TWI738050B

TWI738050B - 變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶及使用該轉移酶製備嘌呤核苷酸的方法

Info

Publication number: TWI738050B
Application number: TW108131886A
Authority: TW
Inventors: 李智惠; 朴素靜; 白珉知
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2021-09-01
Also published as: AU2019226146A1; HUE063033T2; US20210047666A1; EP3739044A1; ZA201905668B; PT3739044T; ES2955417T3; EP3739044A4; JP2021512586A; BR112019020178B1; BR112019020178A2; WO2020196993A1; MX2019011479A; EP3739044B1; SG11201907885WA; JP6891292B2; AU2019226146B2; CN112004926B; TW202035686A; KR102006977B1

Abstract

所提供的是變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶、包含該轉移酶的微生物及使用該轉移酶來製備嘌呤核苷酸的方法。

Description

變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶及使用該轉移酶製備嘌呤核苷酸的方法

本公開涉及變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶、包含該轉移酶的微生物、使用該轉移酶來製備嘌呤核苷酸的方法、用於製備嘌呤核苷酸的組成物、增加嘌呤核苷酸產量的方法或變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的用途。

5'-肌苷酸(5'-次黃嘌呤核苷單磷酸鹽；以下簡稱為IMP)，是核苷酸系的材料，是核酸生合成代謝系統的中間材料，並且在多種領域中使用，諸如作為醫療產品及醫療應用。IMP是和5'-鳥苷酸(5'-鳥嘌呤單磷酸鹽；以下簡稱為GMP)一起廣泛使用作為食品調味添加劑或食品用的材料。已知IMP本身具有牛肉風味，且已知如同GMP加強麩胺酸鈉(MSG)的風味。因此，IMP作為核苷酸系味道調味料備受關注。

製備IMP的方法包含酵素降解提取自酵母細胞的核糖核酸的方法、將經由醱酵而產生的肌苷化學磷酸化的方法(Agri.Biol.Chem.,36, 1511(1972)，等)、培養能夠直接生產IMP的微生物然後從其培養物中回收IMP的方法等。這些方法中，最常用的方法是使用能夠直接生產IMP的微生物的方法。

再者，製備GMP的方法包含利用棒狀桿菌群微生物將經由微生物醱酵所生產的5'-黃苷酸(5'-黃核苷單磷酸鹽；以下簡稱為XMP)轉化成GMP的方法，及利用大腸桿菌將經由微生物醱酵所生產的XMP轉化成GMP的方法。根據這些方法，生產XMP然後轉化成GMP時，有必要提高XMP的產率，XMP是微生物醱酵過程中轉化反應的前體，並且需要防止在整個轉化反應中已經產生的GMP的損失以及所產生的XMP的損失。

同時，處於自然狀態的酶在工業應用上所需的活性、穩定性、對光學異構物的基質特異性等方面，無法一直展現最佳性質。因此，曾進行各種嘗試通過改變彼等的胺基酸序列等來改善酶，使得它們變得適合於預期的用途。其中，已經應用酶的合理設計及定點突變以改善酶的功能。然而，在許多情況下，存在的缺點是關於目標酶結構的訊息不充分，或者結構與功能間的關係不清楚，因此，不能有效地應用這些方法。對此，已報導為了嘗試改善酶，藉由定向進化(directed evolution)方法，從突變體酶庫中篩選所需性狀的酶以獲得其活性的改善，所述突變體酶文庫係通過酶基因的隨機突變而構建。

本發明者等人進行深入研究以微生物醱酵生產嘌呤核苷酸的方法來生產高產率的嘌呤核苷酸，並且他們識別出具有高嘌呤核苷酸生產力的蛋白質變異體，從而完成本公開。

本公開的目的是提供一種變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。

本公開的另一個目的是提供編碼該變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸。

本公開的又另一個目的是提供包含該多核苷酸的載體。

本公開的又另一個目的是提供生產嘌呤核苷酸的微生物，該微生物包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶或載體。

本公開的又另一個目的是提供製備嘌呤核苷酸的方法，該方法包含在培養基中培養棒狀桿菌屬微生物的步驟。

本公開的又另一個目的是提供用於生產嘌呤核苷酸的組成物，該組成物包括本公開的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。

本公開的又另一個目的是提供增加嘌呤核苷酸產量的方法，該方法包括本公開的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。

本公開的又另一個目的是提供變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶用於製造嘌呤核苷酸的用途。

本公開的又另一個目的是提供多核苷酸用於製造嘌呤核苷酸的用途。

本公開的又另一個目的是提供棒狀桿菌屬微生物用於生產嘌呤核苷酸的用途。

使用本公開變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶培養棒狀桿菌屬微生物時，可以以高產率生產嘌呤核苷酸。再者，所製備的嘌呤核苷酸不僅可應用於動物飼料或動物飼料添加劑，還可以應用於各種產品諸如人類食品或食品添加劑、調味料、藥品等。

詳細說明如下。同時，本申請中所公開的各個說明及實施例也可應用於其他說明及實施例。亦即，本申請中所公開的各種元件的所有組合都屬於本申請的範圍內。再者，本申請的範圍不受以下所描述的特定說明的限制。

為了實現上述目的，本公開的一方面提供變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶，其具有在SEQ ID NO：2胺基酸序列中包含一個或多個胺基酸取代的多肽。具體地，本公開提供具有在SEQ ID NO：2胺基酸序列中包含一個或多個胺基酸取代的多肽的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶，其中胺基酸取代包含從SEQ ID NO：2 N-端的位置2胺基酸的取代及/或位置445胺基酸的取代。

本公開的另一方面提供變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶，其中從SEQ ID NO：2胺基酸序列N-端：i)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸，ii)精胺酸取代位置445的胺基酸，或iii)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸及精胺酸取代位置445的胺基酸。

如本文所使用，術語「磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶」是指在嘌呤生合成中具有重要作用的酶。關於本公開的目的，該酶是指涉及嘌呤核苷酸製造的蛋白質。

