CN108866028B - 一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用。本发明保护的蛋白质，是将序列表中序列2所示的蛋白质第187‑326位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的。本发明还保护利用所述蛋白质制备(R)1‑丙基(2‑氨基)甲酸的方法。本发明所提供的蛋白质具有较高的氨基裂解酶活性，同时可以催化以反式2‑丁烯酸为底物的加氨反应，生产(R)1‑丙基(2‑氨基)甲酸，产率高且满足100％立体选择性的要求，具有非常广阔的应用前景。

Description

一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
光学纯的(R)1-丙基(2-氨基)甲酸及其衍生物是一类广泛应用于化工产品、食品、原料药合成中的重要化学原料。目前生产(R)1-丙基(2-氨基)甲酸及其衍生物的方法主要有化学合成法和化学合成与生物酶催化结合的方法。
生物酶转化法主要由脱羧酶制备，由于其原料价格较高，并且原料利用率较低导致生产成本相对较高。化学合成法工艺复杂、反应过程大量使用有毒有机溶剂，环境污染大，反应条件剧烈，整体收率低，立体选择性低，生产成本也处在较高水平。
光学纯的氨基醇类化合物是原料药度鲁特韦的一个重要原料，通过化学合成法难于合成光学纯(R)1-丙基(2-氨基)甲醇，反应步骤多、收率低、立体选择性差等原因导致成本高昂不易实现工业化。光学纯的(R)1-丙基(2-氨基)甲酸可作为其上游原料，其手性中心在光学纯的制药原料合成中具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供了一种蛋白质，是将序列表中序列2所示的蛋白质(自N端)第187-326位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的。
所述蛋白质是将序列表中序列2所示的蛋白质(自N端)第187位氨基酸残基、第321位氨基酸残基、第324位氨基酸残基和第326位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的。
所述蛋白质具体可为如下(a1)-(a34)中的任一种：
(a1)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a3)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为I，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a4)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下三个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a5)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a6)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为V，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a7)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为V，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a8)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为C，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a9)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a10)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a11)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下三个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a12)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下三个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a13)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a14)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为C，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a15)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a16)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a17)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为F，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a18)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为V，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a19)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为W，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a20)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为F，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a21)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为F，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a22)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为P；
(a23))将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为P；
(a24)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为P；
(a25)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a26)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为P；
(a27)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为F，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a28)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为F，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a29)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a30)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为P；
(a31)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为P；
(a32)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下三个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
(a33)将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为C；
(a34)将将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为A，第321位氨基酸残基由M突变为V，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A。
