KR101526047B1 - 아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 - Google Patents

아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이되어, L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물, 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 제조방법 및 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물을 이용하여 L-오르니틴을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 NCgl0462 유전자가 도입되어 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되고, L-오르니틴 생산능이 향상되도록 변이된 미생물을 이용하면, L-오르니틴 생합성 대사경로의 특이적 활성의 증대에 의하여 L-오르니틴의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-오르니틴의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-오르니틴의 제조방법{Microorganism having improved L-ornithin production by increasing the aminotransferase activity and process for preparing the L-ornithin employing the same}
본 발명은 아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이되어, L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물, 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 제조방법 및 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물을 이용하여 L-오르니틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-오르니틴은 생체내의 요소 회로 상에 존재하는 아미노산 중의 하나이며, 아르기닌 생합성 과정의 중간물질로서 간기능을 촉진시키는 의약성분으로 알려진 바 있다. L-오르니틴은 시트룰린, 프롤린과 같이 암모니아에 대한 해독기능을 갖고 있어 간장 질환의 치료제로서 사용될 뿐 아니라, 비만을 예방하는 식품소재로서도 이용되고 있으며, 주름살개선과 같은 피부미용작용 등 새로운 기능성이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 코리네박테리움 균주(Corynebacterium sp.), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.
구체적으로 오르니틴 생산에 이용되는 미생물로는 자외선 처리 등에 의하여 시트룰린 또는 아르기닌 영양 요구성 돌연변이주인 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)(교와하꼬공업(주), 일본, 미국 특허 제 2,988,489호), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 동속 카와사키(B. kawasaki), 동속 플라붐(B. flavum)(아지노모토, 일본 특허공고 제68-8712, 68-8714 및 69-26,910호), 동속 케토글루타미쿰(B. ketoglutamicum), 아스로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus)(교와하꼬공업(주), 미국 특허 제3,574,061호)등이 알려져 있다. 또한 아르기닌이나 시트룰린의 영양 요구성 균주인 아스로박터 시트레우스(A. citreus), 브레비박테리움 락토페르멘툼(B. Lactofermentum), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)(아지노모토(주), 유럽특허 공개 제 0393708 A2)을 마이코페놀산(mycophenolic acid) 또는 오르니티놀(ornithinol)에 저항성을 갖는 영양 요구성 돌연변이 주를 선별하여 오르니틴 생산에 사용한다.
상기 미국 특허 제3,574,061호에서는 영양 요구성 돌연변이주인 브레비박테리움 케토글루타미쿰(ATCC 21092)을 탄화수소, 예를 들어, 파라핀을 주요 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 L-오르니틴을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 방법에 의하면 오르니틴의 생산성은 4일간의 배양에서 8.6 mg/ml로 그다지 높지 않았다.
그러나 L-오르니틴의 산업적 대량생산은 여전히 요구되고 있기 때문에 이를 위하여 L-오르니틴의 생산방법을 더욱 더 개발할 필요성이 있다.
한편, L-오르니틴은 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 L-글루탐산으로부터 순환경로(cyclic pathway)를 통해 생합성 되고, 상기 생합성 과정 중 4번째 단계는 argD 유전자에 의해 코딩된 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제(acetylornithine aminotransferase)에 의해 촉매화 된다. 코리네박테리움 글루타미쿰 세포에는 다양한 종류의 아미노트랜스퍼라제가 존재하는 것으로 알려진 바 있다. 그리고 대부분의 아미노트랜스퍼라제가 다양한 종류의 아미노산 생합성에 관여할 수 있으며, 또한 중복적인 기질 특이성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명자는 이전의 연구에서, 시트룰린과 프롤린 생합성 유전자가 결손되고 아르기닌 억제자(ArgR)에 의한 피드백 제어가 차단된 돌연변이 균주에서 argCJBD 유전자의 상동적 발현(homologous expression)으로 L-오르니틴의 생산량이 증가하였음을 보고한 바 있다. 그러나, L-오르니틴의 생합성 경로로 최대의 카본 플럭스를 유지하기 위해서는 argCJBD의 과발현 뿐 만 아니라, 다양한 아미노트랜스퍼라제의 기능 강화가 L-오르니틴 생합성 증대를 위하여 필수적일 수 있을 것이다.
이러한 배경하에서 본 발명자는 L-오르니틴을 보다 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 NCgl0462 유전자를 도입할 경우, L-오르니틴의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이되어, L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물을 이용하여 L-오르니틴을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 L-오르니틴 생산 미생물에 NCgl0462 유전자가 도입되어 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되고, L-오르니틴 생산능이 향상되도록 변이된 미생물을 제공한다.
본 발명자는 오르니틴의 생산성이 우수한 미생물을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 오르니틴 생합성 경로에 주목하게 되었다. 통상적으로, 산업적인 오르니틴 생합성에 이용되고 있는 코리네박테리움 속 미생물에서는 argJ, argB, argC 및 argD 유전자로부터 발현되는 효소인 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루타메이트 키나아제, 아세틸글루타메이트 세미알데히드 디하이드로게나제 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제가 오르니틴의 생합성에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 효소 중에서 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제는 다른 효소와는 달리 기질다양성을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 이와 유사한 활성을 가지는 다른 아미노트랜스퍼라제 활성을 도입할 경우에도, L-오르니틴 생산능을 향상시킬 수 있을 것으로 예상하고 이를 확인하였다.
본 발명의 용어 "L-오르니틴"이란, 고등동물의 생체 내의 요소 회로 상에 존재하는 염기성 아미노산으로서, 간에 대해 독성이 강한 암모니아를 무독성의 요소로 변환, 오줌으로 배출함으로써 간을 보호하는 역할을 하는 아미노산을 의미한다. L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시킴으로써 근육합성을 증가시키고 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 작용 등의 새로운 기능이 있는 것으로 밝혀졌다. L-오르니틴은 L-오르니틴알파케토글루타릴산염(OKG: L-오르니틴과 알파케토글루타릴산이 2:1의 비율로 함유되어 있음)의 형태로 근육증강, 비만예방 및 면역증강소재로서도 폭넓게 이용되고 있다. L-오르니틴은 유럽에서는 간장장애를 개선하는 의약품으로서 이용되고 있고, 일본에서는 L-오르니틴산염의 형태로 식품소재로서 사용되고 있으며, 미국에서는 식품보조제로서 사용되고 있다.
