KR101863456B1

KR101863456B1 - L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산방법

Info

Publication number: KR101863456B1
Application number: KR1020160152037A
Authority: KR
Inventors: 변효정; 김형준; 배현원; 유송기; 최향; 문준옥; 이경창; 최윤정
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2016-11-15
Publication date: 2018-06-01
Also published as: US10787690B2; BR112019009942A2; KR20180055010A; EP3543329A1; RU2720522C1; WO2018093033A1; CN110268046B; US20190352683A1; JP6859437B2; JP2019535271A; CN110268046A; MY189749A; EP3543329A4

Abstract

본원은 L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 생산방법 {A microorganism of the genus Corynebacterium and a method for producing L-lysine using the same}

본원은 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물, 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며, 주로 코리네박테리움 속 균주나 에세케리키아 속 균주를 이용한 발효에 의해 생산되고 있다. L-라이신의 생산을 위하여, 고효율 생산균주 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 구체적으로, L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-0838038호).

본 발명자들은 라이신 생산능을 증가시킬 수 있는 유효 형질을 탐색하고자 코리네박테리움 속 미생물의 내재적 유전자를 무작위적으로 도입시킴으로써 라이신의 고농도 생산과 관련된 유전자를 발굴하였으며, 코리네박테리움 속 미생물에서 상기 유전자의 발현량을 증가시킬 경우 L-라이신 생산능이 증가한다는 사실을 확인하여 본원을 완성하였다.

본원의 하나의 목적은 내재적 활성에 비하여 증가된 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물을 제공하는 것이다.

본원의 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 L-라이신의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본원의 하나의 양태는, 내재적 활성에 비하여 증가된 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본원에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 “HM1524 단백질”과 혼용되어 사용될 수 있다. 또한 이는 “HM1524 유전자에 의해 코딩되는 단백질”과 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질, 혹은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 활성을 가지는 경우라면 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또한 본원의 범위 내에 속한다.

본원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 서열번호 2의 염기 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 은

상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 상기 유전자 단편은 예를 들면, 적어도 약 50 뉴클레오티드, 60 뉴클레오티드, 70 뉴클레오티드, 80 뉴클레오티드, 90 뉴클레오티드, 또는 적어도 100 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.

본원에서, 용어, “내재적 활성”은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.

본원에서, 용어, “단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가”한다는 것은, 미생물이 가진 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성 증가는 외래의 HM1524를 도입하는 것과, 내재적으로 HM1524의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다.

구체적으로, 본원에서 활성 증가는,

1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,

4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는

5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.

다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

본원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.

본원에서 용어, “L-라이신”이란 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며, 화학식은 NH₂(CH₂)₄CH(CH₂)COOH인 L-아미노산의 일종을 의미한다. 또한, 상기 L-라이신은 염의 형태로 존재하는 경우에도 모두 본원의 범위에 포함될 수 있다.

본원에서 용어, “L-라이신을 생산하는 미생물”은 본원의 목적상 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물 균주로서, 구체적으로는 본원에 따른 조작에 의해 L-라이신을 고농도로 생산할 수 있는 균주를 의미한다. 따라서, 상기 미생물은 L-라이신을 생산할 수 있는 한, 그 모균주의 종류에 특별히 제한되지 않는다. 즉 본원에서 모균주는 L-라이신 생산능이 없는 균주 및 L-라이신 생산능이 있는 균주를 모두 포함할 수 있다. 상기 L-라이신 생산능은 자연적으로 발생한 것 또는 인위적으로 조작된 것을 모두 포함할 수 있다. 인위적으로 조작된 L-라이신 생산능을 갖는 미생물은, 예컨대 NTG (nitrosoguanidine) 등 돌연변이를 유발하는 물질에 의해 변이되어 L-라이신 생산능을 갖는 것일 수 있고, 또는 특정 목적 단백질의 발현 정도 또는 활성을 조절하여 L-라이신 생산능을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 특정 목적 단백질은 L-라이신 생합성 경로에 직접/간접적으로 작용하는 모든 단백질이 포함될 수 있으며, 이들의 발현 정도 또는 활성을 증가시키거나 감소시킴으로써 L-라이신 생산능을 갖도록 변이된 것일 수 있고, 또한 이들의 아미노산 서열 또는 염기서열상의 변이를 유도하여 L-라이신 생산능을 갖도록 한 것일 수도 있다. 상술한 NTG 등을 이용한 무작위 돌연변이 유도 및 특정 목적 단백질의 발현 조절을 포함하는 미생물의 인위적 조작은 공지된 기술로서 당업자에 의해 적절히 수행될 수 있다.