本公開中，SEQ ID NO：2是指具有磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性的胺基酸序列。具體地，SEQ ID NO：2是具有磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性之蛋白質的序列，該轉移酶經由purF基因編碼。SEQ ID NO：2胺基酸序列可從NCBI GenBank獲得，NCBI GenBank是公共資料庫。例如，雖然不限於此，但SEQ ID NO：2胺基酸序列可衍生自棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)，並可不受限制地包含具有與上述胺基酸序列相同活性的任何序列。再者，SEQ ID NO：2胺基酸序列的範圍可包含具有SEQ ID NO：2的磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶之活性的胺基酸序列或具有與此有80%或更高相似性或一致性的胺基酸序列，但不限於此。具體地，胺基酸序列可包含SEQ ID NO：2胺基酸序列或具有與SEQ ID NO：2胺基酸序列至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高相似相似性或一致一致性的胺基酸序列。具有相似相似性或一致一致性的胺基酸序列可以是那些排除與上述範圍具有100%一致一致性的序列的胺基酸序列，或者可以是具有小於100%一致一致性的序列。再者，顯然地，具有一些胺基酸的缺失、修飾、取代或添加的胺基酸序列的蛋白質也屬於本發明的範圍，只要它具有相似相似性或一致一致性並且展現出與上述蛋白質相應的功效。

如本文所使用，術語"變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶"可與具有嘌呤核苷酸生產力的變體多肽、生產嘌呤核苷酸的變體多肽、生產嘌呤核苷酸的變體多肽、具有磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性的變體多肽、磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的變體等互換使用。

變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可包含在SEQ ID NO：2胺基酸序列中從N-端的位置2及/或位置445的變異。與包含SEQ ID NO：2胺基酸序列或衍生自野生型微生物的未修飾磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶者比較，變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可在SEQ ID NO：2胺基酸序列中的位置2及/或位置445由另一個胺基酸取代而加強活性。這樣的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶意指從SEQ ID NO：2 N-端的位置2或位置445的胺基酸具有變異及/或具有與SEQ ID NO：2至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高相似性一致性相似性或一致性的胺基酸序列的轉移酶，如以上所述。

例如，變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可在SEQ ID NO：2胺基酸序列中具有：i)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸，ii)精胺酸取代位置445的胺基酸，或iii)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸及精胺酸取代位置445的胺基酸，且相較於包含SEQ ID NO：2胺基酸序列的多肽，可具有加強的磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性，但不限於此。

關於本公開的目的，包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的微生物具有比野生型微生物、包含野生型磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的微生物或不包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的微生物較高的嘌呤核苷酸生產力。本公開的重要性在於，經由使用本公開的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可增加微生物的嘌呤核苷酸產量，而棒狀桿菌屬的野生型菌株不能夠生產嘌呤核苷酸，或者即使它生產嘌呤核苷酸，也只能生產微量的嘌呤核苷酸。

具體地，變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可包含用另一個胺基酸取代位置2及/或位置445的胺基酸序列。具體地，變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可由多肽所組成，該多肽包含從SEQ ID NO：2胺基酸序列的N-端：i)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸，ii)精胺酸取代位置445的胺基酸，或iii)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸及精胺酸取代位置445的胺基酸。再者，變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可包含其中在SEQ ID NO：2胺基酸序列中從N-端的位置2及/或位置445的胺基酸經另一個胺基酸取代的胺基酸序列，或具有與此有80%或更高相似性或一致性的胺基酸序列，但不限於此。具體地，本公開變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶可包含多肽，而該多肽與在SEQ ID NO：2胺基酸序列中具有甲硫胺酸取代位置2的胺基酸或精胺酸取代位置445的胺基酸的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的相似性或一致性。再者，顯然地，具有在胺基酸序列位置2及/或445以外的其他胺基酸序列的缺失、修飾、取代或添加的胺基酸序列的蛋白質也屬於本發明的範圍，只要它具有相似性或一致性並且展現出與上述蛋白質相應的功效。

換言之，即使本公開描述一種「具有由特定SEQ ID NO：表示的胺基酸序列的蛋白質或多肽」，但顯然地也可在本公開中使用具有一些胺基酸的缺失、改變、取代、保守取代或添加的胺基酸序列的蛋白質，只要該蛋白質具有與具有相應SEQ ID NO：的胺基酸序列的多肽相同或相應的活性。例如，只要蛋白質具有與變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的活性相同或相應的活性，並不排除在胺基酸序列之前或之後其不改變蛋白質功能的序列添加、天然發生的突變、沉默突變或保守取代。顯然地，具有這種序列添加或突變的蛋白質也屬於本公開的範圍。

「保守取代」意指用具有相似結構及/或化學性質的另一個胺基酸來置換胺基酸。這種胺基酸取代通常可基於極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性質的相似性來進行。例如，帶正電荷的(鹼性)胺基酸包含精胺酸、離胺酸及組胺酸；帶負電荷的(酸性)胺基酸包含麩胺酸及天冬胺酸；芳香胺基酸包含苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸；及疏水性胺基酸包含丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸。

因此，本公開中，「變體」可進一步包含在「具有由特定SEQ ID NO：表示的胺基酸序列的蛋白質或多肽」中的一個或多個胺基酸的保守取代及/或修飾。例如，某些變體可包含其中一個或多個部分，諸如N-端先導序列或跨膜域已移除的變體。另外的變體可包含其中已從成熟蛋白質的N-及/或C-端移除一部分的變體。變體還可包含其他修飾，包含對多肽的性質及二級結構具有最小影響的胺基酸的缺失或添加。例如，多肽可與蛋白質的N-末端的訊號(或先導)序列接合，而共轉譯地或轉譯後地指導該蛋白質的轉移。為了容易鑑定、純化或合成多肽，多肽還可接合另外的序列或連接子。術語「變體」可與修飾、經修飾的蛋白質、經修飾的多肽、突變體、突變蛋白質、趨異(divergent)等互換使用，並且可使用任何術語而沒有限制，只要它是以經修飾的意義使用。

相似性及一致性意指兩種指定的胺基酸序列或核苷酸序列間的相關程度，並且可用百分比表示。術語相似性及一致性通常可彼此互換使用。

保守多核苷酸或多肽的序列相似性或一致性可經由標準比對算法來確定，而該標準比對算法與要使用的程式所建立的默認空位罰分一起使用。基本上，相似或一致序列可在中等或高度嚴格條件下沿其整個序列雜交，或在整個長度的至少約50%、約60%、約70%、約80%或約90%雜交。關於有待雜交的多核苷酸，也可考慮包含簡併密碼子而不是密碼子的多核苷酸。

