CN102382871A - 一种改进的生产5’-呈味核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生化工程技术领域，一种改进的生产5’-呈味核苷酸的方法，具体涉及一种以DNA重组技术构建基因工程菌，对该基因工程菌进行突变筛选，并利用高活性基因工程菌生产5’-核苷酸的方法。包括如下步骤：1.利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌。2.酸性磷酸酶基因的突变与对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的筛选。3.以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’-核苷酸。利用本发明的方法催化合成5’-核苷酸，具有简单，高效，周期短，用菌量少，成本低，符合环保要求等特点，适合于工业化生产。

Description

一种改进的生产5’-呈味核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产5’-呈味核苷酸的方法，具体涉及一种利用高活性基因工程菌生产5’-呈味核苷酸的方法，属于生化工程技术领域， 

背景技术

5’-核苷酸常被用作食品添加剂和药物合成中间体，其中5’-肌苷酸(Inosine-5’-monophosphate，简称5’-IMP)和鸟苷酸(Guanosine-5’-monophosphate，简称5’-GMP)作为一种呈味剂可与味精(谷氨酸钠MSG)混合产生协同效应，使鲜度提高数倍至数十倍；此外它们对甜味、肉味有增效作用，对咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，因此在食品工业生产中越来越受到重视和欢迎。 

工业化生产5’-核苷酸的方法主要有核糖核酸(RNA)酶解法，利用谷氨酸产生菌、产氨短杆菌、谷氨酸杆菌等微生物直接发酵法以及利用枯草杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌等发酵肌苷后以化学法或者微生物酶法转化为5’-肌苷酸。这些方法或者反应物对人体有毒性或者反应底物昂贵或者副产物多，所以不能用来高效而廉价的生产5’-核苷酸。 

中国专利公开号CN101063126A公开了一种生产5’-呈味核苷酸的方法，利用酸性磷酸酶(acid phosphatase，EC3.1.3.2)以焦磷酸钠盐为磷酸供体生产5’-核苷酸，以突变后的基因工程菌为酶源，以50g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底物，基因工程菌用量为2％(湿重)，反应2小时5’-IMP累积量达到90.6g/L，转化率达到92％；以100g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底物时，基因工程菌用量为2％(湿重)，反应7小时后5’-IMP累积量达到153.7g/L，转化率达到78％。然而此方法仍然存在基因工程菌使用量高，转化率较低等缺点。 

发明内容

本发明的目的是提供一种酶，一个编码该酶的基因，含有该基因的重组DNA，可用于生产5’-呈味核苷酸的微生物，本发明的另一目的是提供一种高效廉价生产5’-呈味核苷酸的方法，以解决现有技术中基因工程菌使用量高，转化率不高的缺点。 

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现： 

一种改进的生产5’-呈味核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤： 

1.1利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌(Escherichia coli)，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌；所述的酸性磷酸酶来源于产气肠杆菌，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2； 

1.2酸性磷酸酶基因的突变与对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的筛选；该突变型的酸性磷酸酶的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.3，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4； 

1.3以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’-核苷酸。 

其中，步骤1.3所述的核苷为嘌呤核苷或嘧啶核苷之一种。 

其中，步骤1.3所述的磷酸基团供体为多磷酸或其盐，苯磷酸或其盐，氨甲酰磷酸或其盐，乙酰磷酸或其盐之一种。 

其中，步骤1.3中反应温度为20-50℃，缓冲液的pH值为2.5-6，反应底物中核苷浓度为10-200mM，磷酸基团供体浓度为其1-10倍；反应时间在1-24小时之间；所述酶源为DH5α/pBV220-mphoc，占反应体系(湿重)的0.1％-1％。 

具体包括： 

1.利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌(Escherichia coli)，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌。 

酸性磷酸酶的来源不做限制，只要能催化相应的核苷与磷酸基供体在酸性缓冲液中生成相应5’-核苷酸即可，例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)等，在特别推荐的方 案中，本发明使用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes W8401)的酸性磷酸酶。 