상기 미생물은, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 또는 브레비박테리움 페르멘툼 (Brevibacterium fermentum) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그 한 예로, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 사용할 수 있다. 그러나 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 이 외에도 공지된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이 사용될 수 있다.

공지된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 예로는 대한민국 등록특허 제10-0397322호 (또는 미국 공개특허 제2003-0124688호), 대한민국 등록특허 제10-0924065호 (또는 미국 공개특허 제2010-0143984호), 대한민국 등록특허 제10-0073610호, 또는/및 Binder et al., Genome Biology 2012, 13:R40에 기술된 미생물이 있으며, 상기 문헌의 내용 전체는 본원에 참고자료로서 전문이 포함된다.

다른 하나의 양태는, 내재적 활성에 비하여 증가된 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 이의 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법이다.

L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-라이신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본원의 상기 배양 단계에서 생산된 L-라이신을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-라이신을 회수 할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본원의 L-라이신 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 L-라이신을 높은 효율로 생산할 수 있다.

이하 본원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 코리네박테리움 속 미생물의 야생형 라이브러리 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 유전체 DNA를 추출한 후 제한효소 Sau3AI를 처리하고, 아가로스 겔 상에서 전기영동을 통해 DNA 절편을 크기에 따라 분리하여 3 ~ 4 kb의 DNA 절편들을 선택적으로 획득하였다. 이를 제한효소 BamHI 말단을 가지는 pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 연결한 후 대장균 DH5α에 도입하고, 카나마이신 (25 mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하여 형질전환된 콜로니를 획득하였다. 무작위의 100 개의 콜로니로부터 서열번호 3 및 4의 프라이머 이용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 목적한 3 ~ 4 kb 가량의 DNA 절편이 삽입된 벡터를 포함하는 콜로니의 비율이 90 % 이상임을 확인하였다. 획득한 모든 콜로니를 카나마이신 (25 mg/L)이 포함된 LB 액체배지에 접종하여 혼합 배양하고, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용해 플라스미드를 추출하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유전체 DNA 라이브러리를 완성하였다.

서열번호 3 : 5'-ACGACGGGATCAGTACCGA-3'

서열번호 4 : 5'-AGCTATCTGTCGCAGCGCC-3'

실시예 2 : 야생형 라이브러리를 도입한 라이신 생산 미생물의 제작 및 평가

실시예 1에서 제작한 유전체 DNA 라이브러리를 전기펄스법을 이용하여 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P (상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받음, 대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 도입한 후, 카나마이신 (25 mg/L) 이 포함된 복합평판 배지에 도말하고, 30 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 콜로니 약 2000 개를 획득하였다.

<복합평판배지>

포도당 20 g, (NH₄)₂SO₄ 50 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 5 g, K₂HPO₄ 10 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍, 한천 20 g, 카나마이신 25 mg (증류수 1L 기준)

96-웰 세포 배양접시의 각 웰에 복합액체배지 200 μl를 분주하고 획득한 콜로니를 각각 접종한 후 30 ℃, 1200 rpm의 조건으로 24 시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하고, 상등액 50 μl를 라이신 옥시다제 (lysine oxydase)를 함유하는 반응액에 혼합하였다.

<복합액체배지>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍, 카나마이신 25 mg (증류수 1 리터 기준)

<반응액>

라이신 옥시다제 (Sigma-Aldrich) 0.02 unit, 페록시다제 (peroxidase, Sigma-Aldrich) 0.2 unit, ABTS 2 mg (인산칼륨 완충용액 1 ml 기준)

그 다음, 30 분간 OD₄₀₅에서의 흡광도를 분석하여 대조구 (KCCM11016P/pECCG117)보다 높은 흡광도를 나타내는 15 종의 실험구를 선별하였다. 각 형질전환체의 라이신 생산능을 확인하기 위해, 카나마이신 (25 mg/L)이 포함된 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃, 200 rpm의 조건으로 20 시간 동안 진탕 배양하였다. 카나마이신 (25 mg/L)이 포함된 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종배양액을 접종하고, 37℃, 200 rpm에서 96 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 L-라이신 농도를 분석하였다 (표 1).

<종배지>

포도당 20 g, (NH₄)₂SO₄ 5 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1 리터 기준)

상기 결과로부터 대조구 대비 라이신 생산능이 증가한 효과를 보이는 KCCM11016P/H15와 KCCM11016P/M24를 선택하고, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 추출하였다. KCCM11016P/H15에서 유래된 플라스미드는 pEC-H15, KCCM11016P/M24에서 유래된 플라스미드는 pEC-M24로 명명하였다. 그 후, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 그 결과, 플라스미드 pEC-H15는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열이 포함되고, 플라스미드 pEC-M24는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있었다. 이를 통해 상기 2 종의 플라스미드에는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열이 공통적으로 포함되어 있음을 확인하였다. 이에, 서열번호 1의 아미노산 서열 코딩 유전자를 HM1524로 명명하였고, 이하 HM1524로 표기하였다.

