JP6463806B2 - Ｌ−アルギニン産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ−アルギニンの産生方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−アルギニン産生能が向上した組み換えコリネバクテリウム属微生物およびこの微生物を用いてＬ−アルギニンを産生する方法に関する。

Ｌ−アルギニンは、植物の種子やニンニク中に遊離状態で含有されており、アミノ酸類強化剤としても用いられ、医薬品、食品などにも広く用いられる。医薬用には、肝機能促進剤、脳機能促進剤、男性不妊治療剤、総合アミノ酸製剤などに用いられており、食品用には、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用に最近脚光を浴びている物質である。

コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物は、環状段階経路を通じてＬ−アルギニンの生合成が行われ、Ｌ−アルギニンは、Ｌ−グルタメートからＮ−アセチルグルタメート（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ−アセチルグルタメートセミアルデヒド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）、Ｎ−アセチルオルニチン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）およびアルギノスクシネート（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経て合成される。

また、コリネバクテリウムグルタミクムは、細胞内のアルギニンによってフィードバック阻害を受けることが知られており（Ｖｅｈａｒｙ Ｓａｋａｎｙａｎ， ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４２：９−１０８， １９９６）、高い歩留まりのＬ−アルギニンを産生するのに限界があることが報告されている。

池田らは、アルギニンの発酵に際して発酵培地の上にシトルリンが蓄積されることを報告した（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００９ Ｍａｒ；７５（６）：１６３５−４１． Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊａｎ ９）。

前記生合成過程において、シトルリンはアスパルテートと結合してアルギノスクシネートとなり、フマレートを放出してアルギニンとなる。ここで、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ａｓｐＡ）は、フマレート及びアンモニアからアスパルテートを合成する酵素であり（図１）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｓｐＢ）は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アミノ酪酸などの様々なＬ−アミノ酸からアミノ基をα−ケトグルタル酸、α−ケトイソ吉草酸などのケト酸に転移させることにより様々なＬ−アミノ酸を合成する触媒の機能を有する酵素である。

メンケルらは、大腸菌のａｓｐＡをユリネ型微生物に取り込んだ場合、アスパルテートの利用性が増加してＬ−リシンの産生が増加すると報告した（ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ， Ｍａｒ． １９８９， ｐ． ６８４−６８８）。

そこで、本発明者らは、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ酵素および／またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素酵素の発現を強化させてシトルリンと結合するアスパルテートの流入を増やすことにより、Ｌ−アルギニンの産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。

Ｖｅｈａｒｙ Ｓａｋａｎｙａｎ， ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４２：９−１０８， １９９６ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００９ Ｍａｒ；７５（６）：１６３５−４１． Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊａｎ ９ ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ， Ｍａｒ． １９８９， ｐ． ６８４−６８８

本発明の目的は、Ｌ−アルギニンの産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を用いてＬ−アルギニンを産生する方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼの活性が強化されてＬ−アルギニン産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

また、本発明は、前記コリネバクテリウム属微生物を培養してＬ−アルギニンを産生する方法を提供する。

本発明は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ活性が強化されたり、ここにさらにアスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性が強化されたりしてＬ−アルギニン産生能が向上した組み換えコリネバクテリウム属微生物を提供し、前記組み換えコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−アルギニンを高い歩留まりにて産生することができるので、産業上に有効に利用可能である。

図１は、シトルリンからアルギニンを合成する経路およびフマレートからアスパルテートを合成する経路を示す図である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、Ｌ−アルギニンの産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明において、前記用語「Ｌ−アルギニン産生能（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、本発明のコリネバクテリウム属微生物を培地中において培養するとき、培地中にＬ−アルギニンを蓄積する能力のことをいう。このようなＬ−アルギニン産生能は、コリネバクテリウム属微生物の野生型菌株の特性、または人為的な変異により添加または増強された特性であり得る。

