CN114729338B - 变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产l-苏氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种二氢吡啶二羧酸还原酶活性减弱的变异多肽和使用其生产L‑苏氨酸的方法。

Description

变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产L-苏氨酸的 方法
技术领域
本公开涉及具有减弱的二氢吡啶二羧酸还原酶活性的变异多肽，以及使用该变异多肽生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
棒杆菌(Corynebacterium)属微生物(例如，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))是一种革兰氏阳性微生物，常用于生产L-氨基酸和其他有用物质。为了生产L-氨基酸和其他有用物质，已经进行了各种研究以开发高效微生物和发酵技术。例如，主要使用目标物质特异性方法，如增加编码涉及L-赖氨酸生物合成的酶的基因的表达或去除对于L-赖氨酸生物合成不必要的基因(美国专利号8048650)。
同时，在L-氨基酸中，L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和L-甘氨酸是天冬氨酸衍生的氨基酸，并且天冬氨酰半醛(aspartyl semialdehyde)有效转化为高丝氨酸可影响L-苏氨酸的合成水平，其中天冬氨酰半醛是一种共同前体，其作用于从天冬氨酸到L-赖氨酸和其他天冬氨酸衍生氨基酸的生物合成分支。
二氢吡啶二羧酸还原酶是作用于微生物中赖氨酸生物合成途径中的酶，并且是从天冬氨酰半醛生物合成赖氨酸的途径中紧随二氢吡啶二羧酸合成酶之后起作用的关键酶，天冬氨酰半醛是微生物中苏氨酸生物合成和赖氨酸生物合成的共同前体。
二氨基庚二酸(diaminopimelate)是赖氨酸生物合成的前体，用于形成作为微生物细胞壁组分的肽聚糖。因此，当在二氨基庚二酸生产途径中起作用的编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因缺失时，微生物细胞壁合成受到抑制，从而导致菌株的生长受到抑制。
因此，为了提高L-苏氨酸生产能力，需要将基因减少到适当的水平，而不是使在L-赖氨酸生物合成途径中起作用的基因缺失。
发明内容
[技术问题]
鉴于该技术背景，为了在不延迟菌株生长速率的情况下增加L-苏氨酸生产量同时减少L-赖氨酸生产量，本发明人已做出许多努力。结果，他们发现当使用将二氢吡啶二羧酸还原酶活性减弱为特定水平的新变异多肽时，L-苏氨酸的生产量增加，同时维持微生物的生长，从而完成本公开。
【技术方案】
本公开的一个目的是提供一种源自谷氨酸棒杆菌的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽。
本公开的另一个目的是提供编码变异多肽的多核苷酸。
本公开的又一目的是提供包括变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的棒杆菌属微生物。
本公开的又一个目的是提供一种使用该微生物生产L-苏氨酸的方法。
本公开的又一个目的是提供微生物在生产L-苏氨酸中的用途。
【有益效果】
当使用二氢吡啶二羧酸还原酶活性减弱的的本公开的新变异多肽时，与具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的野生型菌株相比，可以在不延迟生长速率的情况下增加苏氨酸生产量同时减少赖氨酸生产量，并且因此，该新型变异多肽可广泛应用于苏氨酸的大规模生产。
具体实施方式
下面将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。即，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下描述的具体描述的限制。
为实现上述目的，本公开一方面提供了一种源自谷氨酸棒杆菌的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽。
具体地，源自谷氨酸棒杆菌的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽是一种具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽，其中该多肽具有与源自谷氨酸棒杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶相同的序列作为待突变的参考序列，并且包括一个或多个氨基酸的取代。更具体地，变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽包括氨基酸取代，其中第13位的氨基酸被另一个氨基酸取代。
变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可以具有与源自谷氨酸棒杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶的序列相同的序列，例如其可以是这样的变异多肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性的氨基酸序列中第13位的氨基酸可以被天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺取代。例如，本公开提供了一种具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的变异多肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性或同源性的氨基酸序列中第13位的氨基酸可以被天冬酰胺取代。
特别地，具有98％或更多同一性的氨基酸序列可由SEQ ID NO:51组成。此外，变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:53的氨基酸序列组成。
在本公开中，“二氢吡啶二羧酸还原酶(Ec 1.3.1.26)”是指通过使用NADPH将2,3-二氢吡啶二羧酸转化为哌啶2,6-二羧酸(其是赖氨酸生物合成的前体)来催化赖氨酸生物合成的酶，其中2,3-二氢吡啶二羧酸是经由二氢吡啶二羧酸合酶从天冬氨酰半醛转化的，天冬氨酰半醛是微生物中作为天冬氨酸衍生氨基酸的L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸生物合成的共同中间体。
在本公开中，二氢吡啶二羧酸还原酶可以源自任何来源，只要它是具有上述转化活性的多肽，并且可以使用源自任何生物体(植物、微生物等)的酶。具体地，二氢吡啶二羧酸还原酶可以具有与源自棒杆菌属微生物的序列相同的序列，且更具体地，可以具有与源自谷氨酸棒杆菌的序列相同的序列。
在本公开中，源自谷氨酸棒杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶意指其还包括与源自微生物的二氢吡啶二羧酸还原酶的序列相同的序列。
例如，该序列可以是SEQ ID NO：1的序列或与其具有98％或更多的同一性或99％或更多的同一性的序列，但不限于此。这样的序列可以是例如包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的多肽。
包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:51的氨基酸序列的多肽可与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:51的氨基酸序列的多肽或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成的多肽互换使用。
在本公开中，本领域公知的方法可适用于得到二氢吡啶二羧酸还原酶的方法。该方法的实例可以包括基因合成技术，包括密码子优化以从通常用于多肽表达的棒杆菌属微生物高效地得到多肽；以及通过生物信息学方法基于微生物的大量基因组数据筛选有用酶资源的方法，但不限于此。
在本公开中，“具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽”不排除在具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：51的氨基酸序列)的上游或下游添加无意义的序列、天然存在的突变、或沉默突变(silent mutation)，并且对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，只要蛋白质具有与包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：51的氨基酸序列的多肽的活性相同或对应的活性，则其对应于本公开的具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽。
具体地例如，本公开的具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽可以是包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：51的氨基酸序列或与其具有至少60％、70％、80％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、或99％的同源性或同一性的氨基酸序列的多肽。此外，显然，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性并表现出与该多肽相应的生物活性，则除了第13位的氨基酸外，具有在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何多肽也可包括在本公开的范围内。
例如，本公开的具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽可以是源自谷氨酸棒杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶。更具体地，该多肽可以具有源自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)或源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)。具有上述序列的这些二氢吡啶二羧酸还原酶彼此可存在同源性或同一性，并表现出相应的作为二氢吡啶二羧酸还原酶的功效，因此，显然上述二氢吡啶二羧酸还原酶都包含在本公开的具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽中。
“同源性”或“同一性”是指两个给定的多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比，且是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，且可以用百分比表示。术语“同源性”和“同一性”经常可以彼此互换使用。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列的活性相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。从一个部分到另一部分的序列同源性可以通过本领域已知的技术来确定。例如，可以使用用于计算诸如评分、同一性和相似性的参数的标准软件(具体地，BLAST 2.0)或通过在限定的严格条件下通过Southern杂交实验比较序列来确认同源性，并且限定的合适的杂交条件可以通过在相应技术范围内本领域普通技术人员熟知的方法来确定(例如，J.Sambrook等人,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
如本文所用，术语“修饰”、“变异体”或“突变体”是指遗传或非遗传上表现出稳定表型变化的培养产物或个体，具体是指这样的变异体，其中与具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽相对应的氨基酸序列的一个或多个氨基酸被修饰，因此与其野生型、天然型或非修饰型相比，活性减弱。
如本文所用，变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可与“变异二氢吡啶二羧酸还原酶”、“修饰的二氢吡啶二羧酸还原酶”、“二氢吡啶二羧酸还原酶变异体”、“突变的二氢吡啶二羧酸还原酶”或“二氢吡啶二羧酸还原酶突变体”互换使用。同时，这些变异体可以是非天然存在的。
如本文所用，术语“修饰”是指用于改进酶的常用方法，且可以不受限制地使用本领域已知的任何方法，包括诸如合理设计、定向进化等的策略。例如，合理设计的策略包括在特定位置指定氨基酸的方法(位点定向诱变或位点特异性诱变)等，以及定向进化的策略包括诱导随机诱变的方法等。此外，修饰可以是在没有外部操作的情况下由天然突变引起的修饰。具体地，变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可以是分离的多肽、重组多肽或非天然存在的多肽，但不限于此。
本公开的“变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽”为具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽，该多肽包括一个或多个氨基酸的取代，其中氨基酸取代包括用另一氨基酸取代第13位的氨基酸。
“用另一氨基酸取代”没有限制，只要取代是用与取代前的氨基酸不同的氨基酸取代即可。具体地，取代可以是用选自以下的任一种氨基酸取代：赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。更具体地，变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可以是其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性的氨基酸序列中第13位的氨基酸可以被极性氨基酸或碱性氨基酸取代的多肽。
更具体地，变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可以是其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性的氨基酸序列中第13位的氨基酸可以被天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺取代的变异多肽。
此外，取代的氨基酸残基可包括天然氨基酸以及非天然氨基酸。非天然氨基酸可包括，例如，D-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、罕见氨基酸(例如，瓜氨酸或萘丙氨酸等)，但不限于此。同时，在本公开中，当表述“特定氨基酸被取代”时，除非另有指示，显然该氨基酸被取代为与取代前的氨基酸不同的氨基酸。
