KR101485222B1 - ｄａｐＡ 활성 조절을 통해 Ｌ-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 내재적 디하이드로디피콜리네이트의 활성이 감소 또는 불활성화되고, UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제의 활성이 도입되어 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE)의 활성을 도입하고 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA)를 불활성화한 코리네박테리움 속 미생물을 이용하면, L-쓰레오닌의 생산수율을 현저히 향상시킬 수 있으므로, L-쓰레오닌의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ｄａｐＡ 활성 조절을 통해 Ｌ-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산방법 {Corynebacterium sp. microorganism having enhanced L-threonine productivity by regulation of dapA activity and a method of producing L-threonine using the same}
본 발명은 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제의 활성이 도입됨과 동시에 내재적 디하이드로디피콜리네이트의 활성이 감소 또는 불활성화됨으로써, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관한 것이다.
L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 식품 첨가제 및 동물성장 촉진제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 이와 같은 L-쓰레오닌은 미생물 발효 기술에 의해서 생산될 수 있는 아미노산인데, 대장균(Escherichia coli), 코리네형 세균(Corynebacterium), 브레비형 세균(Brevibacterium), 세라티아속 세균(Serratia), 프로비덴시아속 균주(Providencia)의 야생주로부터 유도된 돌연변이주를 주로 이용한 발효법으로 생산된다.
유전자 재조합 균주에 관한 공지 기술로는 아스파테이트 키나아제-호모세린디하이드로게나제 (aspartate kinase/homoserine dehydrogenase, thrA), 호모세린 키나아제 (homoserine kinase, thrB) 및 쓰레오닌 신타아제 (threonine synthase, thrC)를 코딩하는 유전자로 구성된 쓰레오닌 오페론 (operon)이 플라스미드 형태로 도입된 재조합 대장균을 사용한 L-쓰레오닌 제조방법 (일본 공개특허공보 제05-227977호), 대장균 염색체로 쓰레오닌 오페론을 추가 삽입의 방법으로 발현강화를 통한 L-쓰레오닌을 생산하는 방법 (대한민국특허 등록번호 제10-0427479호) 및, 대장균 유래의 쓰레오닌 오페론을 쓰레오닌 생산 균주인 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum)에 도입하여 L- 쓰레오닌을 생산하는 방법 (TURBA E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:2269~2271, 1989) 등이 있다.
한편, 코리네박테리움 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다. 그러나, L-쓰레오닌의 생산 수율을 증가시키기 위해서 상기 개시된 것과 같이 포스포에놀파이루베이트로부터 쓰레오닌에 이르는 생합성 경로에 연구가 집중되었으나, 여전히 더 높은 수율의 L-쓰레오닌을 공업적으로 대량 생산하기 위한 방법의 필요성이 대두되고 있다.
L-쓰레오닌의 생합성 과정은 포스포에놀 파이루베이트(phosphoenol pyruvate; 이후 PEP라 함)가 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(phosphoenol pyruvate carboxylase; 이후 ppc라 함)에 의하여 그리고/또는 파이루베이트(pyruvate)가 파이루베이트 카르복실레이즈(pyruvate carboxylase; 이후 pyc라 함)에 의하여 L-쓰레오닌 생합성 대사과정의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate; 이후 OAA라 함)로 전환되고 이 OAA가 다시 아스파테이트(aspartate)로 전환된 후, 아스파테이트로부터 L-쓰레오닌을 생합성하는 경로에 관여하는 유전자들인 아스파르테이트 카이네이즈(aspartate kinase; lysC), 아스파르테이트 세미알데하이드 디하이드로게네이즈(aspartate semialdehyde dehydrogenase; asd), 호모세린 디하이드로게네이즈(homoserine dehydrogenase; hom), 호모세린 카이네이즈(homoserine kinase; thrB), 쓰레오닌 신테이즈(threonine synthase; thrC) 유전자에 의해 여러 단계의 중간 과정을 거쳐 L-쓰레오닌이 합성된다.
