JP2023506053A - クエン酸シンターゼの活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドを含み、ロイシンを生産する微生物、及び前記微生物を用いたＬ－アミノ酸生産方法に関する。
Description
本出願は、クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドを含む微生物、及び前記微生物を用いたＬ－アミノ酸生産方法に関する。
コリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられているグラム陽性微生物である。前記Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。例えば、Ｌ－リシンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献１）。
一方、Ｌ－アミノ酸のうちＬ－リシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－グリシンは、アスパラギン酸由来アミノ酸であり、アスパラギン酸の前駆体であるオキサロ酢酸（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）の合成レベルが前記Ｌ－アミノ酸の合成レベルに影響を及ぼす。
クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＣＳ）は、微生物の解糖過程で生成されるアセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を重合してクエン酸を生成する酵素であると共に、ＴＣＡ回路への炭素流入を決定する重要な酵素である。
クエン酸シンターゼをコードするｇｌｔＡ遺伝子の欠損によるＬ－リシン生産菌株のｐｈｅｎｏｔｙｐｅ変化に関する内容は、先行技術文献で報告されている（非特許文献１）。しかし、ｇｌｔＡ遺伝子欠損菌株においては、菌株の生長が阻害されるだけでなく、糖消費速度が大幅に低下して単位時間当たりのリシン生産量が低下するという欠点がある。よって、効果的なＬ－アミノ酸生産能の向上及び菌株の生長を共に考慮した研究が依然として求められている現状である。
Ｏｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０９（８）：２０７０－２０８１，２０１２
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Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０
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本発明者らは、特定のレベルにクエン酸シンターゼ活性を弱化させた新規な変異型ポリペプチドを用いるとＬ－アミノ酸の生産量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物を提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アミノ酸生産方法を提供する。
本出願のクエン酸シンターゼの基質に対する活性が変化した、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培養すると、従来の非改変ポリペプチドを有する微生物に比べて高収率でＬ－アミノ酸を生産することができる。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本出願において、配列番号１の配列は、クエン酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列であってもよい。具体的には、配列番号１の配列は、ｇｌｔＡ遺伝子によりコードされるクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質配列であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｎ）由来のものであるが、これに限定されるものではなく、前記アミノ酸配列を含むタンパク質と同じ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列であればいかなるものでもよい。また、本出願におけるクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質は、たとえ配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であると定義したとしても、配列番号１のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、本出願のクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質に含まれることは当業者にとって自明である。具体的には、本出願のクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、そのような相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願の変異対象となるタンパク質に含まれることは言うまでもない。
本出願における「クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」とは、微生物の解糖過程で生成されるアセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を重合してクエン酸を生成する酵素であって、ＴＣＡ回路への炭素流入を決定する重要な酵素である。具体的には、クエン酸合成酵素としてＴＣＡ回路の最初の段階で速度調節の役割を果たす。また、前記酵素は、アセチルＣｏＡと４炭素オキサロ酢酸の分子からの２炭素酢酸残基の縮合反応を触媒して６炭素酢酸を形成する。本出願における前記クエン酸シンターゼは、クエン酸合成酵素、ＣＳ、ＧｌｔＡタンパク質又はＧｌｔＡと混用されてもよい。
本出願における「変異型（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により上記列挙した配列（ｔｈｅ ｒｅｃｉｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは異なるが、前記タンパク質の機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）又は特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを意味する。変異型ポリペプチドは、数個のアミノ酸置換、欠失又は付加により識別される配列（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは異なる。このような変異型は、一般に前記ポリペプチド配列の１つを改変し、その改変したポリペプチドの特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異型の能力は、本来のタンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）より向上するか、変わらないか又は低下する。このような変異型は、一般に前記ポリペプチド配列の１つを改変し、その改変したポリペプチドの反応性を評価することにより識別することができる。また、一部の変異型には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）などの少なくとも１つの部分が除去された変異型も含まれる。他の変異型には、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異型も含まれる。
本出願における「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記変異型は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有すしてもよい。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン及びトリプトファンが挙げられる。通常、保存的置換は、生成されるポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
また、変異型は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）又は翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移転（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
本出願における「クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチド」とは、クエン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一部が置換されることにより野生型より弱化したクエン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドを意味する。本出願においては、クエン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列上で少なくとも１つのアミノ酸が変異し、その活性が野生型と比較して弱化することにより、炭素の流れを効率的に均衡にする変異型ポリペプチドを意味する。
具体的には、前記変異型ポリペプチドは、前記クエン酸シンターゼ活性を有する様々なタンパク質において、配列番号１のアミノ酸配列の３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドである。前記「他のアミノ酸」とは、置換前とは異なるアミノ酸を意味し、置換前のアミノ酸を除くアミノ酸であればいかなるものでもよい。
より具体的には、前記変異型ポリペプチドは、前記クエン酸シンターゼ活性を有する様々なタンパク質において、配列番号１のアミノ酸配列の３１２番目の位置に相当するメチオニンが他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドであってもよい。前記メチオニンがアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に置換されたものであり、より具体的には、イソロイシンに置換された変異型配列であるが、これらに限定されるものではない。