构建重组质粒的载体也不做限制，只要能高效表达外源的酸性磷酸酶即可，在特别推荐的方案中，本发明使用温度诱导型的表达载体pBV220，此载体不需使用化学诱导剂，只须提高温度到42℃诱导4h即可诱导外源蛋白的大量表达，相对于通常所用的由化学诱导剂诱导表达的表达质粒(如携带由IPTG诱导的lac启动子的质粒)而言，可以节约大量成本。 

培养微生物的培养基不受特别限制，为可以获得含有一般碳源，氮源，无机离子和可选的有机营养物质的普通培养基，在特别推荐的方案中，本发明使用的是LB培养基，配方如下：蛋白胨10g、酵母抽提物5g和NaCl10g，使用10mol/L NaOH调节pH为7.2，定容至1L。固体培养基只需在液体培养基内加入2％琼脂即可。 

培养微生物的条件也不特别限制，例如可以在需氧条件下培养12-48小时，同时将pH值控制在5-8，温度控制在25-40℃的范围。对于需要诱导表达外源蛋白质的微生物的培养，可以在上述的培养之后再根据相应表达载体选择相应的诱导表达条件，例如使用pBV220表达载体时，可在30℃培养16小时后，将温度提高到42℃的方法诱导表达外源蛋白质。 

2.酸性磷酸酶基因的突变与对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的筛选。 

酸性磷酸酶基因的突变的方法不受限制，只要能使酸性磷酸酶产生突变即可。比如可以用紫外光辐射或者用人工诱变剂处理含有该酶基因的微生物，也可以用定点突变的方法直接突变，或者DNA改组(DNA shuffling)的方法定向突变。 

对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的筛选的方法不做限制，只要能快速而高效的筛选到表达对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的微生物即可。 

3.以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’-核苷酸。 

使用的酸性磷酸酶的来源不做限制，只要能催化核苷与磷酸基团供体合成相应的5’-核苷酸即可。比如可以是经过初步抽提的粗酶，也可以是 源自细菌的非增殖的完整细胞作为酶源。在特别推荐的方案中，本发明使用表达外源酸性磷酸酶的基因工程菌作为酶源。 

使用的核苷不做限制，包括嘌呤核苷(比如肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、6-甲基嘌呤核苷、6-甲氧基嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、6-氟嘌呤核苷、6-硫代嘌呤核苷、巯基鸟苷、2-氨基6-硫代嘌呤核苷、阿拉伯糖腺苷等)，嘧啶核苷(比如尿苷、胞苷、5-氨基尿苷、5-羟基尿苷、5溴尿苷、6-氮杂尿苷、阿拉伯糖胞苷等)。 

使用的磷酸基团供体也不做限制，包括多磷酸及其盐(如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、它们的混合物、其钠盐、钾盐及其混合物)，苯磷酸及其盐(如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐及其混合物)，氨甲酰磷酸及其盐(如氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂及其混合物)，乙酰磷酸及其盐(如乙酰磷酸锂钾等)。 

