KR101687474B1

KR101687474B1 - L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법

Info

Publication number: KR101687474B1
Application number: KR1020150015876A
Authority: KR
Inventors: 강민경; 배현애; 이한형; 김혜원; 이성근
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2016-12-28
Also published as: KR20150023598A

Abstract

본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 상기 코리네박테리움속 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 L-아르기닌의 생산 방법{MICROORGANISM OF THE GENUS CORYNEBACTERIUM WITH ENHANCED L-ARGININE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING L-ARGININE USING THE SAME}

본 발명은 L-아르기닌 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움속 미생물 및 이 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-아르기닌은 식물 종자나 마늘 중에 유리 상태로 함유되어 있으며, 아미노산류 강화제로도 사용되고, 의약품, 식품 등에도 널리 이용된다. 의약용으로는 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 생선묵 첨가제, 건강 음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.

코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물은 고리형 단계 경로를 통해 L-아르기닌의 생합성이 이루어지며, L-아르기닌은 L-글루타메이트로부터 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate), N-아세틸글루타밀포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate), N-아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde), N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), 및 아르기니노숙시네이트(argininosuccinate)를 거쳐서 합성된다.

또한, 코리네박테리움 글루타미쿰은 세포 내 아르기닌에 의해서 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 것으로 알려져 있어(Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142:9-108, 1996), 고수율의 L-아르기닌을 생산하는 데에는 한계가 있는 것으로 알려져 있다.

이케다 등은 아르기닌 발효시 발효 배지상에 시트룰린이 축적됨을 보고하였다(Appl Environ Microbiol. 2009 Mar;75(6):1635-41. Epub 2009 Jan 9).

상기 생합성 과정에서, 시트룰린은 아스파테이트(aspartate)와 결합하여 아르기노숙시네이트로 되고, 푸마레이트(fumarate)를 방출하여 아르기닌이 된다. 여기에서, 아스파테이트 암모니아 리아제(aspartate ammonia-lyase, aspA)는 푸마레이트와 암모니아로부터 아스파테이트를 합성하는 효소이고(도 1), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase, aspB)는 아스파르트산, 글루탐산, 아미노부티르산 등의 다양한 L-아미노산으로부터 아미노기를 α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산 등의 케토산에 전이시킴으로써 다양한 L-아미노산을 합성하는 촉매 기능을 가진 효소이다.

멘켈 등은 대장균의 aspA를 코리네형 미생물에 도입한 경우 아스파테이트의 이용성이 증가되어 L-라이신의 생산이 증가하였음을 보고하였다(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 1989, p. 684-688).

이에 본 발명자들은 아스파테이트 암모니아 리아제 효소 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 효소의 발현을 강화시켜 시트룰린과 결합하는 아스파테이트의 유입을 늘림으로써 L-아르기닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L-아르기닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리움속 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 코리네박테리움속 미생물을 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제 활성이 강화되거나 여기에 추가로 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움속 미생물을 제공하며, 상기 재조합 코리네박테리움속 미생물은 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있으므로 산업상 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성하는 경로 및 푸마레이트로부터 아스파테이트를 합성하는 경로를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 L-아르기닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명에서, 상기 용어 'L-아르기닌 생산능(L-arginine productivity)'은 본 발명의 코리네박테리움속 미생물을 배지 속에서 배양할 시에 배지 속에 L-아르기닌을 축적시키는 능력을 의미한다. 이러한 L-아르기닌 생산 능력은 코리네박테리움속 미생물의 야생형 균주의 특성, 또는 인위적인 변이에 의해 첨가 또는 증강된 특성일 수 있다.

예를 들어, L-아르기닌의 생산 능력 부여를 위하여 코리네박테리움속 미생물은 아르기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖도록 육종될 수 있고; 숙신산에 대해 영양요구성을 갖거나 핵산 염기 동족체에 대해 내성을 갖도록 육종될 수 있고; 아르기닌을 물질 대사시킬 수 없고 아르기닌 길항제 및 카나바닌에 내성을 가지며 리신에 영양요구성을 갖도록 육종될 수 있고; 아르기닌, 아르기닌 하이드록사메이트, 호모아르기닌, D-아르기닌 및 카나바닌에 내성을 갖도록 또는 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성을 갖도록 육종될 수 있으며; 카나바닌에 내성을 갖도록 육종될 수 있다.