한편, 상기 생합성 대사과정 중 아스파르테이트 세미알데하이드(aspartate semi-aldehyde)는 L-쓰레오닌의 생합성 과정에 관여할 뿐 만 아니라 여러 단계의 대사과정을 거쳐 디아미노피멜레이트(diaminopimelate)으로 전환되어 L-라이신과 펩티도글리칸(peptidoglycan)의 생합성에 관여하게 된다. 그러나 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-쓰레오닌의 생합성을 보다 증대시키기 위해서는 아스파트 세미알데하이드가 L-라이신과 펩티도글리칸의 생합성으로 전환되는 분지점을 유전적으로 차단할 필요가 있지만, 아직까지 이 분지점을 차단하기 위한 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA) 유전자를 유전적으로 차단하는 것이 성공적으로 보고된 바가 없었다. 그 이유는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 디하이드로디피콜리네이트 신타제 유전자를 유전적으로 차단하는 것은 펩티도글리칸의 생합성을 차단함으로 세포의 성장을 불가능하게 할 수 있기 때문이다. 따라서, dapA 유전자를 유전적으로 차단하면서도 세포의 성장 또한 가능하게 함으로써 L-쓰레오닌을 효율적으로 생산하는 방법을 개발할 필요성이 있었다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 L-쓰레오닌을 보다 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 디아미노피멜레이트(diaminopimelate) 대신 L-라이신을 펩티도글리칸의 생합성을 위한 전구체로 사용할 수 있는 Streptococcus pyogenes 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE) 유전자의 발현을 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유도하고 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA) 유전자를 유전적으로 차단함으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase)의 활성이 도입되고, 내재적 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase)의 활성이 감소 또는 불활성화된, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제를 코딩하는 murE 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하는, 상기 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase)의 활성이 도입되고, 내재적 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase)의 활성이 감소 또는 불활성화된, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명은 코리네박테리움 속 미생물 세포 내의 L-쓰레오닌 생합성 경로에 대한 분지점에 관여하는 유전자의 기능을 조절하여 상기 미생물의 L-쓰레오닌 생합성 경로를 통한 L-쓰레오닌 생합성 증대효과가 이루어지게 한다. 상기 유전자 기능의 조절은 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA)를 불활성화하는 것이다. 더불어, 상기 유전자의 불활성화를 위하여, Streptococcus pyogenes 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE)의 활성을 코리네박테리움 글루타미쿰에서 도입함으로써 펩티도글리칸 생합성에 필요한 디아미노피멜레이트 대신 L-라이신을 이용하도록 할 수 있다.
상기 dapA 유전자를 불활성화시켜 L-쓰레오닌 생성 기작에서 중간체인 아스파르테이트 세미알데히드가 L-라이신 생성에 사용되는 것을 막아 L-쓰레오닌 생성이 특이적으로 증대됨에 따라 세포 내 L-쓰레오닌의 농도가 유의적으로 증가될 수 있다. 상기 유전자의 불활성화는 NCgl1896를 불활성화시키는 것이다.
본 발명에서 용어, "디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA)"란 아스파트 세미알데하이드(aspart semi-aldehyde)로부터 디아미노피멜레이트의 생합성 대사과정의 첫 번째 반응을 책임지는 효소이다.
본 발명에서 용어, "내재적"이란 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 것을 의미하는데, 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물이 천연적으로 가지고 있는 dapA 또는 dapA의 활성을 표시할 때 사용한다.
본 발명에서 "디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase)의 불활성화"한다는 것은 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자의 변이에 의해 정상적인 유전자의 발현을 불가능하게 하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 dapA 유전자 NCgl1896가 변이되어, 이로부터 정상적인 단백질의 발현이 불가능한 상태를 표시할 때 사용한다.
본 발명에서 "불활성화"란 상기 dapA 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미하고, 상기 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서 "디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA)의 불활성화"는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition), 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의하여 유발될 수 있고, 바람직하게는 상동 재조합에 의하여 상기 유전자를 결실시키는 방법을 사용함이 바람직하다.
상기 디하이드로디피콜리네이트 신타제의 불활성화는 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자의 일부가 결실된 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 형질전환을 유도함으로써, dapA 유전자 일부 염기서열의 결실을 유도하였다. 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, pK18mobsacB 벡터로부터 유래된 것을 사용함이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, NCgl1896의 내부적 결실을 포함하는 도 3에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC2509 등을 사용할 수 있다. 상기 pK18mobsacB는 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 타겟 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있다(Schafer et al. 1994).
본 발명의 일 실시예에서는 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자의 일부분이 결실된 유전자 염기서열과 항생제 마커 및 레반수크라아제 유전자(sacB)를 포함하는 재조합 벡터를 이용하였다. 이때, 상기 항생제 마커는 특별히 이에 제한되지 않으나, 카나마이신 내성부여 유전자를 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 dapA 유전자를 변이시켜서, 디하이드로디피콜리네이트 신타제의 활성을 감소시키면, 디하이드로디피콜리네이트 신타제에 의하여 사용되지 않는 아스파르테이트 세미알데히드가 L-쓰레오닌 생성 경로에 따라, 호모세린(homoserine)으로 전환되고, 이후 과정에 의해, 결과적으로는 L-쓰레오닌의 생산수율을 향상시킴을 확인할 수 있었다. 다만, 이를 위해 UDP-N-아세틸뮤라메이트 펜타펩티드에 L-라이신 생합성의 중간체인 디아미노피멜레이트 대신 L-라이신이 포함될 수 있도록 S. pyogenes 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE)를 코딩하는 유전자의 발현을 코리네박테리움 속 미생물에 유도함으로써 펩티도글리칸 생합성을 위한 디아미노피멜레이트의 필수적 요소를 배제하였다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-쓰레오닌 생산과정을 나타내는 개요도이다.
