RU2667425C2

RU2667425C2 - Микроорганизм Corynebacterium sp. с повышенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью

Info

Publication number: RU2667425C2
Application number: RU2016114418A
Authority: RU
Inventors: Сан Хи ПАРК; Джун Ок МУН; Хьюн Вон БЭ; Кван Хо ЛИ
Original assignee: СиДжей ЧеилДжеданг Корп.
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2018-09-19
Also published as: EP3064569A4; BR112016009324B1; MY181203A; JP2016533771A; JP6286571B2; CN105849249B; KR101498630B1; EP3064569A1; RU2016114418A; BR112016009324A2; US9758801B2; US20160251687A1; WO2015064917A1; CN105849249A

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, с улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего ген NCgl0862 Corynebacterium glutamicum. Предложен способ получения L-лизина, с использованием указанного модифицированного микроорганизма. Группа изобретений позволяет повысить продукцию L-лизина по сравнению с родительским штаммом. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 табл., 9 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, принадлежащему к роду Corynebacterium, с повышенной способностью продуцировать L-лизин и к способу получения L-лизина с применением этого микроорганизма.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-лизин является типичным представителем незаменимых аминокислот и применяется в областях, связанных с питанием, медициной и кормами. В основном, L-лизин получают в результате прямого ферментирования с помощью такого микроорганизма, как Escherichia coli или Corynebacterium, и в этом отношении улучшения способности продуцировать L-лизин путем разработок с целью получения продуцирующих штаммов с улучшенными выходами или усовершенствованием процесса ферментации может в результате дать существенные экономические результаты.

В отношении способа улучшения эффективности продукции лизина применяли способ усиления гена, вовлеченного в путь биосинтеза лизина, или модификации промотора этого гена с целью увеличения активности ферментов, вовлеченных в путь биосинтеза лизина. К тому же, с целью повышения способности продуцировать лизин непрерывно продолжались исследование генов, отличных от вовлеченных в путь биосинтеза лизина.

Авторы настоящего изобретения попытались создать и изучить библиотеку ДНК дикого типа Corynebacterium glutamicum с целью обнаружения признаков, которые относятся к способности продуцировать лизин. В результате было подтверждено, что при повышенной экспрессии гена NCgl0862 лизин эффективно продуцируется, что, таким образом, позволяет реализовать настоящее изобретение. До этого времени еще не было публикаций исследований. посвященных микроорганизмам, принадлежащим к роду Corynebacterium, способным продуцировать L-лизин вследствие дополнительного введения в них гена NCgl0862, полученного из Corynebacterium.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, принадлежащему к роду Corynebacterium, у которого усилена экспрессия полинуклеотида. кодирующего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение относится к способу получения L-лизина с использованием этого микроорганизма.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Один аспект настоящего изобретения относится к микроорганизму, принадлежащему к роду Corynebacterium, у которого усилена экспрессия полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Полинуклеотид может кодировать аминокислотную последовательность, которая характеризуется приблизительно 70% или более высокой, приблизительно 75% или более высокой, приблизительно 80% или более высокой, приблизительно 85% или более высокой, приблизительно 90% или более высокой, приблизительно 92% или более высокой, приблизительно 95% или более высокой, приблизительно 97% или более высокой, приблизительно 98% или более высокой или приблизительно 99% или более высокой гомологией последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Термин "гомология", используемый в данном документе, относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидами или двумя полипептидными фрагментами. Гомологию последовательностей между одним фрагментом и другим фрагментом можно определить с помощью способов, известных в данной области. Например, такую гомологию последовательностей можно определять с помощью алгоритма BLAST, который раскрыт в литературе [см. Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (опубликовано в 1993 году)] или алгоритма FASTA по Пирсону [см. Methods Enzymol., 183, 63 (опубликовано в 1990 году)]. На основе алгоритма BLAST также разработаны программы под названием BLASTN или BLASTX [см. www.ncbi.nlm.nih.gov].