反应的缓冲液的pH值为2.5-6之间。 

反应的温度为20-50℃。 

反应底物中核苷浓度为10-200mM，磷酸基团供体浓度为其1-10倍。 

反应可以在静止的条件下进行，也可以在适当的搅拌下进行。 

反应时间在1-24小时之间。 

反应完成后，可以使用合成树脂吸附的方法，使用沉淀剂的方法或其他常规收集和分离方法，从混合物中收集和分离由此生成的5’-核苷酸。 

利用本发明的方法催化合成5’-核苷酸，具有简单，高效，周期短，用菌量少，成本低，符合环保要求等特点，适合于工业化生产。 

本发明的有益效果： 

本发明酸性磷酸酶存在如下突变：L81Q，A83Q，E84A，N87D，S89A，A90F，G92D，T153K，E154D，L158F，T1169S，I171T。新增突变使得酸性磷酸酶的磷酸转移酶活性进一步提高，基因工程菌用量减少，反应时间缩短，5’-肌苷酸累积量也得到提高。以50g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底物，基因工程菌用量为0.5％(湿重)，反应2小时5’-IMP累积量达到94.6g/L，转化率达到96％；以80g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底 物，基因工程菌用量为0.5％(湿重)，反应6小时5’-IMP累积量达到144.4g/L，转化率达到92％；以100g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底物，基因工程菌用量为0.5％(湿重)，反应6小时5’-IMP累积量达到167.5g/L，转化率达到85％。(现有技术(中国专利公开号CN101063126A)引入突变S89N，A90F，G92D，I171T后以50g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底物，基因工程菌用量为2％(湿重)，反应2小时5’-IMP累积量达到90.6g/L，转化率达到92％；以100g/L的肌苷与300g/L的焦磷酸钠为底物时，基因工程菌用量为2％(湿重)，反应7小时后5’-IMP累积量达到153.7g/L，转化率达到78％。 

附图说明

图1为本发明的不同菌量对酶反应的影响。 

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明不仅限于这些例子。 

实施例1 

1.基因工程菌的构建 

根据GeneBank中提供的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的phoc基因序列(GeneBank access：AB044338.1)设计引物如下： 

Primer 1：5’-cgggatcccatgaaaaagcgcgttctcgccctctg-3’(BamHI)(记为SEQ.ID.NO.5)， 

Primer2：5’-ccgctcgagcgatgacgttacttctgcgttttggcg-3’(XholI)(记为SEQ.ID.NO.6)， 

以产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes W8401)的染色体DNA为模板做PCR：95℃5min，30×(95℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。得到长度约760bp的PCR产物，与pBV220载体分别经限制性内切酶酶切后用T4DNA连接酶连接，转化E.coli DH5α感受态细胞。用pBV220载体通用引物PCR及限制性酶切鉴定转化子得到基因工程菌DH5α/pBV220-phoc。DNA测序结果为SEQ.ID.NO.1： 

atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctggccagtttcttctccgttaacgcctttgctctggttccccccgggaacgatgtcaccaccaagcccgatctctactatctgaccaatgcccaggccatcgacagcctggcgctgttgccaccaccgccggcggtgggcagtatcgcatttttaaacgatcaggcgatgtatgagcaaggacgtctgctgcgcaataccgagcgcgggaagctggcggcagaggatgctaacctcagcgcgggcggcgtggccaacgccttctccagcgcctttggttcgccgattaccgagaaagacgcgccgcagcttcacaaactgctgaccaatatgattgaagacgccggcgacctggcgacccgcagcgcgaaagagaaatacatgcgcattcgcccgtttgcgttctatggcgtctccacctgcaacaccaccgaacaggacaagctggcgaaaaacggctcttacccgtccgggcatacctctatcggctgggccaccgccctggtgctggcggagatcaacccgcagcggcaaaacgaaattttgaagcgcggctatgagctcggcgagagccgggtgatctgcggctatcactggcagagcgatgtcgatgcggcgcgcatcgtcggctccgcggtggtcgctacgctgcacaccaacccggccttccagcagcagttgcagaaagccaaagatgaattcgccaaaacgcagaagtaa 

其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2： 

mkkrvlalclasffsvnafalvppgndvttkpdlyyltnaqaidslallppppavgsiaflndqamyeqgrllrntergklaaedanlsaggvanafssafgspitekdapqlhklltnmiedagdlatrsakekymrirpfafygvstcntteqdklakngsypsghtsigwatalvlaeinpqrqneilkrgyelgesrvicgyhwqsdvdaarivgsavvatlhtnpafqqqlqkakdefaktqk 

与GeneBank提供的氨基酸序列同源性为97.2％，存在以下改变：L13F，A24P，A28V，K38T，E54A，K69Q，S159A。 

2.湿菌体的制备。 

重组菌活化后接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养到OD₆₀₀0.6时立即升温至42℃培养4h，离心后的菌体用10mM pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤，再离心得湿菌体。 

3.酶催化合成5’-肌苷酸(5’-IMP)。 

反应体系如下： 

缓冲液：100mM pH3.5的醋酸盐缓冲液 

底物：10g/L肌苷Ir和250g/L Na₄P₂O₇·10H₂O 

菌体量：2％(湿重) 

