KR20070056491A - 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 코딩유전자가 도입된 미생물 및 이를 사용한 ５’-크산틸산의생산방법 - Google Patents

포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 코딩유전자가 도입된 미생물 및 이를 사용한 ５’-크산틸산의생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate: 이하 PRPP) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호 하는 유전자 purF에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머, purF 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하며, 또한 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 purF 유전자로 형질전화킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 및 CJXCFR KCCM-10700P, 그리고 이들을 육종 및 배양하여 5’-크산틸산(xanthosine 5’-monophosphate, 이하 XMP)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530 균주의 특징인 아데닌 요구성, 구아닌 요구성, 라이소자임 감수성, 프롤린유사체 내성, 글루타민유사체 내성, 트립토판유사체 내성을 동일하게 보유함과 동시에, 세포내 5’-크산틸산 (XMP) 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자 발현량이 증가하여, 효소의 활성이 증가되었을 뿐만 아니라 상기 효소에 대한 조절이 해제되어 5’-크산틸산 (XMP) 생산능이 탁월하게 향상된 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명을 이용하면 직접발효법에 의하여 5’-크산틸산(XMP)을 배양액 내에 고수율로 직접 축적하므로, 5’-크산틸산(XMP)을 고농도, 고수율로 생산할 수 있다.
코리네박테리움 암모니아게네스, 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 효소, purF, 5’-크산틸산

Description

포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 코딩 유전자가 도입된 미생물 및 이를 사용한 ５’-크산틸산의 생산방법{Microorganisms having a gene purF and production method of xanthosine 5′-monophosphate using the same}
도 1은 셔틀벡터인 pECCG117에 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 purF를 도입하여 재조합 벡터 pECCG117-purF를 제작하고 이를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 형질전환시키는 과정을 나타내는 도이며,
도 2는 재조합 벡터 pSecB-purF를 나타내는 도이다.
본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate: 이하 PRPP) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호 하는 유전자 purF를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 형질전환시킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 및 CJXCFR KCCM-10700P, 그리고 이들을 육종 및 배양하여 5’-크산틸산(xanthosine 5’-monophosphate, 이하 XMP)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
5’-구아닐산(GMP)은 5’-이노신산(IMP)과 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. 5’-구아닐산은 그 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 5’-이노신산과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.
지금까지 알려진 5’-구아닐산의 제조방법은 첫째, 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, 둘째, 미생물 발효법으로 5’-구아닐산을 직접 발효하는 방법, 셋째, 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, 넷째, 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, 다섯째, 미생물 발효법으로 생산한 5’-크산틸산(XMP)를 코리네형 미생물을 이용하여 5’-구아닐산으로 전환하는 방법, 여섯째, 미생물 발효법으로 생산한 5’-크산틸산(XMP)를 대장균을 이용하여 5’-구아닐산으로 전환시키는 방법이 있다.
상기 방법 중에서 첫째는 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, 두번째의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다. 특히, 5’-크산틸산 (XMP)를 효소적으로 전환시키는 방법이 널리 이용되고 있다.
5’-크산틸산은 핵산 생합성 대사계의 중간 물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를가질 뿐만 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료분야 등 다방면에 이용되고 있다.
종래 5’-크산틸산(XMP)의 제조방법에는 화학합성법, 또는 효모 중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5’-구아닐산(GMP)을 탈아미노화하는 제조법, 그리고 발효법으로는 발효배지내 전구물질로 크산틴(Xanthine)을 첨가하는 방법과 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-1477, 소 44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소42-3825, 소42-3838) 등이 알려져 있다. 이 중에서도 미생물 변이주에 의한 5’-크산틸산 (XMP)의 직접적인 발효 제조 방법이 경제적으로 유리하다. 5’-크산틸산 (XMP) 고생산성 균주로 개발하기 위해서는 생합성에 관련된 효소들을 증폭하거나 변이를 발생시켜 생성물에 대한 저해를 풀어주는 방법이 이용되고 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 고생산성으로 5’-크산틸산 (XMP)을 생산하는 미생물을 개발하고자 퓨린(purine) 생합성 경로가 강화되었을 것으로 예상되는 5’-이노신산(IMP) 생산주인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100 KCCM-10330의 퓨린(purine) 생합성 관련 유전자인 purF 유전자를 5’-크산틸산(XMP) 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301 KCCM-10530에 도입함으로써 기존보다 5’-크산틸산 (XMP) 생산이 향상된 미생물을 제작함으로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate: 이하 PRPP) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호 하 는 유전자 purF를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM-10530에 형질전화킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 및 CJXCFR KCCM-10700P, 그리고 이들을 육종 및 배양하여 5’-크산틸산(xanthosine 5’-monophosphate, 이하 XMP)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호하는 유전자 purF에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호하는 유전자 purF를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pECCG117-purF 또는 도 2의 개열지도를 갖는 pSecB-purF를 의미한다.