例えば、Ｌ−アルギニンの産生能を与えるために、コリネバクテリウム属微生物は、アルギニンヒドロキサメートに耐性を有するように育種されてもよく、コハク酸に対して栄養要求性を有するか、あるいは、核酸塩基同族体に対して耐性を有するように育種されてもよく、アルギニンを物質代謝させることができず、アルギニン拮抗剤およびカナバニンに耐性を有し、リシンに栄養要求性を有するように育種されてもよく、アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、酵母アルギニン、Ｄ−アルギニンおよびカナバニンに耐性を有するように、または、アルギニンヒドロキサメートおよび６−アザウラシルに耐性を有するように育種されてもよく、カナバニンに耐性を有するように育種されてもよい。

また、Ｌ−アルギニンの産生能は、Ｌ−アルギニン生合成酵素を暗号化させる遺伝子の発現が増進されるようにコリネバクテリウム属微生物を変形して与えてもよい。Ｌ−アルギニン生合成酵素の例としては、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェートリダクターゼ（ａｒｇＣ）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（ａｒｇＢ）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（ａｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ａｒｇＦ）、アルギニノコハク酸合成酵素（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）およびカルバモイルホスフェート酸合成酵素が挙げられる。これらのアルギニン生合成酵素はＡｒｇオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ）の上に存在し、ａｒｇＲにより暗号化されたアルギニンリプレッサーにより調節される（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００２ Ｄｅｃ；１８４（２３）：６６０２−１４．）。このため、アルギニンリプレッサーを弱化させることにより（ＵＳ２００２−００４５２２３）、または前記生合成関係の遺伝子のうちのいずれか一つ以上の遺伝子を過発現させることによりＬ−アルギニン産生能を与えることができる。

本発明において、Ｌ−アルギニン産生能を有するコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−アルギニンを産生する能力を有している限り、特に制限されない。好ましくは、Ｌ−アルギニンを産生し得るコリネバクテリウムグルタミクムであってもよく、さらに好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１（大韓民国特許登録番号０７９１６５９）およびコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１であってもよい。

上記の目的を達成するための一つの態様として、本発明は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼの活性が強化されてＬ−アルギニン産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ａｓｐＡ）は、フマレートおよびアンモニアからアスパルテートを合成する酵素であるため、前記アスパラギン酸アンモニアリアーゼの発現の強化によりアスパルテートの合成が増加され、増加されたアスパルテートによりＬ−アルギニンの産生能が高くなる。

本発明において、前記アスパラギン酸アンモニアリアーゼは、前記活性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来の酵素であっても活用可能であり、好ましくは、エシェリキア属微生物またはユリネ型微生物由来の酵素、さらに好ましくは、大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミクム由来の酵素を活用することができる。前記アスパラギン酸アンモニアリアーゼは、具体的に、配列番号２１または配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し得る。前記配列番号２１のアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属微生物由来のアスパラギン酸アンモニアリアーゼは、配列番号２３に記載の塩基配列を有するａｓｐＡ（ＮＣｇｌ１４４６）により暗号化され、前記配列番号２２のアミノ酸配列を有するエシェリキア属微生物由来のアスパラギン酸アンモニアリアーゼは、配列番号２４に記載の塩基配列を有するａｓｐＡ（ＮＣＢＩＧＥＮＥＩＤ：１２９３３６９８）により暗号化される。

本発明において提示したアスパラギン酸アンモニアリアーゼの活性を有するタンパク質である限り、前記タンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するアスパラギン酸アンモニアリアーゼもまた本発明に含まれる。前記アミノ酸配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ．

Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ［参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプルグラムが開発された［参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ］。

上記の目的を達成するための他の態様として、本発明は、さらに、アスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明において、前記アスパラギン酸アミノ基転移酵素は、コリネバクテリウム属微生物から由来するものであり、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、配列番号２６の塩基配列を有するａｓｐＢ（ＮＣｇｌ０２３７）により暗号化される。

本発明において提示したアスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性を有するタンパク質である限り、前記タンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するアスパラギン酸アミノ基転移酵素もまた本発明に含まれる。上述したように、前記アミノ酸配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏ．

Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ［参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプルグラムが開発された［参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ］。

上記の目的を達成するためのさらに他の態様として、本発明は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼおよびアスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性が両方とも強化されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明は、Ｌ−アルギニン産生能を有するコリネバクテリウム属微生物において、アスパラギン酸アンモニアリアーゼおよび／またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性が本来の活性よりも強化（または、増加）されたことを特徴とする。