결과적으로는 dapA 유전자의 불활성화에 의하여 L-쓰레오닌의 생합성 증가를 유도할 수 있을 것으로 예상하였으며, 이를 실험적으로 입증하였다.
본 발명에서 용어, "L-쓰레오닌"이란 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식은 NH2(CH2)4CH(NH2)COOH인, L-아미노산의 일종을 말한다. L-쓰레오닌은 옥살아세트산으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성 되며, NADPH 의존성 환원효소가 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다.
본 발명에서 용어, "L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물"은 염색체 상에 존재하는 dapA 유전자가 변이되어 디하이드로디피콜리네이트 신타제의 활성이 감소 또는 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 의미하는데, 상기 dapA 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl1896 등을 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "코리네박테리움 속 미생물(Corynebacterium sp.)"이란 방선균 유연의 세균 속으로 대체로 주걱형의 장간균의 형태를 가지며, 비운동성, 다형변태성, 포자 비형성 및 그람양성을 특징으로 가지는 미생물을 의미한다. 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물은 바람직하게는 L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes) 등일 수 있으며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 NCgl0624(호모세린-O-아세틸전이효소, homoserine-O-acetyltransferase), NCgl2046(쓰레오닌-탈수효소, threonine-dehydratase), NCgl1133(디아미노피멜레이트 탈카복실화효소, diaminopimelate decarboxylase) 및 NCgl2528(D-2-하이드록시아이소카푸로에이트 탈수소화효소, D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase)의 일부를 결실시킨 SJ3611(KACC91730P, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)균주 유래일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 SJ3611 균주를 모균주로 하여 추가적으로 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase)를 코딩하는 유전자인 murE을 도입하고, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자인 NCgl1896을 결실시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3638(KACC91733P, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, NCgl0624::Pgap-spy0388-TrrnB, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△, NCgl1896△)일 수 있다.
아울러, 본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 향상시키기 위해서 코리네박테리움 속 미생물의 dapA 유전자를 변이시키면 펩티도글리칸의 생성에 문제가 생기는데, 이를 보완하기 위해서 S. pyogenes 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE)의 활성을 도입할 수 있다. 구체적으로, UDP-N-아세틸뮤라메이트 펜타펩티드에 L-라이신 생합성의 중간체인 디아미노피멜레이트 대신 L-라이신을 사용하는 murE 유전자를 도입할 수 있다.
본 발명에서 용어, "펩티도글리칸(peptidoglycan)"이란 세균의 세포벽을 구성하는 성분으로 다양한 당분자와 아미노산으로 구성된 폴리머이며 세균 세포벽의 다양한 구조적인 기능을 수행한다. 펩티도글리칸의 생합성은 세포질에서 시작되며 UDP-N-아세틸뮤라메이트(UDP-N-acetylmuramate)을 전구체로 이용하여 UDP-N-아세틸뮤라메이트 펜타펩티드를 형성하게 되는데, 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 UDP-N-아세틸뮤라메이트 펜타펩티드에 L-라이신 생합성의 중간체인 디아미노피멜레이트(diaminopimelate)을 포함하게 된다. 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰에서 디아미노피멜레이트의 생합성은 세포의 성장을 위한 필수적인 요소이다.
본 발명의 일 양태로 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(murE)가 도입되고, 디하이드로디피콜리네이트 신타제 유전자(dapA)가 파괴된 재조합 균주인 SJ3638의 경우, 모균주보다 L-쓰레오닌의 생산량이 약 10배 증가하였다(0.18 vs. 1.79 g/l). 이와 같은 결과는 dapA의 불활성화가 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 L-쓰레오닌의 농도를 증가시키는 역할을 한다는 것을 보여준다.
본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제를 코딩하는 murE 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, (ⅰ) 단계에서 상기 murE 발현 재조합 벡터는 (a) murE를 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입될 수 있고 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 도입하는 단계를 통해 수득된 재조합 벡터일 수 있다.
또한 바람직하게는, (ⅱ) 단계에서 상기 dapA 불활성 재조합 벡터는 (a) dapA를 코딩하는 유전자의 일부 서열이 변이된 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입될 수 있고 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 도입하는 단계를 통해 수득된 재조합 벡터일 수 있다.