본원발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 코리네박테리움 암모니아게네스 숙주세포를 제공한다.
또한, 본원발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5- phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호하는 유전자 purF를 재조합 벡터 pECCG117-purF를 이용하여 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 형질전환시킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P을 제공하며,
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호 하는 유전자 purF를 재조합 벡터 pSecB-purF를 이용하여 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 형질전화킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P을 제공한다.
또한 본원발명 상기 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P을 이용하여 5′-크산틸산을 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제는 5′-크산틸산(XMP) 생합성에 관련된 주요 효소 중에서 퓨린 뉴클레오타이드에 의한 조절을 많이 받는 것으로서, 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP)에 글루타민의 아미드기(amide)를 이동시켜 5’-포스포리보실아민 (5-phosphoribosylamine)을 만드는 역할을 한다. 따라서, 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제는 5’-이노신산(IMP), 5’-아데닌산(5’-adenosine monophosphate: AMP), 5’-구아닐산(5’- guanine monophosphate: GMP) 등의 퓨린 뉴클레오타이드에 의해 발현 및 활성이 저해(feedback inhibition)를 받는다.
포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제의 상기와 같은 특징에 착안하여, 기존의 5’-이노신산(IMP) 생산주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 KCCM-10330와 5’-크산틸산(XMP) 생산균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM-10530의 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제를 코딩하는 purF 유전자 서열상에 차이가 있을 것으로 예상하고 유전자 변이를 확인한 결과, 5’-이노신산(IMP) 생산균주의 경우만 1개 이상의 변이가 발견되었고, 5’-크산틸산 생산균주의 경우 변이가 관찰되지 않았다. 또한 단백질 발현 양 측정 결과 5’-이노신산(IMP) 생산균주의 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제가 2~3배 이상이 과발현됨을 관찰하였다.
상기 결과로부터 5’-이노신산(IMP) 생산균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 KCCM-10330의 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제는 조절 기작이 해제되고 발현이 증가된 효소일 것으로 판단되었다. 따라서 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 KCCM-10330의 purF 유전자를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM-10530에 도입할 경우 탄소원의 이동이 퓨린 뉴클레오타이드 생합성 계로 더 많이 흘러, 결국 5’-크산틸산(XMP) 생산을 향상시키게 될 것이다.
따라서, 본 발명은 purF 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 제공한다.
purF를 코딩하는 유전자를 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 KCCM-10330의 염색체를 주형으로 이용하고 상기 purF에 특이하게 결합하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 PCR을 사용하여 증폭한 후, 제한효소로 절단하여 셔틀벡터에 도입(transformation)하거나 염색체 내로 직접도입(integration)하여 형질전환할 수도 있다.
상기 셔틀벡터에 도입시킬 경우, 본 발명은 purF 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제공할 수 있으며, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pECCG117-purF 또는 도 2의 개열지도를 갖는 pSecB-purF를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 코리네박테리움 암모니아게네스 숙주세포를 제공하며, 바람직하게는 상기 재조합 벡터를 포함하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM-10530을 의미한다.
따라서, 본 발명은 purF 유전자가 도입된 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 및 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P를 제공하며, 상기 본 발명의 형질전환된 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530 균주의 특징인 아데닌 요구성, 구아닌 요구성, 라이소자임 감수성, 프롤린유사체 내성, 글루타민유사체 내성, 트립토판유사체 내성 및 고수율로 XMP 생산하는 활성을 동일하게 보유한다.
그러므로 상기 본 발명의 미생물은 발효에 의한 5’-크산틸산 (XMP)의 제조에 적합한 미생물로서, 세포내 5’-크산틸산 (XMP) 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자 발현량이 증가하여, 효소의 활성이 증가되었을 뿐만 아니라 상기 효소에 대 한 조절이 해제되어 5’-크산틸산 (XMP) 생산능이 탁월하게 향상되었다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 미생물을 이용하여 직접발효법에 의하여 배양액내에 고수율로 5’-크산틸산(XMP)을 직접 축적하여 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명이 이에 의하여 한정되지는 않는다.
