KR20220110413A - 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법 - Google Patents

신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 신규한 단백질 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 상기 균주를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법{Novel protein variant and a method for producing L-lysine using the same}
본 출원은 신규한 단백질 변이체, 상기 변이체를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 상기 균주를 이용한 L- 라이신 생산 방법에 관한 것이다.
L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(WO2008-082181 A1).
다만, L-라이신의 수요 증가에 따라 효과적인 L-라이신의 생산능 증가를 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 출원의 하나의 목적은 하기 (1) 내지 (13)으로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질 변이체를 제공하는 것이다:
(1) 서열번호 3의 220번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 내재성 막 수송 단백질 변이체;
(2) 서열번호 7의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체;
(3) 서열번호 11의 33번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체;
(4) 서열번호 15의 210번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 전사 안티터미네이션 단백질 변이체;
(5) 서열번호 19의 199번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 변이체;
(6) 서열번호 23의 272번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 말레이트 디하이드로게나제 변이체;
(7) 서열번호 27의 304번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 프리모솜 조립 단백질 변이체;
(8) 서열번호 31의 169번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타입 II 시트레이트 신타아제 변이체;
(9) 서열번호 35의 294번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 33로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질 변이체;
(10) 서열번호 39의 358번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 세린으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 미코티온 리덕타제 변이체;
(11) 서열번호 43의 130번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체;
(12) 서열번호 47의 382번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 시스테인으로 치환된, 서열번호 45으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DAHP 신타아제 변이체; 및
(13) 서열번호 51의 209번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 변이체.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 하기 (a) 및 (b)의 단백질 변이체 또는 상기 변이체(하기 (a) 및/또는 (b)의 단백질 변이체)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, L-라이신 생산능을 가진, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공하는 것이다:
(a) 서열번호 51의 209번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 변이체 및
(b) 하기 (1) 내지 (12)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 변이체:
(1) 서열번호 3의 220번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 내재성 막 수송 단백질 변이체;
(2) 서열번호 7의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체;
(3) 서열번호 11의 33번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체;
(4) 서열번호 15의 210번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 전사 안티터미네이션 단백질 변이체;
(5) 서열번호 19의 199번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 변이체;
(6) 서열번호 23의 272번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 말레이트 디하이드로게나제 변이체;
(7) 서열번호 27의 304번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 프리모솜 조립 단백질 변이체;
(8) 서열번호 31의 169번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타입 II 시트레이트 신타아제 변이체;
(9) 서열번호 35의 294번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 33로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질 변이체;
(10) 서열번호 39의 358번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 세린으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 미코티온 리덕타제 변이체;
(11) 서열번호 43의 130번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체; 및
(12) 서열번호 47의 382번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 시스테인으로 치환된, 서열번호 45으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DAHP 신타아제 변이체.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-라이신 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 본 출원의 하나의 목적은 하기 (1) 내지 (13)으로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질 변이체를 제공하는 것이다:
(1) 서열번호 3의 220번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 내재성 막 수송 단백질 변이체;
(2) 서열번호 7의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체;
(3) 서열번호 11의 33번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체;
(4) 서열번호 15의 210번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 전사 안티터미네이션 단백질 변이체;
(5) 서열번호 19의 199번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 변이체;
(6) 서열번호 23의 272번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 말레이트 디하이드로게나제 변이체;
(7) 서열번호 27의 304번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 프리모솜 조립 단백질 변이체;
(8) 서열번호 31의 169번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타입 II 시트레이트 신타아제 변이체;
(9) 서열번호 35의 294번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 33로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질 변이체;
(10) 서열번호 39의 358번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 세린으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 미코티온 리덕타제 변이체;
(11) 서열번호 43의 130번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체;
(12) 서열번호 47의 382번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 시스테인으로 치환된, 서열번호 45으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DAHP 신타아제 변이체; 및
(13) 서열번호 51의 209번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 변이체.
본 출원의 변이체는 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 또는 49으로 이루어지는 군에서 선택된 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 또는 48로 기재된 아미노산 서열에서 각각 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 또는 51의 아미노산 서열을 기준으로 각각 220번, 43번, 33번, 210번, 199번, 272번, 304번, 169번, 294번, 358번, 130번, 382번, 또는 209번 위치에 상응하는 아미노산은 시스테인, 류신, 세린, 아스파르트산, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 발린, 라이신, 세린, 아스파르트산, 시스테인, 또는 류신이고, 상기 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 또는 49으로 이루어지는 군에서 선택된 서열번호로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 변이체의 각 아미노산 서열, 위치, 및 위치에 상응하는 아미노산 종류에 대한 대응관계를 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
　 아미노산 서열 위치를 카운팅하기 위해 기준이 되는 아미노산 서열 위치 아미노산 종류
1 서열번호 1 서열번호 3 220 시스테인
2 서열번호 5 서열번호 7 43 류신
3 서열번호 9 서열번호 11 33 세린
4 서열번호 13 서열번호 15 210 아스파르트산
5 서열번호 17 서열번호 19 199 메티오닌
6 서열번호 21 서열번호 23 272 이소류신
7 서열번호 25 서열번호 27 304 글루타민
8 서열번호 29 서열번호 31 169 발린
9 서열번호 33 서열번호 35 294 라이신
10 서열번호 37 서열번호 39 358 세린
11 서열번호 41 서열번호 43 130 아스파르트산
12 서열번호 45 서열번호 47 382 시스테인
13 서열번호 49 서열번호 51 209 류신
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 “보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 “변이체”는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 또는 51의 아미노산 서열의 220번째, 43번째, 33번째, 210번째, 199번째, 272번째, 304번째, 169번째, 294번째, 358번째, 130번째, 382번째, 또는 209번째 위치에 각각 상응하는 아미노산인 페닐알라닌, 프롤린, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 트레오닌, 아르기닌, 알라닌, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 글리신, 또는 프롤린이 시스테인, 류신, 세린, 아스파르트산, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 발린, 라이신, 세린, 아스파르트산, 시스테인, 또는 류신으로 각각 치환된, 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 또는 49로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 본 출원의 변이체의 각 아미노산 서열, 변이 위치, 위치에 상응하는 치환 전 아미노산, 및 치환 후 아미노산 종류에 대한 대응관계를 하기 표 2에 나타내었다.