于30℃水浴摇床上反应，摇速150r/min，反应结束后100℃煮沸5min，12000r/min离心5min得上清液。 

取2.5μl样品TLC检测其5’-IMP浓度，方法如下：以硅胶GF254铺板，TLC流动相为正丙醇/氨水/水(20/15/4)，层析后晾干，紫外下刮下5’-IMP所对应的点，加入2ml水溶解1小时，离心后紫外分光光度计测定其OD₂₄₉，以不同浓度的5’-IMP OD₂₄₉所做的标准曲线来定量。根据以下公式计算转化率。 

反应5小时5’-IMP浓度达到8.29g/L，转化率达到42.1％。 

实施例2酸性磷酸酶基因phoc突变 

设计8对引物：420，421；422，423；424，425；426，427；428，429；430，431；432，433；434，435。分别记为SEQ.ID.NO.7～22，如表1所示。 

第一轮PCR：分别以通用引物primer1和421以及通用引物primer2和420为引物，以质粒pBV220-phoc为模版，PCR扩增得到两段序列。PCR条件如实施例1步骤1所述。胶回收两片段，用图片扫描软件(Smartview)定量。 

第二轮PCR：以primer1，primer2为引物，以50ng回收片段为模版(1∶1)，进行PCR反应，条件同实施例1步骤1。 

回收目的片段，BamH I，Xhol I酶切过夜，连入经BamH I，Xhol I双酶切的pBV220载体，转化E.coli DH5α(上海复昌科技有限公司保藏)后，验证阳性质粒，测序。 

重复上述步骤依次在Enterobacter aerogenes W8401酸性磷酸酶基因中引入其他11个点突变，获得含有12个点突变的基因工程菌DH5α/pBV220-mphoc。 

表1本发明中使用到的引物 

突变后基因序列为SEQ.ID.NO.3： 

Atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctggccagtttcttctccgttaacgcctttgctctggttccccccgggaacgatgtcaccaccaagcccgatctctactatctgaccaatgcccaggccatcgatagcctggcgctgttgccaccaccgccggcggtgggcagtatcgcatttttaaacgatcaggcgatgtatgagcaaggacgtctgctgcgcaataccgagcgcgggaagcaggcgcaagcggatgctgacctcgcattcggcgacgtggccaacgccttctccagcgcctttggttcgccgattaccgagaaagacgcgccgcagcttcacaaactgctgaccaatatgattgaagacgccggcgacctggcgacccgcagcgcgaaagagaaatacatgcgcattcgcccgtttgcgttctatggcgtctccacctgcaa caccaaagaccaggacaagttcgcgaaaaacggctcttacccgtccgggcatagctctaccggctgggccaccgccctggtgctggcggagatcaacccgcagcggcaaaacgaaattttgaagcgcggctatgagctcggcgagagccgggtgatctgcggctatcactggcagagcgatgtcgatgcggcgcgcatcgtcggctccgcggtggtcgctacgctgcacaccaacccggccttccagcagcagttgcagaaagccaaagatgaattcgccaaaacgcagaagtaa 

其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4： 

Mkkrvlalclasffsvnafalvppgndvttkpdlyyltnaqaidslallppppavgsiaflndqamyeqgrllrntergkqaqadadlafgdvanafssafgspitekdapqlhklltnmiedagdlatrsakekymrirpfafygvstcntkdqdkfakngsypsghsstgwatalvlaeinpqrqneilkrgyelgesrvicgyhwqsdvdaarivgsavvatlhtnpafqqqlqkakdefaktqk 

存在如下突变：L81Q，A83Q，E84A，N87D，S89A，A90F，G92D，T153K，E154D，L158F，T169S，I171T。 

实施例3催化合成5’-肌苷酸(5’-IMP) 

实验1： 

以DH5α/pBV220-mphoc为酶源催化合成5’-IMP，反应体系如下： 

缓冲液：100mM pH 4.0的醋酸盐缓冲液 

底物：50g/L Ir和300g/L Na₄P₂O₇·10H₂O 

菌体量：0.5％(湿重) 