참조예 1. 배지조성
1-1. 영양배지의 조성
영양배지의 조성은 포도당 20g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, 효모엑기스 10g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150mg/ℓ 및 구아닌 150mg/ℓ로 구성되며, pH 7.2로 조정하였다.
1-2. 종배지의 조성
종배지의 조성은 포도당 30g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150mg/ℓ 및 구아닌 150mg/ℓ으로 구성되며, pH 7.2로 조정하였다.
1-3. 발효배지의 조성
발효배지 중 본 배지는 포도당 60g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 아데닌 30mg/ℓ, 구아닌 30mg/ℓ, 비오틴 100ug/ℓ, 황산구리 1mg/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ 및 염화칼슘 10mg/ℓ으로 구성되며, pH 7.2으로 조정하였다.
또한, 별살배지의 경우에는 인산제1칼륨 10g/ℓ, 인산제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ 및 황산암모늄 5g/ℓ으로 구성된다.
실시예 1. 재조합 벡터 pECCG117 - purF 제작 및 형질 전환 균주제작
코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자 서열을 함유하는 재조합 벡터 pECCG117-purF 제작 및 형질 전환 균주를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
1-1. 재조합 벡터 pECCG117 - purF 제작
에크만 등(Eikmann et al., Gene, 102, pp93-98, 1991)의 방법을 응용하여 1일 동안 참조 예 1-1의 영양배지에서 배양한 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330) 25 ㎖로부터 염색체 DNA 500 ㎍을 분리하였다.
상기에서 분리된 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 과발현 단백질인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 부위를 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머를 사용하여 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초간의 반응 사이클을 30 회 반복하는 PCR 반응을 수행함으로써 분리하였다.
상기에서 분리한 유전자를 제한효소 SalI 및 BamHⅠ로 절단하여 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 셔틀벡터인 pECCG117(KFCC-10673)의 SalI과 BamHⅠ 위치에 도입한 후, T4 리가제 10 유닛을 이용하여 16 ℃에서 16 시간동안 결찰반응을 수행하여 재조합 벡터 pECCG117-purF를 제작하였다(도 1 참조).
1-2. 형질전환 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV 제작
상기 실시예 1-1에서 제작한 재조합 벡터 pECCG117-purF를 반 데르 레스트 등의 방법(van der Rest et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 52, pp541-545, 1999)을 응용하여, 형질전환이 가능하게 만든 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301 KCCM-10530에 도입시켰다.
형질 전환된 균주를 카나마이신 10 ㎍/㎖이 포함된 상기 참조예 1-1의 영양배지에 도말하여 32 ℃에서 3일 동안 배양하면서 성장하는 균주를 선별하고 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV로 명명하고, 이를 한국미생물보존센터에 2005년 11월 16일자에 기탁하였고, 기탁번호는 KCCM-10701P이다.
실시예 2. 재조합 벡터 pSecB - purF 제작 및 형질 전환 균주제작
코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100 KCCM-10330의 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자 서열을 함유하는 재조합 벡터 pSecB-purF 제작 및 형질 전환 균주를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
2-1. 재조합 벡터 pSecB - purF 제작
에크만 등(Eikmann et al., Gene, 102, pp93-98, 1991)의 방법을 응용하여 1일 동안 참조예 1-1의 영양배지에서 배양한 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330) 25 ㎖로부터 염색체 DNA 500 ㎍을 분리하였다.
상기에서 분리된 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 과발현 단백질인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 부위를 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머를 사용하여 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초간의 반응 사이클을 30 회 반복하는 PCR 반응을 수행함으로써 분리하였다.
상기에서 수득한 유전자를 코리네형 세균에서 복제가 불가능하고 SecB 및 카나마이신 내성 유전자를 포함한 형태의 재조합 벡터 pSeB-purF를 상기 실시예 1의 재조합 벡터 재조합 벡터 pECCG117-purF 제작의 방법과 동일한 방법을 수행하여 재조합 벡터 pSeB-purF를 제작하였다(도 3 참조).
2-2. 형질전환 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR 제작
상기 실시예 2-1에서 제작한 재조합 벡터 pSeB-purF를 반 데르 레스트 등의 방법(van der Rest et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 52, pp541-545, 1999)을 응용하여, 형질전환이 가능하게 만든 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301 KCCM-10530에 도입시켰다.