실시예 3 : HM1524 유전자의 과발현 벡터 제작

상기 실시예 2로부터 확인된 HM1524의 효과를 확인하고자 해당 유전자를 과발현하기 위한 벡터를 제작하였다.

보고된 염기서열에 근거하여 HM1524 개시 코돈 상단 약 200 bp 부위로부터 종결 코돈 하단 약 50 bp를 포함하는 DNA 단편을 획득하기 위해 5' 말단에 Xho I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 5) 및 3' 말단에 Xho I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 6)를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 56℃ 30 초 어닐링, 72℃ 90 초 중합을 30 회 반복한 후, 72℃ 에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.

서열번호 5 : 5'-TCACTCGAGTGATGGCCAGGTTGTTGTC-3'

서열번호 6 : 5'-TCACTCGAGTTAGTCATAGGTACTAGTTT-3'

상기의 PCR 증폭 산물을 제한효소 Xho I으로 처리한 후, pECCG117 벡터를 제한효소 Xho I으로 처리하여 얻은 DNA 절편과 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR (서열번호 3 및 4)을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pECCG-HM1524 라 명명하였다.

실시예 4 : HM1524 유전자 과발현 벡터 도입 균주의 라이신 생산능 분석

상기 실시예 3에서 제조한 벡터 pECCG-HM1524를 전기펄스법을 이용하여 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입한 후, 카나마이신 (25 mg/L)이 포함된 복합평판 배지에 도말하고, 30℃에서 24 시간 동안 배양하여 콜로니를 획득하였다. 획득한 균주는 KCCM11016P/pECCG-HM1524로 명명하였고, 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 3 batch를 배양하여 배양액 중의 L-라이신 농도를 분석하였다 (표 2).

그 결과, 상기 HM1524 유전자가 과발현된 균주, KCCM11016P/pECCG-HM1524는 모균주인 KCCM11016P 대비 라이신 생산능이 6 % 증가된 것을 확인하였다.

실시예 5 : HM1524 유전자의 염색체 추가 삽입을 위한 벡터 제작

상기 실시예 4로부터 확인된 HM1524 유전자의 효과를 확인하고자 해당 유전자를 코리네박테리움의 염색체상에 추가 삽입하기 위한 벡터를 제작하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 Pcj7 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호)를 증폭하기 위해 Pcj7 프로모터의 5' 말단에 EcoR I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 7) 및 3' 말단에 Nde I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 8)와 Pcj7 프로모터의 5' 말단에 Spe I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 9) 및 3' 말단에 Sal I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 10)를 합성하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스의 유전체 DNA를 주형으로 하여 합성한 프라이머 (서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10)로 PCR을 수행한 결과 5' 말단에 EcoR I 제한효소 부위와 3' 말단에 Nde I 제한효소 부위를 포함하는 Pcj7 프로모터 DNA 단편과 5' 말단에 Spe I 제한효소 부위와 3' 말단에 Sal I 제한효소 부위를 포함하는 Pcj7 프로모터 DNA 단편을 각각 획득하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.

보고된 염기서열에 근거하여 HM1524 유전자의 ORF를 증폭하기 위해 개시코돈 위치에 Nde I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 11)와 종결코돈 하단에 Spe I 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 12)를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 유전체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11 및 12의 프라이머로 PCR을 수행한 결과 개시코돈 위치에 Nde I 제한효소 부위와 종결코돈 하단에 Spe I 제한효소 부위를 포함하는 HM1524 유전자 DNA 단편을 획득하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 56℃ 30 초 어닐링, 72℃ 90 초 중합을 30 회 반복한 후, 72℃ 에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.

서열번호 7 : 5'-TCAGAATTCTTCCTTCAGGCTAATCTTTT-3'

서열번호 8 : 5'-TCACATATGTGTTTCCTTTCGTTGGGTAC-3'

서열번호 9 : 5'-TCAACTAGTCTTCCTTCAGGCTAATCTTT-3'

서열번호 10 : 5'-TCAGTCGACTGTTTCCTTTCGTTGGGTAC-3'

서열번호 11 : 5'-TCACAT ATG CGCGTAGCTATGATTTC-3'

서열번호 12 : 5'-TCAACTAGT TTAGCCGTGATGCGTTTCAC-3'

상기 3 개의 PCR 증폭 산물을 각각 양 말단에 포함하는 제한효소로 처리한 후, pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호)를 제한효소 EcoR I과 Sal I으로 처리하여 얻은 DNA 절편과 연결하여 pDZ-Pcj7-HM1524 벡터를 제작하였다.