　 아미노산 서열 위치를 카운팅하기 위해 기준이 되는 아미노산 서열 변이 위치 치환 전 아미노산 종류 치환된 아미노산 종류
1 서열번호 1 서열번호 3 220 페닐알라닌 시스테인
2 서열번호 5 서열번호 7 43 프롤린 류신
3 서열번호 9 서열번호 11 33 시스테인 세린
4 서열번호 13 서열번호 15 210 아스파라긴 아스파르트산
5 서열번호 17 서열번호 19 199 발린 메티오닌
6 서열번호 21 서열번호 23 272 트레오닌 이소류신
7 서열번호 25 서열번호 27 304 아르기닌 글루타민
8 서열번호 29 서열번호 31 169 알라닌 발린
9 서열번호 33 서열번호 35 294 글루탐산 라이신
10 서열번호 37 서열번호 39 358 프롤린 세린
11 서열번호 41 서열번호 43 130 글리신 아스파르트산
12 서열번호 45 서열번호 47 382 글리신 시스테인
13 서열번호 49 서열번호 51 209 프롤린 류신
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원의 단백질의 변이체를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하는 경우, 기존 비변형 폴리펩티드를 갖는 미생물에 비해 고수율의 L-라이신 생산이 가능하다.
본 출원에서 용어, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 내재성 막 수송 단백질(integral membrane transport protein); DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛(DNA polymerase Ⅲ subunits gamma and tau); 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 NCgl3069 유전자에 의해 코딩되는 단백질; 전사 안티터미네이션 단백질 (Transcription antitermination protein); ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질(ABC transporter ATP-binding protein); 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase); 프리모솜 조립 단백질(primosome assembly protein); 타입 II 시트레이트 신타아제(type II citrate synthase); 막 단백질 (membrane protein, TerC); 미코티온 리덕타제(mycothione reductase); Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트(Co/Zn/Cd efflux system component); DAHP 신타아제(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase; DAHP synthase); 및/또는 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제(N-succinyldiaminopimelate aminotransferase)의 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "내재성 막 수송 단백질(integral membrane transport protein)”는 생물학적 막(biological membrane)을 가로지르는 다른 단백질과 같은 거대분자(macromolecules), 소분자(small molecules), 및 이온(ions)의 이동에 관여하는, 생물학적 막에 부착되는 막 단백질이다. 구체적으로, 본 출원의 내재성 막 수송 단백질은 integral membrane transport protein로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 내재성 막 수송 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_227155.1, WP_011015489.1 일 수 있다. 구체적으로 NCgl2816 유전자에 의해 코딩되는 내재성 막 수송 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛(DNA polymerase Ⅲ subunits gamma and tau)”는 DNA 복제를 담당하는 주요 효소로서, DNA 중합효소 Ⅲ 타우 (tau) 서브유닛은 코어 (알파(alpha), 엡실론(epsilon), 및 세타(theta) 사슬로 구성됨)와 결합하여 코어를 이합체화시키는 역할을 하고, DNA 중합효소 Ⅲ 감마 서브유닛은 베타 서브유닛을 지연 가닥 (lagging strand)에 얻는 클램프 로더 역할을 하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛은 DNA polymerase Ⅲ gamma and tau subunits, 또는 DNA polymerase Ⅲ subunit gamma/tau로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_224542.1, WP_011013499.1일 수 있다. 구체적으로 dnaZX 유전자 (또는 NCgl0239 유전자)에 의해 코딩되는 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "전사 안티터미네이션 단백질(transcription antitermination protein)"는 전사 복합체(transcription complex)이며, 종결 인자(termination factor) Rho 및 RNA 중합효소와 상호작용할 수 있으며, 전사 종결 및/또는 항-종결에 관여하는 전사 신장 인자(transcriptional elongation factor)인 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 전사 안티터미네이션 단백질은 transcription termination/antitermination protein, NusG 단백질, 또는 NusG 로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 전사 안티터미네이션 단백질 는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. WP_011013678.1, YP_224775.1일 수 있다. 구체적으로 nusG 유전자 (또는 NCgl0458 유전자)에 의해 코딩되는 전사 안티터미네이션 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질(ABC transporter ATP-binding protein)"는 막관통단백질로 ATP를 가수분해한 에너지를 사용하여 다양한 기질을 막을 넘기며 이동시키고/이동시키거나, 수송과 관련이 없는 DNA, RNA의 수리와 같은 생물학적인 기능을 하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질은 ABC transporter ATP-binding protein로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. WP_011013802.1, YP_224957.1일 수 있다. 구체적으로 NCgl0636 유전자에 의해 코딩되는 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, " N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제”는 L-glutamate 및 N-succinyl-2-amino-6-ketopimelate를 기질로 하여, 2-oxoglutarate 및 N-succinyl-L,L-2,6-diaminopimelate을 생산하는 라이신 생합성 경로에 관여하는 효소이다. 구체적으로, 본 출원의 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제는 N-succinyldiaminopimelate aminotransferase로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. WP_011014123.1, YP_225395.1 일 수 있다. 구체적으로 NCgl1058 유전자 (또는 dapC 유전자)에 의해 코딩되는 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "말레이트 디하이드로게나제”는 말레이트(malate, 말산)을 옥살아세트산으로 산화시키고, 이 과정에서 NAD+를 NADH로 환원시키는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다. 