CN110770339B

CN110770339B - 一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法

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Publication number: CN110770339B
Application number: CN201880038009.8A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 李振伟; 王敏; 郭杏林
Original assignee: Bontac Invitrolife Bio Technology Shenzhen Co ltd; Zhongshan Bangtai Hesheng Biotechnology Co ltd; Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd
Current assignee: Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd; Bontac Invitrolife Bio Technology Shenzhen Co ltd; Zhongshan Bangtai Hesheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: CN116640742A; US11299721B2; JP6893000B2; JP2020521473A; US20200224183A1; CN110770339A; WO2019210606A1

Abstract

提供一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法，转化率达99％以上。

Description

一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物工程技术领域，特别涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法。

背景技术

酸性磷酸酶(acid phosphatase)是一类水解酶，其可催化磷酸单酯(核苷酸、蛋白质等)分子水解去除磷酸基团，使目标分子去磷酸化，在酸性环境下最为有效，故得名酸性磷酸酶，EC编号为EC 3.1.3.2。

烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，简称NR)，又名烟酰胺核苷、烟酰胺核糖核苷、烟酸核糖/苷、烟酰核苷、β-D-烟酰胺核苷，CAS号为1341-23-7，其结构式如下图所示。

烟酰胺核糖是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的前体，并且代表维生素B3的来源。研究表明，补充烟酰胺核糖可以提高细胞内NAD的浓度，从而起到预防和改善因NAD缺乏而导致的各种不健康状况的作用。

但是，烟酰胺核糖含有高能糖苷键，其在水环境中自发不稳定，会分解成烟酰胺和核糖产物。这种自发分解根据具体的环境条件会以数小时或者数天的过程发生，使得难以在食物中保持任何天然存在的烟酰胺核糖，也很难从天然来源分离得到烟酰胺核糖，因此目前国内外普遍通过化学合成方法生产烟酰胺核糖。

美国专利申请US2017/0121746A1中公开了一种烟酰胺核糖的生产方法，其是以烟酰胺单核苷酸和/或其衍生物、水以及特定的溶剂为原料，在磷酸单酯水解酶的催化作用下生产烟酰胺核糖。该方法采用酶法制备烟酰胺核糖，具有比化学合成法更环保更健康工艺更简单的优点，是烟酰胺核糖生产的发展趋势。但是，野生型酸性磷酸酶的活力相对较低，导致酶法生产烟酰胺核糖的成本较高，因此提高酸性磷酸酶的酶活力，对推动烟酰胺核糖的酶法工业化生产具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于解决野生型酸性磷酸酶活力较低导致酶法工业化生产烟酰胺核糖的成本较高的技术问题，开发一种酶活力提高的酸性磷酸酶以及应用该酶制备烟酰胺核糖的方法。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种酸性磷酸酶突变体，为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

(b)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且以烟酰胺单核苷酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的酸性磷酸酶亲本高的催化活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)或(b)限定的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上同源性且以烟酰胺单核苷酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的酸性磷酸酶亲本高的催化活性的蛋白质。

上述酸性磷酸酶亲本来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，与如SEQ ID NO：2所示的酸性磷酸酶亲本的氨基酸序列相比，本发明的突变体在至少一个如下位点处具有至少一个突变：第44位、第115位、第206位和第240位。

更优选地，与如SEQ ID NO：2所示的酸性磷酸酶亲本的氨基酸序列相比，本发明的突变体具有至少一个如下突变：K44C、K115F、K115I、D206I和S240E。

本发明还提供了一种烟酰胺核糖的制备方法，包括：在KCl和无水MgCl₂存在的条件下，用酸性磷酸酶催化烟酰胺单核苷酸转化成烟酰胺核糖，其中，酸性磷酸酶是氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的酸性磷酸酶亲本或者是如下(a)、(b)或(c)的酸性磷酸酶突变体：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

本发明的烟酰胺核糖的制备方法的转化路线如下图所示。

优选地，本发明的烟酰胺核糖的制备方法按顺序包括以下步骤：1)将KCl和无水MgCl₂溶解于水中，得KCl和MgCl₂的混合溶液；2)冷却至室温；3)向KCl和MgCl₂的混合溶液中加入烟酰胺单核苷酸溶解并调节pH值至6-7；4)加入酸性磷酸酶并调节pH值至6.8-7.3；5)37±5℃下反应至少1.5小时。

为防止底物烟酰胺单核苷酸发生降解，更优选地，在所述酸性磷酸酶催化烟酰胺单核苷酸转化成烟酰胺核糖的酶反应开始之前，向反应体系中加入魔芋葡甘聚糖和/或莱鲍迪苷A。更优选的是加入魔芋葡甘聚糖。