在一个具体的实施方式中，本公开可以提供具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的变异多肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性的氨基酸序列中第13位的氨基酸被天冬酰胺取代。特别地，具有98％或更多同一性的氨基酸序列可由SEQ IDNO:51组成。
如本文所用，术语“对应于”是指蛋白质或肽中所列位置处的氨基酸残基，或与另一蛋白质或肽中所列残基相似、相同或同源的氨基酸残基。如本文所用，“相应区域”通常指相关蛋白质或参考蛋白质中的相似位置。
在本公开中，可以采用在本公开中使用的多肽中氨基酸残基位置的特定编号。例如，通过将本公开的多肽序列与待比较的目标多肽进行比对，可以指定与本公开的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。
本公开提供的变异二氢吡啶二羧酸还原酶通过取代上述二氢吡啶二羧酸还原酶中特定位置的氨基酸，可以与修饰前的多肽相比增加L-苏氨酸的生产能力。该变异多肽可包括用天冬酰胺取代与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性的氨基酸序列中第13位对应的位置处的氨基酸；可与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多且小于100％的序列同源性；并且可以具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性。
与SEQ ID NO：1的野生型氨基酸序列或与其具有98％或更多同一性的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸还原酶活性相比，变异多肽的二氢吡啶二羧酸还原酶活性可以减弱。
具体地例如，本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶可以是包含SEQ ID NO：3或SEQID NO：53的氨基酸序列或与其具有同源性或同一性的氨基酸序列的多肽。此外，显然，只要氨基酸序列具有这种同源性或同一性并表现出与该多肽相应的生物活性，则除了第13位的氨基酸外，具有在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何多肽也可包括在本公开的范围内。
此外，本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的特征可在于与具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的野生型、天然多肽或非修饰多肽不同，具有减弱的在包含其的微生物中生产终产物(即，赖氨酸)的活性。
如本文所用，“减弱”意指蛋白质或多肽的功能降低，并且由于二氢吡啶二羧酸还原酶活性减弱，从天冬氨酰半醛(其是苏氨酸生物合成和赖氨酸生物合成的共同前体)生物合成赖氨酸的功能降低，结果，生产终产物(即，赖氨酸)的能力降低，而生产苏氨酸的能力增加，从而增加苏氨酸和苏氨酸衍生氨基酸的生产性。苏氨酸衍生氨基酸是指可以使用苏氨酸作为前体合成的氨基酸，且只要是可以由苏氨酸合成的物质，则可以不受限制地使用任何材料。
此外，在本公开中，由于二氢吡啶二羧酸还原酶的功能没有受到抑制而是减弱，因此生产作为用于赖氨酸生物合成的前体的二氨基庚二酸没有问题，且因此微生物的细胞壁合成没有受到抑制，且在微生物的生长方面没有问题。换言之，不是通过使编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因(dapB)缺失，而是通过将第13位的氨基酸取代为另一氨基酸的修饰，可以将活性减弱适当程度。
本公开的另一方面提供了编码变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的多核苷酸。
变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽与上述相同。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有预定长度或更长的DNA或RNA链，其是核苷酸单体通过共价键连接形成的核苷酸的长链聚合物，并且作为其基本单元的核苷酸包括天然核苷酸以及具有修饰的糖或碱基部分的类似物。在本公开中，多核苷酸可以是从细胞中分离出来的多核苷酸或是人工合成的多核苷酸，但不限于此。
具体地，多核苷酸可以是编码变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的多核苷酸。编码本公开的变异多肽的多核苷酸可以不受限制地包括任意多核苷酸序列，只要其是编码本公开的具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的变异多肽的多核苷酸序列即可。具体地例如，编码本公开的变异多肽的多核苷酸可以是包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:54的核苷酸序列或与其具有至少60％、70％、80％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％的同源性或同一性的核苷酸序列的多核苷酸。此外，很明显，除了编码第13位氨基酸的核苷酸序列外，具有在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的核苷酸序列的任何多核苷酸也可包括在本公开的范围内，只要该核苷酸序列编码具有这种同源性或同一性，并且表现出与二氢吡啶二羧酸还原酶多肽相对应的生物活性的氨基酸序列即可。
在本公开中，编码变异二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列的多核苷酸可以具体源自棒杆菌属的微生物，更具体地源自谷氨酸棒杆菌，但不限于此。
基于遗传密码简并性，编码相同氨基酸序列的核苷酸序列及其变异体也可包括在本公开的范围内。具体地，编码具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽的多核苷酸可以不受限制地包括任何多核苷酸，只要其具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性即可，因为由于密码子简并性或考虑到要在其中表达多肽的生物体优选的密码子，只要它们不改变多肽的氨基酸序列，可以在编码区进行各种修饰。
此外，编码蛋白质变异体的多核苷酸可包括可由已知基因序列产生的探针，例如，可不受限制地包括任何探针，只要其包括在严格条件与该多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交，以编码具有由上述SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽活性的多肽的序列即可。
术语“严格条件”意指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。此类条件详细描述于文献中(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)，这是本领域普通技术人员众所周知的。例如，严格条件可以包括具有高同源性(即，80％、90％或更高，更具体地95％或更高，更加具体地97％或更高，特别具体地99％或更高的同源性)的基因彼此杂交而同源性低于上述同源性的基因不彼此杂交的条件、或Southern杂交的普通洗涤条件，即，在对应于以下的盐浓度和温度下洗涤一次，具体为两次或三次：60℃1X SSC，0.1％SDS，具体地，60℃0.1X SSC，0.1％SDS，且更具体地，68℃0.1XSSC，0.1％SDS。尽管根据杂交的严格程度，碱基之间的错配是可能的，但杂交要求两个核酸含有互补序列。
如本文所用，术语“互补”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括基本相似的核苷酸序列，而且可以包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段。具体地，可以使用包括在55℃的Tm值下的杂交的杂交条件和上述条件来检测具有同源性的多核苷酸。此外，Tm值可为60℃、63℃或65℃，但不限于此，且可根据目的由本领域普通技术人员适当控制。多核苷酸杂交的适当严格度取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域公知的(参见Sambrook等人,supra,9.50-9.51,11.7-11.8)。
本公开的另一方面提供了包含编码变异多肽的多核苷酸的载体。
如本文所用，术语“载体”是指可操作地连接至适当的调控序列以使目标多肽能够在适当的宿主细胞中表达的DNA构建体(其包括编码目标多肽的多核苷酸的核苷酸序列)。调控序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合域的序列以及调控转录和翻译的终止的序列。在载体转化到适当的宿主细胞后，其可以独立于宿主基因组进行复制或发挥作用，并且可以整合到基因组本身中。
本公开中使用的载体没有特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制即可，并且本领域已知的任何载体都可以使用。常用载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但不限于此。
适用于本公开的载体没有特别限制，并且可以使用任何已知的表达载体。此外，可以使用用于细胞内染色体插入的载体将编码目标多肽的多核苷酸插入到染色体中。多核苷酸的染色体插入可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。可以进一步包括确认染色体插入的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即确认目标核酸分子的插入，并且选择标记可以包括提供可选择表型(如耐药性、辅源营养、对细胞毒剂的耐性或表面蛋白质的表达)的标记。由于只有表达选择标记的细胞才能够在用选择剂处理的环境下存活或显示不同的表型，因此可以选择转化的细胞。
本公开的另一方面是提供一种其中引入有载体的转化体。
如本文所用，术语“转化”意指将包含编码目标多肽的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这种方式多核苷酸编码的多肽在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，转化的多核苷酸是否可以整合到宿主细胞的染色体中并放置在宿主细胞的染色体中，或者其可以存在于染色体外都没有关系。此外，多核苷酸包括编码目标多肽的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要其可以被引入宿主细胞中并在其中表达即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入到宿主细胞中，该表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以原样被引入到宿主细胞中并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。转化方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可以通过选择本领域已知的合适的标准技术来进行，这取决于宿主细胞。例如，该方法可包括电穿孔、磷酸钙(Ca(H2PO4)2、CaHPO4或Ca3(PO4)2)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体法、醋酸锂-DMSO法等，但不限于此。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指启动子序列与多核苷酸序列之间的功能连接，该启动子序列启动并介导编码本公开的目标多肽的多核苷酸的转录。可以使用本领域已知的基因重组技术来制备可操作的连接，并且可以使用本领域已知的用于切割和连接的酶等来制备位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。
本公开的又一方面提供了包含变异二氢吡啶二羧酸还原酶的微生物，特别是生产L-苏氨酸的棒杆菌属微生物，其包含变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽。
变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽与上述相同。
如本文所用，术语“微生物”包括野生型微生物和天然或人工遗传修饰的微生物全部，并且其是包括其中由于外源基因的插入或内源基因活性的增强或减弱而减弱或增强特定机制的所有微生物的概念。
如本文所用，术语“苏氨酸”可与“L-苏氨酸”互换使用，并且“赖氨酸”可与“L-赖氨酸”互换使用。
具体地，包含本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的微生物意指天然具有L-氨基酸生产能力的微生物或通过为不具有L-氨基酸生产能力的亲本菌株提供L-氨基酸生产能力而获得的微生物。具体地，包含二氢吡啶二羧酸还原酶的微生物可以是表达变异二氢吡啶二羧酸还原酶的微生物，其中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：51的氨基酸序列的第13位氨基酸被天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、或谷氨酰胺取代。具体地例如，微生物可以是表达变异二氢吡啶二羧酸还原酶的微生物，其中氨基酸序列的第13位氨基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代，但不限于此。
该微生物包括变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽，其中第13位的氨基酸被取代，因此该微生物的特征在于显示出苏氨酸生产量增加，同时显示出赖氨酸生产量减少，而不干扰其生长。
二氢吡啶二羧酸还原酶的酶活性因突变位点而减弱，从而增加苏氨酸生产量，同时减少赖氨酸生产量，而不会延迟菌株的生长速率。
与包含具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的多肽的野生型或未修饰微生物相比，包含本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶的微生物可具有降低的赖氨酸生产能力和增加的苏氨酸生产能力，因此，可以从该微生物中以高产率获得苏氨酸。
在本公开中，包含变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的微生物不限于特定类型，但它可以是肠杆菌(Enterbacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、棒杆菌属、和短杆菌(Brevibacterium)属。更具体地，微生物可以是棒杆菌属的微生物。
如本文所用，“棒杆菌属的微生物”可以具体为谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热氨基棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。具体地例如，在本公开中，棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌。