Экспрессию полинуклеотида можно усиливать путем модификации последовательности, регулирующей экспрессию, с помощью замены или мутации, мутации, внесенной в полинуклеотидную последовательность, изменения в стартовом кодоне, повышения числа копий полинуклеотида путем внесения хромосомной вставки или вектора или их комбинаций.

Последовательность, регулирующую экспрессию полинуклеотида. можно модифицировать. Последовательность, регулирующая экспрессию. управляет экспрессией функционально связанного с ней полинуклеотида и, к примеру, может охватывать промотор, терминатор, энхансер, сайленсер и последовательность Шайна-Дальгарно. Полинуклеотид может иметь замены в стартовом кодоне. Стартовый кодон. который состоит из TTG или GTG, может быть заменен на ATG с тем, чтобы могла быть увеличена ферментативная активность продукта соответствующего гена. Полинуклеотид может быть встроен в конкретный сайт хромосом в целях повышения, таким образом, числа копий. В этом случае конкретный сайт может включать в себя, например, транспозонный сайт или сайт между генами. К тому же, полинуклеотид может быть встроен в экспрессирующий вектор, который вводят в клетку-хозяина с повышением, таким образом, числа копий.

Полинуклеотид может включать в себя, к примеру, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

Термин "функционально связанный", используемый в данном документе, относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и полинуклеотидной последовательностью, где регуляторная последовательность управляет транскрипцией и/или трансляцией полинуклеотидной последовательности. Регуляторная последовательность может быть сильным промотором, который может повышать уровень экспрессии полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, полученный из микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium. или может представлять собой промотор, полученный из других микроорганизмов. Промотор может представлять собой, к примеру, промотор trc, промотор gap, промотор tac, промотор Т7, промотор lac, промотор trp, промотор araBAD или промотор cj7. Регуляторную последовательность можно модифицировать таким образом, чтобы, к примеру, промоторная последовательность главного гена, вовлеченного в путь биосинтеза лизина, проявляла более усиленную промоторную активность у микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium. Регуляторная последовательность может представлять собой, к примеру, промотор lysCP1. Термин "промотор lysCP1". используемый в данном документе, относится к сильному промотору, ферментативная активность продукта гена которого усилена примерно в 5 раз по сравнению с диким типом путем увеличения уровня экспрессии гена, кодирующего аспартаткиназу, где уровень экспрессии увеличен путем замены последовательностей в промоторном сайте генов, каждый из которых кодирует аспартаткиназу и дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты (корейский патент №10-0930203).

Термин "вектор", используемый в данном документе, относится к полинуклеотидной конструкции, которая содержит регуляторную последовательность гена и последовательность гена и выполнена с возможностью экспрессии целевого гена в подходящей клетке-хозяине. Альтернативно, вектор может также относиться к полинуклеотидной конструкции, которая содержит последовательности, подходящие для гомологической рекомбинации, так что благодаря введению вектора в клетку-хозяина можно изменять регуляторную последовательность эндогенного гена в геноме клетки-хозяина или в конкретный сайт генома хозяина можно встроить целевой ген, который может экспрессироваться. В связи с этим вектор, применяемый в настоящем изобретении, может дополнительно содержать селективный маркер для определения введения вектора в клетку-хозяина или встраивания вектора в хромосому клетки-хозяина. Селективный маркер может включать маркер, придающий селектируемый фенотип, такой как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическому средству или экспрессия поверхностного белка. Поскольку выживать или проявлять особенные стенотипические характеристики могут только клетки, экспрессирующие селективный маркер, в среде, обработанной таким селективным средством, можно произвести отбор трансформированных клеток.