また、前述したように置換されたアミノ酸残基には、天然アミノ酸だけでなく、非天然アミノ酸も含まれる。前記非天然アミノ酸としては、例えばＤ－アミノ酸、ホモ（Ｈｏｍｏ）アミノ酸、β－ホモ（Ｂｅｔａ－ｈｏｍｏ）アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、α－メチルアミノ酸、異常アミノ酸（例えば、シトルリンやナフチルアラニンなど）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
本出願における「相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、タンパク質もしくはペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はタンパク質もしくはペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基を意味する。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は比較タンパク質における類似する位置を意味する。
本出願において、本出願に用いられるポリペプチド内のアミノ酸残基位置に特定ナンバリングが用いられる。例えば、比較する対象のポリペプチドと本出願のポリペプチドの配列をアラインメントすることにより、本出願のポリペプチドのアミノ酸残基位置に相当する位置を再ナンバリングすることができる。
本出願が提供する、クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、前述したクエン酸シンターゼにおいて特異的位置のアミノ酸が置換され、Ｌ－アミノ酸の生産能が変異前のポリペプチドに比べて向上したものであってもよい。
前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、１００％未満の配列相同性を有するものであるが、これに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するものであり、また、そのような相同性を有して前記タンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、３１２番目の位置のアミノ酸配列以外に、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
また、本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記変異型ポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、特定の活性を付与する特定の３１２番目の変異以外に、当該配列番号のアミノ酸配列の前後への無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除外するものではなく、そのような配列付加や突然変異を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
配列番号１のアミノ酸配列において３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むものであってもよい。より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において３１２番目の位置に相当するメチオニンがイソロイシンに置換された変異型ポリペプチドは、配列番号３からなるものであってもよい。また、前記変異型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、又はそれと８０％以上、１００％未満の相同性を有するアミノ酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドには、配列番号３、及び配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するポリペプチドが含まれる。また、そのような相同性を有して前記タンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、３１２番目の位置のアミノ酸配列以外に、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
本出願の目的上、前記クエン酸シンターゼの活性が弱化した変異型ポリペプチドを含む微生物は、Ｌ－アミノ酸の収率は増加するが、糖消費速度は対照群と同程度であることを特徴とする。これは、クエン酸シンターゼの活性調節により、ＴＣＡ回路への炭素の流れと、Ｌ－アミノ酸生合成の前駆体として用いられるオキサロ酢酸の供給量間の好適な均衡が得られ、Ｌ－アミノ酸生産量が増加することを示唆するものである。
前記「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）間の同一性の割合を意味する。与えられたアミノ酸配列又は塩基配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。本出願において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「相同性率」で表される。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定される。例えば、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメーター（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献２、３）で決定されてもよい。
本出願の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
配列番号１のアミノ酸配列、クエン酸シンターゼ及び変異型ポリペプチドについては前述した通りである。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願のポリヌクレオチドは、本出願のクエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。本出願において、クエン酸シンターゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｇｌｔＡ遺伝子であり、前記遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のものであるが、これらに限定されるものではない。また、前記遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、より具体的には配列番号２の塩基配列を含む配列であるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。例えば、本出願の変異型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であるが、これに限定されるものではない。より具体的には、配列番号４で表されるポリヌクレオチド配列からなるものであるが、これに限定されるものではない。
また、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列において３１２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献２）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性もしくは同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ΥＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ΥＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ΥＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献４参照）。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
配列番号１のアミノ酸配列、クエン酸シンターゼ、変異型ポリペプチド及びポリヌクレオチドについては前述した通りである。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＣＲ２．１、ｐＤＣ、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
本出願に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行うことができるが、これに限定されるものではない。また、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。
また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。
前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＣａＨＰＯ４又はＣａ３（ＰＯ４）２）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物を提供する。
配列番号１のアミノ酸配列、クエン酸シンターゼ、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びベクターについては前述した通りである。
前記微生物は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物であるが、これらに限定されるものではない。
また、前記微生物は、野生型ポリペプチドを含む微生物に比べて微生物の生育や糖消費速度が阻害されることなく、Ｌ－アミノ酸の生産能が向上し、その微生物からＬ－アミノ酸を高収率で得ることのできるものである。
本出願における「変異型ポリペプチドを含む微生物」とは、自然に弱いＬ－アミノ酸生産能を有する微生物、又はＬ－アミノ酸生産能のない親株にＬ－アミノ酸生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、クエン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドに少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型ポリペプチドを発現する微生物であり、前記アミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むものである。前記微生物から発現するクエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、弱化した活性を有するものであるが、これに限定されるものではない。