微生物可以是包含编码变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的多核苷酸的微生物，或向其中引入了包含编码变异二氢吡啶二羧酸还原酶的多核苷酸的载体的微生物。具体地，可以通过转化作用进行引入，但不限于此。关于本公开的目的，宿主细胞或微生物可以是任何微生物，只要其包含生产赖氨酸或苏氨酸或者生产衍生自该氨基酸(即，赖氨酸或苏氨酸)的氨基酸的变异多肽即可。
在棒杆菌属的微生物中，具体地，可以增强或增加编码苏氨酸合酶的thrC基因、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因、参与葡萄糖摄取的galP基因、编码赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3的lysC基因、编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或诱导草酰乙酸池(oxaloacetatepool)增加的pyc基因的表达以增强L-苏氨酸生物合成途径。
为了解除L-苏氨酸的反馈抑制，可以将基因修饰引入到例如lysC基因、hom基因或具有双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1的thrA基因中。
为了使减弱L-苏氨酸生物合成途径的基因失活，例如，参与将草酰乙酸(OAA)(其是L-苏氨酸生物合成的中间体)转化为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的pckA基因、阻抑lysC基因的tyrR基因、阻抑参与葡萄糖摄取的galP基因表达的galR基因、或作为DNA结合转录双重调节子的mcbR基因的表达在微生物中可以被减弱或失活。
为了增加L-苏氨酸操纵子的活性，可以通过将包含由编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的基因组成的苏氨酸操纵子(日本专利公开号2005-227977)或源自大肠杆菌(E.coli)的苏氨酸操纵子(TURBA E,等人,Agric.Biol.Chem.53:2269～2271,1989)的质粒引入到微生物中来增加微生物中苏氨酸操纵子的表达。
此外，可以为微生物提供对作为L-苏氨酸类似物的α-氨基-β-羟基戊酸或D,L-苏氨酸异羟肟酸的耐性。
此外，在具有与L-苏氨酸共同前体的L-赖氨酸的生物合成途径中起作用的dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶)、lysA基因(二氨基庚二酸脱羧酶)或ddh基因(二氨基庚二酸脱氢酶)也可减弱。
然而，微生物不限于此，且其L-苏氨酸生产能力可通过本领域已知的基因表达调控方法增强。
如本文所用，术语“增强/增加”是包括与内在活性相比活性增加的概念。
这种基因活性的增强或增加可以通过应用本领域公知的各种方法来实现。该方法的实例可包括选自以下的任何一种或多种方法：增加基因的细胞内拷贝数的方法；在基因的表达调控序列中引入修饰的方法；用具有强活性的序列取代基因表达调控序列的方法；将额外修饰引入到相应基因中以增强基因活性的方法；和将外源基因引入到微生物中的方法，或它们的组合，但不特别限于此。
如本文所用，术语“失活”是包括与内在活性相比活性减弱或消除的概念。
这种基因活性的失活或减弱可以通过应用本领域公知的各种方法来实现。该方法的实例可以包括选自由以下的任何一种或多种方法：使染色体上基因的全部或部分缺失的方法，包括基因活性被消除的情况；用突变的基因置换染色体上编码多肽的基因以降低多肽活性的方法；将修饰引入到染色体上编码多肽的基因的表达调控序列中的方法；将编码多肽的基因的表达调控序列置换为具有弱活性或无活性的序列的方法(例如，用弱于内源启动子的启动子置换基因启动子的方法)；使染色体上编码多肽的基因的全部或部分缺失的方法；引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法，该寡核苷酸与染色体上基因的转录物互补结合以抑制mRNA翻译成蛋白质；在编码多肽的基因的SD序列上游人为添加与SD序列互补的序列以形成二级结构，从而使核糖体无法附着的方法；以及逆转录工程(RTE)的方法，该方法在相应序列的开放阅读框(ORF)的3'端加入启动子以进行逆转录，或者是它们的组合，但并不特别限于此。
例如，增加lysC、hom或pyc基因的细胞内拷贝数以增强基因活性的方法；将修饰引入到基因表达调控序列中的方法；将基因表达调控序列置换为具有强活性的序列的方法；将额外修饰引入到相应基因中以增强基因活性的方法；以及将外源基因引入到微生物中的方法可以实现，但方法不特别限于此，并且为了增强或增加活性，可以不受限制地使用已知方法。
例如，为了减弱dapA、ddh或lysA基因的活性，可以进行使染色体上基因的全部或部分缺失的方法，包括消除基因活性的情况；用突变的基因置换染色体上编码多肽的基因以降低相应多肽的活性的方法；将修饰引入到染色体上编码多肽的基因的表达调控序列中的方法；将编码多肽的基因的表达调控序列置换为具有弱活性或无活性的序列的方法(例如，用弱于内源启动子的启动子置换基因启动子的方法)；使染色体上编码多肽的基因的全部或部分缺失的方法，但该方法不限于此，并且为了减弱活性，可以不受限制地使用已知的方法。
此外，包含变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的微生物可以进一步包括以下变异多肽的任一或多个。
待进一步包括的变异多肽可包括选自以下中的任何一种或多种：变异二氢吡啶二羧酸合酶多肽，其中SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第119位的氨基酸(即，酪氨酸)被苯丙氨酸取代、变异二氨基庚二酸脱羧酶多肽，其中SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第302位的氨基酸(即，精氨酸)被丙氨酸取代、以及变异二氨基庚二酸脱氢酶多肽，其中SEQ ID NO：82的氨基酸序列的第169位的氨基酸(即，苏氨酸)被亮氨酸取代。
其中SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第119位的氨基酸(即，酪氨酸)被苯丙氨酸取代的变异二氢吡啶二羧酸合酶多肽的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:65，但不限于此。二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)是一种用于从天冬氨酰半醛生物合成赖氨酸的酶，天冬氨酰半醛是赖氨酸和苏氨酸的共同前体，并且通过用苯丙氨酸取代氨基酸序列的第119位的氨基酸(即，酪氨酸)而减弱二氢吡啶二羧酸合酶的功能，且结果，可降低赖氨酸生产能力。在本公开的示例性实施方式中，确认由于引入了变异多肽，赖氨酸生产量减少而苏氨酸生产量增加。
其中SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第302位的氨基酸(即，精氨酸)被丙氨酸取代的变异二氨基庚二酸脱羧酶多肽的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:70，但不限于此。二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)是作用于赖氨酸生物合成的最终酶，并且通过用丙氨酸取代氨基酸序列的第302位的氨基酸(即，精氨酸)而减弱二氨基庚二酸脱羧酶的功能，且结果，可降低赖氨酸产生能力。在本公开的示例性实施方式中，确认由于引入了变异多肽，赖氨酸生产量减少而苏氨酸生产量增加。
其中SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第169位的氨基酸(即，苏氨酸)被亮氨酸取代的变异二氨基庚二酸脱氢酶多肽的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:75，但不限于此。二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)是一种作用于赖氨酸生物合成的酶，并且通过用亮氨酸取代氨基酸序列的169位氨基酸(即，苏氨酸)而减弱二氨基庚二酸脱氢酶的功能，且结果，可降低赖氨酸生产能力。在本公开的示例性实施方式中，确认了由于引入变异多肽，赖氨酸生产量减少而苏氨酸生产量增加。
本公开的又一方面提供了一种生产苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养上述微生物的步骤。
此外，本公开提供了一种生产苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的方法，该方法进一步包括从培养的微生物或培养的培养基中回收苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的步骤。
微生物如上所述可以是包含本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的棒杆菌属的微生物，且更具体地可以是谷氨酸棒杆菌。此外，棒杆菌属的微生物或谷氨酸棒杆菌可以是生产苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的微生物。苏氨酸衍生的L-氨基酸可包括苏氨酸衍生的L-氨基酸以及其衍生物。苏氨酸衍生的L-氨基酸可以包括，例如，L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、和/或L-甘氨酸，但不限于此。更具体地，苏氨酸衍生的L-氨基酸可包括L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸和/或L-甲硫氨酸，但不限于此。
苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸可以是由本公开中描述的微生物生产的苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的培养液，或其纯化形式。此外，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，还包括原样的氨基酸及其盐。
在本领域已知的优化培养条件和酶促活性条件下，本领域普通技术人员可以容易地确定生产苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的方法。
在该方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行，但不特别限于此。特别地，关于培养条件，培养条件可以但不特别限于使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节至合适的pH值(例如，pH 5至9，具体地pH 6至8，最具体地pH 6.8)。此外，可以将氧气或含氧气体混合物注入培养物中以维持有氧状态。培养温度可维持在20℃至45℃，具体地在25℃至40℃，但不限于此。培养可进行约10小时至160小时，但不限于此。通过培养生产的氨基酸(例如，苏氨酸或赖氨酸)可以分泌在培养基中或可以保留在细胞中。
此外，作为所用培养基的碳源，可单独或组合使用糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等，但碳源不限于此。作为氮源，可单独或组合使用含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸盐、和硝酸铵)等，但氮源不限于此。作为磷源，可单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其相应的含钠盐等，但磷源不限于此。此外，培养基中可含有必需的促生长物质，如其他金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等。
在本公开的培养步骤中生产的苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸的回收方法中，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液中收集期望的产物。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养物或微生物中回收作为期望的产物的苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸。此外，回收步骤可进一步包括纯化过程，其可使用本领域已知的适当方法进行。
本公开的又一方面提供了一种用于生产L-苏氨酸的组合物，该组合物包括微生物或其培养液，该微生物或其培养液包含本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽；编码变异体的多核苷酸；以及包含多核苷酸的载体中的任一种或多种。
二氢吡啶二羧酸还原酶、其变异多肽、多核苷酸、载体和微生物与上述相同。
微生物可以是棒杆菌属的微生物，具体可以是谷氨酸棒杆菌，但不限于此。这与上述相同。
用于生产L-苏氨酸的组合物可以是指能够通过本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽生产L-苏氨酸的组合物。该组合物可以不受限制地包括变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽或能够操作变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽的组成。变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽可以包含在载体中，使得与其可操作连接的基因可以在引入了该载体的宿主细胞中表达。
该组合物可进一步包括冷冻保护剂或赋形剂。冷冻保护剂或赋形剂可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。对于另一具体实例，冷冻保护剂或赋形剂可以是不与微生物天然接触的物质，或者不是与微生物天然同时包含的物质，但不限于此。
本公开的又一方面提供了本公开的变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽；编码该变异体的多核苷酸；包含该多核苷酸的载体；或包含其中任一种或多种的微生物在生产L-苏氨酸或苏氨酸衍生的L-氨基酸中的用途。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本公开的范围不限于这些实施例。
实施例1：用于将修饰引入到dapB基因ORF中的载体文库的制备
为了找到其中谷氨酸棒杆菌的dapB基因的表达水平或其活性减弱的变异体，通过以下方法制备了文库。
