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 271K-F
<400> 32
tgcacatggt cagcagcaaa 20
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 288P-R
<400> 33
cggactggca cccagcgctt tca 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 288P-F
<400> 34
tgaaagcgct gggtgccagt ccg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 288K-R
<400> 35
cttactggca cccagcgctt tca 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 288K-F
<400> 36
tgaaagcgct gggtgccagt aag 23
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 232T-R
<400> 37
tgtcatcatg atgtattttg attcgcgc 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 232T-F
<400> 38
gcgcgaatca aaatacatca tgatgaca 28
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_HF-F
<400> 39
gctcattcat taaacaaatc cattgc 26
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_HF-R
<400> 40
tttgttattc ctctttaaac ctgtc 25
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FR(hisG)-F
<400> 41
gtttaaagag gaataacaaa gtgtaggctg gagctgcttc 40
<210> 42
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FR(hisG)-R
<400> 42
ccagatcaat tcgcgctaac tctgtcaaac atgagaatta a 41
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG+FR-F
<400> 43
ttaattctca tgtttgacag agttagcgcg aattgatctg g 41
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG+HR-R
<400> 44
tgtgttaaag ctcatggcga tcactccatc atcttctcaa tcg 43
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_HR-F
<400> 45
tcgccatgag ctttaacaca a 21
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG_HR-R
<400> 46
agtgtggaag gtttcaatat tctt 24
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG-F
<400> 47
atatgaattc atgacagaca acactcgttt acg 33
<210> 48
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG-R
<400> 48
atataagctt tcactccatc atcttctcaa tcggcaggac cagaatcgg 49
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 271K-R2
<400> 49
atatagcgct ttcagttttt ccatggtttc ccagaacagg gtttt 45
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG-CF
<400> 50
atattctgaa atgagctgtt gacaa 25
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisG-CR
<400> 51
tactgccgcc aggcaaattc 20
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 250H+252L-R
<400> 52
ccgccagcgg cagaatcaat ggatg 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 250H+252L-F
<400> 53
catccattga ttctgccgct ggcgg 25

Claims (7)

1.一种ATP-磷酸核糖基转移酶变体，是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的，
其中，位于第252号的苏氨酸被置换为丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的变体，其中，所述ATP-磷酸核糖基转移酶是由大肠杆菌即E.coli的hisG基因表达的。
3.根据权利要求1所述的变体，其中，所述变体的组氨酸导致的反馈抑制得到减少。
4.根据权利要求1所述的变体，其中，还包含下述氨基酸置换中的一种以上：
(a)位于第232号的组氨酸被置换为赖氨酸或苏氨酸
(b)位于第250号的精氨酸被置换组氨酸
(c)位于第271号的谷氨酸被置换为赖氨酸
(d)位于第288号的丝氨酸被置换为脯氨酸。
5.一种转化菌株，其表达权利要求1所述的ATP-磷酸核糖基转移酶变体。
6.根据权利要求5所述的转化菌株，其中，所述菌株为大肠杆菌。
7.一种组氨酸的生产方法，包括培养权利要求5所述的菌株的步骤。
CN202180088141.1A 2020-12-28 2021-04-26 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株 Pending CN116802283A (zh)

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