前記微生物は、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて変異型ポリペプチドを発現する細胞又は微生物であり、本出願の目的上、前記宿主細胞又は微生物は、前記変異型ポリペプチドを含み、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物であればいかなるものでもよい。
本出願における「Ｌ－アミノ酸を生産する微生物」とは、自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は弱化されるなどの原因により、特定機序が強化又は弱化された微生物であって、目的とするＬ－アミノ酸生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を弱化させた微生物である。本出願の目的上、前記Ｌ－アミノ酸を生産する微生物とは、前記変異型ポリペプチドを含み、培地中の炭素源から目的とするＬ－アミノ酸を野生型や非改変微生物と比較して過剰量で生産する微生物を意味する。本出願における前記「Ｌ－アミノ酸を生産する微生物」は、「Ｌ－アミノ酸生産能を有する微生物」又は「Ｌ－アミノ酸生産微生物」と混用されてもよい。
前記Ｌ－アミノ酸生産微生物が生産するＬ－アミノ酸は、ロイシン、リシン、バリン、イソロイシン及びＯ－アセチルホモセリンからなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
例えば、前記Ｌ－アミノ酸を生産する微生物には、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などの微生物菌株が含まれる。具体的には、コリネバクテリウム属微生物であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物は、コリネバクテリウム属微生物にイソプロピルリンゴ酸シンターゼの変異体［ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）］を導入してＬ－ロイシン生産能を有するようにしたＣＪＬ－８１００菌株、コリネバクテリウム属微生物に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ），ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ），ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を導入してＬ－リシン生産能を有するようにしたコリネバクテリウムＣＪ３Ｐ（非特許文献５）、バリン生産菌株であるコリネバクテリウムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献２）、Ｌ－イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献３）、又はコリネバクテリウム属微生物に、Ｏ－アセチル－ホモセリン分解経路であるシスタチオニンγ－シンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子とＯ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子を欠損させ、Ｏ－アセチル－ホモセリン生合成を増大させるために、アスパルトキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子のＬ－リシン（Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）及びＬ－トレオニン（Ｌ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）（特許文献４）を導入してＯ－アセチル－ホモセリン生産能を有するようにしたコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これらに限定されるものではない。本出願の目的上、前記Ｌ－アミノ酸を生産する微生物は、前記変異型ポリペプチドをさらに含み、目的とするＬ－アミノ酸の生産能が向上したものであってもよい。
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。より具体的には、本出願におけるコリネバクテリウム属微生物は、クエン酸シンターゼ活性が非改変微生物より弱化しながらも、Ｌ－アミノ酸の収率は増加し、糖消費速度は同程度であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アミノ酸生産方法を提供する。
配列番号１のアミノ酸配列、クエン酸シンターゼ、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物については前述した通りである。
前記方法は、当該技術分野で公知の最適化された培養条件及び酵素活性条件において当業者が容易に決定することができる。具体的には、微生物の培養は、特に限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行うことができる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。上記培養により生産されたＬ－アミノ酸は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含むが、これらに限定されるものではない。
前記方法は、前記培養ステップの後に、培養した培地又は微生物からＬ－アミノ酸を回収するステップをさらに含むが、これらに限定されるものではない。
前記培養ステップで生産されたＬ－アミノ酸を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－アミノ酸を回収することができる。
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。よって、前述したように回収されるＬ－アミノ酸は、精製された形態であってもよく、Ｌ－アミノ酸を含有する微生物発酵液であってもよい。
前記Ｌ－アミノ酸は、ロイシン、リシン、バリン、イソロイシン及びＯ－アセチルホモセリンからなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、前記クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むコリネバクテリウム属微生物又はその培養液を含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供する。
前記微生物は、コリネバクテリウム属であり、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これらに限定されるものではない。これらについては、前述した通りである。
前記Ｌ－アミノ酸生産用組成物とは、本出願のクエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドによりＬ－アミノ酸を生産する組成物を意味する。前記組成物は、前記クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、又は前記クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを作動させる構成を含むものであればいかなるものでもよい。前記クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるようにベクターに含まれる形態であってもよい。
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然発生（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の物質、又は自然発生の物質であるが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、前記微生物が自然に接触しない物質、又は前記微生物と自然に同時に含まれない物質であるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、前記クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むコリネバクテリウム属微生物のＬ－アミノ酸生産における使用を提供する。
以下、実施例を挙げて本出願を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
ｇｌｔＡ変異の発見
１－１．ｇｌｔＡを含むベクターの作製
クエン酸シンターゼ活性を有するｇｌｔＡ変異ライブラリーを作製するために、まずｇｌｔＡの一部を含む組換えベクターを作製した。野生型ｇｌｔＡのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｎ）野生株の染色体を鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、上記増幅産物をＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ－ｇｌｔＡを得た。
１－１．ｇｌｔＡを含むベクターの作製
クエン酸シンターゼ活性を有するｇｌｔＡ変異ライブラリーを作製するために、まずｇｌｔＡの一部を含む組換えベクターを作製した。野生型ｇｌｔＡのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｎ）野生株の染色体を鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、上記増幅産物をＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ－ｇｌｔＡを得た。
１－２．ｇｌｔＡ変異ライブラリーの作製