首先，为了对包含dapB(747bp)基因的DNA片段(747bp)每kb引入0-4.5个修饰，使用了GenemorphII随机诱变试剂盒(GenemorphII Random Mutagenesis Kit)(Stratagene)。使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032(WT)的染色体DNA作为模板以及使用SEQ IDNO:5和6的引物对进行易错PCR。具体而言，将包含WT菌株的染色体DNA(500ng)、SEQ ID NO：5和6的引物对(各125ng)、Mutazyme II反应缓冲液(Mutazyme II reaction buffer)(1Х)、dNTP混合物(40mM)和Mutazyme II DNA聚合酶(Mutazyme II DNA polymerase)(2.5U)的反应混合物在94℃下进行变性2分钟，然后进行25个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，在72℃下聚合2分钟)，然后在72℃下进行聚合10分钟。
使用TOPO TA克隆试剂盒(TOPO TA Cloning Kit)(Invitrogen)将扩增的基因片段连接到pCRII载体中，转化到大肠杆菌DH5α中，涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择出20种转化菌落，并获得质粒，然后进行测序。结果确认，修饰以0.5个突变/kb的频率被引入到不同的位点中。最终，获得了约10,000个转化的大肠杆菌菌落，提取质粒并将其命名为pTOPO-dapB(mt)文库。
实施例2：dapB缺失菌株的制备和基于生长速率对dapB突变菌株的筛选
为了从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备dapB基因缺失菌株，如下制备了作为dapB基因缺失载体的pDZ-ΔdapB。具体而言，将位于dapB基因5'-和3'-端的DNA片段(各300bp)连接到pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)中。基于报道的dapB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，合成了其中在5'-和3'-端插入限制酶SalI识别位点的SEQ ID NOS：7和8的引物，以及在距其300bp处的SEQ ID NO：9和10的引物。使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板以及使用SEQ ID NOS：7和9的引物对通过PCR制备5'-端的基因片段。以同样的方式，使用SEQ ID NOS：8和10的引物对通过PCR制备gltA基因的3'-端的基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。
同时，将用限制酶SalI处理并在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段使用Infusion克隆试剂盒(Infusion Cloning Kit)彼此连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中，并涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NOS：7和8的引物对通过PCR选择用其中插入有所期望基因的载体转化的菌落，然后通过众所周知的质粒提取方法获得质粒，并将其命名为pDZ-ΔdapB。
通过电脉冲法(Van der Rest等人，Appl.Microbial.Biotechnol.52:541-545,1999)将制备的载体pDZ-ΔdapB转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，以通过同源重组制备dapB基因缺失菌株。这种dapB基因缺失菌株被命名为谷氨酸棒杆菌13032::ΔdapB。
此外，通过电脉冲法用pTOPO-dapB(mt)文库转化13032::ΔdapB菌株，并涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的复合培养基平板上，以获得约100个菌落。对获得的100种菌株进行L-赖氨酸生产能力测试。将获得的100种菌株分别接种在含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养20小时。将1mL的种子培养物接种在含有24mL下列L-赖氨酸生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。
赖氨酸生产培养基(pH 7.0)
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)
使用13032和13032::ΔdapB菌株作为对照组。培养完成后，通过HPLC测量赖氨酸生产量。选择与野生型13032菌株相比显示出低L-赖氨酸浓度且与13032::ΔdapB菌株相比显示出高L-赖氨酸浓度的6种菌株，6种菌株的培养物中的氨基酸浓度显示在表1中。选择的6种菌株分别命名为13032::dapB(mt)-1至6。其他94种菌落与13032菌株(即，对照组)相比显示出高L-赖氨酸浓度，或者与13032::ΔdapB菌株(即，对照组)相比显示出相似的L-赖氨酸浓度。此外，与13032菌株相比，13032::ΔdapB菌株的生长速率大大降低，而与13032::ΔdapB菌株相比，所选择的6种菌株维持了较高的生长速率。
[表格1]
选择的6种菌株的L-赖氨酸生产量测试
L-Lys(g/L) 糖消耗速率(g/hr)
13032 1.2 4.95
13032::dapB(mt)-1 0.2 4.23
13032::dapB(mt)-2 1.0 4.68
13032::dapB(mt)-3 0.5 3.47
13032::dapB(mt)-4 0.8 4.03
13032::dapB(mt)-5 0.9 3.62
13032::dapB(mt)-6 0.4 1.98
13032::dapB 0.0 0.36
如表1的结果所示，所选择的6种菌株显示出比WT菌株低的L-赖氨酸浓度和比13032::ΔdapB菌株高的L-赖氨酸浓度。
实施例3：6种dapB突变株的测序
为了鉴定所选择的6种菌株(即，13032::dapB(mt)-1至6)的dapB基因序列，使用实施例1中指定的引物(SEQ ID NOS：5和6)以通过PCR扩增染色体中每个含有dapB基因的DNA片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。
作为对扩增基因的序列进行分析的结果，确认在6种菌株中，13032::dapB(mt)-1是其中在SEQ ID NO：2的第37至39位的现有CGT被AAC取代并且距其N-末端第13位的氨基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代的变异体；13032::dapB(mt)-2是其中在SEQ ID NO：2的第106至108位的现有GTC被ATC并且距其N-末端第36位的氨基酸(即，缬氨酸)被甲硫氨酸取代的变异体；13032::dapB(mt)-3是其中在SEQ ID NO:2的第175至177位的现有GCT被CTG取代并且距其N-末端第59位的氨基酸(即，丙氨酸)被亮氨酸取代的变异体；13032::dapB(mt)-4是其中在SEQ ID NO:2的第235至237位的现有ACG被GCA取代并且距其N-末端第79位的氨基酸(即，苏氨酸)被丙氨酸取代的变异体；13032::dapB(mt)-5是其中在SEQ ID NO：2的第433至435位的现有ACG被GCG取代并且距其N-末端第145位的氨基酸(即，苏氨酸)被丙氨酸取代的变异体；以及13032::dapB(mt)-6是其中在SEQ ID NO：2的第414位的G被C取代并且距其N-末端第138位的氨基酸(即，赖氨酸)被精氨酸取代的变异体。
在6种菌株中，显示出与WT菌株13032相比减少的L-赖氨酸生产量、与13032::ΔdapB最相似的低L-赖氨酸生产量、且与WT菌株13032相似的生长速率的13032::dapB(mt)-1菌株被选择作为最优异的二氢吡啶二羧酸还原酶活性减弱菌株。
实施例4：其中dapB基因的第13位氨基酸(即，精氨酸)被不同氨基酸取代的各种菌 株的制备
尝试用除野生型所具有的精氨酸之外的proteogenic氨基酸取代SEQ ID NO：1的第13位氨基酸。
为了引入19种异源碱基取代(包括作为实施例3中确认的修饰的R13N)，如下构建了各自的重组载体。
首先，使用从WT菌株中提取的基因组DNA作为模板，并且合成了SEQ ID NO：11和12的引物，其中限制酶SalI识别位点各自在dapB基因的第36至39位上游和下游600bp处被插入在5'-和3'-端。为了引入19种异源碱基取代，合成了用于取代dapB基因的第36至39位的核苷酸序列的SEQ ID NO：13至50的引物。
具体而言，制备了pDZ-dapB(R13N)质粒，其中dapB基因的5'和3'端的DNA片段(各600bp)被连接到pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)。使用WT菌株的染色体DNA作为模板以及使用SEQ ID NO：11和13的引物对通过PCR制备了5'-端基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。以同样的方式，使用SEQ ID NO：12和14的引物通过PCR制备了dapB基因3'-端的基因片段。扩增的DNA片段使用Quiagen的PCR纯化试剂盒(PCRPurification kit)纯化，然后作为用于载体构建的插入DNA片段来使用。
同时，将用限制酶SalI处理并在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段使用Infusion克隆试剂盒彼此连接，并转化到大肠杆菌DH5α中。将菌株涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：11和12的引物通过PCR选择用其中插入有期望基因的载体转化的菌落，然后通过众所周知的质粒提取方法获得质粒，并将其命名为pDZ-dapB(R13N)。
以同样的方式，使用SEQ ID NO：11和15、以及12和16的引物制备pDZ-dapB(R13G)，使用SEQ ID NO：11和17、以及12和18的引物制备pDZ-dapB(R13A)，使用SEQ ID NO：11和19、以及12和20的引物制备pDZ-dapB(R13V)，使用SEQ ID NO：11和21、以及12和22的引物制备pDZ-dapB(R13L)，使用SEQ ID NOS：11和23、以及12和24的引物用于制备pDZ-dapB(R13I)，使用SEQ ID NO：11和25、以及12和26的引物制备pDZ-dapB(R13M)，使用SEQ ID NOS：11和27、以及12和28的引物制备pDZ-dapB(R13F)，使用SEQ ID NO：11和29、以及12和30的引物制备pDZ-dapB(R13W)，使用SEQ ID NOS：11和31、以及12和32的引物制备pDZ-dapB(R13P)，使用SEQ ID NO：11和33、以及12和34的引物制备pDZ-dapB(R13S)，使用SEQ ID NO：11和35、以及12和36的引物制备pDZ-dapB(R13T)，使用SEQ ID NO：11和37、以及12和38的引物制备pDZ-dapB(R13C)，使用SEQ ID NO：11和39、以及12和40的引物制备pDZ-dapB(R13Y)，使用SEQ ID NO：11和41、以及12和42的引物制备pDZ-dapB(R13Q)，使用SEQ ID NO：11和43、以及12和44的引物制备pDZ-dapB(R13D)，使用SEQ ID NO：11和45、以及12和46的引物制备pDZ-dapB(R13E)，使用SEQ ID NO：11和47、以及12和48的引物制备pDZ-dapB(R13K)，以及使用SEQ ID NO：11和49、以及12和50的引物制备pDZ-dapB(R13H)。
为了进一步阐明根据引入dapB修饰的赖氨酸浓度和生长速率，通过电脉冲法将制备的载体分别转化到生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株(韩国专利号10-0159812)中。其中将异源碱基取代引入到dapB基因中的19种菌株分别被命名为KCCM11016P::dapB(R13N)、KCCM11016P::dapB(R13G)、KCCM11016P::dapB(R13A)、KCCM11016B::dapB(R13V)、KCCM11016P::dapB(R13L)、KCCM11016P::dapB(R13I)、KCCM11016P::dapB(R13M)、KCCM11016P::dapB(R13F)、KCCM11016P::dapB(R13F)、KCCM1016P::dapB(R13W)、KCCM11016P::dapB(R13P)、KCCM11016P::dapB(R13S)、KCCM11016P::dapB(R13T)、KCCM11016P::dapB(R13C)、KCCM11016P::dapB(R13Y)、KCCM11016P::dapB(R13Q)、KCCM11016P::dapB(R13D)、KCCM11016P::dapB(R13E)、和KCCM11016P::dapB(R13K)。
实施例5：dapB突变菌株的赖氨酸生产能力的分析
使用KCCM11016P菌株作为对照组，并且将选择的19种菌株通过以下方法培养，以测量糖消耗速率、赖氨酸生产收率和苏氨酸生产收率。
首先，将每种菌株接种在含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养20小时。此后，将1mL的种子培养物接种在含有24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养72小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。培养完成后，通过HPLC(Waters 2478)测量L-赖氨酸和L-苏氨酸的浓度。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)
赖氨酸和苏氨酸的生产能力和糖消耗速率的测量结果如下表2所示。
[表2]
赖氨酸和苏氨酸的生产能力
关于包含其中SEQ ID NO:1第13位的氨基酸被另一氨基酸取代的变异多肽的菌株，确认当取代的氨基酸是极性的(S、T、C、Y、N、Q、K)时，菌株的生长维持在工业应用水平，而赖氨酸生产能力减弱且苏氨酸生产能力提高。其中，R13N突变株显示出与KCCM11016P株最相似的生长，并且显示出最低的赖氨酸生产量和最高的苏氨酸生产量。
此外，R13S、R13T、R13C、R13Y、R13Q和R13K突变株也维持生长并显示出降低的赖氨酸生产能力，同时显示出提高的苏氨酸生产能力。
相反，当用具有其他不同性质的氨基酸取代时，苏氨酸生产能力降低，但菌株的糖消耗速率与对照组相当，否则大大降低，表明它们不处于工业应用水平。
这些结果确认，当引入本公开的修饰时，菌株的生长维持在适当的水平，且仅赖氨酸产率降低，而苏氨酸生产性提高。
这些结果确认，通过控制二氢吡啶二羧酸还原酶的活性，在维持由于赖氨酸生物合成途径减弱导致细胞壁合成受到抑制而引起的菌株的生长速率的同时，可以将赖氨酸的生产能力降低在适当的水平，同时将碳通量引导到苏氨酸合成途径中，以提高苏氨酸的生产能力。