更优选地，魔芋葡甘聚糖和/或莱鲍迪苷A的加入量为烟酰胺单核苷酸重量的O.1-0.5倍。

本发明的方法先将KCl和无水MgCl₂溶解并且待降至室温后再加入底物烟酰胺单核苷酸，其好处在于：可以避免因溶解过程中产生过高的热量而对底物造成影响，从而防止转化率降低。

优选地，本发明的方法步骤1)中的水选用双蒸水，以减少水中杂质对底物造成影响而降低转化率。所谓双蒸水是指将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水，英文名叫double distilled water，简写ddwater，也写作ddH₂O。

优选地，本发明的方法步骤3)和步骤4)中使用NaOH调节pH值。

优选地，本发明的方法中烟酰胺单核苷酸在反应体系中的终浓度为100±50g/L。

优选地，本发明的方法中KCl在反应体系中的终浓度为15±5g/L。

优选地，本发明的方法中MgCl₂在反应体系中的终浓度为40±10g/L。

本发明的方法中酸性磷酸酶亲本来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的方法中使用的酸性磷酸酶可以是从市场上购入的商品酶，也可以是自行制备的酶产品，这里的酶产品可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经过完全或者部分纯化的酶，本发明的酸性磷酸酶可以通过以下方法自行制备：

酸性磷酸酶亲本的制备：通过PCR技术对如SEQ ID NO：1所示的基因序列进行扩增；然后将扩增产物插入到表达载体pET22b(+)的NdeI和EcoR I位点，得到重组质粒pET22b-NS3；经测序验证后将重组质粒pET22b-NS3转化入大肠杆菌并进行培养和诱导表达；表达完成后收集菌体进行破胞处理后收集上清液即得酸性磷酸酶亲本的粗酶液。

酸性磷酸酶突变体的制备：利用反向PCR技术设计突变位点的引物序列；利用设计的引物以重组质粒pET22b-NS3为模板进行反向PCR扩增；然后将扩增产物用Dpn I酶消化模板处理后转化入大肠杆菌；对转化后的大肠杆菌进行培养和诱导表达；表达完成后收集菌体进行破胞处理后收集上清液即得酸性磷酸酶突变体的粗酶液。

优选地，本发明的方法中使用的酸性磷酸酶是上述酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液经纯化处理后的纯酶液。

优选地，通过镍柱对上述酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液进行纯化处理。

优选地，通过镍柱对上述酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液进行纯化处理的方法包括：1)镍柱制备：以琼脂糖凝胶为镍载体，用氯化镍溶液挂镍，用1×PBS+10mM咪唑溶液平衡镍柱；2)上样：将粗酶液与镍填料均匀混合后于冰浴中孵育1-2h；然后将孵育后的混合物上样到步骤1)制备的镍柱中；3)洗脱：先用1×PBS+10mM咪唑溶液进行第一次洗脱；再用1×PBS+(200-500)mM咪唑溶液进行第二次洗脱，收集洗脱液即得纯酶液。

当然，上述用镍柱进行纯化处理的方法同样适用于纯化除本发明的酸性磷酸酶亲本和突变体之外的其它酸性磷酸酶的粗酶液。

上述对粗酶液进行纯化处理的方法中，第一次洗脱的目的是为了除去杂蛋白，第二次洗脱的目的是将酸性磷酸酶蛋白洗脱下来。

优选地，本发明的方法中的酸性磷酸酶选用固定化酶。所谓固定化酶是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。

本发明的方法中使用的固定化酶可以直接从市场上购买，也可以自行制备，还可以购买非固定化酶后自己将其进行固定化。固定化时可选用本领域已知的各种酶固定化载体，如传统的无机载体材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等，再如有机高分子载体大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。本发明优选使用镍材料或者固相树脂对酸性磷酸酶进行固定化。

优选地，用固相树脂对酸性磷酸酶进行固定化的方法包括：向酸性磷酸酶中加入0.2-0.8M K₂HPO₄，调节pH值为7.5-9.5，加入固相树脂于室温下搅拌12-24h，然后过滤除去滤液后即得酸性磷酸酶固定化酶。