실시예 6 : HM1524 유전자 염색체 추가 삽입 균주 라이신 생산능 분석

상기 실시예 5에서 제작한 벡터 pDZ-Pcj7-HM1524를 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입하고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 콜로니 가운데 염색체 상의 HM1524 유전자의 종결 코돈 하단에 HM1524 유전자가 삽입된 콜로니를 선별하였다. PCR 방법으로 콜로니를 선별하기 위해 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하였다. 선별된 균주는 KCCM11016P::Pcj7-HM1524로 명명하였고, 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-라이신 농도를 분석하였다 (표 3).

서열번호 13 : 5'-GTCGAACACGCCAGAACATT-3'

서열번호 14 : 5'-TACTCTCACGATCTCACCCT-3'

그 결과, 상기 HM1524 유전자가 추가 삽입된 균주, KCCM11016P::Pcj7-HM1524는 모균주인 KCCM11016P 대비 라이신 생산능이 약 6 % 증가된 것을 확인하였다. 상기 KCCM11016P::Pcj7-HM1524 균주를 CA01-2297로 명명하고, 2016년 8월 2일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11876P를 부여 받았다.

실시예 7 : HM1524 유전자가 추가 삽입된 KCCM10770P 유래 미생물을 이용한 라이신 생산

상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-Pcj7-HM1524를 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P (대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 형질전환시켰다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P는 L-라이신 생합성 경로 관련 유전자 7 종이 염색체에 삽입된 것을 특징으로 한다. PCR 방법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, HM1524 유전자가 도입된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P::Pcj7-HM1524로 명명하였다. 그 다음, 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-라이신 농도를 분석하였다 (표 4).

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P::Pcj7-HM1524 균주는 모균주 대비 라이신 생산능이 약 5 % 증가된 것을 확인하였다.

실시예 8 : HM1524 유전자가 추가 삽입된 CJ3P 유래 미생물을 이용한 라이신 생산

상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-Pcj7-HM1524를 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 형질전환시켰다. 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P는 L-라이신 생산능 향상 관련 유전자 3 종이 염색체에 삽입된 것을 특징으로 한다. PCR 방법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, HM1524 유전자가 도입된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P::Pcj7-HM1524라고 명명하였다. 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-라이신 농도를 분석하였다 (표 5).

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P::Pcj7-HM1524 균주는 모균주 대비 라이신 생산능이 약 38 % 증가된 것을 확인하였다.

실시예 9 : HM1524 유전자가 추가 삽입된 KCCM11347P 유래 미생물을 이용한 라이신 생산

상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-Pcj7-HM1524를 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P (상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 대한민국 특허 등록번호 제10-0073610호)에 형질전환시켰다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P는 L-라이신 생산능 향상 관련 유전자 3 종이 염색체에 삽입된 것을 특징으로 한다. PCR 방법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, HM1524 유전자가 도입된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P::Pcj7-HM1524라고 명명하였다. 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-라이신 농도를 분석하였다 (표 6).

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P::Pcj7-HM1524 균주는 모균주 대비 라이신 생산능이 약 10 % 증가된 것을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, HM1524 유전자의 활성이 내재적 활성에 비해 증가된 균주는, 라이신 생산능이 증가한다는 것을 알 수 있으며, 이는 미생물에서 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 활성을 증가시켜 라이신을 대량생산할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터 (국외)