Вектор, применяемый в настоящем изобретении, может представлять собой, к примеру, вектор pECCG122, который может самореплицироваться в обоих направлениях у бактерий Е. coli и коринебактерий (корейский патент №10-0057684), или вектор pDZ, применяемый для трансформации клетки-хозяина, обеспечивающий встраивание гена, который кодирует целевой белок, в хромосомы клетки-хозяина, при этом вектор pDZ не реплицируется у Corynebacterium glutamicum (корейский патент №10-0924065). Вдобавок, вектор в контексте данного документа может представлять собой, к примеру, вектор pDZTn, полученный из вектора pDZ и подходящий для встраивания гена в транспозонный сайт в хромосоме штаммов АТСС13032 Corynebacterium glutamicum (корейский патент №10-1126041). по вектор им не ограничен.

Термин "трансформация", используемый в данном документе, относится к введению полинуклеотида в клетку-хозяина так, чтобы полинуклеотид мог реплицироваться как внегеномный элемент или как встроенный в геном клетки-хозяина. Способ трансформации вектором, применяемым в настоящем изобретении, может включать способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Вдобавок, как раскрыто в предшествующем уровне техники, можно осуществлять способ с использованием электрического импульса в зависимости от клетки-хозяина.

Микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может представлять собой, к примеру, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium diphtheriae или Corynebacterium ammoniagenes.

Микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium. может обладать способностью продуцировать L-лизин. Микроорганизм может обладать улучшенной способностью продуцировать L-лизин в результате введения вышеописанного полинуклеотида в микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium. со способностью продуцировать L-лизин.

Термин "со способностью продуцировать L-лизин", используемый в данном документе, относится к наличию способности продуцировать и секретировать L-лизин в культуральную среду в процессе культивирования в ней микроорганизма. Микроорганизм может быть способен продуцировать и аккумулировать L-лизин в культуральной среде в больших количествах по сравнению со штаммом дикого типа или родительским штаммом.

Микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, со способностью продуцировать L-лизин может иметь усиленную или сниженную экспрессию гена, связанного с выработкой NADPH, и/или гена, связанного с биосинтезом или секрецией L-лизина, или может иметь ген, замененный чужеродным геном. Ген, связанный с выработкой NADPH, может охватывать, к примеру, ген, кодирующий глюкозодегидрогеназу, ген, кодирующий глюконаткипазу. ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, ген, кодирующий глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, или ген, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидрогеназу. Ген, связанный с биосинтезом L-лизина, может охватывать, к примеру, ген, кодирующий аспартатаминотрансферазу, ген, кодирующий аспартаткиназу. ген. кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, ген, кодирующий дегидродипиколинатсинтазу, ген, кодирующий дегидродипиколинатредуктазу, ген, кодирующий мезо-диаминопимелатдегидрогеназу, или ген, кодирующий диаминодипимелатдекарбоксилазу. Ген, связанный с секрецией L-лизина. может включать lysE, который является геном носителя, участвующего в экспорте лизина. Микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, со способностью продуцировать L-лизин может также приобретать такую способность продуцировать L-лизин благодаря применению ксилозы как источника углерода.

В одном варианте осуществления микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может представлять собой КССМ11016Р (KFCC10881) Corynebacterium glutamicum (корейский патент №10-0159812).

В другом варианте осуществления в микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может быть введен полинуклеотид. кодирующий аспартатаминотрансферазу, полинуклеотид, кодирующий аспартаткиназу. полинуклеотид, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, полинуклеотид, кодирующий дегидродипиколинатсинтазу, полинуклеотид. кодирующий дегидродипиколинатредуктазу. и полинуклеотид. кодирующий диаминодипимелатдекарбоксилазу. К примеру, микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может представлять собой КССМ10770Р Corynebacterium glutamicum (корейский патент №10-0924065).

В другом варианте осуществления микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может представлять собой КССМ11347Р (KFCC10750) Corynebacterium glutamicum.