또한, L-아르기닌의 생산 능력은 L-아르기닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증진되도록 코리네박테리움속 미생물을 변형시켜 부여될 수 있다. L-아르기닌 생합성 효소의 예는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 (argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제 (argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 (argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 (argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제 (argF), 아르기니노숙신산 신테타제 (argG), 아르기니노숙신산 리아제 (argH), 및 카바모일 포스페이트 신테타제를 포함한다. 이들 아르기닌 생합성 효소는 Arg 오페론 (argCJBDFRGH)상에 존재하고 argR에 의해 암호화된 아르기닌 리프레서에 의해 조절된다(J Bacteriol. 2002 Dec;184(23):6602-14.). 따라서, 아르기닌 리프레서의 약화(US2002-0045223), 또는 상기 생합성 관련 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 과발현시킴으로써 L-아르기닌 생산 능력을 부여할 수 있다.

본 발명에서, L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 L-아르기닌을 생산하는 능력을 가지고 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, L-아르기닌을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741(대한민국 특허등록번호 0791659) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831일 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

아스파테이트 암모니아 리아제(aspartate ammonia-lyase, aspA)는 푸마레이트와 암모니아로부터 아스파테이트를 합성하는 효소이므로, 상기 아스파테이트 암모니아 리아제의 발현강화를 통해 아스파테이트의 합성이 증가되며, 증가된 아스파테이트에 의해 L-아르기닌의 생산성이 높아질 수 있다.

본 발명에서, 상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 상기 활성을 가지는 효소라면 어떤 미생물 유래의 효소라도 상관없이 활용할 수 있으며, 바람직하게는 에스케리키아속 미생물 또는 코리네형 미생물 유래의 효소, 더욱 바람직하게는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 효소를 활용할 수 있다. 상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 구체적으로 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 코리네박테리움속 미생물 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제는 서열번호 23으로 기재되는 염기서열을 가지는 aspA (NCgl1446)에 의해 암호화되며, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 에스케리키아 속 미생물 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제는 서열번호 24로 기재되는 염기서열을 가지는 aspA (NCBI GENE ID: 12933698)에 의해 암호화된다.

본 발명에서 제시한 아스파테이트 암모니아 리아제의 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아스파테이트 암모니아 리아제 또한 본 발명에 포함된다. 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].

상기의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 추가로 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 코리네박테리움속 미생물로부터 유래된 것으로 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 26의 염기서열을 가지는 aspB (NCgl0237)에 의해 암호화된다.

본 발명에서 제시한 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 또한 본 발명에 포함된다. 위에서 언급한 바와 같이 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].

상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 모두 강화된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.

본 발명은 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 본래의 활성보다 강화(또는 증가)된 것을 특징으로 한다.

상기 용어 "본래의 활성"이란 상기 효소들의 활성을 조절하기 위한 어떠한 유전적 조작이나 변형이 없는 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물이 가지고 있는 활성을 의미한다. 또한, 상기 "강화" 또는 "증가"는 L-아르기닌 생산능이 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물의 본래의 활성보다 향상된 것을 의미한다.

본 발명의 활성 강화(또는 증가)는 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예로는 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하는 방법 등에 의하여 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 염기서열의 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법, 및 유전자 변이에 의한 방법 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

하나의 구체적 실시에서, L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물의 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성을 강화시키기 위해 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자를 벡터에 도입하고 코리네박테리움속 미생물을 형질전환시킴으로써 상기 유전자의 카피수를 증가시키는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다.

본 발명의 실시예에서는, 상기 유전자들을 포함하는 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 제조하였으며, 2차 교차 과정을 거쳐 상기 유전자를 염색체 내에 2copy 포함하는 L-아르기닌 생산 균주를 분리하였다.

본 발명에서, 상기 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.