当然，上述固定化的方法同样适用于对除本发明的酸性磷酸酶亲本和突变体之外的其它酸性磷酸酶进行固定化。

优选地，本发明提供的烟酰胺核糖的制备方法还包括从酸性磷酸酶催化烟酰胺单核苷酸转化成烟酰胺核糖的酶反应液中纯化得到烟酰胺核糖精制品的后处理过程，包括如下步骤：1)将酶反应液进行过滤，收集滤液；2)调节滤液的pH值为5.0±0.5，以提高烟酰胺核糖在溶液中的稳定性；3)将步骤2)调节pH后的滤液进行微滤，收集滤液；4)将步骤3)微滤得到的微滤液用制备液相进行纯化，制备液相以聚苯乙烯为制备柱的填料，以乙醇和水为流动相，进行梯度洗脱，收集目的峰的洗脱液；5)将步骤4)收集的洗脱液进行冷冻干燥后即得烟酰胺核糖精制品。

本发明方法中的过滤是指采用物理方法将溶液中的固体和液体进行分离的过程，常见的过滤方法均适用于本发明，包括常压过滤、减压过滤、离心过滤等。优选地，上述后处理过程的步骤1)中采用200-400目的过滤膜对酶反应液进行过滤，以除去酶反应液中的酸性磷酸酶。

微滤又称微孔过滤，以微孔滤膜为过滤介质，在0.1～0.3MPa的压力推动下，截留0.1～1微米之间的颗粒和细菌，但能允许大分子有机物和无机盐等通过。优选地，上述后处理过程的步骤3)中采用0.45μm的微孔滤膜对滤液进行微滤。

优选地，上述后处理过程的步骤4)中，流动相的流速为40ml/min，检测波长为260nm，洗脱的梯度为：0-13min，乙醇0％、水100％；13-23min，乙醇1％、水99％；23-31min，乙醇5％、水95％；31-43min，乙醇20％、水80％；43-45min，乙醇20％、水80％；45-60min，乙醇100％、水0％。

优选地，在上述后处理过程的步骤5)的冷冻干燥之前，用盐酸将收集的洗脱液的pH值调节至3-4，在该PH条件下，烟酰胺核糖全部与盐酸反应生成烟酰胺核糖氯化物。

为了获得稳定性更高且性状更好的烟酰胺核糖，优选地，在上述后处理过程的步骤5)的冷冻干燥之前，向收集的洗脱液中加入魔芋葡甘聚糖和/或莱鲍迪苷A并混合均匀。

更优选地，魔芋葡甘聚糖和/或莱鲍迪苷A的加入量为烟酰胺核糖重量的1-2倍，进一步优选为1.5倍。

为了提高冷冻干燥的效率，减少冷冻干燥的时间，优选地，在上述后处理过程的步骤5)的冷冻干燥之前对收集的洗脱液进行浓缩处理，以除去大量的水分。本发明中的浓缩是指采用物理方法使溶剂蒸发而提高溶液的浓度的过程，包括减压蒸馏法、超过滤法、透析法、吸附法、冷冻干燥法等。优选地，将洗脱液浓缩至烟酰胺核糖的浓度为40-90g/L。

为防止烟酰胺核糖发生降解，优选控制浓缩处理过程在25℃以下的温度下进行；更优选地，控制浓缩处理过程在20℃以下的温度下进行。

更优选地，上述浓缩处理采用纳滤浓缩。

纳滤是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，以纳滤膜为过滤介质，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右，允许溶剂分子或某些相对分子质量较小的溶质或低价离子透过，从而达到分离和浓缩的效果。

优选地，控制上述后处理过程的步骤5)的冷冻干燥过程中的升华温度在25℃以下。优选地，冷冻干燥至烟酰胺核糖精制品中的水分含量在2％以下。

本发明还提供了一种制备酸性磷酸酶固定化酶的方法，包括：

1)酸性磷酸酶亲本的制备，包括：通过PCR技术对酸性磷酸酶亲本的基因序列进行扩增；然后将扩增产物插入到表达载体上，得到重组质粒；经测序验证后将重组质粒转化入宿主细胞并进行培养和诱导表达；表达完成后收集细胞并进行破胞处理后收集上清液即得酸性磷酸酶亲本的粗酶液；

2)酸性磷酸酶突变体的制备，包括：利用反向PCR技术设计突变位点的引物序列；利用设计的引物以步骤1)的重组质粒为模板进行反向PCR扩增；然后将扩增产物用Dpn I酶消化模板处理后转化入宿主细胞并进行培养和诱导表达；表达完成后收集细胞并进行破胞处理后收集上清液即得酸性磷酸酶突变体的粗酶液；