В другом варианте осуществления микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может приобретать способность продуцировать лизин в результате введения мутантного полинуклеотида, кодирующего пируваткарбоксилазу (рус), мутантного полинуклеотида, кодирующего гомосериндегидрогеназу (hom), и мутантного полинуклеотида, кодирующего аспартаткиназу (lysC) (Binder et al. Genome Biology, 2012, 13:R40). Микроорганизм может представлять собой, к примеру. CJ3P Corynebacterium glutamicum.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения L-лизина, при этом способ включает культивирование микроорганизма и получение I -лизина из культуры.

Микроорганизм является таким же, как описано выше.

Культивирование микроорганизма можно проводить в соответствующей среде в условиях культивирования, известных в данной области техники. Такой процесс культивирования можно легко регулировать в зависимости от выбранного микроорганизма. Способ культивирования может включать одно или несколько, выбранных из группы, состоящей из периодической культуры, непрерывной культуры и культуры с подпиткой.

Среда, которую применяют при культивировании, может соответствовать требованиям конкретного микроорганизма. Среду можно выбрать из группы, состоящей из источников углерода, источников азота, микроэлементов и их комбинаций.

Источник углерода может быть выбран из группы, состоящей из углеводов, липидов, жирных кислот, спиртов, органических кислот и их комбинаций. Углеводом может быть глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал, целлюлоза или их комбинация. Липидом может быть соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло или их комбинация. Жирной кислотой может быть пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота или их комбинация. Спиртом может быть глицерин или этанол. Органической кислотой может быть уксусная кислота.

Источник азота может включать источник органического азота, источник неорганического азота или их комбинацию. Источник органического азота может быть выбран из группы, состоящей из пептона, дрожжевого экстракта, мясного экстракта, экстракта солода, кукурузного экстракта (CSL), соевой муки и их комбинаций. Источник неорганического азота может быть выбран из группы, состоящей из мочевины, сульфата аммония, хлорида аммония, фосфата аммония, карбоната аммония, нитрата аммония и их комбинаций.

Среда может включать один элемент, выбранный из группы, состоящей из фосфора, солей металлов, аминокислот, витаминов, предшественников и их комбинаций. Источник фосфора может включать дигидрофосфат калия, фосфат дикалия, натрийсодержащую соль, соответствующую ему. Соль металла может представлять собой сульфат магния и сульфат железа.

Среду или ее отдельные компоненты можно добавлять в культуральную среду в режиме периодической культуры, непрерывной культуры или культуры с подпиткой.

В способе культивирования рН культуры можно регулировать. Регулирование рН можно осуществлять путем добавления гидроксида аммония, гидроксида калия, аммиака, фосфорной кислоты или серной кислоты к культуре. Дополнительно, способ культивирования может включать предотвращение образования воздушных пузырьков. Предотвращение образования воздушных пузырьков можно осуществлять путем применения противовспенивающего средства. Противовспенивающее средство может включать полигликолевый эфир жирной кислоты. Дополнительно, способ культивирования может включать введение газа в культуру. Газ может включать любой газ, способный поддерживать аэробные условия культуры. Газ может представлять собой кислород или кислородсодержащий газ. Кислородсодержащий газ может включать воздух. При культивировании температура культуры может составлять от 20 до 45°С, к примеру, от 22 до 42°С или от 25 до 40°С. Культивирование может продолжаться до того момента, пока продукция L-лизина не достигнет желаемого уровня.

Полученный L-лизин можно, к примеру, извлекать из культуры путем обработки культуры серной кислотой или соляной кислотой с последующим выполнением комбинации таких способов, как анионообменная хроматография, концентрирование, кристаллизация и осаждение в изоэлектрической точке.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способность продуцировать L-лизин можно повысить путем применения микроорганизма согласно аспекту настоящего изобретения.

Способность продуцировать L-лизин можно повысить путем применения способа получения L-лизина согласно другому аспекту настоящего изобретения.

ПРИНЦИП ИЗОБРЕТЕНИЯ

В дальнейшем, настоящая заявка будет описана более подробно со ссылками на примеры. Однако эти примеры приведены только в целях иллюстрации, и не подразумевается ограничение объема настоящей заявки этими примерами.