通常，由於密碼子定義要編碼的胺基酸，經由配對三個核苷酸序列而形成密碼子。與待編碼的胺基酸相比，存在更多種類的密碼子，並且根據密碼子的組合，所產生的胺基酸種類不同。轉譯從起始密碼子開始，並且待轉譯的第一個胺基酸可以是fMet。通常，經由轉運對應於DNA的atg序列的mRNA密碼子的fMET而進行轉譯。然而，當mRNA ORF(開放閱讀框)的第一個DNA 是gtg或ttg時，可通過轉運fMET而進行轉譯。亦即，起始密碼子可以是atg、gtg或ttg。

任何兩個多核苷酸或多肽序列是否具有相似性、類似性或一致性，可經由，例如，習知的計算機演算法諸如"FASTA"程式，使用默認參數如Pearson et al.(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444中所述來測定，或者，經由使用在EMBOSS套裝程式的Needleman程式中實現的Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)來測定。(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(5.0.0版或更新版本)(包含GCG程式套裝程式(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994及[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可使用美國國家生物技術資訊中心的BLAST或ClustalW來測定相似相似性、類似性或一致性。

可經由使用GAP計算機程式來比較序列資訊而測定多核苷酸或多肽的相似性、類似性或一致性，例如，Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48：443，揭露於Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482。簡言之，GAP程式將類似性定義為用類似的排列符號(即，核苷酸或胺基酸)的數目除以兩個序列中較短序列中符號的總數。GAP程式的默認參數可包含：(1)一元比較矩陣(含有值1表示相同及值0表示不同)及Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的權重比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣)，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每個空位罰分3.0及每個空位的每個符號另外罰分0.10(或空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5)；及(3)末端空位不罰分。因此，術語「相似性」或「一致性」，如本文所使用，代表序列之間的相關性。

由於密碼子簡併性，顯然地，待轉譯成在SEQ ID NO：2胺基酸序列中從N-端的位置2及/或位置445的胺基酸具有另一個胺基酸的取代的變體多肽的多核苷酸，或與其具有相似性或一致性的變體多肽也包含在內。再者，經由在嚴格條件下與從已知基因序列(例如，與全部或部分核苷酸序列互補的序列)所製備的探針雜交，編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸序列，可以包含其胺基酸序列為在SEQ ID NO：2胺基酸序列中i)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸，ii)精胺酸取代位置445的胺基酸，或iii)甲硫胺酸取代位置2的胺基酸及精胺酸取代位置445的胺基酸，而沒有限制。

如本文所使用，術語「多核苷酸」是指作為核苷酸聚合物具有超過一定長度的DNA或RNA股，其係經由共價鍵連接的核苷酸單體的長鏈，更具體地，是指編碼多肽的多核苷酸片段。

編碼本公開的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸可不限制地包含任何多核苷酸序列，只要其編碼具有本公開的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性的變體多肽即可。在本公開中，編碼磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的胺基酸序列的基因是purF基因，具體地，該基因可衍生自停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)，但不限於此。

具體地，由於密碼子簡併性或經由考量允許多肽表達的微生物所優選的密碼子，可在不改變多肽的胺基酸序列的範圍內對本公開的多核苷酸的編碼區進行各種修飾。可以不限制地包含任何多核苷酸序列，只要其編碼具有在SEQ ID NO：2胺基酸序列中的位置2或位置445用另一個胺基酸取代的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。例如，本公開的多核苷酸可包含在SEQ ID NO：1中具有一些經修飾序列的序列，但不限於此。

再者，經由在嚴格條件下與從已知基因序列(例如，與全部或部分核苷酸序列互補的序列)所製備的探針雜交，編碼具有在SEQ ID NO：2胺基酸序列中的位置2或位置445用另一個胺基酸取代的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性的蛋白質的序列，也可以包含在內而沒有限制。「嚴格條件」意指允許多核苷酸間之特異性雜交的條件。這些條件在文獻中有詳細說明(如，J.Sambrook et al.，同上)。嚴格條件可包含在其下基因具有高相似性或一致性的條件，例如，具有40%或更高，具體地85%或更高，90%或更高，更具體地95%或更高，再更具體地97%或更高，特別具體地，99%或更高的相似性或一致性的基因能夠彼此雜交，而具有較低相似性或一致性的基因不能彼此雜交，或者是南方雜交用的常見洗滌條件的條件，如，鹽濃度及溫度相當於60℃、1×SSC、0.1% SDS，具體地是60℃、0.1×SSC、0.1% SDS，更具體地是68℃、0.1×SSC、0.1%SDS，洗滌一次，具體地，兩次或三次。

雜交需要兩個核酸具有互補序列，儘管取決於雜交的嚴格性，鹼基間的錯配(mismatches)是可能的。術語「互補」用於說明能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，關於DNA，腺苷與胸腺嘧啶互補，及胞嘧啶與鳥嘌呤互補。據此，本公開還可包含與完整序列互補的單離核酸片段以及基本上相似的核酸序列。

具體地，具有相似性或一致性的多核苷酸可經由雜交條件檢測，該雜交條件包含Tm為55℃並利用上述條件的雜交步驟。再者，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限於此，並且可以根據目的而由所屬領域熟練技術人員適當地控制。

用於雜交多核苷酸的適當嚴格性取決於多核苷酸的長度及互補程度，並且該變數是所屬領域熟知的(參見Sambrook et al.，同上，9.50-9.51,11.7-11.8)。

在本公開中，編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶之胺基酸序列的基因是purF基因，及編碼該purF基因的多核苷酸如以上所述。

在本公開中，編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸也如以上所述。

本公開的又另一方面提供編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸，或含有該多核苷酸的載體。

如本文所使用，術語「載體」意指含有編碼所需多肽的多核苷酸的核苷酸序列的DNA構建體(construct)，其與合適的控制序列可操作地連接，而使得所需多肽在合適的宿主中表達。控制序列可包含指導轉錄的啟動子、控制這種轉錄的某些操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結合位點的序列及控制轉錄及轉譯終止的序列。一旦轉形到合適的宿主中，載體可以獨立於宿主基因組進行複製或行使功能，或可自身整合到基因組中。

本公開所使用的載體沒有特別限制，只要該載體能在宿主細胞中複製，可使用所屬領域習知的任何載體。常用載體的實例可包含天然或重組的質體、黏接質體、病毒及噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、 IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等作為噬菌體載體或黏接質體載體，及可使用那些基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的作為質體載體。具體地，可使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等載體。