前記用語「本来の活性」とは、前記酵素の活性を調節するためのいかなる遺伝的操作や変形がないＬ−アルギニン産生能を有するコリネバクテリウム属微生物が有している活性のことをいう。なお、前記「強化」または「増加」とは、Ｌ−アルギニン産生能がＬ−アルギニン産生能を有するコリネバクテリウム属微生物の本来の活性よりも向上したことをいう。

本発明の活性強化（または、増加）は、当該分野における周知の様々な方法が適用可能である。その方法の例としては、アスパラギン酸アンモニアリアーゼおよび／またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素をコーディングするポリヌクレオチドをベクターシステムに取り込む方法などによりアスパラギン酸アンモニアリアーゼおよび／またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素をコーディングする塩基配列のコピー数を増加させる方法、強いプロモーターに取り替える方法、プロモーターに変異を取り込む方法および遺伝子変異による方法などが挙げられるが、本発明はこれらに何ら限定されない。

一つの具体的な実施形態において、Ｌ−アルギニン産生能を有するコリネバクテリウム属微生物のアスパラギン酸アンモニアリアーゼおよび／またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性を強化させるために、アスパラギン酸アンモニアリアーゼおよび／またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素を暗号化させる遺伝子をベクターに取り込み、コリネバクテリウム属微生物を形質転換させることにより前記遺伝子のコピー数を増加させる方法が使用可能である。

本発明において、前記用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に取り込んで宿主細胞内において前記ポリヌクレオチドが暗号化させるタンパク質が発現できるようにすることをいう。取り込まれたポリヌクレオチドは、宿主細胞内において発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置してもよく、染色体外に位置してもよい。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現可能なものである限り、いかなる形で取り込まれても構わない。

本発明の実施形態においては、前記遺伝子を含む組み換えベクターを宿主微生物に取り込んで形質転換された微生物を製造し、２次交差過程を経て前記遺伝子を染色体内に２コピー含むＬ−アルギニン産生菌株を分離した。

本発明において、前記用語「ベクター」とは、好適な宿主内において目的タンパク質を発現させるように好適な調節配列に作動可能なように連結された前記目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物のことをいう。前記調節配列は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列および転写および解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに取り込まれ得る。

本発明において用いられるベクターは、宿主中において複製可能なものであれば、特に制限がなく、当業界において周知の任意のベクターが使用可能である。通常的に用いられるベクターの例としては、天然状態あるいは組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルスおよびバクテリオファージが挙げられる。

本発明の方法により形質転換されたコリネバクテリウムグルタミクム（ＫＣＣＭ１１３５１Ｐ）菌株は、Ｌ−アルギニンの産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１の染色体からＰＣＲにより得られたアスパラギン酸アンモニアリアーゼをコーディングするａｓｐＡをベクターに挿入した後、Ｌ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐに取り込むことにより、ａｓｐＡの発現を増加させた形質転換済み微生物である。本発明による方法により形質転換された前記菌株ＫＣＣＭ１１３５１Ｐは、ａｓｐＡの過発現を通じてＬ−アルギニンを高い歩留まりにて産生することができるということを確認した。

上記の目的を達成するための一つの態様として、本発明はまた、前記形質転換済みコリネバクテリウム属微生物を培養してＬ−アルギニンを産生する方法を提供する。

本発明のＬ−アルギニンを製造する方法において、前記形質転換済みＬ−アルギニン過発現微生物の培養過程は、当業界において周知の適当な培地および培養条件により行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて手軽に調整して用いることができる。前記培養方法の例には、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）および流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような様々な培養方法は、例えば、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」 （Ｊａｍｅｓ Ｍ． Ｌｅｅ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ， ｐｐ１３８−１７６， １９９１）などに開示されている。

本発明において用いられる培地は、原糖若しくは葡萄糖を主な炭素源として用い、原糖を多量含む糖蜜もまた炭素源として使用可能であり、その他の適正量の炭素源は様々に利用可能であり、好ましくは、精製葡萄糖を用いる。使用可能な窒素源の例としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液および大豆麦などの有機窒素源およびヨウ素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が挙げられ、好ましくは、ペプトンを用いる。これらの窒素源は、単独でまたは組み合わせて使用可能である。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムおよび対応するナトリウム含有塩が含まれ得る。なお、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含み得る。これらに加えて、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが含まれ得る。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式により添加可能である。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を培養物に適切な方式を用いて添加して、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えることができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、普通、２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃である。培養期間は、所望のＬ−アルギニン産生量が得られるまで続き、好ましくは、１０〜１６０時間である。