3)用镍柱对酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液进行纯化，包括：a)镍柱制备：以琼脂糖凝胶为镍载体，用氯化镍溶液挂镍，用1×PBS+10mM咪唑溶液平衡镍柱；b)上样：将酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液与镍填料均匀混合后于冰浴中孵育1-2h；然后将孵育后的混合物上样到步骤a)制备的镍柱中；c)洗脱：先用1×PBS+10mM咪唑溶液进行第一次洗脱；再用1×PBS+(200-500)mM咪唑溶液进行第二次洗脱，收集洗脱液即得酸性磷酸酶亲本和/或突变体的纯酶液；

4)用固相树脂进行固定化，包括：向步骤3)得到的纯化后的酶液中加入0.2-0.8MK₂HPO₄，调节pH值为7.5-9.5，再加入固相树脂于室温下搅拌12-24h，过滤除去滤液后即得酸性磷酸酶固定化酶。

上述制备酸性磷酸酶固定化酶的方法中，酸性磷酸酶是本发明的上述酸性磷酸酶亲本和突变体，也可以是除本发明的酸性磷酸酶亲本和突变体之外的其它酸性磷酸酶亲本和突变体。

本发明还提供了一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或重组微生物，所述生物材料含有编码本发明的上述酸性磷酸酶突变体的基因。

本发明还提供了上述酸性磷酸酶突变体在制备烟酰胺核糖中的应用。

有益效果：

与酸性磷酸酶亲本相比，本发明提供的酸性磷酸酶突变体在酶活力、温度稳定性和pH稳定性方面均得到了较为明显的提高。本发明提供的烟酰胺核糖的制备方法可使底物烟酰胺单核苷酸的转化率高达99％，制备得到的烟酰胺核糖的纯度可达99％以上。

附图说明

图1是本发明实施例1中的重组质粒pET22b-NS3的构建过程图；

图2是实施例7的突变体K115I的酶反应液的HPLC图谱；

图3是实施例8的亲本的酶反应液的HPLC图谱；

图4是实施例9的突变体K115I的酶反应液的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。若无特别说明，本发明实施例中所使用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。

实施例1

酸性磷酸酶亲本的制备。

用如下引物对5′-GGAATTCCATATGATGACCATTGCGAAGGATTACCGT-3′和5′-CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3′将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的如SEQ ID NO：1所示的酸性磷酸酶基因NS-3(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)通过PCR扩增技术进行扩增，获得的PCR扩增产物经过酶切处理，同时插入到表达载体pET22b(+)的NdeI和EcoR I位点，得到重组质粒pET22b-NS3，见附图1所示。经测序验证后，将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(de3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(含有100μg/mL的Amp)，30～37℃过夜培养后，以1～5％的接种量转接到一定体积的LB培养基中(含有100μg/mL的Amp)，在30～37℃继续培养OD600达到0.6～1.0加入终浓度为0.1mM～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃诱导表达10～20h后离心收集菌体。

实施例2

酸性磷酸酶突变体的制备

设计如下突变位点：K44C、K115F、K115I、D206I、S240E、K115I/S240E、K115F/K44C/D206I、K115I/S240E/D206I，利用如表1所示的突变引物序列，以实施例1构建的重组质粒pET22b-NS3为模板进行反向PCR，PCR体系和PCR程序如下：

PCR体系：

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PCR程序：

PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，利用Dpn I进行酶切，酶切后产物转入大肠杆菌DH5α，经过Amp平板的筛选后挑取菌落送测序，确认获得在K44C、K115F、K115I、D206I、S240E、K115I/S240E、K115F/K44C/D206I、K115I/S240E/D206I位点处突变成功的突变重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(de3)。将所获得的突变体重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(含有100μg/mL的Amp)，30～37℃过夜培养后，以1～5％的接种量转接到一定体积的LB培养基中(含有100μg/mL的Amp)，在30～37℃继续培养OD600达到0.6～1.0加入终浓度为0.1mM～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃诱导表达10～20h后离心收集菌体。

表1

实施例3

酸性磷酸酶粗酶液的制备

用4倍质量的1×PBS+10mM咪唑溶液重悬发酵收集的菌体后利用高压均质机进行菌体破碎；均质完成后，搅拌条件下加入总体积0.5-1％的聚乙烯亚胺(PEI)并将pH调节至7.0-8.0；通过离心收集上层澄清酶液，并将酶液用0.45μL滤膜进行过滤，收集滤液得到酸性磷酸酶的粗酶液。