実施例１－１で作製したベクターに基づいてｇｌｔＡ変異ライブラリーを作製した。ライブラリーは、エラープローン（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲキット（ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて作製した。変異が起こる条件で、配列番号５及び６をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１０００ｂｐ当たり０～３つの変異が起こる条件で、９４℃で３０秒間予熱処理（ｐｒｅ－ｈｅａｔｉｎｇ）し、その後９４℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間の過程を２５サイクル行った。ここで、得られたＰＣＲ産物をメガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ，５００～１２５ｎｇ）として、９５℃で５０秒間、６０℃で５０秒間、６８℃で１２分間の過程を２５サイクル行い、その後ＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー２０種を選択してプラスミドを得て、ポリヌクレオチド配列を分析した結果、２変異／ｋｂの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。約２０，０００個の形質転換した大腸菌コロニーを採取してプラスミドを抽出した。これをｐＴＯＰＯ－ｇｌｔＡ－ライブラリーと命名した。
実施例１－１で作製したベクターに基づいてｇｌｔＡ変異ライブラリーを作製した。ライブラリーは、エラープローン（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲキット（ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて作製した。変異が起こる条件で、配列番号５及び６をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１０００ｂｐ当たり０～３つの変異が起こる条件で、９４℃で３０秒間予熱処理（ｐｒｅ－ｈｅａｔｉｎｇ）し、その後９４℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間の過程を２５サイクル行った。ここで、得られたＰＣＲ産物をメガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ，５００～１２５ｎｇ）として、９５℃で５０秒間、６０℃で５０秒間、６８℃で１２分間の過程を２５サイクル行い、その後ＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー２０種を選択してプラスミドを得て、ポリヌクレオチド配列を分析した結果、２変異／ｋｂの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。約２０，０００個の形質転換した大腸菌コロニーを採取してプラスミドを抽出した。これをｐＴＯＰＯ－ｇｌｔＡ－ライブラリーと命名した。
本実施例において用いたプライマーを表１に示す。
作製したライブラリーの評価及び変異体の選択
実施例１－２で作製したｐＴＯＰＯ－ｇｌｔＡ－ライブラリーをコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｎ）ＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションで形質転換し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）１００００と命名した。
実施例１－２で作製したｐＴＯＰＯ－ｇｌｔＡ－ライブラリーをコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｎ）ＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションで形質転換し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）１００００と命名した。
確保した１０，０００個のコロニーのうち、ロイシン生産が増加したコロニーを確認するために、各コロニーに対して次の方法で発酵力価評価を行った。
・生産培地：グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質（Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ）２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１，０００μｇ，パントテン酸カルシウム２，０００μｇ，ニコチンアミド３，０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中），ｐＨ７．０
加圧殺菌した生産培地２５ｍｌと２５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各コロニーを白金耳で接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養した。培養終了後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＳＨＩＭＡＺＤＵ ＬＣ２０Ａ）を用いた方法によりロイシン生産量を測定し、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株に比べてロイシン生産能が最も向上した菌株１種を選択した。選択した菌株から生産されたロイシン濃度を表２に示す。
加圧殺菌した生産培地２５ｍｌと２５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各コロニーを白金耳で接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養した。培養終了後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＳＨＩＭＡＺＤＵ ＬＣ２０Ａ）を用いた方法によりロイシン生産量を測定し、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株に比べてロイシン生産能が最も向上した菌株１種を選択した。選択した菌株から生産されたロイシン濃度を表２に示す。
次に、前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号７及び８のプライマーを用いて、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）３１４２菌株においてＰＣＲとシーケンシングを行い、ｇｌｔＡ遺伝子を野生型ＡＴＣＣ１３０３２と比較した。前記菌株は、ｇｌｔＡ遺伝子に変異を含むことが確認された。
具体的には、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）３１４２菌株は、ｇｌｔＡ遺伝子の９３６番目のヌクレオチドであるＧがＣに置換されていることが確認された。これは、ｇｌｔＡのアミノ酸配列において３１２番目のメチオニンがイソロイシンに置換される変異である。よって、以下の実施例においては、前記変異がコリネバクテリウム属微生物のロイシン生産量に影響を及ぼすか否かについて確認する。
ｇｌｔＡ選択変異のロイシン生産能の確認
３－１．ｇｌｔＡ変異を含む挿入ベクターの作製
実施例２で選択した変異を菌株に導入するために、挿入用ベクターを作製した。ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入用ベクターの作製には、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の染色体を鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマー対、配列番号１１及び１２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、得られた遺伝子断片をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣベクターとインフュージョン（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ）酵素を用いてＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列を結合させてクローニングし、３１２番目のアミノ酸であるメチオニンをイソロイシンに置換するベクターｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を作製した。
３－１．ｇｌｔＡ変異を含む挿入ベクターの作製
実施例２で選択した変異を菌株に導入するために、挿入用ベクターを作製した。ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入用ベクターの作製には、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の染色体を鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマー対、配列番号１１及び１２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、得られた遺伝子断片をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣベクターとインフュージョン（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ）酵素を用いてＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列を結合させてクローニングし、３１２番目のアミノ酸であるメチオニンをイソロイシンに置換するベクターｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を作製した。
３－２．ＡＴＣＣ１３０３２菌株への変異体の導入及び評価
実施例３－１で作製したｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から選択した。選択した１次菌株にさらに２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を行い、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、菌株に変異が導入されたことが確認された。作製された菌株をＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉと命名した。
実施例３－１で作製したｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から選択した。選択した１次菌株にさらに２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を行い、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、菌株に変異が導入されたことが確認された。作製された菌株をＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉと命名した。
