KR102277407B1 - 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 상기 균주를 이용한 L-글루탐산 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 L-글루탐산 생산 방법{Novel glutamate synthase subunit alpha variant and a method for producing L-glutamic acid using the same}

본 출원은 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 상기 균주를 이용한 L-글루탐산 생산 방법에 관한 것이다.

L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(US 8206954 B2, KR101481782B1).

다만, L-글루탐산의 수요 증가에 따라 효과적인 L-글루탐산의 생산능 증가를 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열의 1192번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린(Serine)이 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진, 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, L-글루탐산 생산능을 가진, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 하나의 목적은 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, L-글루탐산 생산능을 가진, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-글루탐산 생산 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 출원의 하나의 양태는 서열번호 3의 아미노산 서열의 1192번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린(Serine)이 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진, 변이체를 제공한다.

본 출원의 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.

또한, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 기준으로 1192번 위치에 상응하는 아미노산은 페닐알라닌이고, 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열의 1192번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린(Serine)이 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.

본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 활성을 갖는 야생형 폴리펩티드에 비해 L-글루탐산 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.

본 출원에서 용어, "글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파(glutamate synthase subunit alpha)"는 L-글루타민과 2-옥소글루타레이트로부터 글루탐산염의 합성을 촉매한다. 구체적으로, 본 출원의 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 는 GltB와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 gltB 에 의해 코딩되는 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.

예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 3과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.

이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.

본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1의 1192번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 페닐알라닌을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.

또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공하는 것이다.

본 출원의 균주는 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.

본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주(예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주(예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 균주는 L-글루탐산 생산능을 가진 균주일 수 있다.

본 출원의 균주는 자연적으로 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 또는 L-글루탐산 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 또는 L-글루탐산 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 L-글루탐산 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 L-글루탐산을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 L-글루탐산을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체가 발현되어, L-글루탐산 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-글루탐산 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 비변형 미생물(즉, 야생형 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파(서열번호 3)를 발현하는 미생물 또는 변이형(서열번호 1) 단백질을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-글루탐산 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 L-글루탐산 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 비변형 미생물은 ATCC13869 균주 또는 ATCC13869 △odhA 균주(Appl Environ Microbiol. 2007 Feb;73(4):1308-19. Epub 2006 Dec 8.)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-글루탐산 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상, 약 18.5% 이상, 약 19% 이상, 약 19.5% 이상, 약 20% 이상, 약 20.5% 이상, 약 21% 이상, 약 21.5% 이상, 약 22% 이상, 약 22.5% 이상, 약 23% 이상, 약 23.5% 이상, 약 24% 이상, 약 24.5% 이상, 약 25% 이상, 약 25.5% 이상, 약 26% 이상, 약 26.5% 이상, 약 27% 이상, 약 27.5% 이상, 약 28% 이상, 약 28.5% 이상, 약 29% 이상, 약 29.5% 이상, 약 30% 이상, 약 30.5% 이상, 약 31% 이상, 약 31.5% 이상, 약 32% 이상, 약 32.1% 이상, 약 32.2% 이상, 약 32.3% 이상 또는 약 32.4% 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하 또는 약 33% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-글루탐산 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 1.14배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상, 약 1.18배 이상, 약 1.19배 이상, 약 1.2 배 이상, 약 1.25배 이상, 약 1.26배 이상, 약 1.27배 이상, 약 1.28배 이상, 약 1.29배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.31배 이상, 약 1.32배 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.4배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.

본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.

본 출원의 미생물은 OdhA 단백질의 활성이 추가적으로 약화 또는 불활성화된 미생물일 수 있다.

본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.

상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.

이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).

구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는

1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;

2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;

3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);

4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);

5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;

6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;

7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;

8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는

9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

예컨대,

상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.

또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.

상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.

상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.

상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.

상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).

구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 강화는

1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;

2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;

3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;

4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;

5) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);

6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;

7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;

8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는

9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로,

상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.

상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.

상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.

상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.

이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 서열번호 17을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 17을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 서열번호 18을 포함하는 뉴클레오티드가 추가로 결실된 미생물일 수 있다.