이때, 상기 murE 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 스트렙토코커스 피오제네스(S. pyogenes) 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다. 또한, 상기 dapA 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, Genbank accession number NC_003450의 개방해독틀 DNA 서열을 가지는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl1896을 사용함이 바람직하다.
아울러, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, L-쓰레오닌을 생산하는 미생물을 이용할 수 있는데, 바람직하게는 아스파르테이트 세미알데히드를 중간체로 하는 경로를 포함하는 경로에 의하여 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes) 등의 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주일 수 있으며, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611(KACC91730P)일 수 있다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 숙주세포의 염색체와 따로 복제될 수 없는 벡터로서, 유전자 삽입물이 상기 숙주세포의 염색체상의 특정 유전자와 상동 재조합될 수 있는 필수적인 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 구체적으로 항생제 내성 유전자와 레반수크라아제(levansucrase, sacB) 유전자와 같은 선발유전자를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)를 이용함으로써 유전자 결실을 수행하였다. 구체적으로, 상기 pK18mobsacB 벡터에 1) murE 유전자(spy0388)를 포함하도록 변이된 NCgl0624, 또는 2) dapA를 코딩하는 유전자인 NCgl1896의 일부를 변이, 바람직하게는 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하고, 이에 항생제 마커 및 레반수크라아제 유전자(sacB)를 추가로 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터를 당업계에 알려진 임의의 방법으로 염색체상에 dapA를 코딩하는 유전자를 포함하여 L-쓰레오닌을 생합성할 수 있는 숙주세포에 도입시킨 후, 염색체 내에서 상동 재조합시킴으로써, murE 도입 및 dapA 유전자가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산용 코리네박테리움 미생물을 제작하였다.
구체적으로, pK18mobsacB 벡터에 1) GAP 유전자의 프로모터-murE를 코딩하는 유전자(spy0388)-rrnB의 터미네이터를 포함하고 있는 변이된 NCgl0624의 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터pSJ2810을 제조하였고, 2) NCgl1896의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pSJ2509를 제작하였다.
그런 다음, 상기 제작된 각 재조합 벡터 pSJ2810, 및 pSJ2509를 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611(ATCC13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)에 순차적으로 전기천공법으로 도입하고, 카나마이신 내성 표현형을 선발하여 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 상기 플라스미드가 싱글 크로스오버에 의해 해당 유전자의 염색체 부위에 도입되었음을 확인하였다. 그 후 10%의 수크로오스 배지에서 2차 재조합의 선발과 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 해당 유전자의 염색체 부위로부터 플라스미드가 절제(excision)되었음을 확인하였다. 그 결과 염색체 상에 murE 유전자가 도입되고, dapA 유전자인 NCgl1896의 일부가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 SJ3638이라 명명하고, 2012년 8월 9일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 KACC91733P의 기탁번호를 부여받았다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 탄소원의 일부 또는 전부로서 글루코스가 포함된 배양 배지에 본 발명의 L-쓰레오닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, 상기 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 L-쓰레오닌의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-쓰레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서는, 제조된 재조합 균주를 글루코오스를 포함하는 MMY2 배지에서 배양하였다.
아울러, 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 L-쓰레오닌 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.
한편, 본 발명에서는 L-쓰레오닌 생산량을 더욱 증가시키기 위해, L-쓰레오닌의 생합성에 관련된 공지의 효소들의 활성을 추가로 조절할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 추가로 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제 효소의 활성을 조절하기 위하여 상기 효소를 암호화하는 asd 유전자를 과발현시켜 L-쓰레오닌 생산량을 증대시킬 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조된 L-쓰레오닌의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 글루코스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하고, 이로부터 생산되는 L-쓰레오닌의 생산량의 증가수준을 상호 비교하였다. 그 결과, murE가 도입되고 dapA가 불활성화된 균주에서 L-쓰레오닌의 생산량이 증가함을 확인할 수 있었다(표 4).
본 발명의 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE)의 활성을 도입하고 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase, dapA)를 불활성화한 코리네박테리움 속 미생물을 이용하면, L-쓰레오닌의 생산수율을 현저히 향상시킬 수 있으므로, L-쓰레오닌의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 dapA 유전자가 발현하는 효소가 작용하는 기작을 포함하는 L-쓰레오닌 생합성 대사과정을 나타내는 개요도이다.