本发明还保护编码以上任一所述蛋白质的基因。
所述基因具体可为如下(1)-(34)中的任一种：
(1)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(2)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(3)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第971位核苷酸由“a”突变为“t”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(4)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(5)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(6)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第961位核苷酸由“a”突变为“g”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(7)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“g”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(8)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-972位核苷酸由“aaa”突变为“tgc”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(9)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(10)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(11)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(12)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(13)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(14)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-972位核苷酸由“aaa”突变为“tgc”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(15)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(16)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(17)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-972位核苷酸由“aaa”突变为“ttc”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(18)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“gt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(19)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-560位核苷酸由“ac”突变为“gt”，第961-962位核苷酸由“at”突变为“tg”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(20)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第963位核苷酸由“g”突变为“c”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(21)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第963位核苷酸由“g”突变为“c”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(22)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“cc”；
(23)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“cc”；
(24)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“cc”；
(25)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(26)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559-561位核苷酸由“acg”突变为“tgc”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“cc”；
(27)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第963位核苷酸由“g”突变为“c”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(28)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第963位核苷酸由“g”突变为“c”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(29)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(30)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“cc”；
(31)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第963位核苷酸由“g”突变为“a”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“cc”；
(32)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”；
(33)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第961位核苷酸由“a”突变为“t”，第970-971位核苷酸由“aa”突变为“tt”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“tg”；
(34)将序列表的序列1所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第559位核苷酸由“a”突变为“g”，第961位核苷酸由“a”突变为“g”，第971-972位核苷酸由“aa”突变为“tg”，第976-977位核苷酸由“aa”突变为“gc”。
本发明还保护含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
所述重组表达载体具体可为将pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了所述基因得到的重组质粒。
所述重组菌是将所述基因导入宿主菌中得到的。
所述基因具体可可通过以上任一所述重组表达载体导入宿主菌。
所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还保护以上任一所述蛋白质的应用，为如下(b1)-(b5)中至少一种：
(b1)作为氨基裂解酶；
(b2)催化脱氨反应；
(b3)催化加氨反应；
(b4)催化以反式2-丁烯酸为底物的加氨反应；
(b5)制备(R)1-丙基(2-氨基)甲酸。
本发明还保护所述重组菌的应用，为如下(c1)和/或(c2)：
(c1)制备所述蛋白质；
(c2)制备(R)1-丙基(2-氨基)甲酸。
本发明还保护所述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到所述蛋白质。
所述“从重组菌中得到得到所述蛋白质”具体可包括步骤(d1)和(d2)：
(d1)破碎所述重组菌菌体，得到菌体破碎液；
(d2)将步骤(d1)得到的菌体破碎液加热，然后离心取上清，得到所述蛋白质。