前述したように作製したＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉ菌株のロイシン生産能を評価するために、フラスコ発酵力価評価を行った。実施例２の生産培地をそれぞれ２５ｍｌ含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、及び前述したように作製したＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉをそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してロイシンを生産した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりロイシンの生産量を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のロイシン濃度を表３に示す。
ロイシン生産株におけるｇｌｔＡ選択変異のロイシン生産能の確認
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ロイシンを生産したとしても極微量を生産するにすぎない。よって、ＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を作製し、選択した変異を導入してロイシン生産能を確認する実験を行った。具体的な実験は次の通りである。
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ロイシンを生産したとしても極微量を生産するにすぎない。よって、ＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を作製し、選択した変異を導入してロイシン生産能を確認する実験を行った。具体的な実験は次の通りである。
４－１．ロイシン生産株ＣＪＬ－８１００菌株の作製
ＡＴＣＣ１３０３２由来の高濃度のロイシン生産菌株を作製するために、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，以下「ＩＰＭＳ」という）変異体を導入したＣＪＬ－８１００菌株を作製した。当該変異は、ＩＰＭＳをコードするｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、ＩＰＭＳタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異と、１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異とを含む。
ＡＴＣＣ１３０３２由来の高濃度のロイシン生産菌株を作製するために、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，以下「ＩＰＭＳ」という）変異体を導入したＣＪＬ－８１００菌株を作製した。当該変異は、ＩＰＭＳをコードするｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、ＩＰＭＳタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異と、１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異とを含む。
前記ｌｅｕＡ変異を含むｐＤＣ－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から選択した。選択した１次菌株にさらに２次交差を行い、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、配列番号１３及び１４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、変異が導入されたことが確認された。前記ｐＤＣ－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株をＣＪＬ－８１００と命名した。
４－２．ＣＪＬ－８１００菌株へのｇｌｔＡ変異体の導入及び評価
ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００を実施例３－１で作製したｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から選択した。選択した１次菌株にさらに２次交差を行い、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、菌株にｇｌｔＡ変異が導入されたことが確認された。作製されたＣＪＬ８１００＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２ＩをＣＡ１３－８１０４と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ ＣｕｌｔｕｒｅＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＫＣＣＭ）に２０１９年１２月２０日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２６４９Ｐとして寄託した。
ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００を実施例３－１で作製したｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から選択した。選択した１次菌株にさらに２次交差を行い、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、菌株にｇｌｔＡ変異が導入されたことが確認された。作製されたＣＪＬ８１００＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２ＩをＣＡ１３－８１０４と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ ＣｕｌｔｕｒｅＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＫＣＣＭ）に２０１９年１２月２０日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２６４９Ｐとして寄託した。
前述したように作製したＣＡ１３－８１０４菌株のロイシン生産能を評価した。実施例２と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりロイシン生産量を測定した。培養結果を表４に示す。
表４に示すように、ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８１００は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べてロイシン生産能が著しく向上することが確認された。ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８１００菌株にｇｌｔＡ Ｍ３１２Ｉ変異を導入したＣＪＬ８１０４菌株は、親株ＣＪＬ８１００に比べてロイシン生産能が１０％向上することが確認された。
また、ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００に、実施例１－２で作製したｐＴＯＰＯ－ｇｌｔＡ－ライブラリーのうちｐＴＯＰＯ－ｇｌｔＡ（ｍｔ）３１４２をエレクトロポレーションで形質転換し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から前記ベクターが形質転換された菌株を選択した。選択した菌株をＣＪＬ８１００／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）３１４２と命名した。
前述したように作製したＣＪＬ８１００／ｐＴＯＰＯ＿ｇｌｔＡ（ｍｔ）３１４２菌株のロイシン生産能を評価した。実施例２と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりロイシン生産量を測定した。培養結果を表５に示す。
上記実施例の結果から、クエン酸シンターゼであるｇｌｔＡのアミノ酸配列において、前記３１２番目の位置のアミノ酸がｇｌｔＡ酵素活性に重要な位置であることが確認された。
ｇｌｔＡ変異株（Ｍ３１２Ｉ）が導入されたＣＪ３Ｐ菌株の作製及びリシン生産量の分析
Ｌ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においてもクエン酸シンターゼ活性変化の効果があることを確認するために、野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ），ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ），ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を導入し、Ｌ－リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献５）を対象に、実施例３と同様にｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異が導入された菌株を作製した。前述したように作製した菌株をＣＪ３Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。次の方法で対照群であるＣＪ３Ｐ菌株とＣＪ３Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）のリシン生産量を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）を用いてＬ－リシンの濃度を測定した。それを表６に示す。