도 2는 Streptococcus pyogenes 유래의 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase, murE) 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전체 상에서 발현하기 위한 발현 벡터 pSJ2810의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 dapA 유전자인 NCgl1896을 변이시키기 위한 벡터 pSJ2509의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예1 : 재조합 벡터 제작
1-1. 모균주 제작용 불활성화 유도 재조합 벡터 제작
본 발명의 유전체 재조합 모균주인 SJ3611(Lys-, Met-, Ile-)을 제조하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, NCgl0624(호모세린-O-아세틸전이효소, homoserine-O-acetyltransferase), NCgl2046(쓰레오닌-탈수효소, threonine-dehydratase), NCgl1133(디아미노피멜레이트 탈카복실화효소, diaminopimelate decarboxylase) 및 NCgl2528(D-2-하이드록시아이소카푸로에이트 탈수소화효소, D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase) ORF의 불활성화 단편을 제작하기 위해 GenBank accession number NC_003450의 서열을 근거로 각각 프라이머 0624F1, 0624F2, 0624R1, 0624R2, 2046F1, 2046F2, 2046R1, 2046R2, 1133F1, 1133F2, 1133R1, 1133R2, 2528F1, 2528F2, 2528R1, 2528R2를 제작하였다.
부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능하고 sacB 유전자를 포함하여 2차 재조합 균주를 선별할 수 있으며 카나마이신 내성 유전자를 가지고 있는pK18mobsacB 벡터를 사용하여 수행하였으며, 유전자가 파괴된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 만들기 위하여 NCgl0624, NCgl2046, NCgl1133 와 NCgl2528의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pK18mobsacB 유도체를 만들었다.
상기 pK18mobsacB 유도체는 각각 pSJC2501, pSJC2504, pSJC2505 및 pSJC2507로 명명하였다.
pSJC2501은 2,038-bp 짜리 NCgl0624 ORF의 BamHI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl0624 ORF의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 KpnI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 0624F1-0624R1 프라이머와 0624F2-0624R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.
pSJC2504은 1,902-bp 짜리 NCgl2046 ORF의 XbaI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2046 ORF의 BamHI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 BamHI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2046F1-2046R1 프라이머와 2046F2-2046R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.
pSJC2505은 2,018-bp 짜리 NCgl1133 ORF의 XbaI-HindIII 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl1133 ORF의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 SmaI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 1133F1-1133R1 프라이머와 1133F2-1133R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.
pSJC2507은 2,317-bp 짜리 NCgl2528 ORF의 XbaI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2528 ORF의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 SmaI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2528F1-2528R1 프라이머와 2528F2-2528R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 생성된 것이다.
1-2. murE 도입 재조합 벡터 제작
코리네박테리움의 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(Gap) 유전자의 프로모터를 이용한 S. pyogenes 유래의 murE 유전자의 과발현을 위하여 먼저 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 상기 pK18mobsacB를 사용하여 부위-특이적 유전자 삽입(site specific gene insertion)을 수행하였으며, NCgl0624의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pK18mobsacB 유도체를 만들었다. 상기 pK18mobsacB 유도체는 상기 실시예 1-1에서 제조한 pSJC2501이다.
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032 균주의 게놈 유전자 DNA를 주형으로 하고 PgapF-PgapR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, spy0388F-spy0388R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한,rrnB 터미네이터를 제조하기 위하여 pTrc99A(Amann et al. 1988)을 주형으로 하여 TrrnBF-TrrnBR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
상기 PCR은 중합효소는 PfuUltraTM 고신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)을 이용하였고, 변성(Denaturing) 95℃, 30초; 어닐링(Annealing) 55℃, 30초; 및 중합반응(Extension) 68℃, 1분으로 이루어진 사이클을 25회 반복하였다. 각각의 PCR 산물들의 말단 부위를 제한효소 처리한 후, XbaI으로 제한효소 처리한 pBluescriptKSII 벡터와 접합하여 재조합 벡터를 얻었다.
상기 실시예 1-1에서 얻어진 재조합 pSJC2501 벡터를 KpnI으로 제한효소 처리하고 T4 DNA polymerase를 이용하여 blunt-end 처리한 후, 상기에서 얻은 Gap 유전자의 프로모터 단편과 S. pyogenes 유래의 murE 유전자 단편 및 rrnB 터미네이터 단편을 포함하는 pBluescriptKSII 재조합 벡터를 XbaI으로 제한효소 처리한 후 Klenow DNA polymerase를 이용하여 blunt-end 처리하고 blunt-ended KpnI 처리된 pSJC2501과 접합하여 재조합 벡터 pSJ2810을 얻었다(도 2).
1-3. dapA 불활성화 유도 재조합 벡터 제작
디하이드로디피콜리네이트 신타제(dapA)를 불활성화시킨 본 발명의 유전체 재조합 균주인 SJC3638을 제조하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 발현하는 유전자로 알려진 NCgl1896의 불활성화 단편을 제작하기 위해 NCgl1896의 서열을 근거로 각각 프라이머 1896F1, 1896F2, 1896R1, 및 1896R2를 제작하였다.