实施例6：制备基于棒杆菌属微生物ATCC13032的菌株，其中dapB基因的第13位氨 基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代
为了在野生型菌株中再次确认其中第13位氨基酸被天冬酰胺取代的变异体的效果，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032所具有的内在二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)中第13位氨基酸精氨酸用天冬酰胺取代。
具体地，将实施例4中制备的pDZ-dapB(R13N)载体通过电脉冲法转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中。其中将异源碱基取代引入到dapB基因中的这种菌株被命名为13032::dapB(R13N)。
实施例7：基于棒杆菌属微生物ATCC13032的dapB突变株的苏氨酸和赖氨酸生产能 力的分析
使用实施例1中使用的13032::ΔdapB菌株和谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株作为对照组，并且将实施例6中制备的13032::dapB(R13N)菌株通过以下方法培养，以测量糖消耗速率、苏氨酸和赖氨酸生产收率。
首先，将每个菌株接种在含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。此后，将1mL种子培养物接种于含有24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养24小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。培养完成后，通过HPLC(Waters 2478)测量L-赖氨酸和L-苏氨酸浓度。
种子培养基(pH 7.0)
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg、(基于1L蒸馏水)
L-苏氨酸生产培养基(pH 7.2)
葡萄糖30g、KH2PO4 2g、尿素3g、(NH4)2SO4 40g、蛋白胨2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO4·7H2O 0.5g、亮氨酸400mg、CaCO3 20g(基于1L蒸馏水)
测量苏氨酸和赖氨酸生产能力和糖消耗速率的结果如下表3所示。
[表3]
苏氨酸和赖氨酸浓度和糖消耗速率的测量
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与亲本菌株相比，dapB基因缺失菌株显示出减少的赖氨酸浓度和略微增加的苏氨酸浓度，但直到培养结束才消耗糖。换句话说，当菌株由于dapB基因的缺失而没有赖氨酸生物合成能力时，可以看出由于菌株的生长受到抑制而难以工业应用。
确认了包含其中SEQ ID NO：1的第13位的氨基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代的变异多肽的13032::dapB(R13N)菌株显示出减少的赖氨酸浓度和增加的苏氨酸浓度，同时将生长维持在工业应用水平。换句话说，确认了本公开的修饰的引入显示出提高苏氨酸浓度并降低副产物赖氨酸浓度的效果。
这些结果表明，当二氢吡啶二羧酸还原酶的活性通过将修饰引入到dapB基因中而减弱时，碳通量从天冬氨酰半醛(其是苏氨酸和赖氨酸的共同前体)到赖氨酸生物合成中的引导减少，因此碳通量被引导到苏氨酸合成途径中，从而提高苏氨酸生产量，同时减少副产物赖氨酸生产量。
实施例8：基于棒杆菌属微生物ATCC13869的菌株的制备，其中dapB基因的第13位 氨基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代
为了在野生型菌株中再次确认其中第13位氨基酸被天冬酰胺取代的变异体的效果，谷氨酸棒杆菌ATCC13869所具有的内在二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：51)中第13位氨基酸精氨酸用天冬酰胺取代(SEQ ID NO：53)。
具体地，如下构建了用于将实施例5中确认的修饰R13N引入到谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中的重组载体。
首先，通过使用与实施例4相同的引物和方法来制备pDZ-dapB(R13N)-13869质粒，不同之处在于使用从13869菌株中提取的基因组DNA作为模板。
通过电脉冲法将如此制备的载体转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13869中。其中将异源碱基取代引入到dapB基因中的这种菌株被命名为13869::dapB(R13N)。
实施例9：基于棒杆菌属微生物ATCC13869的dapB缺失菌株的制备
将实施例1制备的pDZ-ΔdapB通过电脉冲法(Van der Rest等人,Appl.Microbial.Biotecnol.52:541-545,1999)转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13869中以通过同源重组制备dapB基因缺失菌株。这种dapB基因缺失菌株被命名为谷氨酸棒杆菌13869::ΔdapB。
实施例10：基于13869的dapB突变株的苏氨酸和赖氨酸生产能力的分析
使用实施例9中制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株和13869::ΔdapB菌株作为对照组，并通过与上述实施例相同的方法来培养实施例8中制备的13869::dapB(R13N)菌株，以测量糖消耗速率和苏氨酸和赖氨酸生产收率。
测量苏氨酸和赖氨酸生产能力以及糖消耗速率的结果如下表4所示。
[表4]
苏氨酸和赖氨酸浓度以及糖消耗速率的测量
与亲本菌株相比，dapB基因缺失菌株显示出减少的赖氨酸浓度和略微增加的苏氨酸浓度，但直到培养结束才消耗糖。换句话说，当菌株由于dapB基因缺失而没有赖氨酸生物合成能力时，可以看出由于菌株的生长受到抑制而难以工业应用。确认了包含其中第13位氨基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代(如SEQ ID NO:53)的变异多肽的13869::dapB(R13N)菌株显示出减少的赖氨酸浓度和增加的苏氨酸浓度，同时将生长维持在工业应用水平。
换句话说，确认了本公开的修改的引入显示出提高苏氨酸浓度且减少副产物赖氨酸的效果。
这些结果表明，当二氢吡啶二羧酸还原酶活性通过将修饰引入到dapB基因中而减弱时，碳通量从作为苏氨酸和赖氨酸的共同前体的天冬氨酰半醛到赖氨酸生物合成中的引导减少，因此碳通量被引导到苏氨酸合成途径中，从而提高苏氨酸生产量，同时减少副产物赖氨酸生产量。
实施例11：基于苏氨酸生产菌株的dapB(R13N)修饰引入菌株的制备
为了阐明通过引入dapB(R13N)修饰引起的L-苏氨酸生产能力的变化，制备了苏氨酸生产菌株。具体而言，为了解除作为苏氨酸生物合成途径中的第一关键酶起作用的天冬氨酸激酶(lysC)的反馈抑制，制备了lysC(L377K)修饰引入菌株(韩国专利号2009-0094433)。如下制备了用于修饰引入的重组载体。
为了制备引入有lysC(L377K)修饰的菌株，使用从13032菌株中提取的基因组DNA作为模板，并且合成了SEQ ID NO：56和57的引物，其中限制酶SmaI识别位点各自在lysC基因的第1128至1131位上游和下游500bp处被插入在5'-和3'-端。为了引入L377K异源碱基取代，合成了用于取代lysC基因的第1128至1131位核苷酸序列的SEQ ID NO：58和59的引物。
具体而言，制备了pDZ-lysC(L377K)质粒，其中lysC基因的5'和3'端的DNA片段(各515bp、538bp)被连接到pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)。使用13032菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：56和58的引物对，通过PCR制备了5'-端基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。以同样的方式，使用SEQ ID NO：57和59通过PCR制备了lysC基因的3'-端处的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化了扩增的DNA片段，然后将其用作用于载体构建的插入DNA片段。
同时，将用限制酶SmaI处理且在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段使用Infusion克隆试剂盒彼此连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中。将菌株涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：56和57的引物通过PCR选择用插入有所期望基因的载体转化的菌落，然后通过众所周知的质粒提取方法获得了质粒，并将其命名为pDZ-lysC(L377K)。
通过电脉冲法将制备的载体转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中。其中将异源碱基取代引入到lysC基因中的这种菌株被命名为CJP1。CJP1被命名为CA01-2307，并于2017年3月29日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，其保藏号为KCCM12000P。
接下来，将编码生产高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶的基因的修饰引入到制备的CJP1菌株中并将其增强，高丝氨酸是L-苏氨酸和L-异亮氨酸生物合成途径中的共同中间体。具体而言，制备了具有hom(R407H)修饰的菌株，其中如SEQ ID NO：60，第1218至1221位的现有TTG被AAG取代，因此距其N-末端第407位的氨基酸(即，精氨酸)被组氨酸取代。如下制备了用于修饰引入的重组载体。
首先，使用从13032菌株中提取的基因组DNA作为模板，并合成了SEQ ID NO：61和62的引物，其中限制酶SalI识别位点各自在hom基因的第1219至1221位的上游和下游600bp处被插入在5'-和3'-端。为了引入R407H异源碱基取代，合成了SEQ ID NO：63和64的引物，其用于取代hom基因的第1219至1221位的核苷酸序列。
具体而言，制备了pDZ-hom(R407H)质粒，其中hom基因的5'和3'端的DNA片段(各600bp)被连接到pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)。使用WT菌株的染色体DNA为模板，并使用SEQ ID NO：61和63的引物，通过PCR制备5'-端基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。以同样的方式，使用SEQ ID NO：62和64的引物通过PCR制备了在hom基因的3'-端处的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化了扩增的DNA片段，然后将其用作用于载体构建的插入DNA片段。
同时，将用限制酶SalI处理且在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段用Infusion克隆试剂盒彼此连接，然后将其转化到大肠杆菌DH5α中。将菌株涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：61和62的引物通过PCR选择用插入有所期望基因的载体转化的菌落，然后通过众所周知的质粒提取方法获得质粒，并将其命名为pDZ-hom(R407H)。
通过电脉冲法将制备的载体转化到CJP1中。其中将异源碱基取代引入到hom基因中的这种菌株被命名为CA09-0900(保藏号KCCM12418P)。
为了检查通过将变异二氢吡啶二羧酸还原酶引入到菌株中导致的L-苏氨酸生产量和赖氨酸生产量的变化，将实施例4中确认的修饰引入到编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因中。具体而言，为了将R13N修饰引入到CA09-0900菌株中，将实施例4中制备的pDZ-R13N载体通过电穿孔转化到CA09-0900菌株中，并以与实施例4相同的方式，通过二次交换过程获得了在染色体上具有修饰的菌株。具有变异核苷酸取代的这种菌株被命名为CA09-0903。
将CA09-0903菌株于2019年4月25日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)中，其保藏号为KCCM12502P。
实施例12：基于苏氨酸生产菌株的dapB突变株的苏氨酸和赖氨酸生产能力的分析
使用实施例10中制备的CA09-0900菌株作为对照组，并通过与实施例7相同的方法培养CA09-0903菌株，以测量苏氨酸和赖氨酸生产收率。
测量苏氨酸和赖氨酸生产能力的结果如下表5所示。
[表5]
苏氨酸和赖氨酸浓度的测量
结果，与对照CA09-0900菌株相比，引入有修饰的菌株显示出减少的L-赖氨酸生产量和增加1.07g/L的L-苏氨酸生产量，表明在二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)的第13位的氨基酸取代的修饰引入获得了减少赖氨酸生产量和增加苏氨酸生产量的效果。
实施例13：赖氨酸途径(dapA)额外减弱的菌株的制备
为了阐明通过赖氨酸生物合成途径的额外减弱导致的L-苏氨酸生产能力的变化，通过使赖氨酸生物合成途径中的基因额外减弱来进行实验。首先，制备了用于引入文献中已知的修饰(减弱二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)的活性)的菌株，二氢吡啶二羧酸合酶是第一个作用于从天冬氨酰半醛生物合成赖氨酸的酶，天冬氨酰半醛是赖氨酸和苏氨酸的共同前体(J Mol Biol.2004Apr 23；338(2):329-39)。具体而言，制备了具有dapA(Y119F)修饰(SEQ ID NO：80)的菌株，其中如SEQ ID NO：65，在二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)的核苷酸序列的第355至357位处，现有TAC被修饰为TTT，结果，距N-末端第119位的氨基酸(即，酪氨酸)被苯丙氨酸取代。如下制备了用于修饰引入的重组载体。
为了制备引入有dapA(Y119F)修饰的菌株，使用从13032菌株提取的基因组DNA作为模板，并且合成了SEQ ID NOS：66和67的引物，其中限制酶SalI识别位点各自在dapA基因的355至357位的上游和下游350bp和610bp处被插入在5'-和3'-端。为了引入Y119F异源碱基取代，合成了用于取代dapA基因的第355至357位核苷酸序列的SEQ ID NO：68和69的引物。