형질 전환된 균주를 카나마이신 10 ㎍/㎖이 포함된 상기 참조예 1-1의 영양배지에 도말하여 32 ℃에서 3일 동안 배양하면서 성장하는 균주를 선별하고 다시 10% 수크로우즈(sucrose)가 들어간 상기 참조예 1-1의 영양배지에 도말하여 성장하는 콜로니를 다시 선별하였다.
상기 선별한 콜로니들을 영양배지 및 카나마이신이 첨가된 영양배지 모두에 동일하게 이동시킨 뒤 영양배지에서만 성장하는 콜로니만을 선별하였다. 최종적으로 purF를 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머 각각을 사용하여 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초간의 반응 사이클을 30 회 반복하여 PCR을 수행하여 서열분석을 하고 치환여부를 확인하였다.
치환이 확인된 균주 즉, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330)의 purF 유전자를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KCCM-10530에 도입시켜 형질전환된 균주를 제작하고 이를 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR로 명명하고, 한국미생물보존센터에 2005년 11월 16 일자에 기탁하였으며, 기탁번호는 KCCM-10700P이다..
실험예 1. 5′- 크산틸산 생산능 측정
상기 실시예 1-2에서 제작된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 및 상기 실시예 2-2에서 제작된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P의 5′-크산틸산 생산능을 실험하였다.
코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P 및 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301 KCCM-10530를 상기 참조예 1-2의 종배 지 5㎖을 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한 후 사용 균주를 접종하고 180rpm으로 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다.
상기 참조예 1-3의 발효배지 중 본배지와 별살배지를 각각 상법에 따라 가압 살균하여 미리 가압 살균한 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 29㎖과 10㎖ 씩 분주하고 상기에서 수득한 종배양액 1㎖을 식균한 다음 90시간 동안 배양하였다. 회전수는 200rpm, 온도 30℃로 조절하였다. 배양이 완료된 후 배지내의 5’-크산틸산 축적량을 측정하였다.
상기 실험 수행의 결과, 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJXFT0301 KCCM-10530의 경우에는 28.6g/ℓ이며, 본 발명의 실시예 1의 변이주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P균주는 32.1g/ℓ, 실시예 2의 변이주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P는 30.4g/ℓ임을 확인할 수 있었다.(5’-크산틸산의 축적 농도는 5’-크산틸산 나트륨·7H2O로 표시하였다.)
상술한 바와 같이, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate: 이하 PRPP) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호 하는 유전자 purF에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 프라이머, purF 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하며, 또한 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 purF 유전자로 형질전화킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 및 CJXCFR KCCM-10700P, 그리고 이들을 육종 및 배양하여 5’-크산틸산(xanthosine 5’-monophosphate, 이하 XMP)을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530 균주의 특징인 아데닌 요구성, 구아닌 요구성, 라이소자임 감수성, 프롤린유사체 내성, 글루타민유사체 내성, 트립토판유사체 내성을 동일하게 보유함과 동시에, 세포내 5’-크산틸산 (XMP) 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자 발현량이 증가하여, 효소의 활성이 증가되었을 뿐만 아니라 상기 효소에 대한 조절이 해제되어 5’-크산틸산 (XMP) 생산능이 탁월하게 향상된 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명을 이용하면 직접발효법에 의하여 5’-크산틸산(XMP)을 배양액 내에 고수율로 직접 축적하므로, 5’-크산틸산(XMP)을 고농도, 고수율로 생산할 수 있다.
<110> CJ Corp. <120> Microorganisms having a gene purF and production method of xanthosine 5-monophosphate using the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> primer for purF <400> 1 tcgactacgt agggccctac gcccccg 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> primer for purF <400> 2 ggatccgtta acctctgcga caaggc 26

Claims (7)

  1. 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호하는 유전자 purF에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머.
  2. 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호하는 유전자 purF를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pECCG117-purF 또는 도 2의 개열지도를 갖는 pSecB-purF임을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제 2항의 재조합 벡터를 포함하는 코리네박테리움 암모니아게네스 숙주세포.
  5. 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호하는 유전자 purF를 재조합 벡터 pECCG117-purF를 이용하여 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 형질전환시킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P.