구체적으로, 본 출원의 말레이트 디하이드로게나제는 malate dehydrogenase, MDH, 또는 말산 탈수소효소로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 말레이트 디하이드로게나제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. WP_011015079.1, YP_226625.1 일 수 있다. 구체적으로 NCgl2297 유전자 (또는 mdh 유전자)에 의해 코딩되는 말레이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "프리모솜 조립 단백질”은 헬리카제(helicase) 활성을 가지는 단백질로 DNA replication 과정에 관여하는 단백질을 의미한다. 구체적으로, 본 출원의 프리모솜 조립 단백질은 primosome assembly protein, PriA 단백질, PriA, 또는 primosomal protein N'로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 프리모솜 조립 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. WP_011014474.1, YP_225886.1 일 수 있다. 구체적으로 NCgl1540 유전자 (또는 priA 유전자)에 의해 코딩되는 프리모솜 조립 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 타입 II 시트레이트 신타아제는 integral type II citrate synthase, 시트레이트 신타아제, 또는 citrate synthase로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 타입 II 시트레이트 신타아제는공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_225121.1, WP_011013914.1 일 수 있다. 구체적으로 gltA 유전자(또는 NCgl0795 유전자)에 의해 코딩되는 타입 II 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 막 단백질은 멤브레인 단백질, membrane protein, TerC, 또는 TerC 단백질로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 막 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_226209.1, WP_011014789.1 일 수 있다. 구체적으로 terC 유전자(또는 NCgl1892 유전자)에 의해 코딩되는 막 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미코티온 리덕타제는 미코티온 환원효소, 또는 mycothione reductase로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 미코티온 리덕타제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_226245.1, WP_011014816.1 일 수 있다. 구체적으로 mtr 유전자(또는 NCgl1928 유전자)에 의해 코딩되는 미코티온 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트는 Co/Zn/Cd efflux system component로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_226309.1, WP_011014862.1일 수 있다. 구체적으로 NCgl1992 유전자에 의해 코딩되는 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 DAHP 신타아제는 3-디옥시-D-아라비노헵툴로손산 7-인산 생성효소, 3-디옥시-D-아라비노헵툴로손산 7-인산 신타아제, 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase, 또는 DAHP synthase로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 DAHP 신타아제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 예를 들면 GenBank Accession No. YP_226420.1, WP_011014936.1 일 수 있다. 구체적으로 aroG 유전자(또는 NCgl2098 유전자)에 의해 코딩되는 DAHP 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 야생형 폴리펩티드에 비해 L-라이신 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
상기 내재성 막 수송 단백질; DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛; NCgl3069 유전자에 의해 코딩되는 단백질; 전사 안티터미네이션 단백질; ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질; 말레이트 디하이드로게나제; 프리모솜 조립 단백질; 타입 II 시트레이트 신타아제; 막 단백질; 미코티온 리덕타제; Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트; DAHP 신타아제; 및/또는 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제의 야생형 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열의 일 예를 하기 표 3에 기재하였다.
단백질 아미노산 서열 단백질을 코딩하는 핵산 서열
내재성 막 수송 단백질 서열번호 3 서열번호 4
DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 서열번호 7 서열번호 8
NCgl3069 유전자에 의해 코딩되는 단백질 서열번호 11 서열번호 12
전사 안티터미네이션 단백질 서열번호 15 서열번호 16
ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 서열번호 19 서열번호 20
말레이트 디하이드로게나제 서열번호 23 서열번호 24
프리모솜 조립 단백질 서열번호 27 서열번호 28
타입 II 시트레이트 신타아제 서열번호 31 서열번호 32
막 단백질 서열번호 35 서열번호 36
미코티온 리덕타제 서열번호 39 서열번호 40
Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 서열번호 43 서열번호 44
DAHP 신타아제 서열번호 47 서열번호 48
N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 서열번호 51 서열번호 52
본 출원에서 용어, "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 또는 51과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 또는 51의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 또는 49으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 50의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 50의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 50로 기재된 핵산 서열에서 각각 서열번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 또는 52의 핵산 서열을 기준으로 659번, 128번, 97번, 628번, 595번, 815번, 911번, 506번, 880번, 1072번, 389번, 1144번, 또는 626번 위치에 각각 상응하는 염기는 G, T, A, G, A, T, A, T, A, T, A, T, 또는 T 이고, 상기 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 50으로 기재된 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 폴리펩티드나 단백질을 암호화하는 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 본 출원의 폴리뉴클레오티드의 각 핵산 서열, 위치, 및 위치에 상응하는 염기 종류에 대한 대응관계를 하기 표 4 에 나타내었다.