본 발명의 용어 "L-오르니틴 생산 미생물"이란, 상기 L-오르니틴을 내재적으로 생산할 수 있는 미생물을 의미한다. 상기 L-오르니틴 생산 미생물은 특별히 제한되지 않으나, L-오르니틴을 생산하면서도 글루코스 디하이드로게나제(GDH) 경로를 포함하는 오탄당 인산화 경로에 의하여 NADPH를 생산하고 이에 의하여 L-오르니틴을 생산할 수 있는 디케야 속 미생물(Dickeya sp.), 예르시니아 속 미생물(Yersinia sp.), 시아노박테리움 속 미생물(Cyanobacterium sp.), 칼로트릭스 속 미생물(Calothrix sp.), 렙토링비야 속 미생물(Leptolyngbya sp.), 신트로포보툴루스 속 미생물(Syntrophobotulus sp.), 마이크로코커스 속 미생물(Micrococcus sp.), 브레비박테리움 속 미생물(Brevibacterium sp.), 아스로박터 속 미생물(Arthrobacter sp.), 코리네박테리움 속 미생물(Corynebacterium sp.) 등이 될 수 있고, 바람직하게는 L-오르니틴을 생산하는 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes) 등의 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 L-오르니틴을 생산할 수 있으면서도, 염색체 상에서 GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 일부가 모두 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(수탁번호 KACC91800P)이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "NCgl0462 유전자"란, "Cgl0479 유전자"라고도 하고, 액티노박테리움 속 미생물(Actinobacterium sp.), 액티노박테리다에 속 미생물(Actinobacteridae sp.), 액티노마이세탈레스 속 미생물(Actinomycetales sp.), 코리네박테리네아에 속 미생물(Corynebacterineae sp.), 코리네박테리아세아에 속 미생물(Corynebacteriaceae sp.), 코리네박테리움 속 미생물(Corynebacterium sp.) 등에 존재하는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제(4-aminobutyrate aminotransferase)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 NCgl0462 유전자는 1,344개의 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)로서, 448개의 아미노산으로 구성된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 생성할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 NCgl0462 유전자는 기질다양성을 갖는 아미노트랜스퍼라제인 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 L-오르니틴 생산 미생물에 도입하여 L-오르니틴의 생산성을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 상기 NCgl0462 유전자는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하지만, 오르니틴의 생합성 수율을 증가시키기 위한 본 발명의 목적에 부합되는 한, NCgl0462 유전자의 변이체가 될 수도 있다. 상기 NCgl0462 유전자의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 일부가 치환, 결실, 삽입 또는 부가에 의해 변이된 염기서열을 포함할 수도 있다. 상기 NCgl0462 유전자의 변이체로부터 발현된 변이된 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 역시 오르니틴의 생합성 수율을 증가시키기 위한 본 발명의 목적에 부합되는 한 모두 사용될 수 있는데, 변이되지 않은 아미노산 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 용어 "아미노트랜스퍼라제(aminotransferase, AT)"란 트랜스아미나제(transaminase)라고도 하고, 아미노기(NH2)와 키토기(=O)의 교환을 유도하여, 아미노산과 알파-키토산 사이의 반응을 촉매함으로써, 다양한 종류의 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 의미하는데, 리진, 트레오닌, 프롤린 및 히드록시프롤린을 제외한 L형 아미노산을 기질로서 사용할 수 있으며, 사용되는 기질에 따라 50여종 이상으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제로 분류된 아미노트랜스퍼라제는 L-아스파르트산과 a-케토글루타르산의 반응을 촉매하여 옥살로아세트산과 L-글루탐산을 생성하는 활성을 나타낸다. 상기 아미노트랜스퍼라제는 그의 활성을 위한 조효소로서 피리독살인산을 필요로 하는데, 상기 아미노트랜스퍼라제에 의해 수행되는 촉매반응은 가역적 반응이기 때문에, 생체내 질소대사에 있어서, 상기 아미노트랜스퍼라제는 중심적인 역할을 수행한다. 본 발명의 목적상 상기 아미노트랜스퍼라제는 기질 다양성을 갖고 L-오르니틴 생산 미생물에서 L-오르니틴의 생산성을 향상시킬 수 있는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "오르니틴 생합성"이란, 미생물에 내재적으로 존재하는 유전자 세트 또는 인위적으로 도입된 유전자 세트에서 발현되는 일련의 효소를 사용하여 글루타메이트로부터 오르니틴을 생산하는 일련의 대사과정을 의미한다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 미생물의 염색체에 존재하는 argJ, argB, argC 및 argD 유전자로부터 발현되는 각각의 효소를 사용하여 글루타메이트로부터 오르니틴을 생산할 수 있는데, 이들 생산과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: L-글루타메이트에 argJ 유전자에서 발현되는 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제(glutamate N-acetyltransferase)가 작용하여 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate)를 생성하고, 상기 N-아세틸글루타메이트에 argB 유전자에서 발현되는 N-아세틸글루타메이트 키나아제(N-acetylglutamate kinase)가 작용하여 N-아세틸글루타밀포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate)를 생성하며, 상기 N-아세틸글루타밀포스페이트에 argC 유전자에서 발현되는 아세틸글루타메이트 세미알데히드 디하이드로게나제(acetylglutamate semialdehyde dehydrogenase)가 작용하여 N-아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde)를 생성하고, 상기 N-아세틸글루타메이트 세미알데히드에 argD 유전자에서 발현되는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제(acetylornithine aminotransferase)가 작용하여 N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine)을 생성하며, 상기 N-아세틸오르니틴에 다시 argJ 유전자에서 발현되는 N-아세틸트랜스퍼라제가 작용하여 오르니틴을 생성한다.