例如，可將編碼所需多肽的多核苷酸通過將染色體插入細胞中的載體而插入到染色體中。可使用所屬領域習知的任何方法將多核苷酸插入到染色體中，如，經由同源重組，但不限於此。可以進一步包含用於確認載體插入到染色體的篩選標記。使用篩選標記來選擇用載體轉形的細胞，即，用以確認是否已插入所需的核酸分子，及可使用能夠提供可選擇的表現型的標記諸如抗藥性、營養缺陷性、對細胞毒性劑的抗性及表面蛋白質的表達。經選擇性試劑處理的情況下，只有能夠表達篩選標記的細胞才能存活或表達其他表現型性狀，因此可以篩選出經轉形的細胞。

本公開的又另一方面提供生產嘌呤核苷酸的微生物，該微生物包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶或編碼該變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸。具體地，包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶及/或編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸的微生物可以是經由用包含該多核苷酸的載體轉形而製備的，但不限於此。

如本文所使用，術語「轉形」是指將包含編碼目標蛋白質的多核苷酸導入到宿主細胞中而使得經由多核苷酸編碼的蛋白質能夠在宿主細胞中表達的過程。不管經轉形的多核苷酸是否插入到宿主細胞的染色體中並位於其上或位在染色體外，只要經轉形的多核苷酸可在宿主細胞中表達即可。再者，多核苷酸可包含編碼目標蛋白質的DNA及RNA。可以任何形態導入多核苷酸，只要可將該多核苷酸導入到宿主細胞中並在其中表達。例如，可以表達盒的形態將多核苷酸導入到宿主細胞中，表達盒是包含其自主表達所需所有元件的基因建構體。表達盒可包含可操作地連接多核苷酸的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合位點及轉譯終止信號。表達盒可以是進行自我複製的表達載體形式。此外，可照原樣將多核苷酸導入到宿主細胞並可操作地連接在宿主細胞中表達所需的序列，但不限於此。

再者，「可操作地連接」是指基因序列與啟動子序列間的功能性連接，其起始並介導編碼本公開所需多肽的多核苷酸的轉錄。

術語「包含變體多肽的微生物」或「包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的微生物」，如本文所使用，意指經由對具有天然微弱嘌呤核苷酸生產力的微生物或不具嘌呤核苷酸生產力的親株提供嘌呤核苷酸生產力而製備的微生物。該微生物可以是表達具有包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸取代的多肽的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的微生物，其中胺基酸取代可包含甲硫胺酸取代從SEQ ID NO：2 N端位置2的胺基酸及/或精胺酸取代位置445的胺基酸。再者，該微生物可以是表達變體多肽的微生物，其中由於在SEQ ID NO：2胺基酸序列中位置2及/或位置445的胺基酸經另一個胺基酸取代，該微生物具有磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶活性，但不限於此。

微生物可以是細胞或微生物，該細胞或微生物可包含編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸，或可用包含編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸的載體轉形而表達該變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶，關於本公開的目的，宿主細胞或微生物可以是任何微生物，只要它包含生產嘌呤核苷酸的變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。

在本公開中，生產嘌呤核苷酸的微生物可以與生產嘌呤核苷酸微生物或具有嘌呤核苷酸生產力的微生物互換使用。

關於本公開的目的，「嘌呤核苷酸」意指包含嘌呤結構的核苷酸。其實例可包含IMP、XMP或GMP，但不限於此。

具體地，術語「IMP(5'-次黃嘌呤核苷酸)」是由下列化學式1所組成的核苷酸系材料：

IMP具有IUPAC名稱5'-次黃嘌呤核苷酸或5'-肌苷酸，且與XMP或GMP一起作為增味劑而廣泛在食品中使用。

術語「GMP(5'-鳥嘌呤單磷酸)」是由下列化學式2所組成的核苷酸系材料：

GMP具有IUPAC名稱[(2R,3S,4R,5R)-5-(2-胺基-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫-2-呋喃基]甲基二氫磷酸鹽，也稱為5'-鳥苷酸(5'-guanidylic acid)、5'-鳥苷酸(5'-guanylic acid)或鳥苷酸(5'-guanylic acid)。

GMP以其鹽的形式，諸如鳥苷酸鈉、鳥苷酸二鉀及鳥苷酸鈣，而廣泛地使用作為食品添加劑。與IMP、GMP一起使用作為添加劑時，展現協同效應而加強風味。可從XMP轉化而製備GMP，但不限於此。如本公開的實施例所確認，本公開的變體多肽可增加XMP產量，並且從增加的XMP產量，可轉化成GMP並且可增加GMP產量。據此，顯然地，GMP也包含在本公開的範圍內。

術語「XMP(5'-黃核苷單磷酸)」是嘌呤代謝的中間物質並且由下列化學式3所組成。XMP具有IUPAC名稱5'-黃核苷單磷酸或5'-黃苷酸。XMP可經由IMP脫氫酶的作用而從IMP來形成，或者XMP可經由GMP合成酶的作用而轉化為GMP。再者，XMP可經由去氧核糖核苷三磷酸焦磷酸水解酶從XTP而形成，該酶是具有XTPase活性的酶。

如本文所使用，術語「生產嘌呤核苷酸的微生物」可以是為了生產所需嘌呤核苷酸而其中發生基因改造或活性加強的微生物，包含所有野生型微生物或其中天然地或人工地發生基因改造的微生物，及該微生物可以是其中經由插入外源基因或經由加強或失活內源基因的活性而減弱或加強特定機制的微生物。關於本公開的目的，生產嘌呤核苷酸的微生物的特徵可以是該微生物包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶而具有所需嘌呤核苷酸的提高生產力，具體地，該微生物可以是棒狀桿菌屬微生物。具體地，在本公開中，生產嘌呤核苷酸的微生物或具有嘌呤核苷酸生產力的微生物可以是其中一些經加強或減弱涉及嘌呤核苷酸生合成的基因，或其中一些經加強或減弱涉及嘌呤核苷酸降解路徑的基因的微生物。例如，該微生物可以是其中編碼腺苷醯琥珀酸合成酶的purA基因的表達經減弱的微生物。此外，可根據嘌呤核苷酸而調控guaB的表達，guaB是編碼存在於IMP降解路徑中的肌苷-5'-單磷酸鹽脫氫酶的基因。具體地，當嘌呤核苷酸是IMP時，可減弱guaB的表達，或當嘌呤核苷酸是XMP或GMP時，可加強guaB的表達，但其表達不限於此。