Ｌ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においてもクエン酸シンターゼ活性変化の効果があることを確認するために、野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ），ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ），ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を導入し、Ｌ－リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献５）を対象に、実施例３と同様にｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異が導入された菌株を作製した。前述したように作製した菌株をＣＪ３Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。次の方法で対照群であるＣＪ３Ｐ菌株とＣＪ３Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）のリシン生産量を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）を用いてＬ－リシンの濃度を測定した。それを表６に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
表６に示すように、リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ菌株にｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異を導入したＣＪ３Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株は、親株に比べてリシン生産量が１２７％向上することが確認された。
バリン生産株におけるｇｌｔＡ選択変異のバリン生産能の確認
ロイシンと同じく代表的な分枝鎖アミノ酸であるバリンに対しても選択した変異が効果を発揮するか否かを確認するために、コリネバクテリウム属バリン生産菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献２）にも選択した変異を導入してバリン生産能を確認する実験を行った。
ロイシンと同じく代表的な分枝鎖アミノ酸であるバリンに対しても選択した変異が効果を発揮するか否かを確認するために、コリネバクテリウム属バリン生産菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献２）にも選択した変異を導入してバリン生産能を確認する実験を行った。
ＫＣＣＭ１１２０１Ｐを実施例３－１で作製したｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターで形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から選択した。選択した１次菌株にさらに２次交差を行い、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、菌株にｇｌｔＡ変異が導入されたことが確認された。作製された菌株をＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。
前述したように作製したＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株のバリン生産能を評価した。実施例２－２と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりバリン生産量を測定した。培養結果を表７に示す。
表７に示すように、バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株にｇｌｔＡ Ｍ３１２Ｉ変異を導入したＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株は、親株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてバリン生産能が７％向上することが確認された。
この結果から、クエン酸シンターゼであるｇｌｔＡのアミノ酸配列において、前記３１２番目の位置のアミノ酸がｇｌｔＡ酵素活性に重要な位置であることが確認された。
イソロイシン生産株におけるｇｌｔＡ選択変異のＬ－イソロイシン生産能の確認
７－１．Ｌ－イソロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８ＰからのｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ＯＲＦ変異が導入されたＬ－イソロイシン菌株の作製及びＬ－イソロイシン生産能の評価
実施例４と同様に、Ｌ－イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献３）に実施例３－１で作製した組換えプラスミドｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。作製した菌株を次の方法で培養し、イソロイシン生産能を比較した。
７－１．Ｌ－イソロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８ＰからのｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ＯＲＦ変異が導入されたＬ－イソロイシン菌株の作製及びＬ－イソロイシン生産能の評価
実施例４と同様に、Ｌ－イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献３）に実施例３－１で作製した組換えプラスミドｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。作製した菌株を次の方法で培養し、イソロイシン生産能を比較した。
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １２．５ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－イソロイシンの生産能を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のＬ－イソロイシン濃度を表８に示す。
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １２．５ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－イソロイシンの生産能を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のＬ－イソロイシン濃度を表８に示す。
表８に示すように、Ｌ－イソロイシン生産菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐに比べて、ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異が導入されたＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）においてＬ－イソロイシンの濃度が約３６％増加することが確認された。よって、ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）遺伝子の変異によりＬ－イソロイシンの生産能が向上することが確認された。
この結果は、コリネバクテリウム属Ｌ－イソロイシン生産菌株におけるｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異の導入がＬ－イソロイシン生産に効果的であることを示すものである。
７－２．コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３０３２からのｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ＯＲＦ変異が導入されたＬ－イソロイシン菌株の作製及びＬ－イソロイシン生産能の評価
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入がＬ－イソロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＷＴ）菌株をベースにｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異体（特許文献５）とｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異体（特許文献４）を導入して菌株を作製し、公知のトレオニンデヒドラターゼ（Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子にｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）変異（非特許文献６）を導入してＬ－イソロイシン生産能を比較した。
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入がＬ－イソロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＷＴ）菌株をベースにｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異体（特許文献５）とｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異体（特許文献４）を導入して菌株を作製し、公知のトレオニンデヒドラターゼ（Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子にｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）変異（非特許文献６）を導入してＬ－イソロイシン生産能を比較した。
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号１５及び１６又は配列番号１７及び１８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列を表９に示す。
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５０９ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５２０ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１５及び１８のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異を含む１０１１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製不可能なｐＤＺベクター（特許文献６）と１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、その後ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、次いでクローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）と命名した。