Пример 1. Получение геномной библиотеки ДНК Corynebacterium glutamicum дикого типа

Получали геномную ДНК штамма АТССТ3032 Corynebacterium glutamicum. а затем обрабатывали ферментом рестрикции Sau3AI так. чтобы получить частичные фрагменты размером от 6 до 8 т.п.о. Фрагмент лигировали в челночный вектор pECCG122 для трансформации Е. coli и Corynebacterium, при этом челночный вектор включает концы для фермента рестрикции BamHI. Затем DH5α Е. coli трансформировали полученным в результате вектором и наносили на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором, в который были встроены фрагменты, отбирали с помощью ПЦР (с применением праймеров SEQ ID NO: 3 и 4) и вносили в смешанную культуру, и из них получали плазмиды с помощью общеизвестного способа выделения плазмид.

Пример 2. Внедрение библиотеки и отбор штамма с улучшенной способностью продуцировать лизин

Штамм КССМ11016Р Corynebacterium glutamicum, продуцирующий лизин, трансформировали рекомбинантным вектором, полученным в примере 1 с применением способа с использованием электрического импульса, а затем вносили в планшет с комплексной средой, как описано ниже.

<Комплексная среда для планшета>

20 г глюкозы, 50 г (NH₄)₂SO₄, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 5 г КН₂РО₄, 10 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида, 20 г агара и 25 мг канамицина (на основе 1 л дистиллированной воды).

Приблизительно 2000 колоний инокулировали в каждую лунку 96-луночного планшета (изготовленного в Bioneer Company), содержащую 200 мкл комплексной жидкой среды, описанной выше, и затем культивировали путем встряхивания при 200 об./мин. и 30°С в течение 24 часов. В соответствии со способом с использованием лизиноксидазы 50 мкл каждой культуры добавляли в 96-луночный планшет с распределенной в нем реакционной смесью, содержащей лизиноксидазу (содержащей 200 мкл фосфата калия (рН 7,5), 0,04 мкл лизиноксидазы (0,1 ед./мкл), 0,04 мкл пероксидазы (1 ед./мкл) и 0,4 мг ABTS). После прохождения реакции в течение 30 минут измеряли поглощение при OD_405нм и сравнивали степень изменения цвета. Среди них были выбраны 7 типов экспериментальных групп, каждая из которых характеризовалась более высоким поглощением, чем контрольная группа (KCCM11016P/pECCG122).

<Комплексная жидкая среда>

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г КН₂РО₄, 8 г К₂НРО₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина. 1000 мкг тиамина-HCl. 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды).

Отдельные штаммы инокулировали во флакон с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащий 25 мл среды для посева, описанной ниже, и затем культивировали путем встряхивания при 200 об./мин. и 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл засеянной культуры инокулировали во флакон с угловыми перегородками объемом 250 мл, содержащий 24 мл продукционной среды, описанной ниже, и затем культивировали путем встряхивания при 200 об./мин. и 37°С в течение 96 часов. После окончания культивирования анализировали концентрации L-лизина с помощью HPLC, а результаты анализа показаны в таблице 1.

<Среда для посева (рН 7,0)>

20 г глюкозы, 10 г (NH₄)₂SO₄, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г К₂НРО₄, 0.5 г MgSO₄⋅7H₂O. 100 мкг биотина. 1000 мкг тиамина-HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (на основе 1 л дистиллированной воды).

<Продукционная среда (рН 7,0)>

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка. 5 г концентрата кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина-HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида и 30 г СаСО₃ (на основе 1 л дистиллированной воды).