如本文所使用，術語「生產嘌呤核苷酸的棒狀桿菌屬微生物」是指天然地或由於突變而具有嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。具體地，如本文所使用，具有嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物可以是由於加強編碼磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的purF基因的活性而具有提高之嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。更具體地，如本文所使用，具有嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物是指由於包含變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶或編碼該轉移酶的多核苷酸，或者由於用包含編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸的載體的轉形，而具有提高的嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。「具有提高之嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物」是指相較於轉形前的親株或未修飾的微生物，而具有提高之嘌呤核苷酸生產力的棒狀桿菌屬微生物。「未修飾的微生物」是指野生型菌株本身，或不包含生產嘌呤核苷酸的變體蛋白質的微生物，或沒用包含編碼變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的多核苷酸的載體來轉形的微生物。

如本文所使用，「棒狀桿菌屬微生物」具體地可以是麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸醱酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、熱產胺棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)等，但不限於此。

本公開的又另一方面提供製備嘌呤核苷酸的方法，該方法包含在培養基中培養生產嘌呤核苷酸的棒狀桿菌屬微生物的步驟。例如，本公開的方法可進一步包含在培養步驟之後從微生物或培養基回收嘌呤核苷酸的步驟。

在該方法中，可經由習知的批次培養、連續培養及饋料批次培養等來進行培養微生物的步驟，但是沒有特別限制。在這方面，培養條件沒有特別限制，但是可使用鹼性化合物(如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(如，磷酸或硫酸)而將pH調至最適當的pH(如，pH 5至pH 9，具體地pH 6至pH 8及最具體地pH 6.8)。可經由在培養物中添加氧氣或含氧氣體混合物而維持有氧的條件。可將培養溫度維持在20℃至45℃，及具體地在25℃至40℃，可進行約10小時至約160小時的培養，但不限於此。經由培養所產生的嘌呤核苷酸可分泌到培養基中或可保留在細胞內。

另外，在要使用的培養基中，糖類及碳水化合物(如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、油類及脂肪類(如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油)、脂肪酸類(如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸)、醇類(如，甘油及乙醇)、有機酸類(如，乙酸)等可單獨或混合使用而作為碳源，但碳源不限於此。含氮有機化合物(如，蛋白腖、酵母抽出物、肉抽出物、麥芽抽出物、玉米浸液、大豆粉及尿素)或無機化合物(如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)等可單獨或混合使用而作為氮源，但不限於此。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉鹽等可單獨或混合使用而作為磷源，但不限於此。培養基也可包含必需的促進生長物質諸如其他金屬鹽(如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸及維生素。

回收本公開培養步驟中所生產的嘌呤核苷酸的方法是根據培養方法經由使用所屬領域習知的適當方法從培養基中收集所需嘌呤核苷酸。例如，可使用離心、過濾、陰離子交換層析、結晶、HPLC等，及經由使用所屬領域習知的適當方法從培養基或微生物回收所需嘌呤核苷酸。

再者，回收步驟可包含純化過程。可經由使用所屬領域習知的適當方法來進行純化過程。因此，所回收的嘌呤核苷酸可以是經純化的形式或是包含嘌呤核苷酸的微生物醱酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。

本公開的又另一方面提供生產嘌呤核苷酸的組成物，該組成物包括變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。

用於生產嘌呤核苷酸的組成物是指能經由本公開多核苷酸而生產嘌呤核苷酸的組成物。例如，該組成物包括多核苷酸，及進一步不限制地包括能夠操作多核苷酸的構成。多核苷酸可以是包含在載體中的形式，以便表達與導入的宿主細胞可操作地連接的基因。

此外，組成物可進一步包括任何常在生產嘌呤核苷酸用的組成物中使用的適當賦形劑。這種賦形劑可以是，例如，防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、安定劑或等張劑，但不限於此。

本公開的又另一方面提供增加嘌呤核苷酸產量的方法，包括在棒狀桿菌屬微生物中培養變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的步驟。

術語「變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶」、「棒狀桿菌屬微生物」、「培養」、「高絲胺酸或高絲胺酸衍生的L-胺基酸」如以上所述。

本公開的又另一方面提供變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶用於生產嘌呤核苷酸的用途，或用於製備生產嘌呤核苷酸用的組成物的用途。

本公開的又另一方面提供多核苷酸用於生產嘌呤核苷酸的用途，或用於製備生產嘌呤核苷酸用的組成物的用途。

本公開的又另一方面提供棒狀桿菌屬微生物用於生產嘌呤核苷酸的用途，或用於製備生產嘌呤核苷酸用的組成物的用途。

[實施例]

在下文中，將參考實施例而更詳細地說明本公開。然而顯然地，對於本公開所屬領域的技術人員，這些實施例僅用於說明之目的，並且本公開的範圍不受這些實施例的限制。

實施例1：製備野生型系IMP-生產菌株

棒狀桿菌屬野生型菌株不能生產IMP，或只能生產非常少量的IMP。因此，基於野生型停滯棒狀桿菌ATCC6872而製備IMP生產菌株。具體地，經由減弱編碼腺苷醯琥珀酸合成酶的purA的活性及編碼5'-肌苷酸脫氫酶的guaB的活性，而製備IMP生產菌株。

實施例1-1：製備purA弱化菌株

為了製備其中purA起始密碼子改變的菌株，首先製備含有purA的插入載體。為了將purA基因選殖到插入載體中，使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的基因組DNA作為模板，SEQ ID NO：3及4以及SEQ ID NO：5及6的引子進行30個循環的PCR，在94℃變性30秒，55℃黏著30秒及72℃延伸2分鐘。使用經由上述PCR所得到的兩個DNA片段作為模板及SEQ ID NO：3及6的引子進行30個循環的PCR，在94℃變性30秒，55℃黏著30秒及72℃延伸2分鐘而得到DNA片段。用限制酶XbaI對所得到的DNA片段進行酶切，並選殖到已用該相同限制酶酶切的pDZ載體中(Korean Patent No.10-0924065及International Patent Publication No.2008-033001)。將經由上述方法所製備的載體命名為pDZ-purA-a1t。