实施例4

镍柱制备

a)将柱子清洗干净后，以琼脂糖凝胶为镍载体，根据镍填料(ml)∶菌体(g)＝1∶2的比例取琼脂糖凝胶，用ddH₂O和1×PBS先后各用5个柱体积洗净琼脂糖凝胶；

b)配制0.2mol/L氯化镍溶液后挂镍，为了充分挂镍，可重复挂；

c)用5个柱体积的ddH₂O洗去未结合的Ni²⁺，再用5-10个柱体积的1×PBS+10mM咪唑溶液(pH＝8.0)平衡镍柱。

实施例5

上样及洗脱

a)将实施例3得到的酸性磷酸酶的粗酶液与镍填料混合均匀后转移至锥形瓶，在摇床冰浴孵育1-2h，转速100rm；

b)用1×PBS+10mM咪唑溶液(pH＝8.0)洗脱杂蛋白，再用1×PBS+200mM咪唑溶液(pH＝8.0)充分洗脱目的蛋白，收集洗脱液即得酸性磷酸酶的纯酶液。

实施例6

酶活力对比实验

酶活力测定方法：以终浓度200mM的KCl和400mM的MgCl₂为辅助因子，在一个200uL的反应体系中加入终浓度2mmol的NMN，再加入10uL的稀释后的纯酶液，空白对照用相应的缓冲液代替纯酶液，在37℃、pH7.0条件下，混匀反应10min后立即加入200μL10％三氯乙酸溶液混匀，终止反应，取样用甲醇稀释50倍后进HPLC检测产物的量，计算酶活力单位U。

酸性磷酸酶酶活力U的定义：在37℃、pH7.0条件下，1分钟内水解底物NMN释放出1umol所需的酶量，称为一个酶活力国际单位(U)。

酸性磷酸酶亲本和本发明的酸性磷酸酶突变体的酶活力及其稳定性对比实验结果见表2，其中，温度稳定性及pH稳定性是指目的酶在相应保存条件下储存12h后，残余活力≥90％的保存范围。

表2

结果表明本发明的酸性磷酸酶突变体与酸性磷酸酶亲本相比，酶活力、温度稳定性和pH稳定性均得到较为明显的提高。

实施例7

烟酰胺核糖的制备

设计总体系2L，设置底物终浓度为100g/L，准备一个干净的3L三口瓶，加入1L的ddH₂O，然后加入30g KCl和80g无水MgCl₂，搅拌使之溶解，待溶液温度降至室温，再加入200gNMN并用5M NaOH调节pH至6-7使其完全溶解。设置反应温度37℃，加入900ml实施例5得到的酸性磷酸酶突变体K115I的纯酶液，并用pH7.0的磷酸钠缓冲液补充到2L体系，调整反应体系到pH7.2，开始反应。反应2h后取反应液用纯水稀释50～100倍，微孔过滤后通过高效液相色谱分析反应结果，分析方法如表3所示，其HPLC图谱如图2所示。检测结果表明：底物NMN降解较为明显，大约42％的底物发生了降解，剩余的NMN转化为NR的转化率为99.9％。

表3

实施例8

设计总体系2L，设置底物终浓度为100g/L，准备一个干净的3L三口瓶，加入1L的ddH₂O，然后加入30g KCl和80g无水MgCl₂，搅拌使之溶解，待溶液温度降至室温，加入20g魔芋葡甘聚糖，再加入200g NMN并用5M NaOH调节pH至6-7使其完全溶解。设置反应温度37℃，加入900ml实施例5得到的酸性磷酸酶突变体K115I的纯酶液，并用pH7.0的磷酸钠缓冲液补充到2L体系，调整反应体系到pH7.2，开始反应。反应2h后取反应液用纯水稀释50～100倍，微孔过滤后通过高效液相色谱分析反应结果，分析方法如表3所示，其HPLC图谱如图3所示。检测结果表明：底物NMN未发生明显降解，NMN转化为NR的转化率为99.8％。

实施例9

设计总体系2L，设置底物终浓度为100g/L，准备一个干净的3L三口瓶，加入1L的ddH₂O，然后加入30g KCl和80g无水MgCl₂，搅拌使之溶解，待溶液温度降至室温，加入20g魔芋葡甘聚糖，再加入200g NMN并用5M NaOH调节pH至6-7使其完全溶解。设置反应温度37℃，加入900ml实施例5得到的酸性磷酸酶亲本的纯酶液，并用pH7.0的磷酸钠缓冲液补充到2L体系，调整反应体系到pH7.2，开始反应。反应2h后取反应液用纯水稀释50～100倍，微孔过滤后通过高效液相色谱分析反应结果，分析方法如表3所示，其HPLC图谱如图4所示。检测结果表明：底物NMN未发生明显降解，NMN转化为NR的转化率为72.5％。