본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 미생물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 L-글루탐산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-글루탐산 생산방법을 제공한다.

본 출원의 L-글루탐산 생산방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.

본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-글루탐산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

본 출원의 L-글루탐산 생산방법은, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 L-글루탐산 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 L-글루탐산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.

상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-글루탐산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-글루탐산을 회수할 수 있다.

또한, 본 출원의 L-글루탐산 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-글루탐산 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 균주 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-글루탐산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 L-글루탐산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.

본 출원의 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파의 변이체를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하는 경우, 기존 비변형 폴리펩티드를 갖는 미생물에 비해 고수율의 L-글루탐산 생산이 가능하다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.

실시예 1: 미생물내 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 발현을 위한 벡터 제작

글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)의 1192번째 위치 세린이 페닐알라닌으로 치환된 변이체(S1192F; 서열번호 1)가 L-글루탐산 생산에 미치는 영향을 확인하고자 이의 발현 균주 제작을 위한 벡터를 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 하기와 같이 제작하였다.

야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 5 및 6의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 7 및 8의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 상기에서 얻어진 두 단편의 혼합물을 주형으로 서열번호 5 및 서열번호 8의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 다시 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃ 에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 벡터는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-gltB(S1192F)라 명명하였다.

실시예 2: 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 L-글루탐산 생산주 제작 및 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 도입 균주 제작

실시예 2-1: 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 L-글루탐산 생산능을 갖는 균주를 제작하기 위해 선행문헌(Appl Environ Microbiol. 2007 Feb;73(4):1308-19. Epub 2006 Dec 8.)을 바탕으로 odhA 유전자를 결손한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869△odhA 균주를 제작하였다.

구체적으로 odhA 결손을 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11과 서열번호 12, 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머 세트를 이용하여 odhA 유전자의 업스트림 지역과 다운스트림 지역을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 58℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

증폭된 odhA 업스트림과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDCM2를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDCM2-△odhA로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.

제작된 pDCM2-△odhA 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 odhA 유전자가 결손된 균주를 수득하였다. 유전자 결손 여부는 서열번호 15와 서열번호 16을 이용한 PCR 과 게놈 시퀀싱을 통해 확인하였으며, 제작된 균주를 ATCC13869△odhA 로 명명하였다.

여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열
11	odhA_up_F	TGAATTCGAGCTCGGTACCCTTGAACGGAATTGGGTGG
12	odhA_up_R	CCCAGGTGGCATCGGTACCTTCACCCAGCGCCACGCAG
13	odhA_down_F	CGCTGGGTGAAGGTACCGATGCCACCTGGGTTGGTCAAG
14	odhA_down_R	GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGACAAGGAATGGAGAGA
15	odhA_del_F	CTTACCGTTGTTGCCCTT
16	odhA_del_R	CTCCTTCACCCACATCATT

실시예 2-2: 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 발현 균주 제작

상기 실시예1에서 제작한 벡터를 상기 실시예 2-1에서 제작한 ATCC13869△odhA 에 형질전환 하였다.

상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 9와 10을 이용하여 변이체가 도입된 균주를 선별하였다. 각 선별된 균주를 ATCC13869 △odhA_gltB_S1192F로 명명하였다.

실시예 2-3: 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 발현 균주의 L-글루탐산 생산능 비교

상기 실시예 2-1에서 제작된 균주를 L-글루탐산 생산능을 확인하고자 ATCC13869△odhA 균주를 대조군으로 하여 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 40시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-글루탐산 생산능을 측정하였으며, 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 MSG 농도 및 농도 증가율은 하기 표 2와 같다.