본 발명의 용어 "내재적 활성"이란, 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 상기 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 발현시킬 수 있는 야생형 미생물에서 발현되는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성으로 해석될 수 있고, 바람직하게는 야생형 코리네박테리움 속 미생물에서 발현되는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이" 되었다는 것은, 본 발명에서 제공하는 변이된 미생물에서 발현된 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성이 상기 내재적 활성에 비하여 증가되도록, 내재적 활성을 갖는 야생형 미생물에 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성이 추가로 도입되어 변이된 상태를 의미한다. 이처럼, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성을 추가로 도입하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 1) 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 NCgl0462 유전자를 도입하여, 상기 NCgl0462 유전자의 복제수를 증가시키는 방법, 2) NCgl0462 유전자와 관련된 전사수준의 조절인자 요소(trans- 및 cis-acting)를 변화시키는 방법, 3) NCgl0462 유전자의 발현을 증대시키기 위하여 번역수준에서 발현을 강화시키는 방법, 또는 4) 이들을 조합하여 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 NCgl0462 유전자의 복제수를 증가시키기 위하여는, 상기 NCgl0462 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 미생물내에 도입하거나, 상기 NCgl0462 유전자를 미생물의 게놈 염색체에 삽입시키거나, 내재적 NCgl0462 유전자와 외인성 NCgl0462 유전자를 접합시키거나, 내재적 NCgl0462 유전자를 전위시키는 등의 방법을 사용할 수 있고; 전사수준의 조절인자 요소를 변화시키기 위하여는, 상기 NCgl0462 유전자의 발현에 관여하는 negative trans-acting factor를 불활성화하거나, positive trans-acting factor의 발현을 증대시키거나, 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 교체하는 방법을 사용할 수 있으며; 번역수준에서 강화시키기 위하여는, mRNA의 안정성을 향상시키거나, 코돈사용 최적화 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "벡터"란, 적합한 숙주 내에서 목적하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 벡터는 특별히 제한되지 않으나, NCgl0462 유전자를 L-오르니틴 생산 미생물에 도입하거나 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하기 위하여 사용되는 수단으로서 해석될 수 있고, 바람직하게는 pZ1, pEkEx1, pHS2-1, pCG4, pNG2, pEK0 등의 벡터에 NCgl0462 유전자가 도입된 벡터로 해석될 수 있으며, 보다 바람직하게는 pEK0 벡터에 NCgl0462 유전자가 도입된 벡터로 해석될 수 있고, 가장 바람직하게는 도 1에 도시된 재조합 발현 벡터 pEK-NCgl0462 또는 도 2에 도시된 유전체 재조합 벡터 pSJC1097로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물"이란, 모 균주 대비 L-오르니틴의 생산능이 증가된 미생물을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 오르니틴 생산능이 향상된 미생물은 상기 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이된 미생물이 될 수 있고, 바람직하게는 L-오르니틴 생산능을 갖고 있는 코리네박테리움 속 미생물에서 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이된 미생물이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 속 미생물에 NCgl0462 유전자가 플라스미드를 통해 도입되거나 또는 게놈 염색체에 삽입되어 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되도록 변이된 미생물이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8505 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 게놈 염색체에 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514(KACC9 1801P)이 될 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물에서 L-오르니틴의 생산성을 추가로 향상시키기 위하여, L-오르니틴의 생합성에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드를 추가로 도입하거나 또는 손상시킬 수도 있다. 예를 들어, 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 argJ 유전자를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하거나; N-아세틸글루타메이트 키나아제를 코딩하는 argB 유전자를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하거나; 아세틸글루타메이트 세미알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 argC 유전자를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하거나; 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 argD 유전자를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하거나; 당전이 효소인 레반수크라아제를 코딩하는 sacB 유전자를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하거나; 오르니틴 생합성 경로에 작용하는 효소의 에너지원으로 사용되는 NADPH의 생합성 수준을 증가시키기 위하여 글루코스 디하이드로게나제(glucose dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 게놈 염색체에서 손상시키거나; NADPH의 생합성 수준을 증가시키기 위하여 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 게놈 염색체에서 손상시키거나; 오르니틴을 시트룰린으로 전환시키는 효소활성을 나타내어, 결과적으로는 오르니틴의 생산성을 저하시키는 효과를 나타내는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransferase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 게놈 염색체에서 손상시키거나; 글루타메이트를 미생물의 외부로 방출하는 활성을 나타내는 단백질(NCgl1221)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 게놈 염색체에서 손상시킬 수 있고, 이들을 단독으로 또는 조합하여 수행함으로써, L-오르니틴의 생산성을 추가로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, Mycobacterium tuberculosis의 오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자인 Rv2321c의 아미노산 서열과 36%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 NCgl0462 유전자를 선별하고(실시예 1), gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드, NCgl0462 유전자 및 rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 pEK0 벡터에 도입하여 재조합 벡터 pEK-NCgl0462를 제작하였으며(실시예 2 및 도 1), L-오르니틴을 생산할 수 있으면서도, 염색체 상에서 GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 일부가 모두 결실된 숙주 미생물인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260를 제작하고(실시예 3-1), 상기 재조합 벡터 pEK-NCgl0462를 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 도입하여 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8505를 제작하였다(실시예 3-2).
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA에 포함된 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB에 도입하여 벡터 pSJ3515를 수득하고, 상기 벡터 pSJ3515에 gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드, 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 도입하여 유전체 재조합 벡터 pSJC1097을 제작하였으며(실시예 2 및 도 2), 이를 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 도입하고, 상동재조합에 의하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA에 포함된 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부위에 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514를 제작하였다(실시예 3-2).