본 발명의 방법으로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 (KCCM11351P) 균주는 L-아르기닌의 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831의 염색체로부터 PCR을 통해 수득한 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 aspA를 벡터에 삽입한 후, L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P에 도입함으로써 aspA의 발현을 증가시킨 형질전환된 미생물이다. 본 발명에 의한 방법으로 형질전환된 상기 균주 KCCM11351P는 aspA의 과발현을 통해 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 또한 상기 형질전환된 코리네박테리움속 미생물을 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 L-아르기닌을 제조하는 방법에서, 상기 형질전환된 L-아르기닌 과발현 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuousculture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 배지는 원당 혹은 포도당을 주탄소원으로 사용하고, 원당을 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있으며, 바람직하게는 정제 포도당을 사용한다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함되며, 바람직하게는 펩톤을 사용한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양기간은 원하는 L-아르기닌 생산량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 L-아르기닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: L-아르기닌 생산에서 aspA 유전자의 영향 확인

aspA 가 L-아르기닌 생산에 주요한 유전자인지를 확인하기 위하여, aspA 결손 벡터를 제작하고 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(대한민국 특허등록 제0791659호)에 형질전환하여 L-아르기닌 생산성을 평가하였다.

(1) aspA 결손 벡터의 제작

염색체에서 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 유전자인 aspA(Ncgl1446) 유전자를 결실하기 위해서, 카이젠사의 게노믹-팁 시스템(QIAGEN Genomic-tip system)을 이용하여 미국생물자원센터(American Type Culture Collection: ATCC)로부터 구매한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831의 염색체를 추출하였고, 이 염색체를 주형(template)으로 교차 PCR을 수행하였다.

구체적으로, 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 60초간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 XmaI 제한효소 자리를 가진 약 798bp의 단편을 증폭하였다. 그 후, 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 3' 영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 829bp 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAll^R Expin^TM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 교차 PCR을 위한 주형으로 사용하였다.

상기 aspA의 결실을 포함하는 DNA 단편을 확보하기 위해 서열번호 1과 4의 프라이머를 이용해 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 기재된 PCR 법을 통하여 약 1583 bp 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 XmaI 과 XbaI으로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pD 벡터와의 라이게이션을 통해 벡터 pDKO1446를 제작하였다.

(2) 재조합 균주의 제조

상기 제작된 pDKO1446 벡터를 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspA가 결실된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 선별된 균주를 KCCM10741ΔaspA로 명명하였다.

(3) 재조합 균주의 L-아르기닌 생산능 확인

상기 제조된 재조합 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741ΔaspA를 이용하여 aspA의 결실이 L-아르기닌 생산능에 미치는 영향을 파악하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.

이때, 대조군으로는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P를 배양하여 사용하였으며, 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1백금이의 균주를 접종하고 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양종료 후, HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

< 생산배지 >

포도당 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 효모 추출물 0.5%, 비오틴 100 mg/L, pH7.2

L-아르기닌 생산능의 비교

균주	OD	아르기닌농도(g/L)
KCCM10741P	91	3.0
KCCM10741PΔaspA	101	2.4

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, aspA가 결손된 균주는 L-아르기닌의 생산능이 하락됨을 확인하였으며, aspA가 L-아르기닌의 생산에 있어 주요 유전자임을 확인하였다.

실시예 2: 코리네박테리움 유래 aspA 도입 벡터의 제작

코리네박테리움 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 유전자인 aspA(Ncgl1446)의 2copy 벡터를 제작하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 염색체를 주형(template)으로 서열번호 5와 6의 프라이머, 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 aspA가 각각 포함된 DNA 단편을 확보하였다.

구체적으로, 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 XmaI와 3' 영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 1893 bp의 단편을 증폭하였다. 두 번째로 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 5' 영역에 BamHI와 3' 영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1885 bp 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

얻어진 DNA 단편들은 GeneAll^R Expin^TM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 첫 번째 단편은 XmaI 및 BamHI으로 처리하였고, 두 번째 단편은 BamHI 및 XbaI으로 처리하였으며, pD 벡터는 XmaI 및 XbaI으로 처리하였다. 제한효소가 처리된 pD 벡터와 두 DNA 단편을 라이게이션하여 pD1446-2X 벡터를 제작하였다.

실시예 3: aspA 의 발현이 강화된 재조합 균주의 제조

상기 실시예 2에서 제작된 pD1446-2X 벡터를 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 aspA 2copy가 포함된 L-아르기닌 생산 균주를 얻었다. 얻어진 균주들을 각각 KCCM10741P::aspA_2X 및 ATCC21831::aspA_2X로 명명하였다.