　 핵산 서열 위치를 카운팅하기 위해 기준이 되는 핵산 서열 위치 염기 종류
1 서열번호 2 서열번호 4 659 G
2 서열번호 6 서열번호 8 128 T
3 서열번호 10 서열번호 12 97 A
4 서열번호 14 서열번호 16 628 G
5 서열번호 18 서열번호 20 595 A
6 서열번호 22 서열번호 24 815 T
7 서열번호 26 서열번호 28 911 A
8 서열번호 30 서열번호 32 506 T
9 서열번호 34 서열번호 36 880 A
10 서열번호 38 서열번호 40 1072 T
11 서열번호 42 서열번호 44 389 A
12 서열번호 46 서열번호 48 1144 T
13 서열번호 50 서열번호 52 626 T
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 50의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 또는 50의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 또는 49의 220번, 43번, 33번, 210번, 199번, 272번, 304번, 169번, 294번, 358번, 130번, 382번, 또는 209번 위치에 각각 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 각각 시스테인, 류신, 세린, 아스파르트산, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 발린, 라이신, 세린, 아스파르트산, 시스테인, 또는 류신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 “엄격한 조건(stringent condition)”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J.Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공하는 것이다.
일 예는 하기 (a) 및 (b)의 단백질 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 (b) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 및/또는 상기 (a)와 (b)를 코딩하는 폴리펩티드)를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공할 수 있다:
(a) 서열번호 51의 209번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 변이체 및
(b) 하기 (1) 내지 (12)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 변이체:
(1) 서열번호 3의 220번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 내재성 막 수송 단백질 변이체;
(2) 서열번호 7의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체;
(3) 서열번호 11의 33번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체;
(4) 서열번호 15의 210번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 전사 안티터미네이션 단백질 변이체;
(5) 서열번호 19의 199번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 변이체;
(6) 서열번호 23의 272번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 말레이트 디하이드로게나제 변이체;
(7) 서열번호 27의 304번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 프리모솜 조립 단백질 변이체;
(8) 서열번호 31의 169번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타입 II 시트레이트 신타아제 변이체;
(9) 서열번호 35의 294번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 33로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질 변이체;
(10) 서열번호 39의 358번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 세린으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 미코티온 리덕타제 변이체;
(11) 서열번호 43의 130번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체; 및
(12) 서열번호 47의 382번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 시스테인으로 치환된, 서열번호 45으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DAHP 신타아제 변이체.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이형 폴리펩티드(예를 들면, 상기 (a) 및 (b)의 변이체), 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 (b) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 및/또는 상기 (a)와 (b)를 코딩하는 폴리펩티드), 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들면, 상기 (a) 및/또는 (b)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 (a) 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 벡터와 상기 (b) 변이체를 포함하는 벡터)를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체(예를 들면, 상기 (a) 및 (b)의 변이체), 본 출원의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 (b) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 및/또는 상기 (a)와 (b)를 코딩하는 폴리펩티드) 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들면, 상기 (a) 및/또는 (b)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 (a) 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 벡터와 상기 (b) 변이체를 포함하는 벡터) 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 균주는 L-라이신 생산능을 가진 균주일 수 있다.
본 출원의 균주는 자연적으로 (i) 내재성 막 수송 단백질(integral membrane transport protein); (ⅱ) DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 (DNA polymerase Ⅲ subunits gamma and tau); (ⅲ) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 NCgl3069 유전자에 의해 코딩되는 단백질; (ⅳ) 전사 안티터미네이션 단백질(Transcription antitermination protein); (ⅴ) ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질(ABC transporter ATP-binding protein); (ⅵ) 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase); (ⅶ) 프리모솜 조립 단백질(primosome assembly protein); (ⅷ) 타입 II 시트레이트 신타아제(type II citrate synthase); (ⅸ) 막 단백질 (membrane protein, TerC); (x) 미코티온 리덕타제(mycothione reductase); (xi) Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트(Co/Zn/Cd efflux system component); (xii) DAHP 신타아제(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase; DAHP synthase); 및/또는 (xiii) N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제(N-succinyldiaminopimelate aminotransferase)의 활성 및/또는 L-라이신 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 상기 (i) 내지 (xiii)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질의 활성 및/또는 L-라이신 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 (예를 들면, 상기 (a) 및 (b)의 변이체) 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 L-라이신 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체(예를 들면, 상기 (a) 및 (b)의 변이체)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 L-라이신을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 (b) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 및/또는 상기 (a)와 (b)를 코딩하는 폴리펩티드)가 도입됨으로써 단백질 변이체가 발현되어, L-라이신 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 균주는 단백질 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 균주(예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰)과 비교하여, L-라이신 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-아미노산 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 상기 (i) 내지 (xiii)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질이 비변형된 미생물 (즉, 상기 (i) 내지 (xiii)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 야생형 단백질을 발현하는 미생물; 예를 들면 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 또는 51의 폴리펩티드 및/또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물)에 비하여 L-라이신 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 L-라이신 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 비변형 미생물은 ATCC13032 균주 및/또는 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(US 9556463 B2; 문헌 전체가 본 명세서에 참조로서 포함됨)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-라이신 생산능이 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상, 약 18.5% 이상, 약 19% 이상, 약 19.5% 이상, 약 20% 이상, 약 20.5% 이상, 약 21% 이상, 약 21.5% 이상, 약 22% 이상, 약 22.5% 이상, 약 23% 이상, 약 23.5% 이상, 약 24% 이상, 약 24.5% 이상, 약 25% 이상, 약 25.5% 이상, 약 26% 이상, 약 26.5% 이상, 약 27% 이상, 약 27.5% 이상, 약 28% 이상, 약 28.5% 이상, 약 29% 이상, 약 29.5% 이상, 약 30% 이상, 약 31% 이상, 약 32% 이상, 약 33% 이상, 약 34% 이상, 또는 약 35% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 또는 약 35% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-라이신 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 1.15배 이상, 1.16배 이상, 1.17배 이상, 1.18배 이상, 1.19배 이상, 약 1.2 배 이상, 1.25배 이상, 또는 약 1.3배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 전사 안티터미네이션 단백질 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 “약화”는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성”은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 “변형 전 활성”과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 “불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠”한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 “강화”는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성”은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 “변형 전 활성”과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 “강화”, “상향조절”, “과발현” 또는 “증가”한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형(예컨대, 상술한 단백질 변이체를 코딩하기 위한 변형)은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 L-라이신 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체(예를 들면, 상기 (a) 및 (b)의 단백질 변이체) 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 (b) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 및/또는 상기 (a)와 (b)를 코딩하는 폴리펩티드)를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공한다.