부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 상기 pK18mobsacB를 사용하여 수행하였으며, 유전자가 파괴된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 만들기 위하여 NCgl1896의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pK18mobsacB 유도체를 만들었다.
상기 pK18mobsacB 유도체는 pSJC2509로 명명하였다.
pSJC2509는 1,919-bp짜리 NCgl1896의 EcoRI-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl1896의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 KpnI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 1896F1-1896R1 프라이머와 1896F2-1896R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다(도 3).
상기에서 사용한 프라이머들의 서열을 정리하면 하기 표 1과 같다.
PCR 및 재조합 사용된 프라이머
프라이머 핵산 서열
0624F1(서열번호 3) cgggatccTCCTGGATATTCCTGCGG (BamHⅠ)
0624F2(서열번호 4) ggggtaccAGCAAGAACACCTCTCC (KpnⅠ)
0624R1(서열번호 5) ggggtaccTGATGGCTTTGCCGGGAC (KpnⅠ)
0624R2(서열번호 6) gctctagaTGCTGGGTTGGATTGAGG (XbaⅠ)
2046F1(서열번호 7) gctctagaTGGAGTCCCTAGTAGAGG (XbaⅠ)
2046F2(서열번호 8) cgggatccCTATCGCTGGGTTGAAGG (BamHⅠ)
2046R1(서열번호 9) cgggatccTTGGTGCAATGACGGAGG (BamHⅠ)
2046R2(서열번호 10) gctctagaCCTTCCACGACTCTCACC (XbaⅠ)
1133F1(서열번호 11) gctctagaTCCCTGATCCGTTCCTCC (XbaⅠ)
1133F2(서열번호 12) tcccccgggTACTGCTACGCCATGAGC (SmaⅠ)
1133R1(서열번호 13) tcccccgggGTCTTCGTGGCTAGTGG (SmaⅠ)
1133R2(서열번호 14) cccaagcttACTCTGACGACGATCGCA (HindⅢ)
2528F1(서열번호 15) gctctagaTCAAGGCTGCTGCTGACC (XbaⅠ)
2528F2(서열번호 16) tcccccgggCAAGCTGGACCGAAACCC (SmaⅠ)
2528R1(서열번호 17) tcccccgggCACAGGAACAGCACGTCC (SmaⅠ)
2528R2(서열번호 18) gctctagaCTTGCTGGCTGATCCTCG (XbaⅠ)
1896F1(서열번호 19) cggaattcGTGGAGTTGATAGCGTG (EcoRI)
1896F2(서열번호 20) ggggtaccGGTGGAGTCAGCTTGGCA (KpnI)
1896R1(서열번호 21) ggggtaccGCCGAAGTGCTCTACTCC (KpnI)
1896R2(서열번호 22) gctctagaTCGTTGACCTCGATCAGC (XbaI)
PgapF(서열번호 23) gctctagaGTCGTATTCGTCGTCTTTTGACGATCGC (XbaI)
PgapR(서열번호 24) ggaattccatatgGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG (NdeI)
spy0388F(서열번호 25) ggaattccatatgATAACCATTGAACAA (NdeI)
spy0388R(서열번호 26) aactgcagTTAAAGTGTTCATCTGCCC (PstI)
TrrnBF(서열번호 27) aactgcagGCTGTTTTGGCGGATGAGAG (PstI)
TrrnBR(서열번호 28) gctctagaAAAAGGCCATCCGTCAGG (XbaI)
상기 표 1에서 밑줄친 서열은 괄호 안에 나타낸 바와 같은 제한효소에 대한 제한위치를 나타내며, 대문자는 세균성 유전자의 서열을 의미한다.
또한, 상기 실시예에서 사용 또는 제조된 플라스미드 및 이의 구조를 정리하면 하기 표와 같다(표 2).
사용 또는 제조된 플라스미드 및 이의 구조
플라스미드 구조
pK18mobsacB 코리네박테리움에서 non-replicale sacB KmR
pSJC2501 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 0624F1-0624R1 프라이머와 0624F2-0624R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,038-bp의 BamHⅠ-XbaⅠ 말단을 지니는 NCgl0624 단편이 KpnⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2504 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2046F1-2046R1 프라이머와 2046F2-2046R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 1,902-bp의 XbaⅠ-XbaⅠ 말단을 지니는 NCgl2046 단편이 BamHⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2505 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 1133F1-1133R1 프라이머와 1133F2-1133R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,018-bp의 XbaⅠ-HindⅢ 말단을 지니는 NCgl1133 단편이 SmaⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2507 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2528F1-2528R1 프라이머와 2528F2-2528R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 2,317-bp의 BamHⅠ-XbaⅠ 말단을 지니는 NCgl0624 단편이 KpnⅠ 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2509 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 1896F1-1896R1 프라이머와 1896F2-1896R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 1,896-bp의 EcoRI-XbaI 말단을 지니는 NCgl1896 단편이 KpnI 절편의 인-프레임 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체
pSJC2810 코리네박테리움 글루타미쿰의 gap 유전자 프로모터, S. pyogenes 유래의 murE 유전자, pTrc99A 플라스미드의 rrnB 터미네이터의 염기서열로 구성된 transcriptional fusion이 pSJC2501 상의 NCgl0624 단편의 KpnI 부위에 포함되어 있는 pK18mobsacB 유도체
상기 정리된 플라스미드들을 이용하여 이하 재조합 균주를 제작하였다.