具体而言，制备了pDZ-dapA(Y119F)质粒，其中dapA基因的5'和3'端的DNA片段(分别为350bp、610bp)连接到pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)。使用13032菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：66和68的引物对，通过PCR制备了5'端基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。以同样的方式，使用SEQ ID NO：67和69的引物通过PCR制备了在dapA基因的3'-端处的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化了扩增的DNA片段，然后将其用作用于载体构建的插入DNA片段。
同时，将用限制酶SalI处理且在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段用Infusion克隆试剂盒彼此连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中。将菌株涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：66和67的引物通过PCR选择用插入有所期望基因的载体转化的菌落，然后通过众所周知的质粒提取方法获得了质粒，并将其命名为pDZ-dapA(Y119F)。
将制备的载体通过电脉冲法转化到实施例11中制备的CA09-0903菌株中。其中将异源碱基取代引入到dapA基因中的这种菌株被命名为CA09-0903/dapA(Y119F)。
实施例14：dapA突变株的苏氨酸和赖氨酸生产能力的分析
使用实施例11中制备的CA09-0903菌株作为对照组，通过与实施例7相同的方法培养CA09-0903/dapA(Y119F)菌株以测量苏氨酸和赖氨酸的生产收率。
测量苏氨酸和赖氨酸生产能力的结果如下表6所示。
[表6]
苏氨酸和赖氨酸浓度的测量
结果，与对照CA09-0903菌株相比，额外引入有dapA(Y119F)修饰的菌株显示出减少的L-赖氨酸生产量和增加0.90g/L的L-苏氨酸生产量，表明在二氢吡啶二羧酸合酶dapA的第119位处进行氨基酸变异体的额外引入，获得了由于赖氨酸生物合成途径的额外减弱而进一步减少赖氨酸生产量和进一步增加苏氨酸生产量的效果。
实施例15：赖氨酸途径(lysA)额外减弱的菌株的制备
为了阐明通过赖氨酸生物合成途径的额外减弱导致的L-苏氨酸生产能力的变化，进行了赖氨酸生物合成途径中基因的额外减弱。制备了用于引入文献中已知的修饰(减弱二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)的活性)的菌株，二氨基庚二酸脱羧酶是作用于赖氨酸生物合成的最后一种酶(BiochemBiophys Res Commun.2018Jan 8；495(2):1815-1821)。具体而言，制备了具有lysA(R302A)修饰的菌株，其中如SEQ ID NO：70，在二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)的核苷酸序列的第904至906位处，现有的CGC被修饰为GCA，结果，距N-末端第302位的氨基酸(即，精氨酸)被丙氨酸取代(SEQ ID NO：81)。如下制备了用于修饰引入的重组载体。
为了制备引入有lysA(R302A)修饰的菌株，使用从13032菌株提取的基因组DNA作为模板，并且合成了SEQ ID NO：71和72的引物，其中限制酶SalI识别位点各自在lysA基因的第904至906位的上游和下游500bp处被插入在5'-和3'-端。为了引入R302A异源碱基取代，合成了用于取代lysA基因的第904至906位核苷酸序列的SEQ ID NO：73和74的引物。
具体而言，制备了pDZ-lysA(R302A)质粒，其中lysA基因的5'和3'端的DNA片段(各500bp)与pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)连接。使用13032菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：71和73的引物，通过PCR制备了5'端基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒循环)，然后在72℃下聚合10分钟。以同样的方式，使用SEQ ID NO：72和74通过PCR制备了lysA基因的3'-端的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化了扩增的DNA片段，然后将其用作用于载体构建的插入DNA片段。
同时，将用限制酶SalI处理且在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段用Infusion克隆试剂盒彼此连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中。将菌株涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：66和67的引物通过PCR选择了用插入有所期望基因的载体转化的菌落，然后通过众说周知的质粒提取方法获得了质粒，并将其命名为pDZ-lysA(R302A)。
将制备的载体通过电脉冲法转化到实施例11中制备的CA09-0903菌株中。将其中异源碱基取代被引入到lysA基因的这种菌株命名为CA09-0903/lysA(R302A)。
实施例16：lysA突变株的苏氨酸和赖氨酸生产能力的分析
使用实施例11中制备的CA09-0903菌株作为对照组，通过与实施例7相同的方法培养CA09-0903/lysA(R302A)菌株，以测量苏氨酸和赖氨酸的生产收率。
测量苏氨酸和赖氨酸生产能力的结果如下表7所示。
[表7]
苏氨酸和赖氨酸浓度的测量
结果，与对照CA09-0903菌株相比，额外引入有lysA(R302A)修饰的菌株显示出减少的L-赖氨酸生产量和增加0.20g/L的L-苏氨酸生产量，表明在lysA基因的第302位进行氨基酸变异体的引入，获得了由于赖氨酸生物合成途径的额外减弱而进一步减少赖氨酸生产量和进一步增加苏氨酸生产量的效果。
实施例17：赖氨酸途径(ddh)额外减弱的菌株的制备
为了阐明通过赖氨酸生物合成途径的额外减弱导致的L-苏氨酸生产能力的变化，进行了赖氨酸生物合成途径中基因的额外减弱。制备了用于减弱二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)活性的菌株，二氨基庚二酸脱氢酶是一种作用于赖氨酸生物合成的酶。具体而言，制备了具有ddh(T169L)修饰的菌株，其中如SEQ ID NO：75，在二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)的核苷酸序列的第505至507位，现有ACC被修饰为CTC，结果，距N末端第169位的氨基酸(即，苏氨酸)被亮氨酸取代(SEQ ID NO：82)。如下制备了用于修饰引入的重组载体。
为了制备引入有ddh(T169L)修饰的菌株，使用从13032菌株提取的基因组DNA作为模板，并合成了SEQ ID NOS：76和77的引物，其中限制酶SalI识别位点各自在lysA基因的第505至507位的上游和下游500bp处被插入在5'-和3'-端。为了引入T169L异源碱基取代，合成了用于取代ddh基因的第505至507位核苷酸序列的SEQ ID NO：78和79的引物。
具体而言，制备了pDZ-ddh(T169L)质粒，其中ddh基因的5'和3'端的DNA片段(各500bp)与pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)连接。使用13032菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：76和78的引物，通过PCR制备了5'端基因片段。PCR条件如下：在94℃下变性2分钟，然后30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)，然后在72℃下聚合10分钟。以同样的方式，使用SEQ ID NO：77和79的引物通过PCR制备了ddh基因的3'-端的基因片段。使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化了扩增的DNA片段，然后将其用作用于载体构建的插入DNA片段。
同时，将用限制酶SalI处理且在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段用Infusion克隆试剂盒彼此连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中。将菌株涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO：76和77的引物通过PCR选择了用插入有所期望基因的载体转化的菌落，然后通过众所周知的质粒提取方法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ddh(T169L)。
将制备的载体通过电脉冲法转化到实施例11中制备的CA09-0903菌株中。将其中异源碱基取代被引入到ddh基因中的这种菌株命名为CA09-0903/ddh(T169L)。
实施例16：ddh突变株的苏氨酸和赖氨酸生产能力的分析
使用实施例11中制备的CA09-0903菌株作为对照组，通过与实施例7相同的方法培养CA09-0903/ddh(T169L)菌株，以测量苏氨酸和赖氨酸的生产收率。
测量苏氨酸和赖氨酸生产能力的结果如下表8所示。
[表8]
苏氨酸和赖氨酸浓度的测量
结果，与对照CA09-0903菌株相比，额外引入有ddh(T169L)修饰的菌株显示出减少的L-赖氨酸生产量和增加0.35g/L的L-苏氨酸生产量，表明在ddh基因的第169位进行氨基酸变异体的引入，获得了由于赖氨酸生物合成途径的额外减弱而进一步减少赖氨酸生产量和进一步增加苏氨酸生产量的效果。
基于以上描述，本领域普通技术人员将理解，在不改变本公开的技术精神或必要特征的情况下，可以以不同的具体形式来实施本公开。因此，应当理解，上述实施方式不是限制性的，而是在所有方面都是示例性的。本公开的范围由所附权利要求而不是由其前面的描述限定，因此落入权利要求的边界和界限，或这些边界和界限的等同物内的所有变化和修改因此旨在被权利要求所涵盖。
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<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产L-苏氨酸的方法
<130> OPA20114-PCT
<150> KR 10-2019-0119159
<151> 2019-09-26
<160> 82
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dapB氨基酸序列（dapB aa seq.）
<400> 1
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
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Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
100 105 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
115 120 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
130 135 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
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Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
180 185 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dapB核苷酸序列（dapB nt seq.）
<400> 2
atgggaatca aggttggcgt tctcggagcc aaaggccgtg ttggtcaaac tattgtggca 60
gcagtcaatg agtccgacga tctggagctt gttgcagaga tcggcgtcga cgatgatttg 120
agccttctgg tagacaacgg cgctgaagtt gtcgttgact tcaccactcc taacgctgtg 180
atgggcaacc tggagttctg catcaacaac ggcatttctg cggttgttgg aaccacgggc 240
ttcgatgatg ctcgtttgga gcaggttcgc gactggcttg aaggaaaaga caatgtcggt 300
gttctgatcg cacctaactt tgctatctct gcggtgttga ccatggtctt ttccaagcag 360
gctgcccgct tcttcgaatc agctgaagtt attgagctgc accaccccaa caagctggat 420
gcaccttcag gcaccgcgat ccacactgct cagggcattg ctgcggcacg caaagaagca 480
ggcatggacg cacagccaga tgcgaccgag caggcacttg agggttcccg tggcgcaagc 540
gtagatggaa tcccggttca tgcagtccgc atgtccggca tggttgctca cgagcaagtt 600
atctttggca cccagggtca gaccttgacc atcaagcagg actcctatga tcgcaactca 660
tttgcaccag gtgtcttggt gggtgtgcgc aacattgcac agcacccagg cctagtcgta 720
ggacttgagc attacctagg cctgtaa 747
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<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dapB变异体氨基酸序列（dapB variant aa seq.）
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130 135 140
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<211> 747
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<213> 人工序列
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<223> dapB变异体核苷酸序列（dapB variant nt seq.）