[表1]

經由電穿孔法將重組載體pDZ-purA-a1t轉形到停滯棒狀桿菌ATCC6872菌株中，然後在含有25mg/L康黴素(kanamycin)的培養基上，篩選其中載體經由同源重組而插入到染色體中的菌株。對初篩選的菌株進行第二次交叉，然後將經篩選所得的菌株進行定序，從而篩選出經導入突變的最終菌株。此菌株命名為ATCC6872-purA(a1t)。

實施例1-2：製備guaB弱化菌株

為了製備其中guaB起始密碼子改變的菌株，首先製備含有guaB的插入載體。為了將guaB基因選殖到插入載體中，使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的基因組DNA作為模板，SEQ ID NO：7及8以及SEQ ID NO：9及10的引子進行PCR。還使用上述PCR產物作為模板及SEQ ID NO：7及10的引子進行PCR。以如實施例1-1中的相同方式選殖所得到的DNA片段。將所製備的載體命名為pDZ-guaB-a1t。

[表2]

經由電穿孔法將重組載體pDZ-guaB-a1t轉形到實施例1-1所製備的ATCC6872-PurA(a1t)菌株中，然後在含有25mg/L康黴素的培養基上，篩選其中載體經由同源重組而插入到染色體中的菌株。對初篩選的菌株進行第二次交叉，然後將經篩選所得的菌株進行定序，從而篩選出經導入突變的最終菌株。

將基於野生型停滯棒狀桿菌ATCC6872而最終篩選出的IMP生產菌株命名為CJI9088。

實施例1-3：CJI9088的醱酵效價試驗

將2mL種子培養基分裝到直徑為18mm的試管中並在壓力下高壓滅菌。各別接種ATCC6872及CJI9088，並在30℃下振盪培養24小時以用作種子培養物。將29mL醱酵培養基分裝到250mL三角搖瓶中，於121℃在壓力下高壓滅菌15分鐘，接種2mL種子培養物並培養3天。將培養條件調在170rpm的轉速，30℃的溫度及pH7.5。

培養完成後，用HPLC(SHIMAZDU LC20A)測量IMP產量，培養結果如下列表3所示。以下結果表明purA-及guaB-弱化菌株具有IMP生產力。

[表3]

-種子培養基：1%葡萄糖、1%蛋白腖、1%肉抽出物、1%酵母抽出物、0.25%氯化鈉、100mg/L腺嘌呤、100mg/L鳥嘌呤、pH 7.5

-醱酵培養基：0.1%麩胺酸鈉、1%氯化銨、1.2%硫酸鎂、0.01%氯化鈣、20mg/L硫酸鐵、20mg/L硫酸錳、20mg/L硫酸鋅、5mg/L硫酸鐵、23mg/L L-半胱胺酸、24mg/L丙胺酸、8mg/L菸鹼酸、45μg/L生物素、5mg/L硫胺素鹽酸鹽、30mg/L腺嘌呤、1.9%磷酸(85%)、2.55%葡萄糖、1.45%果糖

實施例2：磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶加強型變體的鑑定

為了加強磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的活性而提高IMP生產力，該酶是IMP生合成路徑的第一個酶，而製備編碼磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶的基因purF的突變體庫，並識別出一種IMP生產力加強的突變體。

實施例2-1：製備含purF之載體

為了製備purF突變體庫，首先製備含有purF的重組載體。使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的基因組DNA作為模板，SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12的引子而進行PCR，並使用TOPO選殖試劑套組(Invitrogen)將PCR產物選殖到大腸桿菌載體pCR2.1中。

[表4]

實施例2-2：製備purF突變體庫

基於實施例2-1中所製備的載體而製備purF突變體庫。使用易出錯PCR試劑套組(clontech Diversify® PCR隨機突變試劑盒)來製備該突變體庫。在可發生突變的條件下，使用SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14引子進行PCR。具體地，在可發生每1000bp 0至3個突變的條件下，在94℃下進行預熱30秒，隨後進行25個循環的94℃持續30秒及68℃持續1分30秒。使用大引子(500ng至125ng)對所得到的PCR產物進行25個循環的PCR，95℃持續50秒，60℃持續50秒及68℃持續12分鐘，然後用DpnI處理，轉形至E.coli DH5α並塗抹在含有康黴素(25mg/L)的LB固體培養基上。選出20種經轉形的菌落然後得到質體，隨後進行定序分析。結果，確認以2個突變/kb的頻率在不同位點導入突變。取得約20,000經轉形的大腸桿菌菌落並從中提取出質體，並命名為pTOPO-purF-庫。

[表5]

實施例2-3：所製備突變體庫的評估及菌株篩選

經由電穿孔法將實施例2-2中所製備的pTOPO-purF-庫轉形到實施例1所製備的CJI9088菌株中，然後塗抹在含有25mg/L康黴素的營養培養基上而得到其中插入突變體基因的10,000個菌落。該10,000個菌落命名為CJI9088_pTOPO_purF(mt)1至CJI9088_pTOPO_purF(mt)10000。

-營養培養基：1%蛋白腖、1%肉抽出物、0.25%氯化鈉、1%酵母抽出物、2%瓊脂、pH 7.2

將所得到的10,000個菌落中的每一個接種在壓力下高壓滅菌的200μL種子培養基中，並在96孔深孔盤中經由使用微孔盤振盪器(TAITEC)在30℃及1200rpm振盪下培養24小時，然後用作種子培養物。將在壓力下高壓滅菌的醱酵培養基290μL分配到96孔深孔盤中，並將20μL各種子培養物接種到其上，隨後在與上述相同的條件下振盪培養72小時。

為了分析培養基中5'-肌苷酸的產量，在培養完成後，將3μL培養上清液轉移到96孔UV盤中，各個孔含有197μL蒸餾水。接著，使用微孔盤儀進行振盪30秒，並使用光譜儀測量25℃及270nm處的光密度，並與CJI9088菌株的光密度進行比較，以選擇顯示增加10%或更多光密度的50個突變菌株菌落。與對照組相比，其他菌落顯示相似或降低的光密度。

以與上述相同的方式測量50株篩選菌株的光密度，以重複檢驗5'-肌苷酸的產量。選出與CJI9088菌株相比顯示出5'-肌苷酸生產力顯著提高的CJI9088_pTOPO_purF(mt)201及CJI9088_pTOPO_purF(mt)5674兩株菌株。