이에, 본 발명자는 gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드, NCgl0462 유전자 및 rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 pEK0 벡터에 도입하여 제조된 재조합 벡터 pEK-NCgl0462를 2013년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC95126P로 기탁하고; L-오르니틴을 생산할 수 있으면서도, 염색체 상에서 GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 일부가 모두 결실된 숙주 미생물을 "코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(Corynebacterium glutamicum SJ8260)"이라 명명하고, 2013년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC91800P로 기탁하였으며; 유전체 재조합 벡터 pSJC1097을 상기 실시예 3-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 도입하여 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 염색체의 NCgl2582 유전자 부위에 NCgl0462 과발현 카셋이 삽입된 돌연변이 균주를 "코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514(Corynebacterium glutamicum SJ8514)"라 명명하고, 2013년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC91801P로 기탁하였다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 L-오르니틴 생산 미생물에 NCgl0462 유전자(서열번호 2)를 포함하는 재조합 벡터를 도입하여, 상기 미생물에 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성을 도입 또는 강화시키는 단계를 포함하는 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 L-오르니틴 생산 미생물은 특별히 제한되지 않으나, L-오르니틴을 생산하면서도 글루코스 디하이드로게나제(GDH) 경로를 포함하는 오탄당 인산화 경로에 의하여 NADPH를 생산하고 이에 의하여 L-오르니틴을 생산하는 미생물이 될 수 있는데, 바람직하게는 디케야 속 미생물(Dickeya sp.), 예르시니아 속 미생물(Yersinia sp.), 시아노박테리움 속 미생물(Cyanobacterium sp.), 칼로트릭스 속 미생물(Calothrix sp.), 렙토링비야 속 미생물(Leptolyngbya sp.), 신트로포보툴루스 속 미생물(Syntrophobotulus sp.), 마이크로코커스 속 미생물(Micrococcus sp.), 브레비박테리움 속 미생물(Brevibacterium sp.), 아스로박터 속 미생물(Arthrobacter sp.), 코리네박테리움 속 미생물(Corynebacterium sp.) 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 L-오르니틴을 생산하는 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes) 등의 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)이 될 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 L-오르니틴 생산 미생물에 도입된 후 게놈 염색체와 독립적으로 복제가능한 형태로 유지되고 발현될 수 있는 플라스미드 재조합 벡터; 또는 L-오르니틴 생산 미생물의 게놈 염색체에서 상동재조합을 유도하여 상기 NCgl0462 유전자를 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입하여 발현시킬 수 있는 유전체 재조합 벡터가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 NCgl0462 유전자(서열번호 2)를 포함하는 플라스미드 발현벡터 또는 유전체 재조합 벡터가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 NCgl0462 유전자(서열번호 2) 뿐만 아니라, 코리네박테리움의 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(gap) 유전자의 프로모터 및 rrnB 터미네이터를 포함하는 과발현 카세트를 포함하는 도 1에 도시된 재조합 발현 벡터 pEK-NCgl0462 또는 도 2에 도시된 유전체 재조합 벡터 pSJC1097가 될 수 있다.
한편, 유전체 재조합 벡터 pSJC1097를 사용하여 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 L-오르니틴 생산 미생물의 게놈 염색체에 도입할 경우, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 상기 게놈 염색체 상의 위치는 특별히 제한되지 않으나, Genbank accession number NC_003450의 개방해독틀 DNA 서열을 가지는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 NCgl2582을 사용함이 바람직하다.
아울러, 상기 재조합 벡터를 L-오르니틴 생산 미생물에 도입하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 환원제인 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하는 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법 등을 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는, L-오르니틴의 생산방법을 제공한다. 이때, 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물은 상기 정의한 바와 동일하다.
본 발명자는 NCgl0462 유전자가 L-오르니틴 생산 미생물 또는 상기 미생물의 게놈 염색체에 도입되어 제조된 형질전환체는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성이 증가하고, L-오르니틴 생산성이 증대됨을 확인하였다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 전반적인 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물로부터 L-오르니틴을 생산하기 위한 목적으로 수행되며, 이러한 배양방법은 특별히 제한되지 않고, 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물이 접종된 배지를 배치 공정, 주입 배치 공정 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에 적용하여, 회분식, 유가식 또는 연속식으로 배양하는 방법을 사용할 수 있다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으며, 약 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 오르니틴은 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
아울러, 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 L-오르니틴 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 대조군(숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260), 비교군(pEK0 벡터를 포함하는 균주, SJ8503) 및 본 발명의 형질전환체(SJ8505 및 SJ8514)를 각각 배양하고, 이로부터 발현되는 아미노트랜스퍼라제 활성을 측정 및 비교한 결과, 대조군과 비교군에서 발현된 아미노트랜스퍼라제 활성은 별다른 차이가 없었으나, 본 발명에서 제공하는 각 형질전환체의 아미노트랜스퍼라제 활성은 대조군에 비하여, SJ8514의 경우 약 83% 정도 증가하고, SJ8505의 경우 약 192% 정도 증가함을 알 수 있었다(표 2). 또한, 상기 대조군, 비교군 및 본 발명의 형질전환체의 성장률을 측정 및 비교한 결과, 성장률은 각 균체별로 별다른 차이를 나타내지 않음을 확인하였다(표 3). 한편, 상기 대조군, 비교군 및 본 발명의 형질전환체에서 생산된 L-오르니틴의 농도를 측정 및 비교한 결과, 대조군과 비교군에서 생산된 L-오르니틴의 농도는 별다른 차이가 없었으나, 본 발명에서 제공하는 각 형질전환체에서 생산된 L-오르니틴의 농도는 대조군에 비하여, SJ8514의 경우 약 43% 정도 증가하고, SJ8505의 경우 약 26% 정도 증가함을 알 수 있었다(표 4). 그러나, 아미노트랜스퍼라제 활성과 생산된 L-오르니틴의 농도가 비례하지는 않음을 알 수 있었다.
본 발명의 NCgl0462 유전자가 도입되어 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되고, L-오르니틴 생산능이 향상되도록 변이된 미생물을 이용하면, L-오르니틴 생합성 대사경로의 특이적 활성의 증대에 의하여 L-오르니틴의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-오르니틴의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 재조합 벡터 pEK-NCgl0462의 개열지도를 나타내는 개략도이다.
도 2는 유전체 재조합 벡터 pSJC1097의 개열지도를 나타내는 개략도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰의 내재적 아미노트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 선별
본 발명자는 코리네박테리움 글루타미컴의 내재적 아미노트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 유전자를 선별하기 위하여, 일반이 접근 가능한 데이터베이스인 "NCBI database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)"에서 Mycobacterium tuberculosis 유래의 오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자인 Rv2321c의 아미노산 서열을 query sequence으로 이용하여 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 검색한 결과, 36%의 상동성을 나타내는 NCgl0462 유전자의 ORF 서열(서열번호 2)을 선별하였다. 상기 선별된 NCgl0462 유전자는 기질다양성을 갖는 아미노트랜스퍼라제인 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제(서열번호 1)를 코딩하는 유전자임을 확인하였다.