<종배지>

포도당 1%, 육즙 0.5%, 폴리펩톤 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 0.5%, 한천 2%, 유레아 0.2%, pH 7.2

<생산배지>

원당 6%, 탄산칼슘 5%, 황산암모늄 2.25%, 일인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.04%, 황산철 10 mg/L, 티아민 염산염 0.2 mg/L, 비오틴 50㎍/L

균주명	L-글루탐산 농도(g/L)	L-글루탐산 농도 증가율(%)
ATCC13869 △odhA	2.10	-
ATCC13869 △odhA_gltB_S1192F	2.78	32.4

상기 표 2에서 나타난 바와 같이 ATCC13869△odhA 균주에 비하여 gltB(S1192F) 유전자가 도입된 ATCC13869△odhA_gltB_S1192F에서 L-글루탐산의 농도가 32.4% 증가함을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel glutamate synthase subunit alpha variant and a method for producing L-glutamic acid using the same <130> KPA210515-KR <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1510 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> glutamate synthase subunit alpha variant <400> 1 Met Lys Pro Gln Gly Leu Tyr Asn Pro Ala His Glu His Asp Ala Cys 1 5 10 15 Gly Val Ala Phe Ile Ala Asp Ile His Gly Arg Pro Ser Arg Ser Ile 20 25 30 Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ile Asp His Arg Gly Ala 35 40 45 Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp Gly Ala Gly Ile Leu Met Gln 50 55 60 Ile Pro Asp Gly Phe Tyr Arg Glu Val Ser Gly Ile Glu Leu Pro Glu 65 70 75 80 Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Gly Ile Ala Phe Leu Pro Arg Gly Arg Met 85 90 95 Ala Met Met Asp Ala Gln Lys Glu Ile Glu Arg Ile Ala Lys Gln Glu 100 105 110 Gly Ala Asp Val Leu Gly Trp Arg Met Val Pro Phe Asp Ser Arg Glu 115 120 125 Leu Gly Ser Met Ala Glu Glu Ala Met Pro Ser Phe Ala Gln Ile Phe 130 135 140 Leu Thr Val Pro Gly Lys Ser Gly Glu Asp Leu Asp Arg Val Met Phe 145 150 155 160 Phe Ile Arg Lys Arg Cys Glu Arg Glu Leu Gly Thr Thr Asn Gly Arg 165 170 175 Asp Thr Val Tyr Phe Pro Ser Leu Ser Ser Arg Thr Ile Ile Tyr Lys 180 185 190 Gly Met Leu Thr Thr Leu Gln Leu Glu Gly Phe Phe Glu Asp Leu Gly 195 200 205 Asp Ala Arg Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ile Val His Ser Arg Phe Ser 210 215 220 Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu Ala His Pro Tyr Arg Phe Val 225 230 235 240 Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Val Arg Gly Asn Glu Asn Trp Met 245 250 255 Arg Ala Arg Glu Ala Leu Ile Lys Asn Asp Lys Leu Gly Asn Leu Ser 260 265 270 Ser Val Leu Pro Ile Cys Thr Pro Glu Gly Ser Asp Thr Ala Arg Phe 275 280 285 Asp Glu Ala Leu Glu Leu Leu His Leu Gly Gly Tyr Ser Leu Pro His 290 295 300 Ala Val Ala Met Met Ile Pro Gln Ala Trp Glu His Asn Lys Thr Leu 305 310 315 320 Ser Pro Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Glu Tyr His Ser Cys Leu Met Glu 325 330 335 Pro Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Ala Phe Thr Asp Gly Arg Phe Val 340 345 350 Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu Arg Pro Gly Arg Ile Thr Ile 355 360 365 Thr Asp Ser Gly Leu Val Val Met Ala Ser Glu Ser Gly Val Leu Asp 370 375 380 Leu Arg Glu Glu Ser Val Val Lys Arg Thr Arg Val Gln Pro Gly Arg 385 390 395 400 Met Phe Leu Val Asp Thr Ala Glu Gly Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu 405 410 415 Ile Lys Gln Lys Leu Ser Glu Ala Gln Pro Tyr Gly Glu Trp Ile Arg 420 425 430 Asp Asn Phe Val His Leu Asp Arg Leu Pro Gln Thr Arg Tyr Asn Tyr 435 440 445 Met Ala His Ser Arg Ala Val Leu Arg Gln Arg Val Phe Gly Ile Thr 450 455 460 Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Leu Leu Pro Met Ala Arg Gln Gly Ala 465 470 475 480 Glu Ala Ile Gly Ser Met Gly Ser Asp Thr Pro Ile Ala Ala Leu Ser 485 490 495 Gln Arg Pro Arg Met Leu Tyr Asp Phe Phe Ala Gln Arg Phe Ala Gln 500 505 510 Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ser Ile Arg Glu Lys Pro Val Thr Ser 515 520 525 