所述(d1)中，所述重组菌菌体的制备方法包括如下步骤：将重组菌接种于5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600nm＝1-2，加入30ppm IPTG，继续30℃、200rpm振荡培养，12000rpm离心收集菌体。所述(d1)中，振荡培养(包括加入IPTG前的振荡培养和加入IPTG后的振荡培养)的总时间为24小时。所述LB液体培养基中含有100μg/ml的氨苄青霉素。
所述(d1)中，破碎菌体的方法为：将所述重组菌菌体采用50mM Tris(pH 7.5)，2mMMgCl21.0ml重悬后超声(功率为25W)破碎30s。
本发明还保护一种制备(R)1-丙基(2-氨基)甲酸的方法，包括如下步骤：以反式-2-丁烯酸为底物，与所述重组菌的菌体进行反应，得到(R)1-丙基(2-氨基)甲酸。
所述方法具体包括如下步骤(e1)-(e4)：
(e1)将重组菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵；
(e2)将步骤(e1)的发酵体系离心收集菌体；
(e3)采用底物溶液重悬步骤(e2)得到的菌体，进行转化反应，然后离心收集上清液；
(e4)将步骤(e3)得到的上清液过滤浓缩，收集析出的白色晶体，将白色晶体进行干燥处理，得到(R)1-丙基(2-氨基)甲酸。
所述(e1)中，所述种子液是将所述重组菌接种至LB液体培养基中培养得到的。所述培养条件为37℃、200rpm培养。所述种子液的OD600nm＝1.8-2。
所述(e1)中，所述发酵的初始发酵体系的OD600nm＝0.1-0.2。发酵过程具体为：发酵全程保持通气比为1-1.5/min，pH 7.0，温度37℃，溶解氧(DO)30-60％，残糖＜0.1g/L(通过向发酵体系中加入60％葡萄糖水溶液并不断调整补糖速率来控制)。当发酵体系的OD600nm＝20时，加入30ppm IPTG开始诱导酶表达。当菌体基本不生长，OD600nm平稳不再上升时结束发酵，整个发酵过程约20-24小时。
所述(e2)中，离心收集菌体具体为5000rpm离心45min收集菌体。
所述(e3)中，底物溶液的制备方法具体可为：将1150g反式-2-丁烯酸加至约2000ml纯化水中，搅拌并通过滴加25％(质量百分比)氨水调节pH至9.0(30℃)，然后加纯化水定容至3800ml，用氨水微调pH至9.0±0.05(30℃)，得到底物溶液。
所述(e3)中，转化反应体系中，菌体终浓度为20g DCW/L。转化反应的反应条件为：50℃、200rpm反应8h。所述离心收集上清液具体可为10000rpm离心45min收集上清液。
所述(e4)中，所述将上清液浓缩过滤具体包括如下步骤(f1)-(f3)
(f1)上清液采用中空纤维超滤膜(截留孔径：10kD，材质：PS)，得到滤液。
(f2)将步骤(f1)得到的滤液75℃，0.05MPa浓缩至3L，加入1％(质量百分比)活性炭，60℃搅拌1h，抽滤除去活性炭，收集滤液。
(f3)步骤(f2)得到的滤液75℃，0.05MPa浓缩至1.8L，开始析出白色晶体，自然降温结晶，加入0.9L无水乙醇，搅拌均匀，抽滤分离晶体，滤液继续浓缩再结晶，多次收集晶体用无水乙醇洗涤，收集析出的白色晶体。
所述(e4)中，将白色晶体进行干燥处理具体可为将白色晶体80℃干燥。
本发明还保护一种用于制备(R)1-丙基(2-氨基)甲酸的试剂盒，包括所述重组菌。
所述试剂盒还包括底物；所述底物为反式-2-丁烯酸。
以上任一所述(R)1-丙基(2-氨基)甲酸为式(I)所示的化合物。
Figure BDA0001289630980000081
本发明公开了一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的突变体蛋白具有较高的氨基裂解酶活性，同时可以催化以反式2-丁烯酸为底物的加氨反应，生产(R)1-丙基(2-氨基)甲酸，产率高且满足100％立体选择性的要求，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为反式-2-丁烯酸标准品色谱图。
图2为菌体生长曲线。
图3为转化过程监测。
图4为核磁共振氢谱(HNMR)图。
图5为核磁共振碳谱(CNMR)图。
图6为(DL)1-丙基(2-氨基)甲酸标准品色谱图。
图7为(R)1-丙基(2-氨基)甲酸标准品色谱图。
图8为白色晶体产物色谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pET21a载体：Novagen，产品目录编号：69740-3CN。
大肠杆菌BL21(DE3)：天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB105-02。
发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下：KH2PO43.4g/L，Na2HPO4 10g/L，(NH4)2SO4 1g/L，一水合柠檬酸1.7g/L，微量元素储备液10ml/L，MgSO4.7H2O 0.6g/L，一水葡萄糖10g/L；所述溶剂为水。
微量元素储备液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在微量元素储备液中的浓度如下：EDTA 840mg/L，CoCl2·6H2O 250mg/L，MnCl2·4H2O 1500mg/L，CuCl2·2H2O 150mg/L，H3BO3 300mg/L，Na2MoO4·2H2O 250mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 1300mg/L，柠檬酸铁铵11.42g/L；所述溶剂为水。
实施例1、突变位点的筛选确定
对来源于枯草芽孢杆菌的L-天门冬氨酸脱氨酶蛋白(aspB蛋白)进行序列分析、突变和功能验证，发现了37个氨基酸位点，通过进一步研究分析从37个氨基酸位点中又筛选出了4个重要的氨基酸位点。将这4个氨基酸位点进行不同形式突变，得到的突变体蛋白均具有较高的氨基裂解酶活性，同时可以催化以反式2-丁烯酸为底物的加氨反应，可用于生产(R)1-丙基(2-氨基)甲酸，产率高且满足100％立体选择性的要求。
所述aspB蛋白如序列表的序列2所示，所述aspB蛋白的编码基因(aspB基因)如序列表的序列1所示。
4个氨基酸位点及其突变形式如表1所示。
表14个氨基酸位点及其突变形式
Figure BDA0001289630980000091
实施例2、重组菌的制备
野生型aspB蛋白如序列表的序列2所示，野生型aspB蛋白的编码基因(aspB基因)如序列表的序列1所示。
一、野生型重组表达载体的构建
将序列1所示的双链DNA分子插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-aspB(测序验证正确)。序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。
二、突变体重组表达载体的构建
1、将双链DNA分子1插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-1(测序验证正确)。双链DNA分子1是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子1的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第963位g突变为a，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子1编码蛋白1。与野生型aspB蛋白相比，蛋白1的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为I，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
2、将双链DNA分子2插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-2(测序验证正确)。双链DNA分子2是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子2的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子2编码蛋白2。与野生型aspB蛋白相比，蛋白2的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为L，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