KCCM11876P

20160802

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism of the genus Corynebacterium and a method for producing L-lysine using the same <130> KPA151382-KR <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HM1524 amino acid <400> 1 Met Arg Val Ala Met Ile Ser Met His Thr Ser Pro Leu Gln Gln Pro 1 5 10 15 Gly Thr Gly Asp Ser Gly Gly Met Asn Val Tyr Ile Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Thr Glu Leu Ala Lys Gln Gly Ile Glu Val Asp Ile Tyr Thr Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Pro Ser Gln Gly Glu Ile Val Arg Val Ala Glu Asn Leu Arg 50 55 60 Val Ile Asn Ile Ala Ala Gly Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Lys Glu Glu 65 70 75 80 Leu Pro Thr Gln Leu Ala Ala Phe Thr Gly Gly Met Leu Ser Phe Thr 85 90 95 Arg Arg Glu Lys Val Thr Tyr Asp Leu Ile His Ser His Tyr Trp Leu 100 105 110 Ser Gly Gln Val Gly Trp Leu Leu Arg Asp Leu Trp Arg Ile Pro Leu 115 120 125 Ile His Thr Ala His Thr Leu Ala Ala Val Lys Asn Ser Tyr Arg Asp 130 135 140 Asp Ser Asp Thr Pro Glu Ser Glu Ala Arg Arg Ile Cys Glu Gln Gln 145 150 155 160 Leu Val Asp Asn Ala Asp Val Leu Ala Val Asn Thr Gln Glu Glu Met 165 170 175 Gln Asp Leu Met His His Tyr Asp Ala Asp Pro Asp Arg Ile Ser Val 180 185 190 Val Ser Pro Gly Ala Asp Val Glu Leu Tyr Ser Pro Gly Asn Asp Arg 195 200 205 Ala Thr Glu Arg Ser Arg Arg Glu Leu Gly Ile Pro Leu His Thr Lys 210 215 220 Val Val Ala Phe Val Gly Arg Leu Gln Pro Phe Lys Gly Pro Gln Val 225 230 235 240 Leu Ile Lys Ala Val Ala Ala Leu Phe Asp Arg Asp Pro Asp Arg Asn 245 250 255 Leu Arg Val Ile Ile Cys Gly Gly Pro Ser Gly Pro Asn Ala Thr Pro 260 265 270 Asp Thr Tyr Arg His Met Ala Glu Glu Leu Gly Val Glu Lys Arg Ile 275 280 285 Arg Phe Leu Asp Pro Arg Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Val Tyr Arg 290 295 300 Ala Ala Asp Ile Val Ala Val Pro Ser Phe Asn Glu Ser Phe Gly Leu 305 310 315 320 Val Ala Met Glu Ala Gln Ala Ser Gly Thr Pro Val Ile Ala Ala Arg 325 330 335 Val Gly Gly Leu Pro Ile Ala Val Ala Glu Gly Glu Thr Gly Leu Leu 340 345 350 Val Asp Gly His Ser Pro His Ala Trp Ala Asp Ala Leu Ala Thr Leu 355 360 365 Leu Asp Asp Asp Glu Thr Arg Ile Arg Met Gly Glu Asp Ala Val Glu 370 375 380 His Ala Arg Thr Phe Ser Trp Ala Ala Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ser 385 390 395 400 Leu Tyr Asn Asp Ala Ile Ala Asn Glu Asn Val Asp Gly Glu Thr His 405 410 415 His Gly <210> 2 <211> 1257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM1524 nucleotide <400> 2 atgcgcgtag ctatgatttc catgcacacc tctccattgc agcagcccgg aactggtgat 60 tcaggcggca tgaacgtcta cattctttcg accgcgactg agctagcgaa acagggtatc 120 gaggtcgata tttacactcg tgccacgagg ccttctcagg gtgagatcgt gagagtagct 180 gagaatttgc gggtcattaa tatcgctgcg gggccgtatg aggggctttc caaagaggag 240 cttcctactc agttggcggc gtttaccggc ggaatgttgt cgtttacgcg ccgggagaag 300 gttacttatg atctgatcca ttctcactat tggctgtctg gtcaggtggg gtggttgctg 360 cgcgatttgt ggcggattcc ccttattcat acggcacaca ctttggcggc ggtgaagaat 420 tcttatcggg atgattcgga cactccggag tcggaggcgc gtcgcatttg tgagcagcag 480 ctggtggata acgctgacgt gttggcggtg aacactcagg aggagatgca ggatttgatg 540 catcactacg atgcggatcc ggatcggatt tctgtggtgt caccgggtgc ggacgtggaa 600 ctttatagcc ctggaaatga tcgcgcgacg gaacgttccc gtcgtgagct gggcattccg 660 ctgcacacaa aggtagtggc ttttgtgggt cggttgcagc cgtttaaggg cccgcaggtg 720 ctgatcaagg cggttgcggc gttgtttgat cgcgatccgg