實施例2-4：經由定序鑑定突變

為了鑑定突變菌株的基因突變，使用SEQ ID NOS：15及16引子各別進行CJI9088_pTOPO_purF(mt)201及CJI9088_pTOPO_guaB(mt)5674菌株的PCR，隨後定序。將其等的purF基因與含有野生型purF基因的ATCC6872及CJI9088菌株的purF基因比較。

結果，發現兩株菌株在不同位點包含purF基因突變。

具體地，確認CJI9088_pTOPO_purF(mt)201菌株在SEQ ID NO：2所表示的purF胺基酸序列位置2具有甲硫胺酸取代纈胺酸的突變，及CJI9088_pTOPO_purF(mt)5674菌株在SEQ ID NO：2所表示的purF胺基酸序列位置445具有精胺酸取代甘胺酸的突變。

[表6]

在下列實施例3及4中，檢驗上述突變是否影響棒狀桿菌屬微生物的IMP生產。

實施例3：檢驗CJI9088的IMP生產力

將實施例2中所鑑定的突變導入到CJI9088中，該菌株為ATCC6872-衍生IMP-生產菌株，並檢驗IMP生產力。

實施例3-1：製備含有purF突變之插入載體

為了將實施例2中所篩選的突變導入到菌株中，而製備插入載體。如下製備用於導入purF突變的載體。

使用ATCC6872的基因組DNA作為模板，SEQ ID NO：17及18以及SEQ ID NO：19及20的引子進行PCR。經由在94℃變性5分鐘，然後，20個循環的94℃持續30秒，55℃持續30秒，72℃持續1分鐘，隨後於72℃聚合5分鐘，而進行PCR。使用所得到的各DNA片段作為模板及SEQ ID NO：17及20的引子而進行PCR。用XbaI酶切所得到的DNA片段。經由使用T4連接酶而將DNA片段選殖到已經用限制酶XbaI酶切的線形pDZ載體中，如此而製備pDZ-purF(V2M)。以如上述的方式使用SEQ ID NO：21及22以及SEQ ID NO：23及24引子進行PCR。使用所得到的各DNA片段作為模板，SEQ ID NO：21及24的引子而進行PCR。用XbaI酶切所得到的DNA片段。經由使用T4連接酶而將DNA片段選殖到已經用限制酶XbaI酶切的線形pDZ載體中，如此而製備pDZ-purF(G445R)。

[表7]

實施例3-2：將突變體導入到CJI9088菌株中並評估

用實施例3-1中所製備的各pDZ-purF(V2M)及pDZ-purF(G445R)載體轉形CJI9088，在含有25mg/L康黴素的培養基上篩選出其中載體經由同源重組而插入到染色體中的菌株。對初篩選的菌株進行第二次交叉而選出經導入目標基因的菌株。經由使用SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16引子的PCR來檢驗最終經轉形的菌株中的基因突變導入，然後進行定序而確認將突變導入到菌株中。具體地，將經導入purF基因的V2M突變的菌株命名為CJI9088_purF_m1，及將經導入purF基因的G445R突變的菌株命名為CJI9088_purF_m2。再者，為了製備同時具有V2M及G445R兩種突變的突變株，用pDZ-purF(G445R)載體轉形CJI9088_purF_m1菌株，並以與上述相同的方式而得到菌落。通過對所得菌落的定序分析，篩選出同時經導入purF基因的V2M及G445R突變的菌株並命名為CJI9088_purF_m1m2。

如以下結果所示，purF基因中具有V2M突變或G445R突變的CJI9088_purF_m1或CJI9088_purF_m2菌株顯示IMP濃度分別提高0.15g/L(128%)或0.09g/L(117%)，表明與對照CJI9088菌株比較有所改善。再者，同時具有V2M及G445R突變的CJI9088_purF_m1m2菌株顯示IMP濃度提高0.31g/L(159%)，表明當同時包含兩種突變時，IMP濃度可得到最有效的改善。

[表8]

實施例4：檢驗ATCC6872衍生的IMP生產菌株的IMP生產力

為了檢驗實施例2中所鑑定的purF突變體在生產高濃度IMP的菌株中的效用，將該突變體導入到生產高濃度IMP的菌株CJI0323(Accession No.KCCM12151P,Korean Patent No.10-1904675)中，並檢驗IMP生產力。

實施例4-1：將突變體導入到CJI0323菌株中並評估

用實施例3-1中所製備的各pDZ-purF(V2M)及pDZ-purF(G445R)載體轉形CJI0323，在含有25mg/L康黴素的培養基上篩選出其中載體經由同源重組而插入到染色體中的菌株。對初篩選的菌株進行第二次交叉而選出經導入目標基因的菌株。經由使用SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16引子的PCR來檢驗最終經轉形的菌株中的基因突變導入，然後進行定序而確認將突變導入到菌株中。具體地，將經導入purF基因的V2M突變的菌株命名為CJI0323_purF_m1，及將經導入purF基因的G445R突變的菌株命名為CJI0323_purF_m2。再者，為了製備同時具有V2M及G445R兩種突變的突變株，用pDZ-purF(G445R)載體轉形CJI0323_purF_m1菌株，並以與上述相同的方式而得到菌落。通過對所得菌落的定序分析，篩選出同時經導入purF基因的V2M及G445R突變的菌株並命名為CJI0323_purF_m1m2。

根據布達佩斯條約的規定，稱CJI0323_purF_m1為CJI2353，於2018年9月10日寄存在韓國微生物菌種中心，並分配登錄號KCCM12316P。再者，根據布達佩斯條約的規定，稱所製備的CJI0323_purF_m2為CJI2354，於2018年9月10日寄存在韓國微生物菌種中心，並分配登錄號KCCM12317P。

如以下結果所示，purF基因中具有V2M突變或G445R突變的CJI0323_purF_m1或CJI0323_purF_m2菌株顯示IMP濃度分別提高1.9g/L(119%)或0.95g/L(109%)，表明與對照CJI0323菌株比較有所改善。再者，同時具有V2M及G445R突變的CJI0323_purF_m1m2菌株顯示IMP濃度提高3.33g/L(134%)，表明當同時包含兩種突變時，IMP濃度可得到最有效的改善。

[表9]