Met Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gln Ser Asp Val Leu Asn Pro Gly Pro 530 535 540 Asp Ala Ala Arg Arg Ile Arg Leu Glu Ser Pro Ile Ile Asp Asn His 545 550 555 560 Glu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Ala Asn Ala His Gly Glu Trp Asp Ser 565 570 575 Phe Gly Ala Ala Val Ile Ser Gly Leu Tyr Pro Val Ala His His Gly 580 585 590 Ala Gly Met Lys Ala Ala Ile Ala Arg Val Arg Arg Glu Val Ser Glu 595 600 605 Ala Ile Arg Asn Gly Lys Thr Leu Ile Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser 610 615 620 Asp Glu Arg Met Ala Pro Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ser Ala Val 625 630 635 640 His Gln Tyr Leu Val Gln Gln Arg Thr Arg Thr Gln Cys Ser Leu Val 645 650 655 Val Glu Ser Gly Asp Ala Arg Glu Val His His Leu Ala Met Leu Ile 660 665 670 Gly Phe Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro Tyr Met Ala Phe Glu Thr Ile 675 680 685 Asp Glu Leu Arg Met Lys Gly Gln Leu Gly Asp Leu Ser Leu Asp Glu 690 695 700 Ala Ser Arg Asn Tyr Ile Lys Ala Ala Thr Thr Gly Val Leu Lys Val 705 710 715 720 Met Ser Lys Met Gly Ile Ala Thr Val Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Gln 725 730 735 Leu Ala Asp Val Thr Gly Leu His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Phe 740 745 750 Gly Gly Ile Ala Ser Pro Ile Ser Gly Ile Gly Leu Asp Glu Val Ala 755 760 765 Ala Asp Val Glu Ala Arg His Arg Ser Ala Phe Leu Pro Arg Pro Glu 770 775 780 Glu His Ala His Arg Glu Leu Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Lys Trp Arg 785 790 795 800 Arg Glu Gly Glu Tyr His Leu Phe Asn Pro Glu Thr Ile Phe Lys Leu 805 810 815 Gln His Ala Thr Arg Ser Gly Ser Tyr Glu Ile Phe Lys Asp Tyr Thr 820 825 830 Arg Lys Val Asp Asp Gln Ser Thr Arg Leu Gly Thr Ile Arg Gly Leu 835 840 845 Phe Glu Phe Ser Thr Asp Arg Lys Pro Ile Ser Val Ser Glu Val Glu 850 855 860 Pro Val Ser Glu Ile Val Lys Arg Phe Ser Thr Gly Ala Met Ser Tyr 865 870 875 880 Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Glu Val Leu Ala Ile Ala Met Asn 885 890 895 Arg Leu Gly Gly Met Ser Asn Ser Gly Glu Gly Gly Glu Asp Ala Arg 900 905 910 Arg Phe Asp Val Glu Pro Asn Gly Asp Trp Lys Arg Ser Ala Ile Lys 915 920 925 Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val Thr Ser His Tyr Leu Asn Asn 930 935 940 Cys Thr Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu 945 950 955 960 Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val Tyr Pro Trp Val Ala Glu Val 965 970 975 Arg Ile Thr Thr Pro Gly Val Gly Leu 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Gln Val Leu Arg Lys Arg Phe Gly Ile Pro Ala Asp Ser Arg Ala 1185 1190 1195 1200 Ala His Leu Asp Leu Ser Pro Ile Phe His Arg Pro Glu Thr Pro His 1205 1210 1215 Phe Pro Thr Gln Asp Val Arg Cys Thr Lys Thr Gln Glu His Ser Leu 1220 1225 1230 Glu Lys Ala Leu Asp Asn Ala Phe Ile Asp Lys Ala Ser Asp Thr Ile 1235 1240 1245 Thr Arg Ala Ala Ala Gly Val Glu Thr Ser Ile Val Ile Asp Ser Ser 1250 1255 1260 Ile Ser Asn Val Asn Arg Ser Val Gly Thr Met Leu Gly Ser Ala Val 1265 1270 1275 1280 Ser Arg Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu Pro Asp Gly Thr Ile Thr Leu 1285 1290 1295 Asn Leu Gln Gly Cys Ala Gly Asn Ser Phe Gly Ala Phe Ile Pro Arg 1300 1305 1310 Gly Ile Thr Ile Asn Leu Thr Gly Asp Ala Asn Asp Phe Val Gly Lys 1315 1320 1325 Gly Leu Ser Gly Gly Lys Ile Val Ile Lys Pro Ser Ala Gln Ala Pro 1330 1335 1340 Lys Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Leu Gly 1345 1350 1355 1360 Tyr Gly Ala Thr Ser Gly Glu Leu Phe Ile Arg Gly Gln Val Gly Glu 1365 1370 1375 Arg Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala Thr 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ggagagcgtc