На основании результатов, приведенных выше, были отобраны КССМ11016Р/М2 и KCCM11016P/L52, которые демонстрировали повышенную способность продуцировать лизин по сравнению с контрольной группой, а затем из них выделяли плазмиды с последующим анализом последовательности с применением праймеров SEQ ID NO: 3 и 4. Плазмиду, полученную из КССМ11016Р/М2, назвали рЕС-L1, а плазмиду, полученную из KCCM11016P/L52, назвали pEC-L2. Плазмида pEC-L1 охватывает нуклеотиды от приблизительно 200 пар оснований (п.о.) выше стартового кодона открытой рамки считывания (ORF) гена NCgl0857 до приблизительно 200 п.о. ниже стоп-кодона открытой рамки считывания (ORF) гена NCgl0862. Плазмида pEC-L2 охватывает нуклеотиды от приблизительно 250 п.о. ниже стоп-кодона ORF гена NCgl0861 до приблизительно 300 п.о. выше стартового кодона ORF гена NCgl0865. Соответственно, подтвердили, что оба из двух типов плазмид одновременно содержат ген NCgl0862.

Пример 3. Получение вектора для замены промотора гена NCgl0862

На основании результатов, полученных в примере 2, чтобы подтвердить, индуцирует ли фактически сверхэкспрессия гена NCgl0862 улучшение способности продуцировать лизин, получали вектор, выполненный с возможностью замены промотора гена NCgl0862 в хромосоме. Для замены промотора промотор дикого типа (lysCP) и модифицированный промотор lysCP1 применяли в качестве промоторов гена lysC.

Подробное описание приведено ниже.

На основе GenBank Национальных институтов здравоохранения (GenBank NIH, США) была разработана пара праймеров (SEQ ID NO: 5 и 6 или SEQ ID NO: 7 и 8), выполненных с возможностью проведения амплификации соответственно выше и ниже стартового кодона ORF гена NCgl0862 (SEQ ID NO: 2). Вдобавок, была разработана пара праймеров (праймеры SEQ ID NO: 9 и 10) для амплификации промоторного сайта из последовательностей выше гена lysC. SEQ ID NO: и последовательности праймеров показаны ниже. Подчеркнутые последовательности указывают на сайты, которые узнаются ферментами рестрикции.

Проводили ПЦР с применением геномной ДНК штамма КССМ11016Р Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы и пар праймеров SEQ ID NO: 5 и 6, и SEQ ID NO: 7 и 8, и SEQ ID NO: 9 и 10, с получением, таким образом, фрагментов ДНК размером 300 п.о., каждый из которых имеет фланкирующие последовательности слева и справа от стартового кодона ORF гена NCgl0862 и фрагмент промотора lysCP. Условия ПЦР-амплификации включают денатурацию при 94°С в течение 5 мин., 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжиг при 56°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 30 секунд, а затем полимеризацию при 72°С в течение 7 минут. Каждый из продуктов размером 300 и.о., амплифицированных с помощью ПЦР и имевших фланкирующую последовательность слева или справа от стартового кодона ORF гена NCgl0862, соответственно обрабатывали EcoRI и BamHI и BamHI и Sail, а затем лигировали с фрагментом ДНК, полученным путем обработки вектора pDZ для встраивания в хромосому у микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, ферментами рестрикции SalI и EcoRI, с получением, таким образом, вектора.

Для амплификации промотора lysCP или промотора lysCPl ПЦР проводили с применением геномной ДНК штамма АТСС 13032 или штамма KCCM11016P-lysCP1 Corynebacterium glutamicum (корейский патент №10-0930203) в качестве матрицы и пары праймеров. SEQ ID NO: 9 и 10. с получением, таким образом, фрагментов промотора lysCP и промотора lysCP1 размером 300 п. о. Фрагменты ДНК промотора lysC дикого типа и промотора lysCP1 обрабатывали BamHI и NdeI. Затем полученный ранее вектор лигировали с фрагментом ДНК, полученным путем обработки BamHI и NdeI, с получением, таким образом, рекомбинантных плазмид pDZ-lysCP_N0862 и PDZ-lysCP1_N0862.