3、将双链DNA分子3插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-3(测序验证正确)。双链DNA分子3是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子3的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第963位g突变为a，第971位a突变为t，第976-977位aa突变为tg。DNA分子3编码蛋白3。与野生型aspB蛋白相比，蛋白3的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为I，第324位K突变为I，第326位N突变为C。
4、将双链DNA分子4插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-4(测序验证正确)。双链DNA分子4是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子4的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子4编码蛋白4。与野生型aspB蛋白相比，蛋白4的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
5、将双链DNA分子5插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-5(测序验证正确)。双链DNA分子5是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子5的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第963位g突变为a，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子5编码蛋白5。与野生型aspB蛋白相比，蛋白5的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为I，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
6、将双链DNA分子6插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-6(测序验证正确)。双链DNA分子6是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子6的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第961位a突变为g，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为tg。DNA分子6编码蛋白6。与野生型aspB蛋白相比，蛋白6的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为V，第324位K突变为M，第326位N突变为C。
7、将双链DNA分子7插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-7(测序验证正确)。双链DNA分子7是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子7的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为g，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子7编码蛋白7。与野生型aspB蛋白相比，蛋白7的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为V，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
8、将双链DNA分子8插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-8(测序验证正确)。双链DNA分子8是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子8的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第963位g突变为a，第970-972位aaa突变为tgc，第976-977位aa突变为tg。DNA分子8编码蛋白8。与野生型aspB蛋白相比，蛋白8的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为I，第324位K突变为C，第326位N突变为C。
9、将双链DNA分子9插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-9(测序验证正确)。双链DNA分子9是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子9的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子9编码蛋白9。与野生型aspB蛋白相比，蛋白9的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
10、将双链DNA分子10插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-10(测序验证正确)。双链DNA分子10是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子10的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第963位g突变为a，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子10编码蛋白10。与野生型aspB蛋白相比，蛋白10的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为I，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
11、将双链DNA分子11插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-11(测序验证正确)。双链DNA分子11是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子11的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子11编码蛋白11。与野生型aspB蛋白相比，蛋白11的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第324位K突变为L，第326位N突变为C。
12、将双链DNA分子12插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-12(测序验证正确)。双链DNA分子12是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子12的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子12编码蛋白12。与野生型aspB蛋白相比，蛋白12的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第324位K突变为L，第326位N突变为C。
13、将双链DNA分子13插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-13(测序验证正确)。双链DNA分子13是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子13的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第963位g突变为a，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子13编码蛋白13。与野生型aspB蛋白相比，蛋白13的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为I，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
14、将双链DNA分子14插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-14(测序验证正确)。双链DNA分子14是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子14的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第963位g突变为a，第970-972位aaa突变为tgc，第976-977位aa突变为tg。DNA分子14编码蛋白14。与野生型aspB蛋白相比，蛋白14的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为I，第324位K突变为C，第326位N突变为C。