实施例10

待制备烟酰胺核糖的催化反应完全后，通过200-400目滤布过滤酶反应液以除去其中的酸性磷酸酶，所得滤液加入2-6M盐酸调节PH至5.0左右，再通过0.45μm的微孔滤膜进行微滤，收集微滤液；用制备液相对微滤液进行纯化，制备液相的控制条件如表4所示，收集NR段的洗脱液，可得烟酰胺核糖纯度大于99％的水溶液；然后将所得纯度大于99％的烟酰胺核糖水溶液在25℃以下的温度下进行纳滤浓缩，使烟酰胺核糖浓度提高至50-60g/L，再加入盐酸调节PH至3-4；按浓度90g/L烟酰胺核糖水溶液加入魔芋葡甘聚糖，充分溶解搅并拌均匀；于冷冻干燥机中进行干燥处理，控制干燥过程中的升华温度在25℃以下，24小时后可得到白色粉末状的烟酰胺核糖精制品，纯度达99％以上。上述实施例7、8、9的酶反应液经分离纯化后得到的烟酰胺核糖精制品的产量和纯度如表5所示。

表4

表5

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序列表

<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司

邦泰合盛生物科技（深圳）有限公司

中山市邦泰合盛生物科技有限公司

<120> 一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

atgaccattg cgaaggatta ccgtaccatc tatcgtaacc agattaagaa acaaatccgt 60

ctgaaccagg agcacctgca aagcctgacc cacctgggta gccagattaa ctttgaagtg 120

gacccgccga agctgccgga tccggacccg gcgcgtaaag ttttcttttt cgatatcgac 180

aacaccctgt accgtaagag caccaaagtg cagctgctga tgcagcaaag cctgagcaac 240

tttttcaagt atgagctggg ctttgacgat gacgaggcgg aacgtctgat cgagagctac 300

tatcaagaat acggtctgag cgtgaaaggc ctgattaaga acaaacagat cgatgacgtt 360

ctgcaataca acaccttcat tgatgacagc ctgccgctgc aagattatct gaagccggac 420

tggaaactgc gtgaactgct gatcaacctg aagaaaaaga aactgggcaa gtttgacaaa 480

ctgtggctgt tcaccaacag ctataagaac cacgcgattc gttgcgtgaa aatcctgggt 540

attgcggacc tgttcgacgg catcacctac tgccactatg atcgtccgat tgaggaagag 600

ttcatctgca agccggaccc gaaatttttc gagaccgcga agctgcagag cggcctgagc 660

agctttgcga acgcgtggtt cattgatgac aacgagagca acgtgcgtag cgcgctgagc 720

atgggtatgg gccacgttat ccacctgatt gaagattacc aatatgagag cgaaaacatt 780

gttaccaagg accacaagaa caaacagcaa ttcagcatcc tgaaagatat cctggagatt 840

ccgctgatca tggacgtgga agtttaccgt ccgagcagca tcgcgattaa agagatggaa 900

gagctggaag aggaaggtga agcggtgaac tggagcaacc agcaaatcaa cgttcagagc 960

agctaa 966

<210> 2

<211> 321

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

Met Thr Ile Ala Lys Asp Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Asn Gln Ile Lys

1 5 10 15

Lys Gln Ile Arg Leu Asn Gln Glu His Leu Gln Ser Leu Thr His Leu

20 25 30

Gly Ser Gln Ile Asn Phe Glu Val Asp Pro Pro Lys Leu Pro Asp Pro

35 40 45

Asp Pro Ala Arg Lys Val Phe Phe Phe Asp Ile Asp Asn Thr Leu Tyr

50 55 60

Arg Lys Ser Thr Lys Val Gln Leu Leu Met Gln Gln Ser Leu Ser Asn

65 70 75 80

Phe Phe Lys Tyr Glu Leu Gly Phe Asp Asp Asp Glu Ala Glu Arg Leu

85 90 95

Ile Glu Ser Tyr Tyr Gln Glu Tyr Gly Leu Ser Val Lys Gly Leu Ile

100 105 110

Lys Asn Lys Gln Ile Asp Asp Val Leu Gln Tyr Asn Thr Phe Ile Asp

115 120 125

Asp Ser Leu Pro Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Trp Lys Leu Arg

130 135 140

Glu Leu Leu Ile Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Gly Lys Phe Asp Lys