실시예 4: 코리네박테리움 유래 aspB 도입 벡터의 제작

아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 aspB(Ncgl0237) 2copy 벡터를 제작하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 염색체를 주형(template)으로 서열번호 9와 10의 프라이머, 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 aspB가 각각 포함된 DNA 단편을 확보하였다.

구체적으로, 서열번호 9와 10의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 중합하는 조건을 Pfu polymerase로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 XmaI과 3' 영역에 NdeI 제한효소 자리를 가진 약 1692 bp의 단편을 증폭하였다. 두 번째로 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 5' 영역에 NdeI과 3' 영역에 SpeI 제한효소 자리를 가진 약 1643 bp의 단편을 증폭하였다.

얻어진 DNA 단편들은 GeneAll^R Expin^TM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 첫 번째 단편은 XmaI 및 NdeI으로 처리하였고, 두 번째 단편은 NdeI 및 SpeI으로 처리하였으며, pD 벡터는 XmaI 및 XbaI으로 처리하였다. 제한효소가 처리된 pD 벡터와 두 DNA 단편의 3조각 라이게이션(3 piece ligation)을 통하여 pD0237-2X 벡터를 제작하였다.

실시예 5: aspB 의 발현이 강화된 균주의 제조

상기 실시예 4에서 제작된 pD0237-2X 벡터를 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspB 2copy가 포함된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 얻어진 균주들을 각각 KCCM10741P::aspB_2X 및 ATCC21831::aspB_2X로 명명하였다.

실시예 6: aspA 및 aspB 의 발현이 강화된 균주의 제조

상기 실시예 4에서 제작된 pD0237-2X 벡터를 상기 실시예 3에서 제조된 재조합 미생물인 KCCM10741P::aspA_2X 및 ATCC21831::aspA_2X에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspA 및 aspB 2copy가 포함된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 얻어진 균주들을 각각 KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X 및 ATCC21831:: aspA_2X::aspB_2X로 명명하였다.

실시예 7: L-아르기닌 생산능의 평가

상기 실시예 3, 5 및 6에서 제조된 L-아르기닌 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P::aspA_2X, ATCC21831::aspA_2X, KCCM10741P::aspB_2X, ATCC21831::aspB_2X, KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X 및 ATCC21831::aspA_2X::aspB_2X를 이용하여 aspA 강화 또는 aspB 강화 또는 aspA 및 aspB 동시 강화가 L-아르기닌의 생산능에 미치는 영향을 파악하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.

이때, 대조군으로서는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 ATCC21831을 배양하여 사용하였으며, 실시예 1에서와 같은 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 백금이의 균주를 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양종료 후, HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

균주별 아르기닌 생산능의 비교

균주	OD	아르기닌농도(g/L)
KCCM10741P	91	3.0
KCCM10741P::aspA_2X	90	3.9
KCCM10741P::aspB_2X	93	3.4
KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X	93	3.7
ATCC21831	102	4.2
ATCC21831::aspA_2X	102	5.0
ATCC21831::aspB_2X	105	4.7
ATCC21831::aspA_2X::aspB_2X	104	5.1

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, aspA 2copy가 도입된 경우 두 가지 유래 코리네박테리움 글루타미쿰에서 모두 L-아르기닌 생산능이 향상되는 결과를 보였다. 특히 KCCM10741P::aspA_2X의 경우 대조군 대비 L-아르기닌 생산능이 30%로 크게 향상되었으며, 이를 2013년 01월 21일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11351P로 기탁하였다.

실시예 8: 에스케리키아 속 유래 aspA 도입 벡터의 제작

에스케리키아 속 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 유전자인 aspA(NCBI-GeneID: 12933698)를 L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내부에 도입하기 위하여 글루타메이트 엑스포터(glutamate exporter)로 알려져 있는 Ncgl1221 부위(site)를 이용하였다(yggB: Appl Environ Microbiol. 2007 Jul;73(14):4491-8).

Ncgl1221 부위에 에스케리키아 속 유래의 aspA가 도입된 벡터를 제작하기 위하여 우선, Ncgl1221의 부위 특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 포함하는 pDKO1221 벡터를 제작하였다.