accgaaatct gcgcgtcatt 780 atttgtggcg gcccttctgg tccgaatgcg acaccggata cctataggca tatggcagag 840 gaactgggcg tcgaaaagcg aattcgcttt ttggacccgc gcccgccgag cgagctagtg 900 gccgtgtatc gggcggcgga catcgtggcc gtgccaagtt ttaatgagtc cttcggactc 960 gtcgccatgg aggcgcaagc cagcggcaca ccggtcattg cggcccgggt tggcggcctg 1020 cccatcgcag tcgcggaagg ggagacggga ttgcttgtcg acggccactc cccgcatgcc 1080 tgggccgacg ccttagccac actcttggac gatgacgaaa cgcgcatcag aatgggtgaa 1140 gacgccgtcg aacacgccag aacattctcc tgggcggcca ccgccgcaca gctatcgtcg 1200 ctgtacaacg acgctattgc caacgaaaat gtcgacggtg aaacgcatca cggctaa 1257 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT genomic DNA library primer-1 <400> 3 acgacgggat cagtaccga 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT genomic DNA library primer-2 <400> 4 agctatctgt cgcagcgcc 19 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' XhoI primer <400> 5 tcactcgagt gatggccagg ttgttgtc 28 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' XhoI primer <400> 6 tcactcgagt tagtcatagg tactagttt 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' EcoRI primer <400> 7 tcagaattct tccttcaggc taatctttt 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' NdeI primer <400> 8 tcacatatgt gtttcctttc gttgggtac 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' SpeI primer <400> 9 tcaactagtc ttccttcagg ctaatcttt 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' SalI primer <400> 10 tcagtcgact gtttcctttc gttgggtac 29 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s-NdeI primer <400> 11 tcacatatgc gcgtagctat gatttc 26 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> 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gaaactcgac ctcttaaatc ggcgtctact tgccgagctt cttcaacgtc 540 cactcgtgcg gggcctgagt tgcaaatccc caccacaaat tgctctgatt agtggatttg 600 tggtggattt ttgcgtcttc gctatctgaa accgcgagga tccaccacag attcgagttt 660 tcctttgaaa cgtggttgat ccttgccctg gaatctttca ggaatcacat cagtcccact 720 ggttacaaag tggaaacccc tcagaatcgc ttctgggggg tgaactagcg ccagttgggg 780 taagtgccca tttgggaaac tcgacctctt aaatcggcgt ctacttgccg agcttcttca 840 acaactccgc ctgcacttca cgacgcctaa tcttgcccat ctgatcccgc ggcatctcct 900 caaagtggta gaaagtgcgc ggaaccttgt agcgggtgag gttcttgcgg gcgaattcct 960 tcaggccatc cggatccagc gctgcacctt ccaccaaagt gatggcagca acgacgtttt 1020 cggagccgtc ttcacgcggg ataccaacga ctgcggaatc ttcaatgtct gggtgctctg 1080 cgaggacttc ttcaacctca gctgggtaca cgttgaaacc gccagtgatg atgacttcct 1140 tgatgcgagc aactaggcgg atgaacccgt cttcttccat cactccgacg tcgccggtgc 1200 ggtaccactc gccgtggaag ctgttcttgg tggcttcttc ctggttgagg taacccttga 1260 acacctgtgg gcccttgact aggacttcgc cttcgctgcc gtcgggcatg gtttcgtcga 1320 ggttttctgg gtttgcgatg cgcacgatgg tgtcggggaa ggggattcct acgtagcctt 1380 ggcgtcggtg atcgctcatg gggttaccca cgatgatggg ggaggtttcg gtgaggccgt 1440 agccttcgac gaggcgtccg ccggtgtgct tttcccagcg ttcaacggtg cgctgggaga 1500 gtgtggatgc accggagaag gcgttgcgga ctcccttgat ggggattcct tctttttcgg 1560 aggcgtcgac gattttttcg taaagggtgg gcacgcctgg tagccaggtt ggggtgtgct 1620 ttttcattac gttcatgatc aggtcgatgc gtggggtggg aagtagcacc atttcgccac 1680 cgatgaacac ggacagtgtg ccgaccatgg tcagaccgta tgcgtggaac attggtaggg 1740 ctgcaagcat gcgttctggt ttgtctccga gacctggaac ccagtgcttt ccttggagga 1800 gattggagaa caggtttccg tgggtgagct gggcaccctt ggggcgtccg gtggtgccgg 1860 aggtgtagag gatcagcgcg acggattctt tggtcacggt gggttctgaa