培養物からのＬ−アルギニンの分離は、当業界において周知の通常の方法により行われる。このような分離方法としては、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィおよび結晶化などの方法が用いられる。例えば、培養物を低速にて遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィを用いて分離することができる。

以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることはない。

実施例１：Ｌ−アルギニン産生におけるａｓｐＡ遺伝子の影響の確認
ａｓｐＡがＬ−アルギニン産生に主な遺伝子であるか否かを確認するために、ａｓｐＡ欠損ベクターを製作し、Ｌ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（大韓民国特許登録第０７９１６５９号）に形質転換してＬ−アルギニン産生能を評価した。

（１）ａｓｐＡ欠損ベクターの製作
染色体においてアスパラギン酸アンモニアリアーゼをコーディングする遺伝子であるａｓｐＡ（Ｎｃｇｌ１４４６）遺伝子を欠失させるために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステム（ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて米国生物資源センター（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から購買したコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１の染色体を抽出し、この染色体を鋳型として交差ＰＣＲを行った。

具体的に、配列番号１および２のプライマーを用いて９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニ−リング、７２℃で６０秒間重合する条件をＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ法を用いて、５’領域にＸｍａＩ制限酵素部位を有する約７９８ｂｐの断片を増幅した。その後、配列番号３および４のプライマーを用いて、前記ＰＣＲ法により３’領域にＸｂａＩ制限酵素部位を有する約８２９ｂｐ塩基対の断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭ ＧＥＬ ＳＶキット（韓国ソウル）で分離した後、交差ＰＣＲのための鋳型として用いた。

前記ａｓｐＡの欠失を含むＤＮＡ断片を確保するために、配列番号１および４のプライマーを用いて上記のようにして得た二つのＤＮＡ断片を鋳型として交差ＰＣＲを行った。具体的に、前記ＰＣＲ法を用いて約１５８３ｂｐ断片を増幅した。増幅された断片は、制限酵素ＸｍａＩおよびＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＤベクターと結さつしてベクターｐＤＫＯ１４４６を製作した。

（２）組み換え菌株の製造
前記製作されたｐＤＫＯ１４４６ベクターをＬ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上においてａｓｐＡが欠失したＬ−アルギニン産生菌株を得た。選別された菌株をＫＣＣＭ１０７４１ΔａｓｐＡと命名した。

（３）組み換え菌株のＬ−アルギニン産生能の確認
前記製造された組み換えＬ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１ΔａｓｐＡを用いてａｓｐＡの欠失がＬ−アルギニン産生能に及ぼす影響を把握するために下記の方法を用いて培養した。

このとき、対照群としては、宿主細胞であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐを培養して用い、産生培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１白金耳の菌株を接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍにて培養した。培養が終わった後、ＨＰＬＣを用いてＬ−アルギニンの産生量を測定し、その結果を下記表１に示す。

＜産生培地＞
葡萄糖６％、硫酸アンモニウム３％、第１のリン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．２％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ１％、酵母エキス０．５％、ビオチン１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２

前記表１に示すように、ａｓｐＡが欠損した菌株は、Ｌ−アルギニンの産生能が低下するということを確認し、ａｓｐＡがＬ−アルギニンの産生に当たって主な遺伝子であることを確認した。

実施例２：コリネバクテリウム由来のａｓｐＡを取り込んだベクターの製作
コリネバクテリウム由来のアスパラギン酸アンモニアリアーゼをコーディングする遺伝子であるａｓｐＡ（Ｎｃｇｌ１４４６）の２コピーベクターを製作するために、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１染色体を鋳型として配列番号５および６のプライマー、配列番号７および８のプライマーを用いてＰＣＲを行ってａｓｐＡがそれぞれ含まれているＤＮＡ断片を確保した。