gtaaagcgta ctcgcgtaca gcctggacgc 1200 atgttccttg ttgacacggc cgagggtcgc atcgttgaag acgaggaaat caagcagaaa 1260 ttaagcgaag cgcagccata tggtgagtgg attcgcgata attttgtgca tctggatcgt 1320 ctgcctcaga cacgctacaa ctacatggcg cactctcgtg ctgtgttgcg tcagcgtgtt 1380 ttcggaatca ctgaagaaga tgtggatttg ttgctgctgc cgatggcccg ccagggtgct 1440 gaggcgattg gttccatggg ttcggatacg ccaattgcgg cgctatccca gcgaccacgc 1500 atgctttatg atttcttcgc gcagcgcttt gctcaggtga caaacccacc gttggactct 1560 atccgcgaaa agcctgtgac cagcatgttc actttgttgg gtgcgcagtc tgacgtgctc 1620 aatccgggtc ctgatgcggc gcgacgtatc cgtttggaat cgccgatcat tgataaccat 1680 gagctggcca ccttgatcaa tgccaacgcg catggtgagt gggattcctt tggtgctgct 1740 gtaatttctg gtttgtaccc agtggctcac catggtgccg gcatgaaggc tgcgattgct 1800 cgtgtgcgcc gcgaggtttc tgaagcaatc cgcaatggca agacgttgat cgtgctgtcg 1860 gatcgtgaat ctgatgagcg catggcacct atccctgcgc tgctgctgac ttccgctgtg 1920 catcagtact tggtgcagca acgtacccgt acccagtgct ccctggtggt ggaatccggc 1980 gatgcccgcg aggttcatca 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tattcagatc aagatggcac agggcgcaaa gcccggtgaa 2880 ggtggccagc tgccaccaaa caaggtgtac ccatgggttg cagaagtccg catcaccacc 2940 ccaggcgttg gtctgatttc ccctccacca caccacgata tttactccat tgaggatctg 3000 gctcagctga tccacgacct gaagaacgct aacccacgcg cacgaatcca cgtgaagcta 3060 gtggcagaac aaggcgtggg caccgttgcc gcaggtgtgt ccaaagcaca cgctgatgtg 3120 gtgcttattt ccggccacga cggcggaact ggcgcatctc ctttgacctc cctgaagcat 3180 gccggtggtc catgggagtt gggcttggct gaaacccagc aaacgttgct gctcaacggc 3240 ctgcgtgatc gtattcgcgt gcagtgcgat ggtcagctga aaactggccg agacgtagtt 3300 atcgcagctc tgctcggtgc cgaagaattc ggtttcgcca ccgcaccgct ggtggttgaa 3360 ggctgcatca tgatgcgcgt ctgccacctg gacacctgcc cggtgggtat cgctacccag 3420 aacccggatt tgcgttccaa gttcaccggc aaggctgaac acgtggtcaa cttcttcacc 3480 ttcatcgccc aggaagtccg tgagtacttg gcacagcttg gtttccgctc tattgatgaa 3540 gccgtaggac aagcccaggt gctgcgtaag cgttccggaa tcccagctga ttcccgcgca 3600 gcacacctgg atttgagccc aattttccat cgcccagaaa ctccacactt cccaactcag 3660 gatgtgcgtt gcaccaagac ccaggaacac agcctagaaa aagccctgga caacgcattt 3720 attgataagg cttcggacac aatcacccgt gccgcagcgg gtgtggaaac cagcattgtt 3780 attgatagct ccatcagcaa cgtcaaccgt tcagttggca cgatgctggg ttctgcagtc 3840 agccgcgtgg ctggtgccca aggtttgcca gacggcacca tcaccttgaa tcttcaaggc 3900 tgcgccggta actcctttgg cgcgttcatc ccacgaggca tcaccatcaa cctcaccggc 3960 gatgccaatg actttgtggg caagggatta tctggcggaa agattgtgat caagccttcc 4020 gctcaggctc cgaagcagct gaagaacaat ccaaatatca ttgccggaaa cgtgcttgga 4080 tacggcgcaa ccagtggtga attgttcatt cgtggccagg tcggcgaacg tttctgcgtc 4140 cgtaactctg gcgccaccgc agtggttgaa ggtatcggaa accacggttg tgagtacatg 4200 actggcggcc gagtcctggt tttgggcccg gttggtgaga actttggtgc cggcatgtct 4260 ggtggcattg catacctggc taattccccg gacctaaacc agaagatcaa tggcgaattg 4320 gtggatgttg ttccactgag cgctgacgat ctgacgtggg ctgatgagct cattgctcgc 4380 caccgcgaac tcaccggatc cgagaccaag ctgcgtgcac aagatttggt gaaaatcatg 4440 ccgcgcgatt tccaaaaagt actcaacatc atcgaaacgg cccacgctga gggccaagac 4500 ccagcaatca agatcatgga ggcagtgagc taa 4533 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1F <400> 5 gtgaattcga gctcggtacc ccgcatctcc tttgacctc 39 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2R <400> 6 atcagctggg attccgaaac gcttacgcag cac 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3F <400> 7 gtgctgcgta agcgtttcgg aatcccagct gat 33 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4R <400> 8 ggtcgactct agaggatccc cgtgcaggct cgcgtcg 37 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5F <400> 9 cgcaggtgtg tccaaagc 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6R <400> 