反应2小时5’-IMP浓度达到94.6g/L，转化率达到96％。 

实验2： 

以DH5α/pBV220-mphoc为酶源催化合成5’-IMP，反应体系如下： 

缓冲液：100mM pH 4.0的醋酸盐缓冲液 

底物：80g/L Ir和300g/L Na₄P₂O₇·10H₂O 

菌体量：0.5％(湿重) 

反应6小时5’-IMP浓度达到144.4g/L，转化率达到92％。 

实验3： 

以DH5α/pBV220-mphoc为酶源催化合成5’-IMP，反应体系如下： 

缓冲液：100mM pH 4.0的醋酸盐缓冲液 

底物：100g/L Ir和300g/L Na₄P₂O₇·10H₂O 

菌体量：0.5％(湿重) 

反应6小时5’-IMP浓度达到167.5g/L，转化率达到85％。 

其余详细见表2。 

表2各个体系反应实验 

对照为现有技术(中国专利公开号CN101063126A)引入突变S89N，A90F，G92D，I171T后的酸性磷酸酶8265。本发明在此基础上引入8个新的点突变，获得新的基因工程菌株DH5α/pBV220-mphoc。与对照基因工程菌8265相比，此基因工程菌具有更高的磷酸转移酶活性，在酶催化反应中基因工程菌用量进一步减少，反应时间进一步缩短，转化率进一步得到提高。 

实施例4不同菌量对酶反应的影响 

由于DH5α/pBV220-mphoc具有较高的5’-核苷酸水解酶活性，所以当酶量加大时，生成的5’-肌苷酸很快就会被分解，比如加入50mg菌量时，在48小时内生成的5’-肌苷酸就已经完全分解。而减少菌量可以有效减慢这个过程，不过此时达到最高转化率的时间也相应延长，详细见图1。 

图1为不同菌量对酶反应的影响。反应缓冲液：100mM醋酸钠盐缓冲 液(pH 4.0)；反应底物：80g/L肌苷和300g/L焦磷酸钠；菌株：DH5α/pBV220-mphoc；反应体系：5mL；反应温度为30℃，水浴摇床摇速200r/min。在不同时间点取样，加入0.2倍体积2N HCl终止反应。HPLC检测不同菌株催化反应中5′-肌苷酸的生成量。菌量(湿重)：5mg(◆)，10mg(■)，25mg(▲)，50mg(×)。 

实施例5酸性磷酸酶合成其他5’-核苷酸 

DH5α/pBV220-mphoc除了能催化肌苷的磷酸转移反应，也能催化其他核苷的磷酸转移反应，其中对嘌呤核苷的催化效率比较高，而对嘧啶核苷的催化效率比较低，尤其是脱氧尿嘧啶核苷，24小时转化率才能达到42％，具体结果参见表3。 

表3酸性磷酸酶合成其他5’-核苷酸 

反应条件： 

在100mM醋酸钠盐缓冲液(pH 4.0)中，以20g/L核苷和300g/L的焦磷酸为底物，按照重量百分比计，0.5％的DH5α/pBV220-mphoc为酶源(湿重)，反应温度为30℃，水浴摇床摇速200r/min。在不同时间点取样，加入0.2倍体积2N HCl终止反应。HPLC检测反应中5′-核苷酸的生成量。 

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。 

Claims (4)

1.一种改进的生产5’-呈味核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1.1利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌(Escherichia coli)，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌；所述的酸性磷酸酶来源于产气肠杆菌，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2；

1.2酸性磷酸酶基因的突变与对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的筛选；该突变型的酸性磷酸酶的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.3，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4；

1.3以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’-核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3所述的核苷为嘌呤核苷或嘧啶核苷之一种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3所述的磷酸基团供体为多磷酸或其盐，苯磷酸或其盐，氨甲酰磷酸或其盐，乙酰磷酸或其盐之一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3中反应温度为20-50℃，缓冲液的pH值为2.5-6，反应底物中核苷浓度为10-200mM，磷酸基团供体浓度为其1-10倍；反应时间在1-24小时之间；所述酶源为DH5α/pBV220-mphoc，占反应体系湿重的0.1％-1％。

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