15、将双链DNA分子15插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-15(测序验证正确)。双链DNA分子15是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子15的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子15编码蛋白15。与野生型aspB蛋白相比，蛋白15的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为C。
16、将双链DNA分子16插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-16(测序验证正确)。双链DNA分子16是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子16的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第963位g突变为a，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为tg。DNA分子16编码蛋白16。与野生型aspB蛋白相比，蛋白16的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为I，第324位K突变为M，第326位N突变为C。
17、将双链DNA分子17插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-17(测序验证正确)。双链DNA分子17是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子17的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第963位g突变为a，第970-972位aaa突变为ttc，第976-977位aa突变为tg。DNA分子17编码蛋白17。与野生型aspB蛋白相比，蛋白17的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为I，第324位K突变为F，第326位N突变为C。
18、将双链DNA分子18插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-18(测序验证正确)。双链DNA分子18是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子18的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第963位g突变为a，第970-971位aa突变为gt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子18编码蛋白18。与野生型aspB蛋白相比，蛋白18的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为I，第324位K突变为V，第326位N突变为C。
19、将双链DNA分子19插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-19(测序验证正确)。双链DNA分子19是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子19的差别仅在于：将序列1自5’端第559-560位ac突变为gt，第961-962位at突变为tg，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子19编码蛋白19。与野生型aspB蛋白相比，蛋白19的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为V，第321位M突变为w，第324位K突变为L，第326位N突变为C。
20、将双链DNA分子20插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-20(测序验证正确)。双链DNA分子20是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子20的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第963位g突变为c，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子20编码蛋白20。与野生型aspB蛋白相比，蛋白20的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为F，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
21、将双链DNA分子21插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-21(测序验证正确)。双链DNA分子21是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子21的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第963位g突变为c，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子21编码蛋白21。与野生型aspB蛋白相比，蛋白21的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为F，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
22、将双链DNA分子22插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-22(测序验证正确)。双链DNA分子22是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子22的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为cc。DNA分子22编码蛋白22。与野生型aspB蛋白相比，蛋白22的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为P。
23、将双链DNA分子23插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-23(测序验证正确)。双链DNA分子23是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子23的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第963位g突变为a，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为cc。DNA分子23编码蛋白23。与野生型aspB蛋白相比，蛋白23的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为I，第324位K突变为L，第326位N突变为P。
24、将双链DNA分子24插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-24(测序验证正确)。双链DNA分子24是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子24的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第963位g突变为a，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为cc。DNA分子24编码蛋白24。与野生型aspB蛋白相比，蛋白24的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为I，第324位K突变为M，第326位N突变为P。