실시예 2: 코리네박테리움 글루타미쿰의 내재적 아미노트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 제조
본 발명자는 코리네박테리움의 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(gap)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터를 포함하여 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 NCgl0462(서열번호 2)를 과발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조하고자 하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 PgapF-PgapR 프라이머를 이용한 PCR을 수행함으로써, gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드를 수득하고; 동일한 주형과 0462F-0462R 프라이머를 이용한 PCR을 수행함으로써, 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하였으며; pTrc99A을 주형으로 하고 TrrnBF-TrrnBR 프라이머를 이용한 PCR을 수행함으로써, rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 수득하였다. 이때, 중합효소로는 PfuUltraTM 고신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하고, PCR은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 1분을 25회 반복하여 수행하였다.
프라이머의 염기서열
서열번호 명칭 염기서열(5'-3') 제한효소
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13		 0462F
0462R
PgapF
PgapR
TrrnBF
TrrnBR
2582F1
2582R1
2582F2
2582R2		 ggaattc(catatg)GAAGATCTCTCATACCGCATCCCGC
aa(ctgcag)TTTGTTGTGTTAGCCCACCTTCTGGTGCGC
ctag(tctaga)GTCGTATTCGTCGTCTTTTGACGATGGC
ggaattc(catatg)GTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG
aa(ctgcag)GCTGTTTTGGCGGATGAGAG
ccc(aagctt)AAAAGGCCATCCGTCAGG
ccc(aagctt)CCTCCGCCCCAATTATTC
cgg(ggtacc)GGTCTCTGCAGCTTGTTC
cgg(ggtacc)GGTCTGGTTTCGTTCCTG
ccc(aagctt)CCATCCTGCACTTCTCAG		 NdeI
PstI
XbaI
NdeI
PstI
HindIII
HindIII
KpnI
KpnI
HindIII
상기 표 1에서, 괄호안의 서열은 제한효소 인식부위를 나타내고, 대문자로 표시된 서열은 세균성 유전자의 서열을 의미한다.
먼저, 상기 수득한 gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드를 제한효소 XbaI, T4 DNA polymerase 및 제한효소 NdeI으로 순차적으로 처리하였다. 다음으로, 상기 수득한 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NdeI/PstI, Klenow fragment 및 PstI으로 순차적으로 처리하였다. 끝으로, 상기 수득한 rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 제한효소 HindIII, Klenow fragment 및 PstI으로 순차적으로 처리하였다.
그런 다음, pEK0(E. coli-C. glutamicum shuttle vector, Eikmanns et al. 1991) 벡터를 제한효소 KpnI 및 T4 DNA polymerase으로 순차적으로 처리하고, 상기 처리된 gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드, 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 가하여 연결시켜서, 재조합 벡터 pEK-NCgl0462을 제작하였다(도 1). 도 1은 재조합 벡터 pEK-NCgl0462의 개열지도를 나타내는 개략도이다.
본 발명자는 상기 제작된 재조합 벡터 pEK-NCgl0462를 2013년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC95126P로 기탁하였다.
한편, NCgl0462 과발현 카셋의 부위-특이적 유전자 삽입(site specific gene integration)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 벡터인 pK18mobsacB를 이용하여 유전체 재조합 벡터 pSJ3515를 제작하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA에 포함된 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 NCgl2582를 주형으로 하고, 2582F1-2582R1 프라이머와 2582F2-2582R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 증폭산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA 2 ㎕(250 ng), 2582F1-2582R1 프라이머와 2582F2-2582R2 프라이머 각각 2 ㎕(10 pmole), taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20 ㎕(2 unit) 및 멸균 증류수 24 ㎕를 포함하고, 변성 (94℃ 1분), 어닐링 (58℃ 1분) 및 신장 (70℃ 1분)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 981 bp 및 962 bp의 DNA단편을 수득하고, 이들을 pK18mobsacB에 도입하여, HindIII 말단을 포함하는 1,943-bp짜리 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 pSJ3515를 수득하였다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 NCgl2582과 비교하여 KpnI 부위에서 내부적 유전자 소실을 포함한다는 점에서 차이가 있다.
상기 벡터 pSJ3515를 제한효소 KpnI과 T4 DNA polymerase으로 순차적으로 처리하고, 상기 처리된 gap을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 영역의 폴리뉴클레오티드, 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 rrnB 터미네이터 영역의 폴리뉴클레오티드를 가하여 연결시켜서, 유전체 재조합 벡터 pSJC1097을 제작하였다(도 2). 도 2는 유전체 재조합 벡터 pSJC1097의 개열지도를 나타내는 개략도이다.
실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰의 내재적 아미노트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 NCgl0462 의 과발현 형질전환체의 제조
실시예 3-1: 숙주의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 재조합 벡터를 도입하여 L-오르니틴을 효과적으로 생산할 수 있는 숙주를 다음과 같은 방법에 의해 제조하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)에 NCgl0281 유전자의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편이 삽입된 재조합 벡터 pSJ3517; 상기 pK18mobsacB 벡터에 NCgl2582 유전자의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편이 삽입된 재조합 벡터 pSJ3515; 및, 상기 pK18mobsacB 벡터에 NCgl2053 유전자의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편이 삽입된 재조합 벡터 pSJ3513을 각각 제작하였다.
다음으로, 상기 제작된 각 재조합 벡터 pSJ3517, pSJ3515 및 pSJ3513을 L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039에 순차적으로 전기천공법을 이용하여 도입하고, 카나마이신 내성 표현형을 나타내는 변이주를 선발하였으며, 상기 선발된 변이주 중에서 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 상기 각 재조합 벡터에 의해 상동재조합이 유발된 변이주를 선발하였다.
끝으로, 상기 선발된 변이주를 10%의 수크로오스 배지에서 배양하면서, 2차 재조합의 선발과 유전자 특이적 프라이머를 사용한 다이아그너스틱 PCR을 통해 각각의 해당 유전자의 염색체 부위로부터 플라스미드가 절제(excision)된 균주를 최종 선발하였다.
상기 최종 선발된 변이주는 L-오르니틴을 생산할 수 있으면서도, 염색체 상에서 GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 일부가 모두 결실된 균주이며, 본 발명자는 상기 최종 선발된 변이주를 "코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(Corynebacterium glutamicum SJ8260)"이라 명명하고, 2013년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC91800P로 기탁하였다.