실시예 2: 재조합 균주 제작
2-1. 모균주 제작
상기 실시예 1에서 제조한 결실 유도 플라스미드 pSJC2501, pSJC2504, pSJC2505와 pSJC2507를 순차적으로 전기천공법을 이용하여 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 각각의 상기 플라스미드는 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후, 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제(excision)를 유도하여, NCgl0624, NCgl2046, NCgl1133 와 NCgl2528의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 모균주 SJ3611(ATCC13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)를 제조하였다. 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 NCgl0624, NCgl2046, NCgl1133, 및 NCgl2528 유전자가 모두 결실된 것을 확인하고 SJ3611으로 명명하였고, 2012년 8월 9일 국립농업과학원 농업유전자원 센터에 기탁하여 수탁번호 KACC91730P를 부여받았다.
2-1. murE 유전자가 도입된 재조합 균주 제작
상기 실시예 1-2에서 제조한 재조합 플라스미드 pSJ2810를 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611 균주 (ATCC 13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)에 전기천공법을 이용하여 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 상기 플라스미드는 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후 10%의 수크로오스에서 2 차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제(excision)를 유도하였다. 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 NCgl0624 유전자에 Gap 유전자의 프로모터 단편과 S. pyogenes 유래의 murE 유전자 단편 및 rrnB 터미네이터 단편이 삽입된 것을 확인하고 SJ3650으로 명명하였다.
2-3. dapA 유전자가 결실된 재조합 균주 제작
상기 실시예 2-2에서 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3650(ATCC13032, NCgl0624::Pgap-spy0388-TrrnB, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△)에 추가로 dapA 유전자인 NCgl1896 유전자를 결실시킨 변이주를 제작하였다.
구체적으로는, 상기 실시예 1-3에서 제조한 결실 유도 플라스미드 pSJ2509를 전기천공법을 이용하여 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 각각의 상기 플라스미드는 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후, 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제(excision)를 유도하여, NCgl1896의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 본 발명의 재조합 균주 SJ3638(ATCC 13032, NCgl0624::Pgap-spy0388-TrrnB, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△, NCgl1896△)을 제조하였다.
상기 제조된 균주와 그의 특성을 정리하면 하기 표와 같다.
제조된 균주 및 특성
균주 특성
SJ3611 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, NCgl0624△, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△
SJ3650 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, NCgl0624::Pgap-spy0388-TrrnB, NCgl2046△, NCgl1133△, NCgl2528△
SJ3638 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3650, NCgl1896△
실시예 3. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양
상기 실시예 2에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 재조합 균주인 SJ3611과 SJ3628은 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종배지로 kanamycin(50mg/L)을 포함하는 Recovery Glucose 배지(80g BHI, 20g 클루코오스, 60g 소르비톨/L)을 사용하여 24시간 배양하였다. 생산배지는 kanamycin(50 mg/L)을 포함하는 MMY2 배지[1.0 g KH2PO4, 60 g (NH4)2SO4, 0.8 g MgSO4ㆍ7H2O, 10 mg MnSO4ㆍH2O, 10 mg FeSO4ㆍ7H2O, 20 g yeast extract, 0.4 mg 비오틴, 0.3 mg thiamine, 및 60 g 글루코오스/L, pH 7.0]를 사용하였다. 종배지를 함유하는 100㎖ 배플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 SJ3611와 본 발명의 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3638을 각각 접종하고 진탕배양(200 rmp)하였다. 종배지에서 배양된 상기 클루타미쿰을 분리하여 수확한 후 상기 글루타미쿰은 600nm에서 흡광도가 0.4 ~ 0.5일 때까지 상기 생산배지 10㎖을 함유하는 100㎖ 배플 플라스크에서 재현탁하였다. 그 후, 10㎖ 당 0.2 g의 멸균된 CaCO3를 첨가하였고, 필요한 경우 카나마이신(kanamycin)을 50 ㎍/L 의 최종농도까지 첨가하였다. 상기의 배양은 30℃의 200rpm 회전식 교반기에서 수행하였다.