일 예에서, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공할 수 있다.
본 출원의 L-아미노산 생산방법은 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 (또는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰) 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
더불어, 본 출원의 L-아미노산은 L- 라이신일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-아미노산 생산방법은, 본 출원의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-아미노산 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-아미노산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아미노산을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-아미노산 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-아미노산 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 균주 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체(예를 들면, 상기 (a) 및 (b)의 변이체), 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 (b) 변이체를 코딩하는 폴리펩티드, 및/또는 상기 (a)와 (b)를 코딩하는 폴리펩티드), 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들면, 상기 (a) 및/또는 (b)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 (a) 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 벡터와 상기 (b) 변이체를 포함하는 벡터) 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-아미노산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 L-아미노산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
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ctgaagcaga agcttgctga tgttgccaac 240 ggtaaggcct tcctcttgca gggtggtgac tgtgcggaaa ctttcgagtc aaacactgag 300 ccgcacattc gcgccaacgt aaagactctg ctgcagatgg cagttgtttt gacctacggt 360 gcatccactc ctgtgatcaa gatggctcgt attgctggtc agtacgcaaa gcctcgctct 420 tctgatctgg atggaaatgg tctgccaaac taccgtggcg atatcgtcaa cggtgtggag 480 gcaaccccag aggctcgtcg ccacgatcct gcccgcatga tccgtgctta cgctaacgct 540 tctgctgcga tgaacttggt gcgcgcgctc accagctctg gcaccgctga tctttaccgt 600 ctcagcgagt ggaaccgcga gttcgttgcg aactccccag ctggtgcacg ctacgaggct 660 cttgctcgtg agatcgactc cggtctgcgc ttcatggaag catgtggcgt gtccgatgag 720 tccctgcgtg ctgcagatat ctactgctcc cacgaggctt tgctggtgga ttacgagcgt 780 tccatgctgc gtcttgcaac cgatgaggaa ggcaacgagg aactttacga tctttcagct 840 caccagctgt ggatcggcga gcgcacccgt ggcatggatg atttccatgt gaacttcgca 900 tccatgatct ctaacccaat cggcatcaag attggtcctg gtatcacccc tgaagaggct 960 gttgcatacg ctgacaagct cgatccgaac ttcgagcctg gccgtttgac catcgttgct 1020 cgcatgggcc acgacaaggt tcgctccgta cttcctggtg ttatccaggc tgttgaggca 1080 tccggacaca aggttatttg gcagtccgat ccgatgcacg gcaacacttt caccgcatcc 1140 aattgctaca agacccgtca cttcgacaag gttatcgatg aggtccaggg cttcttcgag 1200 gtccaccgcg cattgggcac ccacccaggc ggaatccaca ttgagttcac tggtgaagat 1260 gtcaccgagt gcctcggtgg cgctgaagac atcaccgatg ttgatctgcc aggccgctac 1320 gagtccgcat gcgatcctcg cctgaacact cagcagtctt tggagttggc tttcctcgtt 1380 gcagaaatgc tgcgtaacta a 1401 <210> 47 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (WT)_3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase <400> 47 Met Asn Arg Gly Val Ser Trp Thr Val Asp Ile Pro Lys Glu Val Leu 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro Pro Leu Pro Glu Gly Met Gln Gln Gln Phe Glu Asp 20 25 30 Thr Ile Ser Arg Asp Ala Lys Gln Gln Pro Thr Trp Asp Arg Ala Gln 35 40 45 Ala Glu Asn Val Arg Lys Ile Leu Glu Ser Val Pro Pro Ile Val Val 50 55 60 Ala Pro Glu Val Leu Glu Leu Lys Gln Lys Leu Ala Asp Val Ala Asn 65 70 75 80 Gly Lys Ala Phe Leu Leu Gln Gly Gly Asp Cys Ala Glu Thr Phe Glu 85 90 95 Ser Asn Thr Glu Pro His Ile Arg Ala Asn Val Lys Thr Leu Leu Gln 100 105 110 Met Ala Val Val Leu Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Val Ile Lys Met 115 120 125 Ala Arg Ile Ala Gly Gln Tyr Ala Lys Pro Arg Ser Ser Asp Leu Asp 130 135 140 Gly Asn Gly Leu Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Ile Val Asn Gly Val Glu 145 150 155 160 Ala Thr Pro Glu Ala Arg Arg His Asp Pro Ala Arg Met Ile Arg Ala 165 170 175 Tyr Ala Asn Ala Ser Ala Ala Met Asn Leu Val Arg Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Ser Gly Thr Ala Asp Leu Tyr Arg Leu Ser Glu Trp Asn Arg Glu Phe 195 200 205 Val Ala Asn Ser Pro Ala Gly Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Ala Arg Glu 210 215 220 Ile Asp Ser Gly Leu Arg Phe Met Glu Ala Cys Gly Val Ser Asp Glu 225 230 235 240 Ser Leu Arg Ala Ala Asp Ile Tyr Cys Ser His Glu Ala Leu Leu Val 245 250 255 Asp Tyr Glu Arg Ser Met Leu Arg Leu Ala Thr Asp Glu Glu Gly Asn 260 265 270 Glu Glu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala His Gln Leu Trp Ile Gly Glu Arg 275 280 285 Thr Arg Gly Met Asp Asp Phe His Val Asn Phe Ala Ser Met Ile Ser 290 295 300 Asn Pro Ile Gly Ile Lys Ile Gly Pro Gly Ile Thr Pro Glu Glu Ala 305 310 315 320 Val Ala Tyr Ala Asp Lys Leu Asp Pro Asn Phe Glu Pro Gly Arg Leu 325 330 335 Thr Ile Val Ala Arg Met Gly His Asp Lys Val Arg Ser Val Leu Pro 340 345 350 Gly Val Ile Gln Ala Val Glu Ala Ser Gly His Lys Val Ile Trp Gln 355 360 365 Ser Asp Pro Met His Gly Asn Thr Phe Thr Ala Ser Asn Gly Tyr Lys 370 375 380 Thr Arg His Phe Asp Lys Val Ile Asp Glu Val Gln Gly Phe Phe Glu 385 390 395 400 Val His Arg Ala Leu Gly Thr His Pro Gly Gly Ile His Ile Glu Phe 405 410 415 Thr Gly Glu Asp Val Thr Glu Cys Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ile Thr 420 425 430 Asp Val Asp Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Ser Ala Cys Asp Pro Arg Leu 435 440 445 Asn Thr Gln Gln Ser Leu Glu Leu Ala Phe Leu Val Ala Glu Met Leu 450 455 460 Arg Asn 465 <210> 48 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (WT)_aroG <400> 48 atgaataggg gtgtgagttg gacagttgat atccctaaag aagttctccc tgatttgcca 60 ccattgccag aaggcatgca gcagcagttc gaggacacca tttcccgtga cgctaagcag 120 caacctacgt gggatcgtgc acaggcagaa aacgtgcgca agatccttga gtcggttcct 180 ccaatcgttg ttgcccctga ggtacttgag ctgaagcaga agcttgctga tgttgccaac 240 ggtaaggcct tcctcttgca gggtggtgac tgtgcggaaa ctttcgagtc aaacactgag 300 ccgcacattc gcgccaacgt aaagactctg ctgcagatgg cagttgtttt gacctacggt 360 gcatccactc ctgtgatcaa gatggctcgt attgctggtc agtacgcaaa gcctcgctct 420 tctgatctgg atggaaatgg tctgccaaac taccgtggcg atatcgtcaa cggtgtggag 480 gcaaccccag aggctcgtcg ccacgatcct gcccgcatga tccgtgctta cgctaacgct 540 tctgctgcga tgaacttggt gcgcgcgctc accagctctg gcaccgctga tctttaccgt 600 ctcagcgagt ggaaccgcga gttcgttgcg aactccccag ctggtgcacg ctacgaggct 660 cttgctcgtg agatcgactc cggtctgcgc ttcatggaag catgtggcgt gtccgatgag 720 tccctgcgtg ctgcagatat ctactgctcc cacgaggctt tgctggtgga ttacgagcgt 780 tccatgctgc gtcttgcaac cgatgaggaa ggcaacgagg aactttacga tctttcagct 840 caccagctgt ggatcggcga gcgcacccgt ggcatggatg atttccatgt gaacttcgca 900 tccatgatct ctaacccaat cggcatcaag attggtcctg gtatcacccc tgaagaggct 960 gttgcatacg ctgacaagct cgatccgaac ttcgagcctg gccgtttgac catcgttgct 1020 cgcatgggcc acgacaaggt tcgctccgta cttcctggtg ttatccaggc tgttgaggca 1080 tccggacaca aggttatttg gcagtccgat ccgatgcacg gcaacacttt caccgcatcc 1140 aatggctaca agacccgtca cttcgacaag gttatcgatg aggtccaggg cttcttcgag 1200 gtccaccgcg cattgggcac ccacccaggc ggaatccaca ttgagttcac tggtgaagat 1260 gtcaccgagt gcctcggtgg cgctgaagac atcaccgatg ttgatctgcc aggccgctac 1320 gagtccgcat gcgatcctcg cctgaacact cagcagtctt tggagttggc tttcctcgtt 1380 gcagaaatgc tgcgtaacta a 1401 <210> 49 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (P209L)_N-succinyldiaminopimelate aminotransferase <400> 49 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val Ser Val Leu Pro Asp Phe Pro Trp 1 5 10 15 Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly 20 25 30 Ile Val Asn Leu Ser Val Gly Thr Pro Val Asp Pro Val Ala Pro Ser 35 40 45 Ile Gln Ile Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gln 50 55 60 Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg Ala Ala Ile Arg Gly Ala Leu Glu 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu Val Asp Ala Ser Leu Leu Pro Val 85 90 95 Val Gly Thr Lys Glu Ala Ile Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly Ile 100 105 110 Ser Gly Thr Val Val Ile Pro Glu Ile Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Val 115 120 125 Ala Val Val Ala Ala Gly Cys Thr Val Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe 130 135 140 Lys Leu Gly Pro Gln Ile Pro Ser Met Met Phe Ile Asn Ser Pro Ser 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gly Lys Val Leu Gly Ile Pro His Leu Arg Lys Val Val 165 170 175 Lys Trp Ala Gln Glu Asn Asn Val Ile Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr 180 185 190 Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro Ile Ser Ile Leu Asp 195 200 205 Leu Arg Val Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu Ile Ala Ile His Ser 210 215 220 Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Val 225 230 235 240 Gly Asp Pro Ala Leu Ile Gly Glu Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn Leu 245 250 255 Gly Leu Met Val Pro Phe Pro Ile Gln Gln Ala Met Ile Ala Ala Leu 260 