실시예 3-2: 형질전환체의 제조
상기 실시예 2에서 제작한 재조합 벡터 pEK-NCgl0462를 상기 실시예 3-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 전기천공법으로 도입하여 형질전환시키고 카나마이신 내성 표현형을 선발하여 형질전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8505를 제조하였다.
한편, 실시예 2에서 제작한 유전체 재조합 벡터 pSJC1097을 상기 실시예 3-1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 전기천공법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 대상으로 하여 카나마이신 내성 표현형을 선발하여 유전자 특이적 프라이머를 사용한 다이아그너스틱 PCR을 통해 상기 유전체 재조합 벡터 pSJC1097이 상동재조합에 의해 NCgl2582 유전자의 염색체 부위에 도입되었음을 확인하였다. 그런 다음, 상기 형질전환체를 10%의 수크로오스 배지에서 배양하면서, 2차 재조합의 선발과 유전자 특이적 프라이머를 사용한 다이아그너스틱 PCR을 통해 해당 유전자(NCgl2582)의 염색체 부위로부터 NCgl0462 과발현 카셋을 남기고 pK18mobsacB 플라스미드 부위가 절제되었음을 확인하였다. 이에 따라, 상기 방법으로 제작되어 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 염색체의 NCgl2582 유전자 부위에 NCgl0462 과발현 카셋이 삽입된 돌연변이 균주를 "코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514(Corynebacterium glutamicum SJ8514)"라 명명하고, 2013년 3월 29일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC91801P로 기탁하였다.
실시예 4 : NCgl0462 가 과발현된 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 아미노트랜스퍼라제 활성도 비교
상기 실시예 3에서 제조한 각각의 NCgl0462의 과발현 형질전환체인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514 및 SJ8505로부터 L-오르니틴을 생산하기 위하여, 상기 각 형질전환체를 하기와 같은 방법으로 배양하였다: 종배지(80 g BHI, 20 g 클루코오스 및 60 g 소르비톨/L)가 담겨진 100 ㎖ 배플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(대조군)과 상기 제조된 형질전환체(SJ8514 또는 SJ8505)을 각각 접종하고 24시간 동안 진탕배양(200 rmp)하여 배양물을 수득하였으며, 상기 배양물로부터 균체를 수득하고, 수득한 균체를 생산배지인 MMY 배지(0.8 g KH2PO4, 10 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO47H2O, 1.2 g Na2HPO4, 2 mg MnSO4H2O, 2 mg FeSO47H2O, 1 mg ZnSO47H2O, 10 g 효모 추출액, 및 60 g 글루코스/L, pH 7.0) 10 ㎖가 담겨진 100 ㎖ 배플 플라스크에서 600 nm에서 흡광도가 0.4 ~ 0.5 정도를 나타내도록 재현탁 하고, 배지 10 ㎖당 0.2 g의 멸균된 CaCO3를 첨가하였으며, 30℃의 200rpm 회전식 교반기에서 배양하였다. 이때, 비교군으로 사용된 pEK0 벡터를 포함하는 균주(SJ8503) 또는 pEK-NCgl0462 벡터를 포함하는 균주(SJ8505)를 배양할 경우에는 카나마이신 25 mg/L를 포함하는 배지를 사용하였다.
배양이 종료된 후, 배양물을 원심분리하여 균체를 수득하고, 수득한 균체를 00 mM Tris/HCl 완충액 (pH 7.5)에 재현탁시킨 다음, 4℃에서 유리알 (glass bead)를 사용하여 균체를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 균체를 4℃에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다.
상기 수득한 상층액에 포함된 단백질을 브래드포드법(Bradford 1976)으로 정량하고, 상기 상층액에 포함된 아미노트랜스퍼라제 활성은 Albrecht and Vogel (1964)의 방법에 따라 AT 효소반응의 결과물인 N-acetylglutamate semialdehyde의 가수분해 결과물 glutamate semialdehyde가 pyrroline carboxylate으로 자연반응에 의해 전환된 후 aminobenzaldehyde와의 반응물을 분광흡광기를 이용하여 440 nm에서 얻어진 값으로부터 산출하여 측정하였다. 이때, 상기 값은 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10 % 이하였다.
아미노트랜스퍼라제 활성
균주 벡터 활성도(U/mg protein)
SJ8260
SJ8503
SJ8505
SJ8514		 none
pEK0
pEK-NCgl0462
none		 0.58
0.49
1.43
1.06
상기 표 2에서 보듯이, 대조군(SJ8260)과 비교군(SJ8503)의 아미노트랜스퍼라제 활성은 별다른 차이가 없었으나, 본 발명에서 제공하는 각 형질전환체의 아미노트랜스퍼라제 활성은 대조군(SJ8260)에 비하여, SJ8514의 경우 약 83% 정도 증가하고, SJ8505의 경우 약 192% 정도 증가함을 확인하였다.
NCgl0462 유전자의 발현을 증대시킬 경우, 아미노트랜스퍼라제 활성이 증가하고, 이러한 아미노트랜스퍼라제 활성증가는 L-오르니틴의 생산량 증가를 유도할 것으로 예상되므로, 대조군에 비하여 증가된 아미노트랜스퍼라제 활성을 나타내는 본 발명의 각 형질전환체는 증가된 L-오르니틴의 생산량을 나타낼 것으로 분석되었다.
실시예 5 : NCgl0462 유전자가 과발현된 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 L-오르니틴 생산
상기 실시예 4에서 분석된 바와 같이, 본 발명의 각 형질전환체가 실제로 증가된 L-오르니틴의 생산량을 나타내는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 대조군(SJ8260), 비교군(SJ8503) 및 형질전환체(SJ8505 및 SJ8514)를 각각 실시예 4의 방법으로 배양하고, 배양이 종료된 후, 각 균주의 성장률 및 L-오르니틴의 농도를 측정하고 비교하였다(표 3 및 표 4). 이때, 균주의 성장률은 600 nm에서 분광법으로 측정하고, L-오르니틴의 농도는 Agilent 1100 series HPLC 및 Zorbax Eclipse C18 column을 사용하여 측정하였다.
균주의 성장률
균주 성장률(μmax)
SJ8260
SJ8503
SJ8505
SJ8514		 0.27
0.26
0.28
0.28
상기 표 3에서 보듯이, 대조군(SJ8260), 비교군(SJ8503) 및 형질전환체(SJ8505 및 SJ8514)의 성장률은 별다른 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다.