Пример 4. Анализ способности продуцировать лизин у штамма, продуцирующего лизин, происходящего от штамма с замененным промотором NCgl0862

Рекомбинантными плазмидами pDZ-lysCP_N0862 и pDZ-lysCP1_N0862, полученными в примере 3, трансформировали КССМ11016Р Corynebacterium glutamicum согласно способу с использованием электрического импульса (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). В соответствии с широко известной хромосомной гомологической рекомбинацией штаммы, в которых промотор lysC встраивался в промоторный сайт гена NCgl0862, были отобраны путем ПЦР (праймеры SEQ ID NO: 5 и 8). Отобранные рекомбинантные штаммы назвали Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::lysCP_N0862 и KCCM11016P::lysCP1_N0862 Corynebacterium glutamicum.

Для определения способности продуцировать лизин у таких полученных штаммов, продуцирующих лизин, KCCM11016P::lysCP_N0862 и KCCM11016P::lysCP1_N0862, штаммы культивировали на среде для посева и продукционной среде так же, как в примере 2. а затем анализировали концентрации лизина в каждой культуре, как показано ниже (см. таблицу 2).

Как показано в таблице 2, было подтверждено, что у штамма KCCM11016P::lysCP_N0862, в котором промотор был заменен промотором lysC дикого типа, способность продуцировать лизин повышалась в среднем на 1% по сравнению с родительским штаммом, КССМ11016Р, и что у штамма KCCM11016P::lysCP1_N0862, в котором промотор был заменен промотором lysCP1, способность продуцировать лизин повышалась в среднем на 4% по сравнению с родительским штаммом. Впоследствии штамм KCCM11016P::lysCP_1_N0862 назвали CA01-2269 и передали на депонирование в Корейский центр культур микроорганизмов (КССМ) 12 июня 2013 г. с номером доступа КССМ11430Р.

Пример 5. Получение вектора для дополнительного встраивания в хромосому гена NCgl0862

Для обеспечения встраивания необходимого гена в положение трапспозомного гена вектор pDZTN, сконструированный на основе вектора pDZ, применяли как основной вектор, конструируя и получая, таким образом, вектор, выполненный с возможностью дополнительного встраивания гена NCgl0862 из примера 2 в хромосомы.

На основе представленных последовательностей были синтезированы праймеры (SEQ ID NO: 7 и 12) для амплификации сайтов гена NCgl0862. Проводили ПЦР с применением хромосом АТСС 13032 Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, амплифицируя, таким образом, сайт ORF гена NCgl0862 размером приблизительно 370 п.о.

Вдобавок, были синтезированы праймеры (SEQ ID NO: 10 и 11) для амплификации сайтов промотора гена lysC. Проводили ПЦР с применением хромосом штамма для введения KCCM11016P-lysCP1 Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, амплифицируя, таким образом, промоторный сайт размером приблизительно 300 п.о. В этом случае условия ПЦР-амплификации включают денатурацию при 94°С в течение 5 минут, 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжиг при 56°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 30 секунд, а потом полимеризацию при 72°С в течение 7 минут.

Фрагменты генов, амплифицированных с помощью ПЦР, обрабатывали ферментами рестрикции SpeI и NdeI, чтобы, таким образом, получить из них фрагменты ДНК. Фрагменты ДНК лигировали в вектор pDZTN для встраивания в хромосому, который имеет концы для фермента рестрикции SpeI. Затем DH5α Е. coli трансформировали полученным в результате вектором и наносили на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонии, трансформированные вектором, содержащим встроенный в него необходимый ген, отбирали с помощью ПЦР (праймеры SEQ ID NO: 12 и 13), а плазмиды получали путем осуществления общеизвестного способа выделения плазмид и затем называли pDZTN-N0862.