前述したように得られたｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ベクターをＷＴ菌株に電気パルス法（非特許文献７）で導入し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。２次交差を経て、染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異を導入した菌株であるＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を得た。ヌクレオチド変異が導入された遺伝子は、配列番号１５及び１８のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後シーケンシングにより野生型ｌｙｓＣ遺伝子の配列と比較して最終確認した。
また、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）を導入したベクターを作製するために、ＷＴゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列を表１０に示す。
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の２２０ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の２２０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。これら２つのＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを鋳型とし、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を含む４４０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
前述したｐＤＺベクターと４４０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次いでＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）と命名した。
前述したように得られたｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）ベクターをＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）菌株に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｈｏｍ遺伝子にヌクレオチド変異を導入した菌株ＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）を得た。
上記実施例と同様に、ＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株に実施例３－１で作製した組換えプラスミドｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、ＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。
ｉｌｖＡ遺伝子を対象に、公知のｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）変異を導入したベクターを作製するために、変異位置を中心に、５’末端上流を増幅するためのプライマー１対（配列番号２３及び２４）と３’末端下流を増幅するためのプライマー１対（配列番号２５及び２６）を設計した。配列番号２３及び２６のプライマーは、各末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線表示）を挿入し、配列番号２４及び２５のプライマーは、交差するように設計した部位にヌクレオチド置換変異（下線表示）が位置するようにした。前記プライマーの配列を表１１に示す。
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の６２７ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の６０８ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２３及び２６のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３２３番目のバリンがアラニンに置換されたＩｌｖＡ変異体をコードするｉｌｖＡ遺伝子の変異を含む１２１７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献７）ベクターと１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）と命名した。
ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）ベクターを上記実施例のＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）に導入した菌株を作製した。また、その対照群として、ＡＴＣＣ１３０３２：：－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）にｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）変異のみ導入した菌株も作製した。
前述したように作製した菌株を実施例４－１のフラスコ培養法と同様に培養し、培養液中のＬ－イソロイシン濃度を分析した。その結果を表１２に示す。
表１２に示すように、野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２：：－ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）に比べて、ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異が導入されたＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）においてＬ－イソロイシンの濃度が約４３％増加することが確認された。
この結果は、コリネバクテリウム属Ｌ－イソロイシン生産菌株におけるｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異の導入がＬ－イソロイシン生産に効果的であることを示すものである。
向上したＯ－アセチルホモセリン生産能を有する菌株の作製及びＯ－アセチルホモセリン生産能の評価
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入によりＯ－アセチル－ホモセリンの生産に及ぼす影響を把握するために、Ｏ－アセチル－ホモセリン分解経路であるシスタチオニンγ－シンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子とＯ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子を欠損させ、Ｏ－アセチル－ホモセリン生合成を増大させるべく、アスパルトキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号１１）に、ｌｙｓＣ遺伝子のＬ－リシン（Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）及びＬ－トレオニン（Ｌ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）（特許文献４）を導入してＯ－アセチル－ホモセリン生産菌株を作製した。
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異導入によりＯ－アセチル－ホモセリンの生産に及ぼす影響を把握するために、Ｏ－アセチル－ホモセリン分解経路であるシスタチオニンγ－シンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子とＯ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子を欠損させ、Ｏ－アセチル－ホモセリン生合成を増大させるべく、アスパルトキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号１１）に、ｌｙｓＣ遺伝子のＬ－リシン（Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）及びＬ－トレオニン（Ｌ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）（特許文献４）を導入してＯ－アセチル－ホモセリン生産菌株を作製した。
まず、ｍｅｔＢ遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、Ｏ－アセチルホモセリン分解経路のシスタチオニンγ－シンターゼ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｇａｍｍａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするｍｅｔＢ遺伝子を確保した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からｍｅｔＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号Ｎｃｇｌ２３６０，配列番号２７）を確保し、それに基づいてｍｅｔＢ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号２８及び２９）、Ｃ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号３０及び３１）を合成した。プライマー配列を表１３に示す。
ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含む５５８ｂｐの増幅された遺伝子と、ｍｅｔＢ遺伝子のＣ末端部分とリンカー部分を含む５２７ｂｐの増幅された遺伝子がそれぞれ得られた。