실시예 4. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 L- 쓰레오닌 생산
상기 실시예 2 및 3에서 제조·배양한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 SJ3611과 SJ3638에서의 L-쓰레오닌 생산 농도를 측정하였다. 이때, L-쓰레오닌의 농도는 Agilent 1100 series HPLC(Agilent Technologies, CA, USA) 및 Zorbax Eclipse C18 column을 사용하여 정량하였다. 건조균체량은 600 nm에서의 흡광도 값을 1로 하여 1L당 건조중량 0.3 g에 해당하는 점을 기초로 측정하였다.
이에 의한 측정값은 하기 표와 같았다(표 4).
재조합 균주의 L-쓰레오닌의 생산농도
코리네박테리움 글루타미쿰 L-쓰레오닌(g/L)
SJ3611 0.18
SJ3638 1.79
상기의 값은 적어도 2개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10% 이하였다.
표 4에서 보듯이, SJ3638은 SJ3611에 비하여 L-쓰레오닌의 생산량이 대략 10배 증가하였다(0.18 vs. 1.79 g/l). 이는 murE의 도입과 dapA의 불활성화가 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 L-쓰레오닌의 농도를 증가시키는데 역할을 한다는 것을 시사한다.
dapA 유전자가 발현하여 작용하는 경로를 차단함으로써 L-쓰레오닌의 생산량이 증가한 것은 L-쓰레오닌 생산 기작의 분지점에서 L-라이신이나 펩티도글리칸 생성으로의 중간체 유입을 억제한 결과로 판단되고, 상기의 결과로부터 dapA 유전자인 NCgl1896을 불활성화시키고, 펩티도글리칸 생성 불능을 극복하기 위해 S. pyogenes 유래의 murE 효소를 도입한 변이주를 사용하여 글루코오스로부터 L-쓰레오닌을 생산하는 방법이 제안될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
농업유전자원센터 KACC91733P 20120809 농업유전자원센터 KACC91730P 20120809
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gctggtgatt tagcaatcgc caaacactac 1440 ctctag 1446 <210> 2 <211> 906 <212> DNA <213> C.glutamicum NCgl1896 <400> 2 atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact tcggcaccgt tggagtagca 60 atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg ctgctggccg cgaagtcgcg 120 gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg cgggcaccac tggtgaatcc 180 ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg ccgttcgtga ggaagttggg 240 gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca cgcggacatc tgtggaactt 300 gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag ttgtaactcc ttattactcc 360 aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa ttgctgcagc aacagaggtt 420 ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc caattgagtc tgataccatg 480 agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg acgccaaggg tgacctcgtt 540 gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt attcaggcga tgacccacta 600 aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt ccgtaattgg acatgcagcc 660 cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag gcgacctcgt ccgtgcgcgg 720 gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2528R2 <400> 18 gctctagact tgctggctga tcctcg 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0281F1 <400> 19 cggaattcgt ggagttgata gcgtg 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0281F2 <400> 20 ggggtaccgg tggagtcagc ttggca 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0281R1 <400> 21 ggggtaccgc cgaagtgctc tactcc 26 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0281R2 <400> 22 gctctagatc gttgacctcg atcagc 26 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PgapF <400> 23 gctctagagt cgtattcgtc gtcttttgac gatcgc 36 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PgapR <400> 24 ggaattccat atggttgtgt ctcctctaaa gattgtagg 39 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer thrBF <400> 25 ggaattccat atgataacca ttgaacaa 28 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer thrBR <400> 26 aactgcagtt aaagtgttca tctgccc 27 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TrrnBF <400> 27 aactgcaggc tgttttggcg gatgagag 28 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TrrnBR <400> 28 gctctagaaa aaggccatcc gtcagg 26

Claims (14)

  1. UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제(UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthetase)의 활성이 도입되고, 내재적 디하이드로디피콜리네이트 신타제(dihydrodipicolinate synthase)의 활성이 감소 또는 불활성화된, L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 감소 또는 불활성화는 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의한, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 감소 또는 불활성화는 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자의 일부가 결실된 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 도 3에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC2509인 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 dapA 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 활성 도입은 UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제를 코딩하는 murE 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC2810인 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 murE 유전자는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래인 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 murE 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 수탁번호 KACC91730P인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3611을 모균주로 하여 제조된 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 수탁번호 KACC91733P인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ3638인 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰.
  13. (ⅰ) UDP-N-아세틸뮤라밀 트리펩타이드 신터타제를 코딩하는 murE 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및,
    (ⅱ) 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰의 제조방법.
  14. (ⅰ) 탄소원의 일부 또는 전부로서 글루코스가 포함된 배양 배지에 제1항 내지 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (ⅱ) 상기 배양물로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌의 생산방법.
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