actacgtcgt 1920 cgccgtcgcc gcccattgct gcgctggtca gggtttcaaa aggaacggtg ttgggggctg 1980 cgccggagag ggattcgcgg ctcttgcgca gtgcagggat tgggagccga agtgctaggc 2040 gctggagtgg tggcatcgcg ttgatcatgt tgaccgacac gatggtttcc aactgggtct 2100 gtccacgtag ctgttcgacg gtgggggagg ctttgtccca gacgatggca acgcgggcac 2160 cgtggtcttt gaagggttcg agcagttcgt gggcggtgta gagcgggttg tgctcaatga 2220 ctactgcgcc gagtttcagc actgcgtaga aagctgcgat gtgctgtggg cagttgggga 2280 ggataatcgc tacgtgatcg ccggggcgga cacctagtgc gcgcaggcca gcggcagttt 2340 tgcggacttc tttgtccagt tcaccgtagg tttgtgaacg accgaaaaag taggtggctg 2400 gcttgtctgc gttgatggcc aggttgttgt cgtaaacgtc cagcagggtg gtgtcgccat 2460 attccagcga gtgtggcgtc cactctgggt agtgctggag ccattctttg gtttcgtatg 2520 ctgacatggt gtcccttcaa ctgcgttgct ttagtgccct ttagtatata gagacgtccc 2580 gctgctttct tcggcgatct agaatgtggg catgcgcgta gctatgattt ccatgcacac 2640 ctctccattg cagcagcccg gaactggtga ttcaggcggc atgaacgtct acattctttc 2700 gaccgcgact gagctagcga aacagggtat cgaggtcgat atttacactc gtgccacgag 2760 gccttctcag ggtgagatcg tgagagtagc tgagaatttg cgggtcatta atatcgctgc 2820 ggggccgtat gaggggcttt ccaaagagga gcttcctact cagttggcgg cgtttaccgg 2880 cggaatgttg tcgtttacgc gccgggagaa ggttacttat gatctgatcc attctcacta 2940 ttggctgtct ggtcaggtgg ggtggttgct gcgcgatttg tggcggattc cccttattca 3000 tacggcacac actttggcgg cggtgaagaa ttcttatcgg gatgattcgg acactccgga 3060 gtcggaggcg cgtcgcattt gtgagcagca gctggtggat aacgctgacg tgttggcggt 3120 gaacactcag gaggagatgc aggatttgat gcatcactac gatgcggatc cggatcggat 3180 ttctgtggtg tcaccgggtg cggacgtgga actttatagc cctggaaatg atcgcgcgac 3240 ggaacgttcc cgtcgtgagc tgggcattcc gctgcacaca aaggtagtgg cttttgtggg 3300 tcggttgcag ccgtttaagg gcccgcaggt gctgatcaag gcggttgcgg cgttgtttga 3360 tcgcgatccg gaccgaaatc tgcgcgtcat tatttgtggc ggcccttctg gtccgaatgc 3420 gacaccggat acctataggc atatggcaga ggaactgggc gtcgaaaagc gaattcgctt 3480 tttggacccg cgcccgccga gcgagctagt ggccgtgtat cgggcggcgg acatcgtggc 3540 cgtgccaagt tttaatgagt ccttcggact cgtcgccatg gaggcgcaag ccagcggcac 3600 accggtcatt gcggcccggg ttggcggcct gcccatcgca gtcgcggaag gggagacggg 3660 attgcttgtc gacggccact ccccgcatgc ctgggccgac gccttagcca cactcttgga 3720 cgatgacgaa acgcgcatca gaatgggtga agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc 3780 ctgggcggcc accgccgcac agctatcgtc gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa 3840 tgtcgacggt gaaacgcatc acggctaagt aaacgcgcgt cgtggaacat aaagtggcaa 3900 actagtacct atgactaacg gaaaattgat tcttcttcgt cacggtcaga gcgaatggaa 3960 cgcatccaac cagttcactg gatgggtcga cgtcaatctg accgaacagg gtgaggctga 4020 ggccaagcgc ggaggcgaac tcctcgtcga ggcaggcgtc ctcccaggcg ttgtatacac 4080 ctccttgctg cgtcgcgcga tc 4102 <210> 16 <211> 3181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEC-M24 <400> 16 gatcgccggg gcggacacct agtgcgcgca ggccagcggc agttttgcgg acttctttgt 60 ccagttcacc gtaggtttgt gaacgaccga aaaagtaggt ggctggcttg tctgcgttga 120 tggccaggtt gttgtcgtaa acgtccagca gggtggtgtc gccatattcc agcgagtgtg 180 gcgtccactc tgggtagtgc tggagccatt ctttggtttc gtatgctgac atggtgtccc 240 ttcaactgcg ttgctttagt gccctttagt atatagagac gtcccgctgc tttcttcggc 300 gatctagaat gtgggcatgc gcgtagctat gatttccatg cacacctctc cattgcagca 360 gcccggaact ggtgattcag gcggcatgaa cgtctacatt ctttcgaccg cgactgagct 420 agcgaaacag ggtatcgagg tcgatattta cactcgtgcc acgaggcctt ctcagggtga 480 gatcgtgaga gtagctgaga atttgcgggt cattaatatc gctgcggggc