10 aggagaagcg gccaggcttg 20 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer odhA_up_F <400> 11 tgaattcgag ctcggtaccc ttgaacggaa ttgggtgg 38 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer odhA_up_R <400> 12 cccaggtggc atcggtacct tcacccagcg ccacgcag 38 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer odhA_down_F <400> 13 cgctgggtga aggtaccgat gccacctggg ttggtcaag 39 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer odhA_down_R <400> 14 gtcgactcta gaggatcccc ggacaaggaa tggagaga 38 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer odhA_del_F <400> 15 cttaccgttg ttgccctt 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer odhA_del_R <400> 16 ctccttcacc cacatcatt 19 <210> 17 <211> 1221 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> OdhA amino acid sequence <400> 17 Met Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu 1 5 10 15 Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp 20 25 30 Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr 35 40 45 Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro 50 55 60 Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro 65 70 75 80 Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln 85 90 95 Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys 100 105 110 Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr 115 120 125 Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met 130 135 140 Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr 145 150 155 160 His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp 165 170 175 Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val 180 185 190 Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp 195 200 205 Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met 210 215 220 Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser 225 230 235 240 Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser 245 250 255 Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu 260 265 270 Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro 275 280 285 Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val 290 295 300 Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln 305 310 315 320 Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr 325 330 335 Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr 340 345 350 Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys 355 360 365 Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His 370 375 380 Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro 385 390 395 400 Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile 405 410 415 Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu 420 425 430 Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr 435 440 445 Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg 450 455 460 Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln 465 470 475 480 Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe 485 490 495 Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu 500 505 510 Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr 515 520 525 Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg 530 535 540 Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser 545 550 555 560 Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly 565 570 575 Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln 580 585 590 Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser 595 600 605 His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys 610 615 620 Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu 625 630 635 640 Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu 645 650 