25、将双链DNA分子25插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-25(测序验证正确)。双链DNA分子25是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子25的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子25编码蛋白25。与野生型aspB蛋白相比，蛋白25的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为C。
26、将双链DNA分子26插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-26(测序验证正确)。双链DNA分子26是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子26的差别仅在于：将序列1自5’端第559-561位acg突变为tgc，第961位a突变为t，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为cc。DNA分子26编码蛋白26。与野生型aspB蛋白相比，蛋白26的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为C，第321位M突变为L，第324位K突变为M，第326位N突变为P。
27、将双链DNA分子27插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-27(测序验证正确)。双链DNA分子27是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子27的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第961位a突变为t，第963位g突变为c，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子27编码蛋白27。与野生型aspB蛋白相比，蛋白27的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为F，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
28、将双链DNA分子28插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-28(测序验证正确)。双链DNA分子28是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子28的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第961位a突变为t，第963位g突变为c，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子28编码蛋白28。与野生型aspB蛋白相比，蛋白28的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为F，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
29、将双链DNA分子29插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-29(测序验证正确)。双链DNA分子29是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子29的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为gc。DNA分子29编码蛋白29。与野生型aspB蛋白相比，蛋白29的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为A。
30、将双链DNA分子30插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-30(测序验证正确)。双链DNA分子30是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子30的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为cc。DNA分子30编码蛋白30。与野生型aspB蛋白相比，蛋白30的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为P。
31、将双链DNA分子31插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-31(测序验证正确)。双链DNA分子31是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子31的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第963位g突变为a，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为cc。DNA分子31编码蛋白31。与野生型aspB蛋白相比，蛋白31的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为I，第324位K突变为L，第326位N突变为P。
32、将双链DNA分子32插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-32(测序验证正确)。双链DNA分子32是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子32的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子32编码蛋白32。与野生型aspB蛋白相比，蛋白32的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
33、将双链DNA分子33插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-33(测序验证正确)。双链DNA分子33是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子33的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第961位a突变为t，第970-971位aa突变为tt，第976-977位aa突变为tg。DNA分子33编码蛋白33。与野生型aspB蛋白相比，蛋白33的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为L，第324位K突变为L，第326位N突变为C。
34、将双链DNA分子34插入至pET21a载体的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组表达载体pET21a-34(测序验证正确)。双链DNA分子34是将野生型aspB基因进行点突变得到的。与野生型aspB基因相比，双链DNA分子34的差别仅在于：将序列1自5’端第559位a突变为g，第961位a突变为g，第971-972位aa突变为tg，第976-977位aa突变为gc。DNA分子33编码蛋白34。与野生型aspB蛋白相比，蛋白34的差别仅在于：将序列2所示第187位T突变为A，第321位M突变为V，第324位K突变为M，第326位N突变为A。
三、重组菌的制备
1、将步骤一得到的重组表达载体pET21a-aspB转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到野生型重组菌。
2、将步骤二中1-34制备的重组表达载体pET21a-1至重组表达载体pET21a-34分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到突变体重组菌，依次编号为突变体重组菌1-34。
实施例3、加氨酶突变体蛋白的酶活力测定
采用实施例2得到的野生型重组菌和突变体重组菌1-34分别进行如下实验：
1、将待测菌接种于接种至5mlLB液体培养基(氨苄抗性：100μg/ml)中，37℃、200rpm震荡至菌液OD600nm＝1-2，加入30ppmIPTG，继续30℃、200rpm震荡培养至24h。
2、完成步骤1后，12000rpm离心收集菌体。
3、将步骤2收集的菌体采用50mM Tris(pH 7.5)，2mM MgCl2 1ml重悬后超声(功率为25W)破碎30s，得到菌体破碎液。
4、将步骤3得到的菌体破碎液60℃加热30min，然后12000rpm离心，收集上清液，即为蛋白溶液。