具体的に、配列番号５および６のプライマーを用いて９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で２分間重合する条件をＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ法を用いて、５’領域にＸｍａＩおよび３’領域にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する約１８９３ｂｐの断片を増幅した。二番目に、配列番号７および８のプライマーを用いて、前記ＰＣＲ法により５’領域にＢａｍＨＩおよび３’領域にＸｂａＩ制限酵素部位を有する約１８８５ｂｐ塩基対の断片を増幅した。

得られたＤＮＡ断片はＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭ ＧＥＬ ＳＶキット（韓国ソウル）で分離した後、最初の断片はＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、二番目の断片はＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで処理し、ｐＤベクターはＸｍａＩおよびＸｂａＩで処理した。制限酵素が処理されたｐＤベクターおよび二つのＤＮＡ断片を結さつしてｐＤ１４４６−２Ｘベクターを製作した。

実施例３：ａｓｐＡの発現が強化された組み換え菌株の製造
前記実施例２において製作されたｐＤ１４４６−２ＸベクターをＬ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１ＰおよびコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１にそれぞれ形質転換し、２次交差過程を経て染色体上においてａｓｐＡが２コピー含まれているＬ−アルギニン産生菌株を得た。得られた菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＡ＿２ＸおよびＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＡ＿２Ｘと命名した。

実施例４：コリネバクテリウム由来のａｓｐＢが取り込まれたベクターの製作
アスパラギン酸アミノ基転移酵素をコーディングする遺伝子であるａｓｐＢ（Ｎｃｇｌ０２３７）２コピーベクターを製作するために、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１染色体を鋳型として配列番号９および１０のプライマー、配列番号１１および１２のプライマーを用いてＰＣＲを行ってａｓｐＢがそれぞれ含まれているＤＮＡ断片を確保した。

具体的に、配列番号９および１０のプライマーを用いて、９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で２分間重合する条件をＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ法を用いて、５’領域にＸｍａＩおよび３’領域にＮｄｅＩ制限酵素部位を有する約１６９２ｂｐの断片を増幅した。二番目に、配列番号１１および１２のプライマーを用いて、前記ＰＣＲ法により５’領域にＮｄｅＩおよび３’領域にＳｐｅＩ制限酵素部位を有する約１６４３ｂｐの断片を増幅した。

得られたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭ ＧＥＬ ＳＶキット（韓国ソウル）で分離した後、最初の断片はＸｍａＩおよびＮｄｅＩで処理し、二番目の断片はＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで処理し、ｐＤベクターは、ＸｍａＩおよびＸｂａＩで処理した。制限酵素が処理されたｐＤベクターおよび二つのＤＮＡ断片を３断片結さつしてｐＤ０２３７−２Ｘベクターを製作した。

実施例５：ａｓｐＢの発現が強化された菌株の製造
前記実施例４において製作されたｐＤ０２３７−２ＸベクターをＬ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１にそれぞれ形質転換し、２次交差過程を経て染色体上においてａｓｐＢが２コピー含まれているＬ−アルギニン産生菌株を得た。得られた菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＢ＿２ＸおよびＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＢ＿２Ｘと命名した。

実施例６：ａｓｐＡおよびａｓｐＢの発現が強化された菌株の製造
前記実施例４において製作されたｐＤ０２３７−２Ｘベクターを前記実施例３において製造された組み換え微生物であるＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＡ＿２ＸおよびＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＡ＿２Ｘにそれぞれ形質転換し、２次交差過程を経て染色体上においてａｓｐＡおよびａｓｐＢが２コピー含まれているＬ−アルギニン産生菌株を得た。得られた菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＡ＿２Ｘ：：ａｓｐＢ＿２ＸおよびＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＡ＿２Ｘ：：ａｓｐＢ＿２Ｘと命名した。

実施例７：Ｌ−アルギニン産生能の評価
前記実施例３、５および６において製造されたＬ−アルギニン産生菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＡ＿２Ｘ、ＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＡ＿２Ｘ、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＢ＿２Ｘ、ＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＢ＿２Ｘ、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＡ＿２Ｘ：：ａｓｐＢ＿２ＸおよびＡＴＣＣ２１８３１：：ａｓｐＡ＿２Ｘ：：ａｓｐＢ＿２Ｘを用いて、ａｓｐＡ強化またはａｓｐＢ強化またはａｓｐＡおよびａｓｐＢ同時強化がＬ−アルギニンの産生能に及ぼす影響を把握するために下記の方法を用いて培養した。