Ncgl1221의 부위 특이적 유전자가 소실된 DNA 단편을 확보하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831의 염색체를 추출하였고, 이 염색체를 주형(template)으로 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 60초간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 EcoRI 제한효소 자리를 가진 약 789 bp의 단편을 증폭하였다. 두 번째로 서열번호 15와 16의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 3' 영역에 PstI 제한효소 자리를 가진 약 835 bp 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAll^R Expin^TM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 교차 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.

상기 내부적 Ncgl1221의 내부적 유전자 소실을 포함하는 DNA 단편을 확보하기 위해 서열번호 13과 16의 프라이머를 이용해 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 기재된 PCR 법을 통하여 약 1602 bp 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 EcoRI 과 PstI으로 처리한 후, 같은 제한 효소로 처리된 pD 벡터와 라이게이션을 통해 pDKO1221 벡터를 제작하였다.

상기 제작된 pDKO1221 벡터를 이용하여 에스케리키아 속 aspA 가 도입된 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 작동하는 cj7 프로모터(cj7 promoter)는 p117 pcj7-gfp(대한민국 특허출원 제10-2004-0107215호)를 주형으로 서열번호 17과 18의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 524 bp의 단편을 증폭하였다. 에스케리키아 속 aspA는 에스케리키아 콜리 W3110 염색체를 카이젠 사의 게노믹-팁 시스템(QIAGEN Genomic-tip system)을 이용하여 추출하였고, 이 염색체를 주형으로 서열번호 19와 20의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR법을 통하여 3' 영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1607 bp의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAll^R Expin^TM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 교차 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.

상기 에스케리키아 속 유래 aspA 의 DNA 단편을 확보하기 위해 서열번호 17과 20의 프라이머를 이용해 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 기재된 PCR 법을 통하여 약 2095 bp 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI 과 XbaI으로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDKO1221 벡터와 라이게이션을 통해 pDKO1221-EC_aspA 벡터를 제작하였다.

실시예 9: 에스케리키아 속 유래 aspA 의 발현이 강화된 재조합 균주의 제조

상기 제작된 pDKO1221-EC_aspA 벡터를 L-아르기닌 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 ATCC21831에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 에스케리키아 속 유래 aspA 유전자가 포함된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 얻어진 균주 각각을 KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA 및 ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA로 명명하였다. 또한, 상기 제작된 pDKO1221 벡터를 L-아르기닌 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 ATCC21831에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 NCgl1221이 결실된 KCCM10741PΔNcgl1221 및 ATCC21831ΔNcgl1221 균주를 얻었다.

실시예 10: 에스케리키아 속 유래 aspA 의 발현이 강화된 재조합 균주의 L-아르기닌 생산능 평가

상기 실시예 9에서 제조된 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA 및 ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA를 이용하여 대장균 유래 aspA의 도입이 L-아르기닌 생산능에 미치는 영향을 파악하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.

이때 대조군으로서는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, ATCC21831, KCCM10741PΔNcgl1221 및 ATCC21831ΔNcgl1221을 배양하여 사용하였으며, 생산 배지(주1) 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 1백금이의 균주를 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양종료 후 HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

아르기닌 생산능의 비교

균주	OD	아르기닌농도(g/L)
KCCM10741P	91	3.0
KCCM10741PΔNcgl1221	90	3.0
KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA	94	3.6
ATCC21831	102	4.2
ATCC21831ΔNcgl1221	103	4.1
ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA	107	4.7

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 에스케리키아 속 유래 aspA가 도입된 경우에도 두 가지 유래의 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-아르기닌 생산능이 향상됨을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11351P