野生型重组菌进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为野生型蛋白溶液。突变体重组菌1-34进行上述步骤得到的蛋白溶液依次命名为突变体1-突变体34蛋白溶液。Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒(Takara)测定蛋白浓度。
5、配制酶活检测反应体系：底物溶液180μL，待测蛋白溶液20μL(蛋白含量约为0.16mg)。55℃反应1h。
底物溶液(pH＝8.0)：300mM(R)1-丙基(2-氨基)甲酸(CAS号：3775-73-3，北京伊诺凯科技有限公司，货号：AK-44656-1g)：用100mM Na2HPO4溶解(R)1-丙基(2-氨基)甲酸，5MNaOH调解PH至8.0，用水调整浓度至300mM。
采用HPLC检测反应产物中反式-2-丁烯酸的浓度。
HPLC检测采用Agilent 1200Series仪器。检测参数如下：
色谱柱：Nucleosil 100C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：流动相由A液(95％)和B液(5％)组成，A液为0.1％(体积百分比)甲酸水溶液，B液为乙腈。
流速：1.00mL/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：210nm；
进样量：10μL。
采用反式-2-丁烯酸(CAS号：107-93-7，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：150870025)作为标准品。标准品色谱图如图1所示。反式-2-丁烯酸标准品的出峰时间为10.095min。
6、根据步骤5检测的结果计算酶活和比活力。
酶活(U)＝A样/7382.7×1000×V/t；
A样：转化液产物反式-2-丁烯酸峰面积；
V：反应体系体积(L)；
t：反应时间(min)。
比活力(U/mg)＝酶活/N；
N：体系中酶的量(mg)。
结果如表2所示。
表2酶活统计结果
Figure BDA0001289630980000161
Figure BDA0001289630980000171
实施例4、加氨酶突变体蛋白生产(R)1-丙基(2-氨基)甲酸
1、将实施例2得到的突变体重组菌1接种于250mlLB液体培养基(氨苄抗性：100μg/ml)中，37℃、200rpm震荡至菌液OD600nm＝1.8-2，得到种子液。
2、将250ml步骤1得到的种子液接种至装有2.25L发酵培养基(氨苄抗性：100μg/ml)的5L发酵罐中进行发酵(初始发酵体系的OD600nm＝0.1-0.2)，发酵全程保持通气比为1-1.5/min，pH为7.0，温度为37℃，溶解氧(DO)为30-60％，通过向发酵体系中加入60％(质量百分比)葡萄糖水溶液并不断调整补糖速率来控制残糖＜0.1g/L。当菌液OD600nm＝20时，加入30ppm IPTG开始诱导酶表达。当菌体基本不生长，OD600nm平稳不再上升时结束发酵，整个发酵过程约20-24小时。
整个发酵过程中菌体生长曲线如图2所示。
发酵结束后，5000rpm离心45min收集菌体。
3、将1150g反式-2-丁烯酸(CAS号：107-93-7，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：150870025)加至约2000ml纯化水中，搅拌并通过滴加25％(质量百分比)氨水调节pH至9.0(30℃)，然后加纯化水定容至3800ml，用氨水微调pH至9.0±0.05(30℃)，得到底物溶液。
4、采用步骤3配制的底物溶液重悬步骤2收集的菌体(菌体终浓度：20g DCW/L)，混悬均匀，于50℃摇床中200rpm振摇反应8h，在转化过程中取样监测反应进程(图3)。
5、完成步骤1后，将反应液10000rpm离心45min，收集上清液。
6、将步骤5得到的上清液采用中空纤维超滤膜(天津大川科技发展有限公司，截留孔径：10kD，材质：PS)，得到滤液。
7、将步骤6得到的滤液75℃、0.05MPa浓缩至3L，加入1％(质量百分比)活性炭，60℃搅拌1h，抽滤除去活性炭，收集滤液。
8、将步骤7得到的滤液75℃、0.05MPa浓缩至1.8L，开始析出白色晶体，自然降温结晶，加入0.9L无水乙醇，搅拌均匀，抽滤分离晶体，滤液继续浓缩再结晶，多次收集晶体用无水乙醇洗涤，收集析出的晶体。
9、将步骤8得到的晶体80℃干燥，得到1260.40g白色晶体，对提取率进行统计，结果见表3。
表3收率统计结果
投料量(g) 转化率％ 理论产量(g) 提取产量(g) 收率％
1150 99.00％ 1377.33 1260.40 91.51％
对白色晶体产物通过核磁进一步验证。核磁共振氢谱(HNMR)图见图4。核磁共振碳谱(CNMR)图见图5。核磁结果为：1HNMR(500MHz，D2O)δ4.67(s，2H)，3.36(dd，J＝13.3，6.6Hz，1H)，2.25(d，J＝6.7Hz，2H)，1.07(d，J＝6.7Hz，3H).13C NMR(126MHz，D2O)δ177.9，45.2，40.6，17.6.
结果表明，产物为(R)1-丙基(2-氨基)甲酸。
(R)1-丙基(2-氨基)甲酸的CAS号为：3775-73-3，分子量为：103.12，分子式为：C4H9NO2，结构式如下：
Figure BDA0001289630980000181
10、采用HPLC检测白色晶体产物的立体结构，具体方法为：将待测样品或标准品溶于去离子水中，配制为浓度为1mg/ml的待测溶液。取25μl待测溶液，向待测溶液中加入10μl1M NaHCO3和40μl FDVA(Nα-[2，4-Dinitro-5-fluorophenyl]-L-valine amide)(CAS号：13679-61-9，sigmaAldrich，货号：42102-100mg)(36.7mM溶解于丙酮中)，60℃反应30分钟，然后加入20μl 1M HCl终止反应，将反应体系离心，取上清液采用HPLC检测。
HPLC检测采用Agilent 1200Series仪器。检测参数如下：
色谱柱：Nucleosil 100C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：流动相由A液(65％)和B液(35％)组成，A液为0.1％(体积百分比)甲酸水溶液，B液为乙腈。
流速：1.00mL/min；
柱温：25℃；
紫外检测波长：340nm；
进样量：10uL。
采用消旋1-丙基(2-氨基)甲酸(CAS号：541-48-0，源叶生物科技有限公司，货号：S20215-1g)和(R)1-丙基(2-氨基)甲酸(CAS号：3775-73-3，北京伊诺凯科技有限公司，货号：AK-44656-1g)作为标准品。
消旋1-丙基(2-氨基)甲酸标准品色谱图如图6所示。图6中，第12.411min出现的色谱峰为(S)1-丙基(2-氨基)甲酸，第18.046min出现的色谱峰为(R)1-丙基(2-氨基)甲酸。
(R)1-丙基(2-氨基)甲酸标准品色谱图如图7所示。
白色晶体产物色谱图如图8所示。
结果表明，加氨酶突变体催化反式-2-丁烯酸生产(R)1-丙基(2-氨基)甲酸具有100％立体选择性。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
atgaataccg atgttcgtat tgagaaagac tttttaggag aaaaggagat tccgaaagac 60
gcttattatg gcgtacaaac aattcgggca acggaaaatt ttccaattac aggttatcgt 120
attcatccag aattaattaa atcactaggg attgtaaaaa aatcagccgc attagcaaac 180
atggaagttg gcttactcga taaagaagtt gggcaatata tcgtaaaagc tgctgacgaa 240
gtgattgaag gaaaatggaa tgatcaattt attgttgacc caattcaagg cggggcagga 300
acttccatta atatgaatgc aaatgaagtg attgctaacc gcgcattaga attaatggga 360
gaggaaaaag gaaactattc aaaaattagt ccaaactccc atgtaaatat gtctcaatca 420
acaaacgatg ctttccctac tgcaacgcat attgctgtgt taagtttatt aaatcaatta 480
attgaaacta caaaatacat gcaacaagaa ttcatgaaaa aagcagatga attcgctggc 540
gttattaaaa tgggaagaac gcacttgcaa gacgctgttc ctattttatt aggacaagag 600
tttgaagcat atgctcgtgt aattgcccgc gatattgaac gtattgccaa tacgagaaac 660