265 270 Asn Asp Asp Asp Gln Glu Ala Gly Gln Lys Leu Thr Tyr Ala Ile Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Gln Val Asp 290 295 300 Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys 305 310 315 320 Arg Asp Thr Val Asp Trp Phe Ala Glu Arg Gly Ile Leu Val Ala Pro 325 330 335 Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly Ala Gln His Val Arg Val Ala Met 340 345 350 Thr Glu Thr Asp Glu Arg Val Asp Ala Phe Val Ser Arg Leu Ser 355 360 365 <210> 50 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (P209L)_NCgl1058 <400> 50 atgacctctc gcaccccgct tgtttctgtt cttcctgatt ttccgtggga ttcgctcgct 60 tccgcaaaag ccaaagctgc gtctcacccg gatgggatcg tgaatctttc tgttggcact 120 ccggttgatc cggtcgcgcc cagcattcag atcgcgttgg cagaagcagc ggggttttcg 180 ggttaccctc aaaccatcgg caccccggaa ctccgcgcag ccatcagggg cgcgcttgag 240 cggcgctaca acatgacaaa gcttgtcgac gcctccctcc tccccgtcgt gggtaccaag 300 gaggcaattg cccttcttcc attcgcgttg ggtatttccg gcaccgttgt catcccagag 360 attgcgtacc caacctacga agtcgctgtc gtggccgcag gatgcaccgt gttgcgttct 420 gattcgctgt ttaagctcgg cccgcagatc ccgtcgatga tgtttatcaa ctcaccatcc 480 aaccccacag gcaaggttct gggcatccca cacttgcgca aggttgtgaa gtgggcgcag 540 gaaaacaacg tgatcctcgc agctgatgaa tgctacttgg gtcttggctg ggacgatgaa 600 aacccaccga tctcaatttt ggatctacgt gtctgcgatg gcgaccacac caacttgatc 660 gccattcact cgctgtctaa aacctcaaac ctcgcttctt accgcgcagg ttacctcgtt 720 ggcgatccag cgctgattgg tgaactcacg gaagtccgta agaacttggg tctcatggtt 780 cctttcccaa tccagcaggc catgatcgca gccctcaacg acgatgacca agaggcaggg 840 cagaagctca cctacgcgat tcgtcgagca aaactcatgc gcgccctgtt ggaatccggc 900 tttcaggtag ataattctga agcgggtctg tacctctggg cgacgcgtga agaaccttgc 960 cgtgacactg tcgattggtt cgctgagcgt ggcattctcg ttgccccagg agacttctat 1020 ggccctcgcg gagcgcagca tgtgcgtgtg gcgatgaccg aaaccgacga gcgcgtcgac 1080 gcctttgttt ctcgcctgag ctaa 1104 <210> 51 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (WT)_N-succinyldiaminopimelate aminotransferase <400> 51 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val Ser Val Leu Pro Asp Phe Pro Trp 1 5 10 15 Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly 20 25 30 Ile Val Asn Leu Ser Val Gly Thr Pro Val Asp Pro Val Ala Pro Ser 35 40 45 Ile Gln Ile Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gln 50 55 60 Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg Ala Ala Ile Arg Gly Ala Leu Glu 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu Val Asp Ala Ser Leu Leu Pro Val 85 90 95 Val Gly Thr Lys Glu Ala Ile Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly Ile 100 105 110 Ser Gly Thr Val Val Ile Pro Glu Ile Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Val 115 120 125 Ala Val Val Ala Ala Gly Cys Thr Val Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe 130 135 140 Lys Leu Gly Pro Gln Ile Pro Ser Met Met Phe Ile Asn Ser Pro Ser 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gly Lys Val Leu Gly Ile Pro His Leu Arg Lys Val Val 165 170 175 Lys Trp Ala Gln Glu Asn Asn Val Ile Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr 180 185 190 Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro Ile Ser Ile Leu Asp 195 200 205 Pro Arg Val Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu Ile Ala Ile His Ser 210 215 220 Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Val 225 230 235 240 Gly Asp Pro Ala Leu Ile Gly Glu Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn Leu 245 250 255 Gly Leu Met Val Pro Phe Pro Ile Gln Gln Ala Met Ile Ala Ala Leu 260 265 270 Asn Asp Asp Asp Gln Glu Ala Gly Gln Lys Leu Thr Tyr Ala Ile Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Gln Val Asp 290 295 300 Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys 305 310 315 320 Arg Asp Thr Val Asp Trp Phe Ala Glu Arg Gly Ile Leu Val Ala Pro 325 330 335 Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly Ala Gln His Val Arg Val Ala Met 340 345 350 Thr Glu Thr Asp Glu Arg Val Asp Ala Phe Val Ser Arg Leu Ser 355 360 365 <210> 52 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (WT)_NCgl1058 <400> 52 atgacctctc gcaccccgct tgtttctgtt cttcctgatt ttccgtggga ttcgctcgct 60 tccgcaaaag ccaaagctgc gtctcacccg gatgggatcg tgaatctttc tgttggcact 120 ccggttgatc cggtcgcgcc cagcattcag atcgcgttgg cagaagcagc ggggttttcg 180 ggttaccctc aaaccatcgg caccccggaa ctccgcgcag ccatcagggg cgcgcttgag 240 cggcgctaca acatgacaaa