145 150 155 160

Leu Trp Leu Phe Thr Asn Ser Tyr Lys Asn His Ala Ile Arg Cys Val

165 170 175

Lys Ile Leu Gly Ile Ala Asp Leu Phe Asp Gly Ile Thr Tyr Cys His

180 185 190

Tyr Asp Arg Pro Ile Glu Glu Glu Phe Ile Cys Lys Pro Asp Pro Lys

195 200 205

Phe Phe Glu Thr Ala Lys Leu Gln Ser Gly Leu Ser Ser Phe Ala Asn

210 215 220

Ala Trp Phe Ile Asp Asp Asn Glu Ser Asn Val Arg Ser Ala Leu Ser

225 230 235 240

Met Gly Met Gly His Val Ile His Leu Ile Glu Asp Tyr Gln Tyr Glu

245 250 255

Ser Glu Asn Ile Val Thr Lys Asp His Lys Asn Lys Gln Gln Phe Ser

260 265 270

Ile Leu Lys Asp Ile Leu Glu Ile Pro Leu Ile Met Asp Val Glu Val

275 280 285

Tyr Arg Pro Ser Ser Ile Ala Ile Lys Glu Met Glu Glu Leu Glu Glu

290 295 300

Glu Gly Glu Ala Val Asn Trp Ser Asn Gln Gln Ile Asn Val Gln Ser

305 310 315 320

Ser

<210> 3

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第115位点由亲本的赖氨酸突变为异亮氨酸

<400> 3

Met Thr Ile Ala Lys Asp Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Asn Gln Ile Lys

1 5 10 15

Lys Gln Ile Arg Leu Asn Gln Glu His Leu Gln Ser Leu Thr His Leu

20 25 30

Gly Ser Gln Ile Asn Phe Glu Val Asp Pro Pro Lys Leu Pro Asp Pro

35 40 45

Asp Pro Ala Arg Lys Val Phe Phe Phe Asp Ile Asp Asn Thr Leu Tyr

50 55 60

Arg Lys Ser Thr Lys Val Gln Leu Leu Met Gln Gln Ser Leu Ser Asn

65 70 75 80

Phe Phe Lys Tyr Glu Leu Gly Phe Asp Asp Asp Glu Ala Glu Arg Leu

85 90 95

Ile Glu Ser Tyr Tyr Gln Glu Tyr Gly Leu Ser Val Lys Gly Leu Ile

100 105 110

Lys Asn Ile Gln Ile Asp Asp Val Leu Gln Tyr Asn Thr Phe Ile Asp

115 120 125

Asp Ser Leu Pro Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Trp Lys Leu Arg

130 135 140

Glu Leu Leu Ile Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Gly Lys Phe Asp Lys

145 150 155 160

Leu Trp Leu Phe Thr Asn Ser Tyr Lys Asn His Ala Ile Arg Cys Val

165 170 175

Lys Ile Leu Gly Ile Ala Asp Leu Phe Asp Gly Ile Thr Tyr Cys His

180 185 190

Tyr Asp Arg Pro Ile Glu Glu Glu Phe Ile Cys Lys Pro Asp Pro Lys

195 200 205

Phe Phe Glu Thr Ala Lys Leu Gln Ser Gly Leu Ser Ser Phe Ala Asn

210 215 220

Ala Trp Phe Ile Asp Asp Asn Glu Ser Asn Val Arg Ser Ala Leu Ser

225 230 235 240

Met Gly Met Gly His Val Ile His Leu Ile Glu Asp Tyr Gln Tyr Glu

245 250 255

Ser Glu Asn Ile Val Thr Lys Asp His Lys Asn Lys Gln Gln Phe Ser

260 265 270

Ile Leu Lys Asp Ile Leu Glu Ile Pro Leu Ile Met Asp Val Glu Val

275 280 285

Tyr Arg Pro Ser Ser Ile Ala Ile Lys Glu Met Glu Glu Leu Glu Glu

290 295 300

Glu Gly Glu Ala Val Asn Trp Ser Asn Gln Gln Ile Asn Val Gln Ser

305 310 315 320

Ser

Claims

1.一种酸性磷酸酶突变体，其特征在于，与如SEQ ID NO：2所示的酸性磷酸酶亲本的氨基酸序列相比，所述的突变发生在第44位，所述突变为K44C；或所述的突变发生在第44位、第115位和第206位，所述突变为K44C，K115F，D206I。

2.一种烟酰胺核糖的制备方法，其特征在于所述方法包括：在KCl和无水MgCl₂存在的条件下，用如权利要求1所述的酸性磷酸酶突变体催化烟酰胺单核苷酸转化成烟酰胺核糖。