このとき、対照群としては、宿主細胞であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１ＰおよびＡＴＣＣ２１８３１を培養して用い、実施例１における産生培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコナーバッフルフラスコに１白金耳の菌株を接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍにて培養した。培養が終わった後、ＨＰＬＣを用いてＬ−アルギニンの産生量を測定し、その結果を下記表２に示す。

前記表２に示すように、ａｓｐＡが２コピー取り込まれた場合、二つの由来コリネバクテリウムグルタミクムにおいて両方ともＬ−アルギニン産生能が向上する結果を示した。特に、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ：：ａｓｐＡ＿２Ｘの場合に、対照群に比べてＬ−アルギニン産生能が３０％と大幅に向上し、これを２０１３年０１月２１日付けで大韓民国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１-２２１番地に所在する国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１３５１Ｐで寄託した。

実施例８：エシェリキア属由来のａｓｐＡが取り込まれたベクターの製作
エシェリキア属由来のアスパラギン酸アンモニアリアーゼをコーディングする遺伝子であるａｓｐＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３６９８）をＬ−アルギニン産生能を有するコリネバクテリウムグルタミクムの染色体の内部に取り込むために、グルタメートエキスポーターとして知られているＮｃｇｌ１２２１部位（ｓｉｔｅ）を用いた（ｙｇｇＢ： Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００７ Ｊｕｌ；７３（１４）：４４９１−８）。

Ｎｃｇｌ１２２１部位にエシェリキア属由来のａｓｐＡが取り込まれたベクターを製作するために、まず、Ｎｃｇｌ１２２１の部位特異的な遺伝子欠失を含むｐＤＫＯ１２２１ベクターを製作した。

Ｎｃｇｌ１２２１の部位特異的な遺伝子が消失されたＤＮＡ断片を確保するために、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１８３１の染色体を抽出し、この染色体を鋳型として交差ＰＣＲを行った。具体的に、配列番号１３および１４のプライマーを用いて、９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間重合する条件をＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ法を用いて、５’領域にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有する約７８９ｂｐの断片を増幅した。二番目に、配列番号１５および１６のプライマーを用いて、前記ＰＣＲ法により３’領域にＰｓｔＩ制限酵素部位を有する約８３５ｂｐ塩基対の断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭ ＧＥＬ ＳＶキット（韓国ソウル）で分離した後、交差ＰＣＲのための鋳型として用いた。

前記内部的Ｎｃｇｌ１２２１の内部的な遺伝子消失を含むＤＮＡ断片を確保するために、配列番号１３および１６のプライマーを用いて、上記のようにして得た二つのＤＮＡ断片を鋳型として交差ＰＣＲを行った。具体的に、前記ＰＣＲ法を用いて約１６０２ｂｐ断片を増幅した。増幅された断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで処理した後、同じ制限酵素で処理されたｐＤベクターと結さつしてｐＤＫＯ１２２１ベクターを製作した。

前記製作されたｐＤＫＯ１２２１ベクターを用いて、エシェリキア属ａｓｐＡが取り込まれたベクターを製作した。コリネバクテリウムグルタミクムにおいて作動するｃｊ７プロモーターは、ｐ１１７ ｐｃｊ７−ｇｆｐ（大韓民国特許出願第１０−２００４−０１０７２１５号）を鋳型として配列番号１７および１８のプライマーを用いて９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間重合する条件をＰｆｕポリメラーゼで３０回繰り返し行うＰＣＲ法を用いて５’領域にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する約５２４ｂｐの断片を増幅した。エシェリキア属ａｓｐＡは、エシェリキアコリＷ３１１０染色体をキアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いて抽出し、この染色体を鋳型として配列番号１９および２０のプライマーを用いて前記ＰＣＲ法を用いて３’領域にＸｂａＩ制限酵素部位を有する約１６０７ｂｐの断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ^ＴＭ ＧＥＬ ＳＶキット（韓国ソウル）で分離した後、交差ＰＣＲのための鋳型として用いた。