20130121

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> MICROORGANISM OF THE GENUS CORYNEBACTERIUM WITH ENHANCED L-ARGININE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING L-ARGININE USING THE SAME <130> PA15-0112 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA deletion <400> 1 cgagctcggt acccggggtg tcgcagatgc catcgccg 38 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA deletion <400> 2 cgccaatgac tggctccatg accgcacgaa gggtgtgcac cccg 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA deletion <400> 3 cggggtgcac acccttcgtg cggtcatgga gccagtcatt ggcg 44 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA deletion <400> 4 tgcaggtcga ctctagagtt cttgcggtga ccgccacg 38 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA 2 copy <400> 5 cgagctcggt acccgggttt taactacccc cg 32 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA 2 copy <400> 6 gtcgactcta gaggatccgg ccatatagtc tgctcc 36 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA 2 copy <400> 7 ttttggatcc ttttaactac cccc 24 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspA 2 copy <400> 8 gcaggtcgac tctagacggc catatagtct gc 32 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspB 2 copy <400> 9 ccagtgaatt cgagctcggt acccgggagc tagaacggct gc 42 <210> 10 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspB 2 copy <400> 10 ctagctcata tgataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatgtat 60 tcactctagc tagcg 75 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspB 2 copy <400> 11 cgttttatca tatgagctag aacggctgca acacatgg 38 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aspB 2 copy <400> 12 gcctgcaggt cgacactagt gtattcactc tagctagc 38 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggb deletion <400> 13 cggaattcga ggaatagagc gggtcataca 30 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggb deletion <400> 14 gtttctagag ccgggatcct tgataatacg catggccag 39 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggb deletion <400> 15 caaggatccc ggctctagaa acgatggaat ctagcgtcga a 41 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggb deletion <400> 16 aaaactgcag ctttctgttt gtgttgtatt ccc 33 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggB::Pcj7-aspA_EC <400> 17 gcgtattatc aaggatcctt ccttcaggct aatctt 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggB::Pcj7-aspA_EC <400> 18 acgaatgttg tttgacatat gtgtttcctt tcgttg 36 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggB::Pcj7-aspA_EC <400> 19 caacgaaagg aaacacatat gtcaaacaac attcgt 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yggB::Pcj7-aspA_EC <400> 20 cgacgctaga ttccatcgtt tctagaaact agcata 36 <210> 21 <211> 526 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 21 Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Thr 1 5 10 15 Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu 20 25 30 Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro 35 40 45 Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly 50 55 60 Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg 65 70 75 80 Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro 85 90 95 Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala 100 105 110 Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val 115 120 125 Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Glu Arg Cys Met Asp Gln Phe 130 135 140 Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn 145 150 155 160 Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu 165 170 175 Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser 180 185 190 Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr 195 200 205 Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala 210 215 220 Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg 225 230 235 240 Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg 245 250 255 Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala 260 265 270 Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr 275 280 285 Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu 305 310 315 320 Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys 325 330 335 Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu 340 345 350 Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg 355 360 365 Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro 370 375 380 Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr 385 390 395 400 Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu 405 410 415 Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn 420 425 430 Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn 435 440 445 Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr 450 455 460 Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys 465 470 475 480 Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys 485 490 495 Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn 500 505 510 Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn 515 520 525 <210> 22 <211> 478 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu 1 5 10 15 Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu 20 25 30 Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val 35 40 