3.根据权利要求2所述的烟酰胺核糖的制备方法，其特征在于所述方法按顺序包括以下步骤：1)将KCl和无水MgCl₂溶解于水中，得KCl和MgCl₂的混合溶液；2)冷却至室温；3)向KCl和MgCl₂的混合溶液中加入烟酰胺单核苷酸溶解并调节pH值至6-7；4)加入酸性磷酸酶并调节pH值至6.8-7.3；5)37±5℃下反应至少1.5小时。

4.根据权利要求2或3所述的烟酰胺核糖的制备方法，其特征在于所述方法还包括：在所述酸性磷酸酶催化烟酰胺单核苷酸转化成烟酰胺核糖的酶反应开始之前，向反应体系中加入魔芋葡甘聚糖和/或莱鲍迪苷A。

5.根据权利要求2或3所述的烟酰胺核糖的制备方法，其特征在于：所述酸性磷酸酶以纯酶液的形式投加，所述纯酶液是指由含有所述酸性磷酸酶基因的微生物体诱导表达后经破胞、离心去除沉淀后的粗酶液再经镍柱纯化处理后得到的含有所述酸性磷酸酶的溶液。

6.根据权利要求2或3所述的烟酰胺核糖的制备方法，其特征在于，所述酸性磷酸酶为固定化酶，所述固定化酶通过以下方法制备：向所述酸性磷酸酶中加入0.2-0.8M K₂HPO₄，调节pH值为7.5-9.5，再加入固相树脂于室温下搅拌12-24h，过滤除去滤液后即得。

7.根据权利要求2或3所述的烟酰胺核糖的制备方法，其特征在于：所述方法还包括从酸性磷酸酶催化烟酰胺单核苷酸转化成烟酰胺核糖的酶反应液中纯化得到烟酰胺核糖精制品的后处理过程，所述后处理过程包括如下步骤：1)将酶反应液进行过滤，收集滤液；2)调节滤液的pH值为5.0±0.5；3)将步骤2)调节pH后的滤液进行微滤，收集滤液；4)将步骤3)微滤得到的微滤液用制备液相进行纯化，制备液相以聚苯乙烯为制备柱的填料，以乙醇和水为流动相，进行梯度洗脱，收集目的峰的洗脱液；5)将步骤4)收集的洗脱液进行冷冻干燥后即得烟酰胺核糖精制品。

8.一种制备酸性磷酸酶固定化酶的方法，所述酸性磷酸酶包括权利要求1所述的酸性磷酸酶突变体及其亲本，其特征在于，所述方法包括： 1)酸性磷酸酶亲本的制备，包括：通过PCR技术对酸性磷酸酶亲本的基因序列进行扩增；然后将扩增产物插入到表达载体上，得到重组质粒；经测序验证后将重组质粒转化入宿主细胞并进行培养和诱导表达；表达完成后收集细胞并进行破胞处理后收集上清液即得酸性磷酸酶亲本的粗酶液； 2)酸性磷酸酶突变体的制备，包括：利用反向PCR技术设计突变位点的引物序列；利用设计的引物以步骤1)的重组质粒为模板进行反向PCR扩增；然后将扩增产物用Dpn I酶消化模板处理后转化入宿主细胞并进行培养和诱导表达；表达完成后收集细胞并进行破胞处理后收集上清液即得酸性磷酸酶突变体的粗酶液； 3)用镍柱对酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液进行纯化，包括：a)镍柱制备：以琼脂糖凝胶为镍载体，用氯化镍溶液挂镍，用1×PBS+10mM咪唑溶液平衡镍柱；b)上样：将酸性磷酸酶亲本和/或突变体的粗酶液与镍填料均匀混合后于冰浴中孵育1-2h；然后将孵育后的混合物上样到步骤a)制备的镍柱中；c)洗脱：先用1×PBS+10mM咪唑溶液进行第一次洗脱；再用1×PBS+(200-500)mM咪唑溶液进行第二次洗脱，收集洗脱液即得酸性磷酸酶亲本和/或突变体的纯酶液； 4)用固相树脂进行固定化，包括：向步骤3)得到的纯化后的酶液中加入0.2-0.8M K₂HPO₄，调节pH值为7.5-9.5，再加入固相树脂于室温下搅拌12-24h，过滤除去滤液后即得酸性磷酸酶固定化酶。

9.一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或重组微生物，其特征在于：所述生物材料含有编码权利要求1所述的酸性磷酸酶突变体的基因。

10.权利要求1所述的酸性磷酸酶突变体在制备烟酰胺核糖中的应用。