前記エシェリキア属由来ａｓｐＡのＤＮＡ断片を確保するために、配列番号１７および２０のプライマーを用いて、上記のようにして得た二つのＤＮＡ断片を鋳型として交差ＰＣＲを行った。具体的に、前記ＰＣＲ法を用いて約２０９５ｂｐ断片を増幅した。増幅された断片は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで処理した後、同じ酵素で処理されたｐＤＫＯ１２２１ベクターと結さつしてｐＤＫＯ１２２１−ＥＣ＿ａｓｐＡベクターを製作した。

実施例９：エシェリキア属由来ａｓｐＡの発現が強化された組み換え菌株の製造
前記製作されたｐＤＫＯ１２２１−ＥＣ＿ａｓｐＡベクターをＬ−アルギニン産生菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１ＰおよびＡＴＣＣ２１８３１に形質転換し、２次交差過程を経て染色体上においてエシェリキア属由来ａｓｐＡ遺伝子が含まれているＬ−アルギニン産生菌株を得た。得られた菌株のそれぞれをＫＣＣＭ１０７４１ＰΔＮｃｇｌ１２２１−ＥＣ＿ａｓｐＡおよびＡＴＣＣ２１８３１ΔＮｃｇｌ１２２１−ＥＣ＿ａｓｐＡと命名した。また、前記製作されたｐＤＫＯ１２２１ベクターをＬ−アルギニン産生菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１ＰおよびＡＴＣＣ２１８３１に形質転換し、２次交差過程を経て染色体上においてＮＣｇｌ１２２１が欠失したＫＣＣＭ１０７４１ＰΔＮｃｇｌ１２２１およびＡＴＣＣ２１８３１ΔＮｃｇｌ１２２１菌株を得た。

実施例１０：エシェリキア属由来ａｓｐＡの発現が強化された組み換え菌株のＬ−アルギニン産生能の評価
前記実施例９において製造されたＬ−アルギニン産生菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１ＰΔＮｃｇｌ１２２１−ＥＣ＿ａｓｐＡおよびＡＴＣＣ２１８３１ΔＮｃｇｌ１２２１−ＥＣ＿ａｓｐＡを用いて、大腸菌由来のａｓｐＡの取り込みがＬ−アルギニン産生能に及ぼす影響を把握するために、下記のような方法を用いて培養した。

このとき、対照群としては、宿主細胞であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ、ＡＴＣＣ２１８３１、ＫＣＣＭ１０７４１ＰΔＮｃｇｌ１２２１およびＡＴＣＣ２１８３１ΔＮｃｇｌ１２２１を培養して用い、産生培地（注１）２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコナーバッフルフラスコに１白金耳の菌株を接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍにて培養した。培養が終わった後、ＨＰＬＣを用いてＬ−アルギニンの産生量を測定し、その結果を下記表３に示す。

前記表３に示すように、エシェリキア属由来のａｓｐＡが取り込まれた場合にも、二つの由来のコリネバクテリウムグルタミクムにおいてＬ−アルギニン産生能が向上するということを確認することができた。

以上の説明から、本発明が属する技術分野における当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態にて実施可能であるということが理解できる筈である。これと関連して、上述した実施形態はあらゆる面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲並びにその等価概念から導き出されるあらゆる変更例または変形例が本発明の範囲に含まれるものと解釈さるべきである。

［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（海外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３５１Ｐ
受託日：２０１３年０１月２１日
［受託証の写し］

Claims (5)

1. アスパラギン酸アンモニアリアーゼ及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素の活性が強化された、Ｌ−アルギニン産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を培養培地で培養するステップと、
   前記培養によって得られる培養培地からＬ−アルギニンを分離するステップと、
   を含む、Ｌ−アルギニンを産生する方法。
2. 前記アスパラギン酸アンモニアリアーゼは、コリネバクテリウム属微生物またはエシェリキア属微生物に由来するものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記アスパラギン酸アンモニアリアーゼは、配列番号２１または配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記アスパラギン酸アミノ基転移酵素は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミクムである、請求項１に記載の方法。