aatttatacg acatcaacat gggtgcaaca gcagtcggca ctggcttaaa tgcagatcct 720
gaatatataa gcatcgtaac agaacattta gcaaaattca gcggacatcc attaagaagt 780
gcacaacatt tagtggacgc aactcaaaat acagactgct atacagaagt ttcttctgca 840
ttaaaagttt gcatgatcaa catgtctaaa attgccaatg atttacgctt aatggcatct 900
ggaccacgcg caggcttatc agaaatcgtt cttcctgctc gacaacctgg atcttctatc 960
atgcctggta aagtgaatcc tgttatgcca gaagtgatga accaagtggc attccaagtg 1020
ttcggtaatg atttaacaat tacatctgct tctgaagcag gccaatttga attaaatgtg 1080
atggaacctg tgttattctt caatttaatt caatcgattt cgattatgac taatgtcttt 1140
aaatccttta cagaaaactg cttaaaaggt attaaggcaa atgaagaacg catgaaagaa 1200
tatgttgaga aaagcattgg aatcattact gcaattaacc cacatgtagg ctatgaaaca 1260
gctgcaaaat tagcacgtga agcatatctt acaggggaat ccatccgtga actttgcatt 1320
aagtatggcg tattaacaga agaacagtta aatgaaatct taaatccata tgaaatgaca 1380
catccgggaa ttgctggaag aaaa 1404
<210> 2
<211> 468
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 2
Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu
20 25 30
Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser
35 40 45
Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly
50 55 60
Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu
65 70 75 80
Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln
85 90 95
Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys
115 120 125
Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala
130 135 140
Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu
145 150 155 160
Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp
165 170 175
Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala
180 185 190
Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile
195 200 205
Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp
210 215 220
Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His
245 250 255
Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp
260 265 270
Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met
275 280 285
Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala
290 295 300
Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile
305 310 315 320
Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val
325 330 335
Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu
340 345 350
Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn
355 360 365
Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr
370 375 380
Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu
385 390 395 400
Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val
405 410 415
Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly
420 425 430
Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu
435 440 445
Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile
450 455 460
Ala Gly Arg Lys
465

Claims (8)

1.蛋白质，是将序列表中序列2所示的蛋白质第187-326位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的；
所述蛋白质为如下（a1）-（a4）中的任一种：
（a1）将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为L，第326位氨基酸残基由N突变为A；
（a2）将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第321位氨基酸残基由M突变为L，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A；
（a3）将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下四个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为V，第321位氨基酸残基由M突变为I，第324位氨基酸残基由K突变为I，第326位氨基酸残基由N突变为C；
（a4）将序列表中序列2所示的蛋白质进行如下三个点突变得到的蛋白质：第187位氨基酸残基由T突变为C，第324位氨基酸残基由K突变为M，第326位氨基酸残基由N突变为A。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
4.权利要求1所述的蛋白质的应用，为如下（b1）-（b5）中至少一种：
（b1）作为氨基裂解酶；
（b2）催化脱氨反应；
（b3）催化加氨反应；
（b4）催化以反式2-丁烯酸为底物的加氨反应；
（b5）制备（R）1-丙基(2-氨基)甲酸。
5.权利要求3中所述的重组菌的应用，为如下（c1）和/或（c2）：
（c1）制备权利要求1所述的蛋白质；
（c2）制备（R）1-丙基(2-氨基)甲酸。
6.权利要求1所述的蛋白质的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求3中所述的重组菌，从重组菌中得到所述蛋白质。
7.一种制备（R）1-丙基(2-氨基)甲酸的方法，包括如下步骤：以反式-2-丁烯酸为底物，与权利要求5中所述的重组菌的菌体进行反应，得到（R）1-丙基(2-氨基)甲酸。
8.一种用于制备（R）1-丙基(2-氨基)甲酸的试剂盒，包括权利要求3中所述的重组菌。
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