前述したように得られた増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を１０サイクル行い、その後配列番号２及び５を添加して重合反応を２０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子のＮ末端－リンカー－Ｃ末端を含む１０６４ｂｐの不活性化カセットが得られた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ断片末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩを処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩが処理されたｐＤＺ（特許文献８）ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によりクローニングし、最終的にｍｅｔＢ不活性化カセットがクローニングされたｐＤＺ－△ｍｅｔＢ組換えベクターを作製した。
作製したｐＤＺ－△ｍｅｔＢベクターをＡＴＣＣ１３０３２に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｍｅｔＢ遺伝子が不活性化されたＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢを得た。不活性化されたｍｅｔＢ遺伝子は、配列番号２８及び３１のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後ｍｅｔＢ遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
Ｏ－アセチル－ホモセリンの他の分解経路であるｍｅｔＹ遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、Ｏ－アセチルホモセリン分解経路のＯ－アセチルホモセリンチオールリアーゼ（Ｏ－ａｃｅｔｙｌｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ（ｔｈｉｏｌ）－ｌｙａｓｅ）をコードするｍｅｔＹ遺伝子を確保した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からｍｅｔＹ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号Ｎｃｇｌ０６２５，配列番号３２）を確保し、それに基づいてｍｅｔＹ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号３３及び３４）、Ｃ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号３５及び３６）を合成した。プライマー配列を表１４に示す。
ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含む５４８ｂｐの増幅された遺伝子と、ｍｅｔＹ遺伝子のＣ末端部分とリンカー部分を含む５５０ｂｐの増幅された遺伝子が得られた。前述したように得られた増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を１０サイクル行い、その後配列番号３３及び３４を添加して重合反応を２０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子のＮ末端－リンカー－Ｃ末端を含む１０７７ｂｐの不活性化カセットが得られた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ断片末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩを処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩが処理されたｐＤＺ（特許文献８）ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によりクローニングし、最終的にｍｅｔＹ不活性化カセットがクローニングされたｐＤＺ－△ｍｅｔＹ組換えベクターを作製した。
作製したｐＤＺ－△ｍｅｔＹベクターをＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｍｅｔＹ遺伝子が不活性化されたＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹを得た。不活性化されたｍｅｔＹ遺伝子は、配列番号７及び１０のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後ｍｅｔＹ遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
Ｏ－アセチルホモセリン生成を増大させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のアスパルトキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号１１）に、ｌｙｓＣ遺伝子のＬ－リシン（Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）及びＬ－トレオニン（Ｌ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）（特許文献４）を導入すべく、実施例７－２で作製したｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を得た。ヌクレオチド変異が導入された遺伝子は、配列番号１５及び１８のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後シーケンシングにより野生型ｌｙｓＣ遺伝子の配列と比較して最終確認した。
実施例３－１で作製したｐＤＣ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｇｌｔＡ遺伝子にヌクレオチド変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を得た。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより、菌株に変異が導入されたことが確認された。
前述したように作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）とＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株のＯ－アセチルホモセリン生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のＯ－アセチルホモセリンを分析した。
次の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｌｏｏｐ）接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ－アセチルホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表１５に示す。
Ｌ－Ｏ－アセチルホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，メチオニン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，メチオニン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
表１５の結果から分かるように、ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異を導入したＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株は、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）菌株に比べてＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能が３１％向上することが確認された。
この結果から、クエン酸シンターゼであるｇｌｔＡのアミノ酸配列において、前記３１２番目の位置のアミノ酸がｇｌｔＡ酵素活性に重要な位置であることが確認された。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Claims (14)
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチド。
- 前記３１２番目の位置に相当するアミノ酸がイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）に置換された、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
- 前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、１００％未満の配列相同性を有する、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
- 前記変異型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物。
- 前記Ｌ－アミノ酸は、ロイシン、リシン、バリン、イソロイシン及びＯ－アセチルホモセリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７に記載の微生物。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）である、請求項７に記載のＬ－アミノ酸を生産する微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項９に記載のＬ－アミノ酸を生産する微生物。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アミノ酸生産方法。
- 前記方法は、培養した培地又は微生物からＬ－アミノ酸を回収するステップをさらに含む、請求項１１に記載のＬ－アミノ酸生産方法。
- 前記Ｌ－アミノ酸は、ロイシン、リシン、バリン、イソロイシン及びＯ－アセチルホモセリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載のＬ－アミノ酸生産方法。
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端から３１２番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、クエン酸シンターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物のＬ－アミノ酸生産における使用。
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