實施例5：檢驗purF突變體的5'-黃苷酸生產力

基於XMP生產菌株，為了檢驗實施例2中所鑑定的purF突變體的效用，將該突變體導入到生產高濃度XMP的菌株KCCM10530(Korean Patent Publication No.10-2005-0056670)中，並檢驗XMP生產力。

實施例5-1：將突變體導入到KCCM10530菌株中並評估

用實施例3-1中所製備的各pDZ-purF(V2M)及pDZ-purF(G445R)載體轉形KCCM10530，在含有25mg/L康黴素的培養基上篩選出其中載體經由同源重組而插入到染色體中的菌株。對初篩選的菌株進行第二次交叉而篩選出經導入目標基因的菌株。經由使用SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16引子的PCR來檢驗最終經轉形的菌株中的基因突變導入，然後進行定序而確認將突變導入到菌株中。具體地，將經導入purF基因的V2M突變的菌株命名為KCCM10530_purF_m1，及將經導入purF基因的G445R突變的菌株命名為KCCM10530_purF_m2。再者，為了製備同時具有V2M及G445R兩種突變的突變株，用pDZ-purF(G445R)載體轉形KCCM10530_purF_m1菌株，並以與上述相同的方式得到菌落。通過對所得菌落的定序分析，篩選出同時經導入purF基因的V2M及G445R突變的菌株並命名為KCCM10530_purF_m1m2。

根據布達佩斯條約的規定，稱KCCM10530_purF_m1為CJX1681，於2018年9月10日寄存在韓國微生物菌種中心，並分配登錄號KCCM12312P。再者，根據布達佩斯條約的規定，稱所製備的KCCM10530_purF_m2為CJX1682，於2018年9月10日寄存在韓國微生物菌種中心，並分配登錄號KCCM12313P。

如以下結果所示，purF基因中具有V2M突變或G445R突變的KCCM10530_purF_m1或KCCM10530_purF_m2菌株顯示XMP濃度分別提高1.77g/L(115%)或0.8g/L(107%)，表明與對照KCCM10530菌株比較有所改善。再者，同時具有V2M及G445R突變的KCCM10530_purF_m1m2菌株顯示XMP濃度提高2.36g/L(120%)，表明當同時包含兩種突變時，XMP濃度可得到最有效的改善。

[表10]

基於以上說明，本公開所屬領域的技術人員將理解，可以以不同的特定形式來實現本公開，而不改變其技術精神或基本特徵。因此，應當理解，以上實施例在所有方面均不是限制性的，而是說明性的。本公開的範圍由所附專利範圍請求項而不是由其之前的說明來定義，因此，確定所附專利範圍請求項涵蓋在專利範圍請求項的界限範圍內的所有改變及修飾或此類界限範圍的等同物。

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【寄存機構】韓國微生物保存中心

【寄存日期】2018/09/10

【寄存號碼】KCCM12312P

【寄存國家】KR南韓

【寄存機構】韓國微生物保存中心

【寄存日期】2018/09/10

【寄存號碼】KCCM12313P

【寄存國家】KR南韓

【寄存機構】韓國微生物保存中心

【寄存日期】2018/09/10

【寄存號碼】KCCM12316P

【寄存國家】KR南韓

【寄存機構】韓國微生物保存中心

【寄存日期】2018/09/10

【寄存號碼】KCCM12317P

<110> 南韓商CJ第一製糖股份有限公司(CJ CheilJedang Corporation)

<120> 變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶及使用該轉移酶製備嘌呤核苷酸的方法

<130> OPA19164

<150> KR 10-2019-0035683

<151> 2019-03-28

<160> 27

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> purF

<400> 1

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> purF

<400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purA alt-1

<400> 3

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purA alt-2

<400> 4

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purA alt-3

<400> 5

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purA alt-4

<400> 6

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaB alt-1

<400> 7

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaB alt-2

<400> 8

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaB alt-3

<400> 9

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaB alt-4

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF tempF

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF tempR

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF lib F

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF lib R

<400> 14

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF seq F

<400> 15

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF seq R

<400> 16

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF V2M 1F

<400> 17

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF V2M 1R

<400> 18

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF V2M 2F

<400> 19

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF V2M 2R

<400> 20

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF G445R 1F

<400> 21

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF G445R 1R

<400> 22

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF G445R 2F

<400> 23

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> purF G445R 2R

<400> 24

<210> 25

<211> 499

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PurF_2M

<400> 25

<210> 26

<211> 499

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PurF_445R

<400> 26

<210> 27

<211> 499

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PurF_2M_445R

<400> 27

Claims

一種變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶，其在SEQ ID NO：2的胺基酸序列中的i)位置2的胺基酸以甲硫胺酸取代、ii)位置445的胺基酸以精胺酸取代、或iii)位置2的胺基酸以甲硫胺酸取代及位置445的胺基酸以精胺酸取代。
一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如申請專利範圍第1項所述之變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。
一種載體，該載體包含如申請專利範圍第2項所述之多核苷酸。
一種生產嘌呤核苷酸的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，該微生物包含如申請專利範圍第1項所述之變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶。
如申請專利範圍第4項所述之生產嘌呤核苷酸的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，其中，該棒狀桿菌屬微生物是停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
一種製備嘌呤核苷酸的方法，該方法包含在培養基中培養如申請專利範圍第4項所述之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物的步驟。
如申請專利範圍第6項所述之製備嘌呤核苷酸的方法，進一步包含在培養步驟之後從微生物或培養基回收嘌呤核苷酸的步驟。
如申請專利範圍第6項所述之製備嘌呤核苷酸的方法，其中，該棒狀桿菌屬微生物(Corynebacterium)是停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
一種用於生產嘌呤核苷酸的組成物，該組成物包含如申請專利範圍第1項所述之變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移酶或如申請專利範圍第4項所述之微生物。
一種增加嘌呤核苷酸產量的方法，該方法包含在培養基中培養如申請專利範圍第4項所述之微生物的步驟。
一種如申請專利範圍第1項所述之變體磷酸核糖焦磷酸胺基轉移醇的用途，係用於生產嘌呤核苷酸。
一種如申請專利範圍第2項所述之多核苷酸的用途，係用於生產嘌呤核苷酸。
一種如申請專利範圍第4項所述之棒狀桿菌屬微生物的用途，係用於生產嘌呤核苷酸。