gcttgtcgac gcctccctcc tccccgtcgt gggtaccaag 300 gaggcaattg cccttcttcc attcgcgttg ggtatttccg gcaccgttgt catcccagag 360 attgcgtacc caacctacga agtcgctgtc gtggccgcag gatgcaccgt gttgcgttct 420 gattcgctgt ttaagctcgg cccgcagatc ccgtcgatga tgtttatcaa ctcaccatcc 480 aaccccacag gcaaggttct gggcatccca cacttgcgca aggttgtgaa gtgggcgcag 540 gaaaacaacg tgatcctcgc agctgatgaa tgctacttgg gtcttggctg ggacgatgaa 600 aacccaccga tctcaatttt ggatccacgt gtctgcgatg gcgaccacac caacttgatc 660 gccattcact cgctgtctaa aacctcaaac ctcgcttctt accgcgcagg ttacctcgtt 720 ggcgatccag cgctgattgg tgaactcacg gaagtccgta agaacttggg tctcatggtt 780 cctttcccaa tccagcaggc catgatcgca gccctcaacg acgatgacca agaggcaggg 840 cagaagctca cctacgcgat tcgtcgagca aaactcatgc gcgccctgtt ggaatccggc 900 tttcaggtag ataattctga agcgggtctg tacctctggg cgacgcgtga agaaccttgc 960 cgtgacactg tcgattggtt cgctgagcgt ggcattctcg ttgccccagg agacttctat 1020 ggccctcgcg gagcgcagca tgtgcgtgtg gcgatgaccg aaaccgacga gcgcgtcgac 1080 gcctttgttt ctcgcctgag ctaa 1104

Claims (5)

  1. 하기 (1) 내지 (13)으로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질 변이체:
    (1) 서열번호 3의 220번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 내재성 막 수송 단백질 변이체;
    (2) 서열번호 7의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체;
    (3) 서열번호 11의 33번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체;
    (4) 서열번호 15의 210번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 전사 안티터미네이션 단백질 변이체;
    (5) 서열번호 19의 199번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 변이체;
    (6) 서열번호 23의 272번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 말레이트 디하이드로게나제 변이체;
    (7) 서열번호 27의 304번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 프리모솜 조립 단백질 변이체;
    (8) 서열번호 31의 169번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타입 II 시트레이트 신타아제 변이체;
    (9) 서열번호 35의 294번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 33로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질 변이체;
    (10) 서열번호 39의 358번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 세린으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 미코티온 리덕타제 변이체;
    (11) 서열번호 43의 130번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체;
    (12) 서열번호 47의 382번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 시스테인으로 치환된, 서열번호 45으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DAHP 신타아제 변이체; 및
    (13) 서열번호 51의 209번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 변이체.
  2. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 하기 (a) 및 (b)의 단백질 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주:
    (a) 서열번호 51의 209번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 49로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 N-숙시닐디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 변이체 및
    (b) 하기 (1) 내지 (12)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 변이체:
    (1) 서열번호 3의 220번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 내재성 막 수송 단백질 변이체;
    (2) 서열번호 7의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 Ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체;
    (3) 서열번호 11의 33번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체;
    (4) 서열번호 15의 210번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 전사 안티터미네이션 단백질 변이체;
    (5) 서열번호 19의 199번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 ABC 트랜스포터 ATP-결합 단백질 변이체;
    (6) 서열번호 23의 272번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 말레이트 디하이드로게나제 변이체;
    (7) 서열번호 27의 304번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 프리모솜 조립 단백질 변이체;
    (8) 서열번호 31의 169번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타입 II 시트레이트 신타아제 변이체;
    (9) 서열번호 35의 294번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 33로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 막 단백질 변이체;
    (10) 서열번호 39의 358번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 세린으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 미코티온 리덕타제 변이체;
    (11) 서열번호 43의 130번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체; 및
    (12) 서열번호 47의 382번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 시스테인으로 치환된, 서열번호 45으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 DAHP 신타아제 변이체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 코리네박테리움 글루타미쿰과 비교하여 L-라이신 생산능이 증가된, 균주.
  5. 제3항 또는 제4항의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-라이신 생산 방법.
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