Пример 6. Анализ способности продуцировать лизин у штамма с NCgl0862, дополнительно встроенным в хромосому

На основе гомологической рекомбинации хромосом вектор pDZTN-N0862. полученный в примере 5, применяли для трансформации штамма КССМ11016Р Corynebacterium glutamicum, продуцирующего L-лизин. Затем его колонии подвергали селективному скринингу с помощью ПЦР (с применением праймеров SEQ ID NO: 12 и 13), и полученный в результате штамм назвали KCCM11016P::N0862-Tn. KCCM11016P::N0862-Tn и контрольную группу в каждом случае культивировали так же, как в примере 2, а затем анализировали концентрации L-лизина в культурах, как показано ниже (см. таблицу 3).

В результате было подтверждено, что у KCCM11016P::N0862-Tn, который представлял собой штамм с дополнительно встроенным в хромосому геном NCgl0862, способность продуцировать лизин повышалась на 8% по сравнению с родительским штаммом КССМ11016Р.

Пример 7. Получение L-лизина с применением микроорганизма, происходящего от КССМ10770Р, содержащего NCgl0862, дополнительно встроенный в хромосому

Вектор pDZTN-N0862, полученный в примере 5. применяли для трансформации КССМ10770Р Corynebacterium glutamicum, который представлял собой штамм, продуцирующий лизин, в котором 7 типов генов, вовлеченных в путь биосинтеза L-лизина, дополнительно добавляли в его хромосому. Впоследствии штамм, в котором ген NCgl0862 был дополнительно встроен в хромосому, отбирали с помощью ПЦР, и полученный в результате штамм назвали KCCM10770P::N0862-Tn Corynebacterium glutamicum. Штамм культивировали так же, как в примере 2, а затем анализировали концентрации L-лизина в культуре, как показано ниже (таблица 4).

В результате было подтверждено, что способность продуцировать лизин повышалась на 5% по сравнению с родительским штаммом.

Пример 8. Получение L-лизина с применением микроорганизма, происходящего от CJ3P, содержащего NCgl0862, дополнительно встроенный в хромосому

Для определения эффектов в других штаммах, принадлежащих к Corynebacterium glutamicum, вектор pDZTN-N0862, полученный в примере 5, применяли для трансформации CJ3P Corynebacterium glutamicum. который представлял собой штамм, продуцирующий лизин, с 3 типами генных мутаций, связанных с улучшениями способности продуцировать L-лизин. Впоследствии штамм, в котором ген NCgl0862 был дополнительно встроен в хромосому, отбирали с помощью ПЦР, а полученный в результате штамм назвали CJ3P::N0862-Tn. Штамм культивировали также, как в примере 2, а затем анализировали концентрации извлеченного из него L-лизина, как показано ниже (см. таблицу 5).

В результате было подтверждено, что способность продуцировать лизин повышалась на 12% по сравнению с родительским штаммом.

Пример 9. Получение L-лизина с применением микроорганизма, происходящего от КССМ11347Р, содержащего NCgl0862, встроенный в хромосому

Для определения эффектов в других штаммах, принадлежащих к Corynebacterium glutamicum, вектор pDZTN-N0862 вводили в штамм КССМ11347Р Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-лизин (корейский патент №1994-0001307) таким же путем, как в примере 5, и полученный в результате штамм назвали KCCM11347P::N0862-Tn. Штамм культивировали также, как в примере 2, а затем анализировали концентрации извлеченного из него L-лизина. как показано ниже (см. таблицу 6).

В результате было подтверждено, что способность продуцировать лизин повышалась на 6% по сравнению с родительским штаммом.

Claims

1. Микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, с улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

2. Микроорганизм по п.1, где улучшенная экспрессия индуцируется посредством повышения числа копий генов, манипуляции с последовательностью, регулирующей экспрессию, или их комбинаций.

3. Микроорганизм по п.2, где манипуляция с последовательностью, регулирующей экспрессию, представляет собой модификацию промотора с помощью замены, изменение в стартовом кодоне или их комбинации.

4. Микроорганизм по п.1, где микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum.

5. Способ получения L-лизина, при этом способ предусматривает: культивирование микроорганизма по п.1 в среде и извлечение L-лизина из микроорганизма или среды.