45 Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu 50 55 60 Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys 65 70 75 80 Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp 85 90 95 Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu 100 105 110 Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu 115 120 125 Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr 130 135 140 Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu 145 150 155 160 Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg 165 170 175 Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu 180 185 190 Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser 195 200 205 Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn 225 230 235 240 Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val 245 250 255 Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser 260 265 270 Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala 275 280 285 Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly 290 295 300 Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly 305 310 315 320 Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val 325 330 335 Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met 340 345 350 Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile 355 360 365 Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr 370 375 380 Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val 385 390 395 400 Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn 405 410 415 Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala 420 425 430 Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu 435 440 445 Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His 450 455 460 Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln 465 470 475 <210> 23 <211> 1581 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 23 atgtctaaga cgagcaacaa gtcttcagca gactcaaaga atgacgcaaa agccgaagac 60 attgtgaacg gcgagaacca aatcgccacg aatgagtcgc agtcttcaga cagcgctgca 120 gtttcggaac gtgtcgtcga accaaaaacc acggttcaga aaaagttccg aatcgaatcg 180 gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca cacccttcgt 240 gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga tttcattcgc 300 ggcatggtcc aggtgaaaaa ggccgcagct ttagcaaacc gccgactgca cacacttcca 360 gcacaaaaag cagaagcaat tgtctgggct tgtgatcaga tcctcattga ggaacgctgt 420 atggatcagt tccccatcga tgtgttccag ggtggcgcag gtacctcact gaacatgaac 480 accaacgagg ttgttgccaa ccttgcactt gagttcttag gccatgaaaa gggcgagtac 540 cacatcctgc accccatgga tgatgtgaac atgtcccagt ccaccaacga ttcctaccca 600 actggtttcc gcctgggcat ttacgctgga ctgcagaccc tcatcgctga aattgatgag 660 cttcaggttg cgttccgcca caagggcaat gagtttgtcg acatcatcaa gatgggccgc 720 acccagttgc aggatgctgt tcccatgagc ttgggcgaag agttccgagc attcgcgcac 780 aacctcgcag aagagcagac cgtgctgcgt gaagctgcca accgtctcct cgaggtcaat 840 cttggtgcaa ccgcaatcgg tactggtgtg aacactccag caggctaccg ccaccaggtt 900 gtcgctgctc tgtctgaggt caccggactg gaactaaagt ccgcacgtga tctcatcgag 960 gctacctctg acaccggtgc atatgttcat gcgcactccg caatcaagcg tgcagccatg 1020 aaactgtcca agatctgtaa cgatctacgt ctgctgtctt ctggtcctcg tgctggcttg 1080 aacgaaatca acctgccacc acgccaggct ggttcctcca tcatgccagc caaggtcaac 1140 ccagtgatcc cagaagtggt caaccaggtc tgcttcaagg tcttcggtaa cgatctcacc 1200 gtcaccatgg ctgcggaagc tggccagttg cagctcaacg tcatggagcc agtcattggc 1260 gaatccctct tccagtcact gcgcatcctg ggcaatgcag ccaagacttt gcgtgagaag 1320 tgcgtcgtag gaatcaccgc caacgctgat gtttgccgtg cttacgttga taactccatc 1380 gggattatca cttacctgaa cccattcctg ggccacgaca ttggagatca gatcggtaag 1440 gaagcagccg aaactggtcg accagtgcgt gaactcatcc tggaaaagaa gctcatggat 1500 gaaaagacgc tcgaggcagt cctgtccaag gagaacctca tgcacccaat gttccgcgga 1560 aggctctact tggagaacta a 1581 <210> 24 <211> 1437 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 24 atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60 gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120 atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180 gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240 gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300 ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360 ctgatgggtc accaaaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420 tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttccctg 480 attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540 ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600 ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa catccaacgt 660 accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggtgcaacag caatcggtac tggtctgaac 720 acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagttac tggcttccca 780 tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgttatggtt 840 cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900 ctctcttcag gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960 tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020 ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080 ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgttcg aatccgttca cattctgacc 1140 aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200 tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260 caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320 gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380 aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437 <210> 25 <211> 426 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 25 Met Ser Ser Val Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ala Glu Arg Ile Gly Leu 1 5 10 15 Phe His Glu Asp Ile Lys Arg Lys Phe Asp Glu Leu Lys Ser Lys Asn 20 25 30 Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asp 35 40 45 Phe Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Pro Gly Lys Gly Asp Phe Lys Ala 50 55 60 Ala Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly Gly Leu Asp Gly Ile Val 65 70 75 80 Asp Ile Arg Gln Ile Trp Ala Asp Leu Leu Gly Val Pro Val Glu Gln 85 90 95 Val Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asn Ile Met Phe Asp Val Ile 100 105 110 Ser Trp Ser Tyr Ile Phe Gly Asn Asn Asp Ser Val Gln Pro Trp Ser 115 120 125 Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp Ile Cys Pro Val Pro Gly Tyr Asp Arg 130 135 140 His Phe Ser Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe Glu Met Ile Ser Val Pro 145 150 155 160 Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Ala Val Glu Glu Leu Val Lys 165 170 175 Asn Pro Gln Val Lys Gly Met Trp Val Val Pro Val Phe Ser Asn Pro 180 185 190 Thr Gly Phe Thr Val Thr Glu Asp Val Ala Lys Arg Leu Ser Ala Met 195 200 205 Glu Thr Ala Ala Pro Asp Phe Arg Val Val Trp Asp Asn Ala Tyr Ala 210 215 220 Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu Val Ile Asp Ile Val Gly 225 230 235 240 Leu Gly Glu Ala Ala Gly Asn Pro Asn Arg Phe Trp Ala Phe Thr Ser 245 250 255 Thr Ser Lys Ile Thr Leu Ala Gly Ala Gly Val Ser Phe Phe Leu Thr 260 265 270 Ser Ala Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Thr Gly His Ala Gly Ile Arg Gly 275 280 285 Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gln Leu Ala His Ala Arg Tyr Phe Gly 290 295 300 Asp Ala Glu Gly Val Arg Ala Val Met Arg Lys His Ala Ala Ser Leu 305 310 315 320 Ala Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile Leu Asp Ser Arg Leu Ala 325 330 335 Glu Tyr Gly Val Ala Gln Trp Thr Val Pro Ala Gly Gly Tyr Phe Ile 340 345 350 Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Ala Ser Arg Val Ala Glu Leu Ala 355 360 365 Lys Glu Ala Gly Ile Ala Leu Thr Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Pro Leu 370 375 380 Arg Gln Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg Leu Ala Pro Ser Leu Pro 385 390 395 400 Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Ala Met Asp Gly Val Ala Thr Cys Val 405 410 415 Leu Leu Ala Ala Ala Glu His Tyr Ala Asn 420 425 <210> 26 <211> 1281 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 26 atgagttcag tttcgctgca ggattttgat gcagagcgaa ttggtttgtt ccacgaggac 60 attaagcgca agtttgatga gctcaagtca aaaaatctga agctggatct tactcgcggt 120 aagccttcgt cggagcagtt ggatttcgct gatgagttgt tggcgttgcc tggtaagggt 180 gatttcaagg ctgcggatgg tactgatgtc cgtaactatg gcgggctgga tggcatcgtt 240 gatattcgcc agatttgggc ggatttgctg ggtgttcctg tggagcaggt cttggcgggg 300 gatgcttcga gcttgaacat catgtttgat gtgatcagct ggtcgtacat tttcggtaac 360 aatgattcgg ttcagccttg gtcgaaggaa gaaaccgtta agtggatttg ccctgttccg 420 ggctatgatc gccatttctc catcacggag cgtttcggct ttgagatgat ttctgtgcca 480 atgaatgaag acggccctga tatggatgct gttgaggaat tggtgaagaa tccgcaggtt 540 aagggcatgt gggttgttcc ggtgttttct aacccgactg gtttcacggt gacagaagac 600 gtcgcaaagc gtctaagcgc aatggaaacc gcagctccgg acttccgcgt tgtgtgggat 660 aatgcctacg ccgttcatac gctgaccgat gaattccctg aggttatcga tatcgtcggg 720 cttggtgagg ccgctggcaa cccgaaccgt ttctgggcgt tcacttctac ttcgaagatc 780 actctcgcgg gtgcgggcgt gtcgttcttc ctcacctctg cggagaaccg caagtggtac 840 accggccatg cgggtatccg tggcattggc cctaacaagg tcaatcagtt ggctcatgcg 900 cgttactttg gcgatgctga gggagtgcgc gcggtgatgc gtaagcatgc tgcgtcgttg 960 gctccgaagt tcaacaaggt tctggagatt ctggattctc gccttgctga gtacggtgtc 1020 gcgcagtgga ctgtccctgc gggcggttac ttcatttccc ttgatgtggt tcctggtacg 1080 gcgtctcgcg tggctgagtt ggctaaggaa gccggcatcg cgttgacggg tgcgggttct 1140 tcttacccgc tgcgtcagga tccggagaac aaaaatctcc gtttggcacc gtcgctgcct 1200 ccagttgagg aacttgaggt tgccatggat ggcgtggcta cctgtgtgct gttggcagca 1260 gcggagcatt acgctaacta a 1281

Claims

아스파테이트 암모니아 리아제(aspartate ammonia-lyase)의 활성이 강화된 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물로서,
상기 활성 강화는 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법 및 프로모터에 변이를 도입하는 방법 중에 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 활성강화된 것을 특징으로 하는 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물 유래인 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,
아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase)의 활성이 추가로 강화된 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물로서,
상기 활성 강화는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법 및 프로모터에 변이를 도입하는 방법 중에 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 활성강화된 것을 특징으 로하는 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
제4항에 있어서,
상기 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 서열번호 25로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 L-아르기닌을 분리하는 단계
를 포함하는 L-아르기닌을 생산하는 방법.