L-오르니틴의 농도
균주 L-오르니틴 농도(g/l)
SJ8260
SJ8503
SJ8505
SJ8514		 7.9
8.1
10.2
11.3
상기 표 4에서 보듯이, 대조군(SJ8260)과 비교군(SJ8503)에서 생산된 L-오르니틴의 농도는 별다른 차이가 없었으나, 본 발명에서 제공하는 각 형질전환체에서 생산된 L-오르니틴의 농도는 대조군(SJ8260)에 비하여, SJ8514의 경우 약 43% 정도 증가하고, SJ8505의 경우 약 26% 정도 증가함을 확인하였다.
특히, SJ8505의 경우 아미노트랜스퍼라제 활성은 SJ8514의 것 보다도 높은 수준을 나타낸 반면, 생산된 L-오르니틴의 농도는 SJ8514의 것 보다도 낮은 수준을 나타내었으므로, 단순히 아미노트랜스퍼라제 활성과 생산된 L-오르니틴의 농도가 비례하지는 않음을 알 수 있었다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC95126P 20130329 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91800P 20130329 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91801P 20130329
<110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Microorganism having improved L-ornithin production by increasing the aminotransferase activity and process for preparing the L-ornithin employing the same <130> PA130323/KR <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> NCgl0462 <400> 1 Met Glu Asp Leu Ser Tyr Arg Ile Pro Gln Ser Arg Thr Val Ala Glu 1 5 10 15 Gln Val Pro Gly Pro Lys Ser Lys Ala Leu Asp Glu Arg Arg Gln Ala 20 25 30 Ala Val Ala Arg Ala Leu Ala Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Val Val Asp 35 40 45 Ala Asp Gly Gly Ile Leu Ala Asp Ala Asp Gly Asn Arg Phe Ile Asp 50 55 60 Leu Ala Ser Gly Ile Ala Val Thr Thr Val Gly Gly Ser Asn Ala Ala 65 70 75 80 Val Ala Lys Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Arg Phe Thr His Thr Cys 85 90 95 Phe Met Val Ser Pro Tyr Glu Thr Tyr Val Ala Met Ala Glu Arg Leu 100 105 110 Asn Ala Leu Thr Pro Gly Asp His Asp Lys Lys Ser Ala Leu Phe Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Val Ala Arg Ala Tyr 130 135 140 Thr Gly Lys Gly Ala Val Val Val Phe Asp Asn Ala Tyr His Gly Arg 145 150 155 160 Thr Asn Leu Thr Met Ala Met Thr Ala Lys Asn Arg Pro Tyr Lys Ser 165 170 175 Gly Phe Gly Pro Leu Ala Ala Asp Val Tyr Arg Ala Pro Met Ser Tyr 180 185 190 Pro Leu Arg Asp Gly Leu Ser Gly Pro Glu Ala Ala Glu Arg Ala Ile 195 200 205 Ser Val Ile Glu Ser Gln Val Gly Ala Glu Asn Leu Ala Cys Val Val 210 215 220 Ile Glu Pro Ile Gln Gly Glu Gly Gly Phe Ile Val Pro Ala Pro Gly 225 230 235 240 Phe Leu Ala Ala Ile Ser Thr Trp Cys Arg Glu Asn Asp Val Val Phe 245 250 255 Ile Ala Asp Glu Ile Gln Ser Gly Phe Leu Arg Thr Gly Asp Trp Phe 260 265 270 Ala Ser Asp Ala Glu Gly Val Ile Pro Asp Val Ile Thr Thr Ala Lys 275 280 285 Gly Ile Ala Gly Gly Met Pro Leu Ser Ala Val Thr Gly Arg Ala Glu 290 295 300 Ile Met Asp Ala Pro Gly Pro Gly Ala Leu Gly Gly Thr Tyr Gly Gly 305 310 315 320 Asn Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ile Glu Val Met Glu 325 330 335 Gln Ala Asp Leu Lys Thr Arg Ala Gln Glu Ile Glu Thr Ile Ile Arg 340 345 350 Asp Glu Phe Ala Gln Leu Ser Ala Phe Pro Glu Val Ala Glu Ile Arg 355 360 365 Gly Arg Gly Ala Met Met Ala Ile Glu Leu Ile Asp Ala Thr Gly Arg 370 375 380 Pro Asn Ala Ala Leu Thr Ala Ala Val Ala Ala Arg Ala Lys Ala Glu 385 390 395 400 Gly Val Leu Leu Leu Thr Cys Gly Thr Asp Gly Asn Val Ile Arg Leu 405 410 415 Leu Pro Pro Leu Val Ile Ala Glu Asp Thr Leu Arg Asp Gly Leu Gln 420 425 430 Val Leu Val Ala Ala Leu Glu Arg Glu Thr Ala His Gln Lys Val Gly 435 440 445 <210> 2 <211> 1347 <212> DNA <213> NCgl0462 ORF <400> 2 gtggaagatc tctcataccg catcccgcag tcgcgcaccg tggccgagca ggtgccaggg 60 ccgaagtcga aagcgctgga tgagcgtcga caagcagcag tagcacgagc acttgcaccg 120 ggtctgcctg gatacgtggt ggacgcagac ggtggcatct tggctgacgc ggacggcaac 180 cgtttcatcg acctggcctc cggcatcgcc gtgaccacgg tcggcggatc caacgcggcc 240 gtcgcgaaag ccgtcggcgc cgcagctgcc cgcttcaccc acacctgctt catggtctca 300 ccttatgaaa cttacgtggc catggcggag agactcaacg ccttgactcc aggcgatcac 360 gacaagaaga gcgcgctgtt taactctggc gccgaagccg tggaaaacgc cgtcaaggtg 420 gcacgcgcct acaccggcaa gggcgcggtc gtggtgttcg acaacgcgta ccacggacgg 480 accaacctca ccatggcgat gaccgcgaag aaccgcccat acaagtccgg attcggacca 540 ctagccgcag acgtctaccg tgcaccaatg tcttacccac tgcgcgacgg actgtccggc 600 ccggaagccg cagagcgcgc gatctccgtg atcgaatccc aggtcggagc cgaaaacctc 660 gcctgcgtgg tcattgaacc gatccagggc gaaggcggat tcatcgtccc cgcaccagga 720 ttcctcgcag ccatttccac ctggtgccgc gagaacgacg tggtgttcat cgccgatgaa 780 atccaatctg gcttcctgcg caccggcgac tggttcgcca gcgacgcaga aggtgtgatc 840 cccgacgtca tcaccaccgc aaaaggcatc gccggcggca tgccactatc cgcagtgacc 900 ggccgcgcag aaatcatgga cgcacccggc cccggcgcgc tcggcggaac ctacggcgga 960 aaccccgttg cttgcgccgc ggcacttgca gccattgaag tgatggaaca agccgacctt 1020 aagacccgcg cgcaagaaat cgagaccatc atccgcgatg aattcgcgca gctgagtgcc 1080 ttcccggagg tcgccgaaat ccgcggccgc ggagcaatga tggccattga gcttatcgac 1140 gctaccggcc gcccgaacgc agctttaacc gccgcagtgg ctgcgcgcgc aaaagctgaa 1200 ggtgtgctgc tgctgacttg cggcaccgat ggcaacgtca tccgcctgct gccaccactg 1260 gtcattgcag aggacactct ccgtgatggt cttcaggtgt tagtcgcagc cctagagcgc 1320 gaaaccgcgc accagaaggt gggctaa 1347 <210> 3 <211> 777 <212> DNA <213> NCgl2582 ORF <400> 3 atgagcaaag ttgcaatggt taccggtggt gcacaaggca tcggtcgtgg aatttcagag 60 