  6. 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 포스포리보실 피로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 아미도트랜스퍼라제 효소를 암호 하는 유전자 purF를 재조합 벡터 pSecB-purF를 이용하여 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXFT0301 KCCM 10530에 형질전화킨 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P.
  7. 제 5항의 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFV KCCM-10701P 또는 제 6항의 코리네박테리움 암모니아게네스 CJXCFR KCCM-10700P를 이용하여 5′-크산틸산을 생산하는 방법.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100957690B1 (ko) * 2008-01-22 2010-05-12 씨제이제일제당 (주) 5'-크산틸산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물및 이를 이용한 5'-크산틸산의 생산 방법
WO2010071366A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Cj Cheiljedang Corporation A corynebacteria strain for enhancement of 5'-guanosine monophosphate productivity and a method of producing 5'-guanosine monophosphate using the same
KR101056872B1 (ko) * 2008-10-22 2011-08-12 씨제이제일제당 (주) 핵산계 물질의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용한 핵산계 물질의 생산 방법
WO2011115439A3 (ko) * 2010-03-19 2012-01-12 씨제이제일제당 (주) 5'-크산틸산 및 5'-구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산의 생산방법
KR102006977B1 (ko) * 2019-03-28 2019-08-05 씨제이제일제당 주식회사 변이형 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법
CN113853429A (zh) * 2020-02-21 2021-12-28 Cj第一制糖株式会社 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法
US11421200B2 (en) 2018-01-25 2022-08-23 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism of the genus Corynebacterium producing purine nucleotide and a method for producing purine nucleotide by using the same
CN113853429B (zh) * 2020-02-21 2024-06-07 Cj第一制糖株式会社 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100957690B1 (ko) * 2008-01-22 2010-05-12 씨제이제일제당 (주) 5'-크산틸산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물및 이를 이용한 5'-크산틸산의 생산 방법
KR101056872B1 (ko) * 2008-10-22 2011-08-12 씨제이제일제당 (주) 핵산계 물질의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용한 핵산계 물질의 생산 방법
WO2010071366A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Cj Cheiljedang Corporation A corynebacteria strain for enhancement of 5'-guanosine monophosphate productivity and a method of producing 5'-guanosine monophosphate using the same
EP2358865A2 (en) * 2008-12-17 2011-08-24 CJ CheilJedang Corporation A corynebacteria strain for enhancement of 5'-guanosine monophosphate productivity and a method of producing 5'-guanosine monophosphate using the same
EP2358865A4 (en) * 2008-12-17 2013-08-21 Cj Cheiljedang Corp CORYNEBACTERIA STRUCTURE FOR REINFORCED 5'-GUANOSINE MONOPHOSPHATE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF 5'-GUANOSINE MONOPHOSPHATE THEREWITH
WO2011115439A3 (ko) * 2010-03-19 2012-01-12 씨제이제일제당 (주) 5'-크산틸산 및 5'-구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산의 생산방법
JP2013521826A (ja) * 2010-03-19 2013-06-13 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション ５’−キサンチル酸及び５’−グアニル酸の生産能が向上した微生物、及びこれを用いた５’−キサンチル酸及び５’−グアニル酸の生産方法
US8859236B2 (en) 2010-03-19 2014-10-14 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism with improved production of 5′-xanthosine monophosphate and 5′-guanine monophosphate, and production method of 5′-xanthosine monophosphate and 5′-guanine monophosphate using same
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KR102006977B1 (ko) * 2019-03-28 2019-08-05 씨제이제일제당 주식회사 변이형 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법
CN112004926A (zh) * 2019-03-28 2020-11-27 Cj第一制糖株式会社 变体磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶及使用其制备嘌呤核苷酸的方法
US11008599B2 (en) 2019-03-28 2021-05-18 Cj Cheiljedang Corporation Variant phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase and method of preparing purine nucleotide using the same
TWI738050B (zh) * 2019-03-28 2021-09-01 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶及使用該轉移酶製備嘌呤核苷酸的方法
CN112004926B (zh) * 2019-03-28 2021-11-12 Cj第一制糖株式会社 变体磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶及使用其制备嘌呤核苷酸的方法
WO2020196993A1 (ko) * 2019-03-28 2020-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법
CN113853429A (zh) * 2020-02-21 2021-12-28 Cj第一制糖株式会社 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法
CN113853429B (zh) * 2020-02-21 2024-06-07 Cj第一制糖株式会社 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法

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