cgtatgaggg 540 gctttccaaa gaggagcttc ctactcagtt ggcggcgttt accggcggaa tgttgtcgtt 600 tacgcgccgg gagaaggtta cttatgatct gatccattct cactattggc tgtctggtca 660 ggtggggtgg ttgctgcgcg atttgtggcg gattcccctt attcatacgg cacacacttt 720 ggcggcggtg aagaattctt atcgggatga ttcggacact ccggagtcgg aggcgcgtcg 780 catttgtgag cagcagctgg tggataacgc tgacgtgttg gcggtgaaca ctcaggagga 840 gatgcaggat ttgatgcatc actacgatgc ggatccggat cggatttctg tggtgtcacc 900 gggtgcggac gtggaacttt atagccctgg aaatgatcgc gcgacggaac gttcccgtcg 960 tgagctgggc attccgctgc acacaaaggt agtggctttt gtgggtcggt tgcagccgtt 1020 taagggcccg caggtgctga tcaaggcggt tgcggcgttg tttgatcgcg atccggaccg 1080 aaatctgcgc gtcattattt gtggcggccc ttctggtccg aatgcgacac cggataccta 1140 taggcatatg gcagaggaac tgggcgtcga aaagcgaatt cgctttttgg acccgcgccc 1200 gccgagcgag ctagtggccg tgtatcgggc ggcggacatc gtggccgtgc caagttttaa 1260 tgagtccttc ggactcgtcg ccatggaggc gcaagccagc ggcacaccgg tcattgcggc 1320 ccgggttggc ggcctgccca tcgcagtcgc ggaaggggag acgggattgc ttgtcgacgg 1380 ccactccccg catgcctggg ccgacgcctt agccacactc ttggacgatg acgaaacgcg 1440 catcagaatg ggtgaagacg ccgtcgaaca cgccagaaca ttctcctggg cggccaccgc 1500 cgcacagcta tcgtcgctgt acaacgacgc tattgccaac gaaaatgtcg acggtgaaac 1560 gcatcacggc taagtaaacg cgcgtcgtgg aacataaagt ggcaaactag tacctatgac 1620 taacggaaaa ttgattcttc ttcgtcacgg tcagagcgaa tggaacgcat ccaaccagtt 1680 cactggatgg gtcgacgtca atctgaccga acagggtgag gctgaggcca agcgcggagg 1740 cgaactcctc gtcgaggcag gcgtcctccc aggcgttgta tacacctcct tgctgcgtcg 1800 cgcgatccgc actgcaaaca tcgcactgaa cgctgcagac cgccactgga tcccagtgat 1860 ccgcgactgg cgcctcaacg agcgtcacta cggcgcactg cagggccttg acaaggctgc 1920 aaccaaggaa aaatacggcg acgaccagtt catggaatgg cgccgctcct acgacacccc 1980 accaccagag ctcgcggatg acgcagagta ctcccaggca aatgaccctc gttacgcgga 2040 cctcgacgta gttccacgca ccgaatgcct caaggacgtt gtggttcgtt ttgttcctta 2100 cttcgaggaa gaaatcctgc cacgcgcaaa gaagggcgaa accgtcctca tcgcagcaca 2160 cggcaactcc ctgcgtgcgc tggttaagca ccttgacggc atctccgatg ctgatatcgc 2220 agagctcaac atcccaaccg gcatcccact ggtctacgaa atcgccgaag acggttccgt 2280 agtaaaccca ggcggcacct acctcgatcc tgaggcagca gcagccggcg cagcagcagt 2340 agcaaaccag ggtaataagt agctatttgt aggtgagcac tcttcttgct ttcgtattgg 2400 gcgtggtcct catgggcctc gccctacctg cgtatacgaa aattaaagat cggatgcgtc 2460 gccacaagtc cgcggtcacc ctgtccgaaa accaggtcac cacggtgggg caggtcctcc 2520 acctggcgat tcaaggctcc ccaacgggaa tcacggttgt cgatcgcacc ggcgacgtca 2580 tcttatccaa cggccgcgcc cacgaattgg gcatcgtcca cgaaagatcc gtcgacggca 2640 acgtttggcg cgtcgcccag gaagccttcc aagaccaaga aacccactca ctcgacgtcc 2700 acccagaccg caatccgcgg cgcccgggta gtcgcatcac cgcagtgcag gcagtggtca 2760 agcctttaac gcttatcgac gatcgtttcg tgatcatcta tgcctccgac gaatccgaaa 2820 acgtgcgcat ggaatcggca cgccgagact tcgtcgcaaa cgtctcccac gaactgaaaa 2880 cccccgtcgg cggcatggca ctcctcgcgg aagccctcat ggaatcctcc gacgacccag 2940 aacaagtcga atacttcgga tccaggctcc accgcgaagc ccaccgcatg gccgacatga 3000 tcaacgaact gatctccctt tccaaacttc agggcgccga acgactccct gatatggaac 3060 ccgtccaggc tgacgacatc atcagcgaag ccatcgaacg cacccaactc gccgccgaca 3120 acgccaacat cgaaatcatt cgcggcgacc gcaccggcgt ttgggtagaa gccgatcgat 3180 c 3181

Claims

내재적 활성에 비하여 증가된 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 미생물.
삭제
내재적 활성에 비하여 증가된 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 또는 이의 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법.
삭제