aagctggcag cagatggttt cgatattgcc gtagccgacc tgccacaaca ggaagaacaa 120 gctgcagaga ccatcaagtt gattgaagct gcaggtcaaa aggctgtatt cgttggatta 180 gatgtcaccg ataaggctaa tttcgacagt gcaattgatg aggcagcaga gaaacttggc 240 ggcttcgatg tgctagtaaa caacgccggc atcgcacaaa ttaagccact tctggaagtc 300 accgaagaag acctaaagca gatctactcc gtgaacgttt ttagcgtatt ttttggtatt 360 caagcagcat cccgaaagtt cgatgagctt ggcgtaaaag gcaagatcat caacgctgca 420 tcaatcgctg ctatccaagg tttcccaatc ttgagcgcct actccaccac caaattcgcg 480 gttcgtggcc tcacccaggc tgctgcgcaa gaactcgcac ccaagggtca caccgtgaat 540 gcctacgcac ctggcatcgt gggcaccgga atgtgggagc aaatcgatgc cgagctttcc 600 aagatcaacg gcaagccaat cggtgagaac ttcaaggagt actcctcctc aatcgcattg 660 ggccgaccat cagtacctga ggatgtagcc ggtctggttt cgttcctggc ttctgaaaac 720 tccaactaca tcaccggaca ggtcatgctt gtcgacggcg gcatgctcta caactag 777 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0462F <400> 4 ggaattccat atggaagatc tctcataccg catcccgc 38 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0462R <400> 5 aactgcagtt tgttgtgtta gcccaccttc tggtgcgc 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PgapF <400> 6 ctagtctaga gtcgtattcg tcgtcttttg acgatggc 38 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PgapR <400> 7 ggaattccat atggttgtgt ctcctctaaa gattgtagg 39 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TrrnBF <400> 8 aactgcaggc tgttttggcg gatgagag 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TrrnBR <400> 9 cccaagctta aaaggccatc cgtcagg 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2582F1 <400> 10 cccaagcttc ctccgcccca attattc 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2582R1 <400> 11 cggggtaccg gtctctgcag cttgttc 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2582F2 <400> 12 cggggtaccg gtctggtttc gttcctg 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2582R2 <400> 13 cccaagcttc catcctgcac ttctcag 27

Claims (19)

  1. L-오르니틴 생산 코리네박테리움 글루타미쿰에 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl0462 유전자가 도입되어 아미노트랜스퍼라제의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되고, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아미노트랜스퍼라제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제인 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  4. 제1항에 있어서,
    도 1의 개열지도로 표시되는 재조합 발현 벡터 pEK-NCgl0462(KACC95126P)에 의해 NCgl0462 유전자가 도입된 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  5. 제1항에 있어서,
    도 2의 개열지도로 표시되는 유전체 재조합 벡터 pSJC1097에 의해 NCgl0462 유전자가 게놈 염색체에 도입된 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  6. 제1항에 있어서,
    도 1의 개열지도로 표시되는 재조합 발현 벡터 pEK-NCgl0462(KACC95126P)가 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(KACC91800P)에 도입되어 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8505인 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  7. 제1항에 있어서,
    도 2의 개열지도로 표시되는 유전체 재조합 벡터 pSJC1097가 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(KACC91800P)에 도입되어 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514(KACC91801P)인 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  8. 제1항에 있어서,
    글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 argJ 유전자, N-아세틸글루타메이트 키나아제를 코딩하는 argB 유전자, 아세틸글루타메이트 세미알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 argC 유전자, 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 argD 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자를 추가로 포함하여 발현시키는 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  9. 제1항에 있어서,
    글루코스 디하이드로게나제(glucose dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransferase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, NCgl1221을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드가 L-오르니틴 생산능이 향상된 미생물의 게놈 염색체에서 추가로 손상되어 발현이 억제되거나 발현수준이 저하된 것인 코리네박테리움 글루타미쿰.
  10. L-오르니틴 생산 코리네박테리움 글루타미쿰에 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl0462 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하여, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰에 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성을 도입 또는 강화시키는 단계를 포함하는 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도로 표시되는 재조합 발현 벡터 pEK-NCgl0462(KACC95126P)인 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 도 2의 개열지도로 표시되는 유전체 재조합 벡터 pSJC1097인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 유전체 재조합 벡터 pSJC1097은 L-오르니틴 생산 미생물의 게놈 염색체상의 글루코스 디하이드로게나제(glucose dehydrogenase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역에서 NCgl0462 유전자를 도입하는데 사용되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 글루코스 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것인 방법.
  16. (a) 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는, L-오르니틴의 생산방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8514(KACC9 1801P)인 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8505인 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 L-오르니틴의 회수는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
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