655 Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile 660 665 670 His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser 675 680 685 Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys 690 695 700 Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val 705 710 715 720 Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe 725 730 735 Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp 740 745 750 Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu 755 760 765 Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu 770 775 780 Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met 785 790 795 800 Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu 805 810 815 Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu 820 825 830 Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala 835 840 845 Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala 850 855 860 Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp 865 870 875 880 Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val 885 890 895 Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His 900 905 910 Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His 915 920 925 Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn 930 935 940 Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser 945 950 955 960 Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp 965 970 975 Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly 980 985 990 Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His 995 1000 1005 Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg 1010 1015 1020 Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser 1025 1030 1035 1040 Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp 1045 1050 1055 Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn 1060 1065 1070 Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe 1075 1080 1085 Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys 1090 1095 1100 Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg 1105 1110 1115 1120 Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met 1125 1130 1135 Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr 1140 1145 1150 Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln 1155 1160 1165 Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn 1170 1175 1180 Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala 1185 1190 1195 1200 Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp 1205 1210 1215 Glu Ala Phe Glu Ala 1220 <210> 18 <211> 3666 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> OdhA nucleotide sequence <400> 18 gtgagcagcg ctagtacttt cggccagaat gcgtggctgg tagacgagat gttccagcag 60 ttccagaagg accccaagtc cgtggacaag gaatggagag aactctttga ggcgcagggg 120 ggaccaaatg ctacccccgc tacaacagaa gcacagcctt cagcgcccaa ggagtctgcg 180 aaaccagcac caaaggctgc ccctgcagcc aaggcagcac cgcgcgtaga aaccaagccg 240 gccgccaaga ccgcccctaa ggccaaggag tcctcagtgc cacagcaacc taagcttccg 300 gagccaggac aaaccccaat caggggtatt ttcaagtcca tcgcgaagaa catggatatc 360 tccctggaaa tcccaaccgc aacctcggtt cgcgatatgc cagctcgcct catgttcgaa 420 aaccgcgcga tggtcaacga tcagctcaag cgcacccgcg gtggcaagat ctccttcacc 480 cacatcattg gctacgccat ggtgaaggca gtcatggctc acccggacat gaacaactcc 540 tacgacgtca tcgacggcaa gccaaccctg atcgtgcctg agcacatcaa cctgggcctt 600 gccatcgacc ttcctcagaa ggacggctcc cgcgcacttg tcgtagcagc catcaaggaa 660 accgagaaga tgaacttctc cgagttcctc gcagcatacg aagacatcgt gacacgctcc 720 cgcaagggca agctcaccat ggatgactac cagggcgtta ccgtttcctt gaccaaccca 780 ggtggcatcg gtacccgcca ctctgtccca cgtctgacca agggccaggg caccatcatc 840 ggtgtcggtt ccatggatta cccagcagag ttccagggcg