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agccttctgg tagacaacgg cgctgaagtt gtcgttgact tcaccactcc taacgctgtg 180
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<400> 25
aatagtttga ccaaccatgc ctttggctcc gagaac 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ctcggagcca aaggcatggt tggtcaaact attgtg 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
aatagtttga ccaacgaagc ctttggctcc gagaac 36
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ctcggagcca aaggcttcgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
aatagtttga ccaacccagc ctttggctcc gagaac 36
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ctcggagcca aaggctgggt tggtcaaact attgtg 36
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
aatagtttga ccaacagggc ctttggctcc gagaac 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ctcggagcca aaggccctgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
aatagtttga ccaacgctgc ctttggctcc gagaac 36
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
ctcggagcca aaggcagcgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
aatagtttga ccaacagtgc ctttggctcc gagaac 36
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ctcggagcca aaggcactgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
aatagtttga ccaacgcagc ctttggctcc gagaac 36
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ctcggagcca aaggctgcgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aatagtttga ccaacatagc ctttggctcc gagaac 36
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
ctcggagcca aaggctatgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
aatagtttga ccaacttggc ctttggctcc gagaac 36
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ctcggagcca aaggccaagt tggtcaaact attgtg 36
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
aatagtttga ccaacgtcgc ctttggctcc gagaac 36
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ctcggagcca aaggcgacgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
aatagtttga ccaacctcgc ctttggctcc gagaac 36
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
ctcggagcca aaggcgaggt tggtcaaact attgtg 36
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
ctcggagcca aaggcgaggt tggtcaaact attgtg 36
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
ctcggagcca aaggcaaggt tggtcaaact attgtg 36
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
aatagtttga ccaacgtggc ctttggctcc gagaac 36
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
ctcggagcca aaggccacgt tggtcaaact attgtg 36
<210> 51
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ATCC13869 dapB氨基酸序列（ATCC13869 dapB aa seq.）
<400> 51
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
65 70 75 80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
100 105 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
115 120 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
130 135 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145 150 155 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
180 185 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245
<210> 52
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATCC13869 dapB核苷酸序列（ATCC13869 dapB nt seq.）
<400> 52
atgggaatca aggttggcgt tctcggagcc aaaggccgtg ttggtcaaac tattgtggca 60
gcagtcaatg agtccgacga tctggagctt gttgcagaga tcggcgtcga cgatgatttg 120
agccttctgg tagacaacgg cgctgaagtt gtcgttgact tcaccactcc taacgctgtg 180
atgggcaacc tggagttctg catcaacaac ggcatttctg cggttgttgg aaccacgggc 240
ttcgatgatg ctcgtttgga gcaggttcgc gcctggcttg aaggaaaaga caatgtcggt 300
gttctgatcg cacctaactt tgctatctct gcggtgttga ccatggtctt ttccaagcag 360
gctgcccgct tcttcgaatc agctgaagtt attgagctgc accaccccaa caagctggat 420
gcaccttcag gcaccgcgat ccacactgct cagggcattg ctgcggcacg caaagaagca 480
ggcatggacg cacagccaga tgcgaccgag caggcacttg agggttcccg tggcgcaagc 540
gtagatggaa tcccagttca cgcagtccgc atgtccggca tggttgctca cgagcaagtt 600
atctttggca cccagggtca gaccttgacc atcaagcagg actcctatga tcgcaactca 660
tttgcaccag gtgtcttggt gggtgtgcgc aacattgcac agcacccagg cctagtcgta 720
ggacttgagc attacctagg cctgtaa 747
<210> 53
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ATCC13869 dapB变异体氨基酸序列（ATCC13869 dapB variant aa seq.）
<400> 53
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Asn Val Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
65 70 75 80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
100 105 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
115 120 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
130 135 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145 150 155 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
180 185 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245
<210> 54
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATCC13869 dapB变异体核苷酸序列（ATCC13869 dapB variant nt seq.）
<400> 54
atgggaatca aggttggcgt tctcggagcc aaaggcaacg ttggtcaaac tattgtggca 60
gcagtcaatg agtccgacga tctggagctt gttgcagaga tcggcgtcga cgatgatttg 120
agccttctgg tagacaacgg cgctgaagtt gtcgttgact tcaccactcc taacgctgtg 180
atgggcaacc tggagttctg catcaacaac ggcatttctg cggttgttgg aaccacgggc 240
ttcgatgatg ctcgtttgga gcaggttcgc gcctggcttg aaggaaaaga caatgtcggt 300
gttctgatcg cacctaactt tgctatctct gcggtgttga ccatggtctt ttccaagcag 360
gctgcccgct tcttcgaatc agctgaagtt attgagctgc accaccccaa caagctggat 420
gcaccttcag gcaccgcgat ccacactgct cagggcattg ctgcggcacg caaagaagca 480
ggcatggacg cacagccaga tgcgaccgag caggcacttg agggttcccg tggcgcaagc 540
gtagatggaa tcccagttca cgcagtccgc atgtccggca tggttgctca cgagcaagtt 600
atctttggca cccagggtca gaccttgacc atcaagcagg actcctatga tcgcaactca 660
tttgcaccag gtgtcttggt gggtgtgcgc aacattgcac agcacccagg cctagtcgta 720
ggacttgagc attacctagg cctgtaa 747
<210> 55
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC变异体氨基酸序列（lysC variant aa seq.）
<400> 55
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34
<210> 57
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcc 29
<210> 60
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hom变异体氨基酸序列（hom variant aa seq.）
<400> 60
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20 25 30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile
35 40 45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65 70 75 80
Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly
85 90 95
Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys
100 105 110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115 120 125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130 135 140
Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu
145 150 155 160
Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr
165 170 175
Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195 200 205
Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala
210 215 220
Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu
225 230 235 240
Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala
245 250 255
Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260 265 270
Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275 280 285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe
290 295 300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala
305 310 315 320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325 330 335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340 345 350
Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His
355 360 365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala
370 375 380
Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu
385 390 395 400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala His Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu
405 410 415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420 425 430
Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp
435 440 445
<210> 61
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
atcctctaga gtcgacccaa ctgcagacgt cgaa 34
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
atgcctgcag gtcgacatag acagatttgt ccacg 35
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
gtgaccacga tcagatgtgc atcatcatcg cgctc 35
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
gcgatgatga tgcacatctg atcgtggtca cccac 35
<210> 65
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dapA变异体氨基酸序列（dapA variant aa seq.）
<400> 65
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
1 5 10 15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
20 25 30
Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
100 105 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Phe Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
130 135 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225 230 235 240
Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn
260 265 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu
275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
290 295 300
<210> 66
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
atcctctaga gtcgacatga gcacaggttt aacag 35
<210> 67
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
atgcctgcag gtcgacttgc gggtaacctt ccggc 35
<210> 68
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
ttggctcggc ttggaaaaat aaggagttac aacta 35
<210> 69
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gttgtaactc cttatttttc caagccgagc caagag 36
<210> 70
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lysA变异体氨基酸序列（lysA variant aa seq.）
<400> 70
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145 150 155 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225 230 235 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Ala Ala Ile
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370 375 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
<210> 71
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
atcctctaga gtcgacgaca cgtggtgctg gactc 35
<210> 72
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
atgcctgcag gtcgacagaa acccagaaac ccaaa 35
<210> 73
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gggcctgcga tagctgcgcc gggctcaaca agcac 35
<210> 74
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
ttgttgagcc cggcgcagct atcgcaggcc cctcc 35
<210> 75
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ddh变异体氨基酸序列（ddh variant aa seq.）
<400> 75
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Leu Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg
305 310 315
<210> 76
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
atcctctaga gtcgacccaa catccgcgta gcta 34
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
atgcctgcag gtcgacaaga ggcaaggaaa ccac 34
<210> 78
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
gtcttcggat gggaggaggt actggactgc cttttg 36
<210> 79
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
aaggcagtcc agtacctcct cccatccgaa gacgcc 36
<210> 80
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dapA氨基酸序列（dapA aa seq.）
<400> 80
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
1 5 10 15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
20 25 30
Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
100 105 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
130 135 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225 230 235 240
Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn
260 265 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu
275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
290 295 300
<210> 81
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lysA氨基酸序列（lysA aa seq.）
<400> 81
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145 150 155 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225 230 235 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370 375 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
<210> 82
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ddh氨基酸序列（ddh aa seq.）
<400> 82
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305 310 315 320

Claims (13)

1.一种具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的变异多肽，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:51的氨基酸序列中第13位的氨基酸被天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺取代。
2.根据权利要求1所述的变异多肽，其中与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:51的氨基酸序列的野生型二氢吡啶二羧酸还原酶的活性相比，所述变异多肽的二氢吡啶二羧酸还原酶活性减弱。
3.根据权利要求1所述的变异多肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第13位的氨基酸被天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺取代。
4.根据权利要求1所述的变异多肽，其中所述变异多肽由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：53的氨基酸序列组成。
5.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的变异多肽。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：54的核苷酸序列组成。
7.一种棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物，包含根据权利要求1所述的变异多肽；编码所述多肽的多核苷酸；以及包含所述多核苷酸的载体中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物，进一步包含选自以下(1)至(3)的变异多肽中的任意一种或多种：
(1)二氢吡啶二羧酸合酶活性减弱的变异多肽；
(2)二氨基庚二酸脱羧酶活性减弱的变异多肽；以及
(3)二氨基庚二酸脱氢酶活性减弱的变异多肽。
9.根据权利要求8所述的棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物，其中所述变异多肽包括选自以下(1)至(3)的变异多肽中的任意一种或多种：
(1)变异二氢吡啶二羧酸合酶多肽，其中SEQ ID NO：65的氨基酸序列的第119位的酪氨酸被苯丙氨酸取代；
(2)变异二氨基庚二酸脱羧酶多肽，其中SEQ ID NO：70的氨基酸序列的第302位的精氨酸被丙氨酸取代；以及
(3)变异二氨基庚二酸脱氢酶多肽，其中SEQ ID NO：75的氨基酸序列的第169位苏氨酸被亮氨酸取代。
10.根据权利要求7所述的棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物，其中与未修饰的菌株相比，所述微生物具有增加的L-苏氨酸生产能力。
11.根据权利要求7所述的棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
12.一种生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养棒杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物的步骤，所述微生物包含根据权利要求1所述的变异多肽。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括从在培养所述微生物的步骤中培养的培养基和微生物中回收L-苏氨酸的步骤。
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