cttccgaaga ccgccttgca 900 gagctcggcg ttggcaagct tgtcaccatc acctccacct acgatcaccg cgtgatccag 960 ggtgctgtgt ccggtgaatt cctgcgtacc atgtctcgcc tgctcaccga tgattccttc 1020 tgggatgaga tcttcgacgc aatgaacgtt ccttacaccc caatgcgttg ggcacaggac 1080 gttccaaaca ccggtgttga taagaacacc cgcgtcatgc agctcattga ggcataccgc 1140 tcccgtggac acctcatcgc tgacaccaac ccactttcat gggttcagcc tggcatgcca 1200 gttccagacc accgcgacct cgacatcgag acccacagcc tgaccatctg ggatctggac 1260 cgtaccttca gcgtcggtgg cttcggcggc aaggagacca tgaccctgcg cgaggtactg 1320 tcccgcctgc gcgctgccta caccttgaag gtcggctccg aatacaccca catcctggac 1380 cgcgacgagc gcacctggct gcaggaccgc ctcgaagccg gaatgccaaa gccaacccag 1440 gcagagcaga agtacatcct gcagaagctg aacgccgcag aggctttcga gaacttcctg 1500 cagaccaagt acgtcggcca gaagcgcttc tccctcgaag gtgcagaagc tctcatccca 1560 ctgatggact ccgccatcga caccgccgca ggccagggcc tcgacgaagt tgtcatcggt 1620 atgccacacc gtggtcgcct caacgtgctg ttcaacatcg tgggcaagcc actggcatcc 1680 atcttcaacg agtttgaagg ccaaatggag cagggccaga tcggtggctc cggtgacgtg 1740 aagtaccacc tcggttccga aggccagcac ctgcagatgt tcggcgacgg cgagatcaag 1800 gtctccctga ctgctaaccc gtcccacctg gaagctgtta acccagtgat ggaaggtatc 1860 gtccgcgcaa agcaggacta cctggacaag ggcgtagacg gcaagactgt tgtgccactg 1920 ctgctccacg gtgacgctgc attcgcaggc ctgggcatcg tgccagaaac catcaacctg 1980 gctaagctgc gtggctacga cgtcggaggc accatccaca tcgtggtgaa caaccagatc 2040 ggcttcacca ccaccccaga ctccagccgc tccatgcact acgcaaccga ctacgccaag 2100 gcattcggct gcccagtctt ccacgtcaat ggtgatgacc cagaggcagt tgtctgggtt 2160 ggccagctgg caaccgagta ccgtcgtcgc ttcggcaagg acgtcttcat cgacctcgtt 2220 tgctaccgcc tccgcggcca caacgaagct gatgatcctt ccatgaccca gccaaagatg 2280 tatgagctca tcaccggccg cgagaccgtt cgtgctcagt acaccgaaga cctgctcgga 2340 cgtggagacc tctccaacga agatgcagaa gcagtcgtcc gcgacttcca cgaccagatg 2400 gaatctgtgt tcaacgaagt caaggaaggc ggcaagaagc aggctgaggc acagaccggc 2460 atcaccggct cccagaagct tccacacggc cttgagacca acatctcccg tgaagagctc 2520 ctggaactgg gacaggcttt cgccaacacc ccagaaggct tcaactacca cccacgtgtg 2580 gctccagttg ctaagaagcg cgtctcctct gtcaccgaag gtggcatcga ctgggcatgg 2640 ggcgagctcc tcgccttcgg ttccctggct aactccggcc gcttggttcg ccttgcaggt 2700 gaagattccc gccgcggtac cttcacccag cgccacgcag ttgccatcga cccagcgacc 2760 gctgaagagt tcaacccact ccacgagctt gcacagtcca agggcaacaa cggtaagttc 2820 ctggtctaca actccgcact gaccgagtac gcaggcatgg gcttcgagta cggctactcc 2880 gtaggaaacg aagactccgt cgttgcatgg gaagcacagt tcggcgactt cgccaacggc 2940 gctcagacca tcatcgatga gtacgtctcc tcaggcgaag ctaagtgggg ccagacctcc 3000 aagctgatcc ttctgctgcc tcacggctac gaaggccagg gcccagacca ctcttccgca 3060 cgtatcgagc gcttcctgca gctgtgcgct gagggttcca tgactgttgc tcagccatcc 3120 accccagcaa accacttcca cctgctgcgt cgtcacgctc tgtccgacct gaagcgtcca 3180 ctggttatct tcaccccgaa gtccatgctg cgtaacaagg ctgctgcctc cgcaccagaa 3240 gacttcactg aggtcaccaa gttccaatcc gtgatcgacg atccaaacgt tgcagatgca 3300 gccaaggtga agaaggtcat gctggtctcc ggcaagctgt actacgaatt ggcaaagcgc 3360 aaggagaagg acggacgcga cgacatcgcg atcgttcgta tcgaaatgct ccacccaatt 3420 ccgttcaacc gcatctccga ggctcttgcc ggctacccta acgctgagga agtcctcttc 3480 gttcaggatg agccagcaaa ccagggccca tggccgttct accaggagca cctcccagag 3540 ctgatcccga acatgccaaa gatgcgccgc gtttcccgcc gcgctcagtc ctccaccgca 3600 actggtgttg ctaaggtgca ccagctggag gagaagcagc ttatcgacga ggctttcgag 3660 gcttaa 3666

Claims (5)

1. 서열번호 3의 1192번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체.
   
2. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
3. 제1항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰과 비교하여 L-글루탐산 생산능이 증가된, 균주.
   
5. 제1항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-글루탐산 생산 방법.