JP2021512586A - 変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】
なし
Description
IMPを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法(非特許文献1など)及びIMPを直接生産する微生物を培養して、培養液内のIMPを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、IMPを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
本発明の他の一つの目的は、変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ及び前記ベクターを含むプリンヌクレオチドを生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含むプリンヌクレオチドの製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、本出願の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを含む、プリンヌクレオチド生産用組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、本出願の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを含む、プリンヌクレオチドの生産増加方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、プリンヌクレオチドの生産のための、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの用途を提供することにある。
本発明の別の目的は、プリンヌクレオチドの生産のための、前記ポリヌクレオチドの用途を提供することにある。
本発明の別の目的は、プリンヌクレオチドの生産のための、前記コリネバクテリウム属微生物の用途を提供することにある。
本発明のもう1つの様態は、配列番号2のアミノ酸配列でN末端からi)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換、ii)445番目のアミノ酸がアルギニン(Arginine)に置換、またはiii)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換されて445番目のアミノ酸がアルギニンに置換された、変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを提供することにある。
本発明において、前記配列番号2はホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列を意味する。具体的には、前記配列番号2はpurF遺伝子によってコードされるホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質配列である。前記配列番号2のアミノ酸は、公知のデータベースであるNCBIのGenBankからその配列を得ることができる。一例として、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)由来であってもよいが、これに制限されず、前記アミノ酸と同様の活性を有する配列は、制限なく含まれてもよい。また、配列番号2のアミノ酸配列の範囲は、配列番号2のホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記アミノ酸配列は、配列番号2及び/または前記配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性(homology)または同一性(identity)を有するアミノ酸配列を含んでもよい。相同性または同一性を有するアミノ酸配列は、100%同一性を有する配列は除かれる前記範囲のものであってもよく、または100%未満の同一性を有する配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。
前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列内のN末端から2番目の位置及び/または445番目の位置での変異を含む。前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列で2番目及び/または445番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであり、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、野生型微生物に由来の非変異ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼに比べて強化された活性を有してもよい。このような変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、前記説明した配列番号2及び/または前記配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列でのN末端から2番目または445番目 のアミノ酸が変異されたものを意味する。
一例として、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列でi)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換、ii)445番目のアミノ酸がアルギニン(Arginine)に置換、またはiii)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換されて445番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたものであり、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて強化されたホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有してもよいが、これに制限されない。
具体的に、前記前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは2番目及び/または445番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含んでもよい。具体的には、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列内のN末端からi)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換、ii)445番目のアミノ酸がアルギニン(Arginine)に置換、またはiii)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換されて445番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドからなってもよい。また、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列でN末端から2番目及び/または445番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列またはこれと80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本発明の前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼは、配列番号2のアミノ酸配列で2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に、または445番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、2番目及び/または445番目のアミノ酸配列の他に、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性(homologous)を有するか同一(identical)の配列は、一般的に、配列全体または全長と少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%の中間または高いストリンジェントな条件(stringent conditions)でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
また、コドン縮退性(codon degeneracy)によって、前記配列番号2のアミノ酸配列でN末端から2番目及び/または445番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチドまたはその相同性または同一性を有する変異型ポリペプチドに翻訳されてもよいポリヌクレオチドも含まれることは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製してもよいプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化して、配列番号2のアミノ酸配列でi)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換、ii)445番目のアミノ酸がアルギニン(Arginine)に置換、またはiii)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換されて445番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列を含む、変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。
本発明の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明のホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。本発明でホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、purF遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Tm値は、60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節してもよい。
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている(非特許文献8参照)。
本発明で変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドも、先に説明した通りである。
本発明の他の一つの様態は、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてpWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、及びCharon21Aなどを用いてもよく、プラスミドベクターとしてpBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系とpET系などを用いてもよい。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いてもよい。
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを使用して、染色体に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換え(homologous recombination)によって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするDNA及びRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよく、これに限定されない。
本明細書で使用される用語、「変異型ポリペプチドを含む微生物」または「変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを含む微生物」とは、自然的に弱いプリンヌクレオチドの生産能を有している微生物、またはプリンヌクレオチドの生産能のない親菌株にプリンヌクレオチドの生産能が付与された微生物を意味する。前記微生物は、配列番号2のアミノ酸配列内に1つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを発現する微生物であって、前記アミノ酸置換は、N末端から2番目のアミノ酸がメチオニンに置換及び/または445番目のアミノ酸がアルギニンへの置換を含んでもよい。また、前記微生物は、配列番号2のアミノ酸配列で2番目及び/または445番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよいが、これに制限されない。
前記微生物は、変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、これを発現しうる細胞または微生物であって、本発明の目的上、前記宿主細胞または微生物は、前記変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを含み、プリンヌクレオチドを生産しうる微生物であれば、すべて可能である。
本発明で、前記プリンヌクレオチドを生産する微生物は、プリンヌクレオチドを生産する微生物、プリンヌクレオチドの生産能を有する微生物として使用してもよい。
具体的には、前記用語、「IMP(5'-inosine monophosphate)」は、下記の化学式(1)で構成されている核酸系物質の中の一つである。
前記用語、「GMP(5'-guanine monophosphate)」は、下記の化学式(2)で構成されている核酸系物質の一つである。
GMPは塩の形態でグアニル酸ナトリウム、グアニル酸ジカリウム、グアニル酸カルシウムのような食品添加剤として広く用いられ、IMPと共に添加物として用いられる時、風味を強化するシナジー効果を有する。GMPはXMPから転換されて製造されてもよいが、これに制限されない。本出願の一実施例で確認されたように、本出願の変異型ポリペプチドはXMPの生産を増加させることができ、生産量が増加されたXMPからGMPにも転換され、その生産量が増加されうるため、前記GMPも本発明の範囲に含まれることは自明である。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5〜9、具体的には、pH6〜8、最も具体的には、pH6.8)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20〜45℃、具体的には、25〜40℃を維持してもよく、約10〜160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたプリンヌクレオチドは、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収されたプリンヌクレオチドは、精製された形態またはプリンヌクレオチドを含有した微生物発酵液であってもよい(非特許文献9)。
前記プリンヌクレオチド生産用組成物は、本発明のポリヌクレオチドによってプリンヌクレオチドを生産することができる組成物を意味する。その例として、前記組成物は、前記ポリヌクレオチドを含み、さらに前記ポリヌクレオチドを作動させうる構成を制限なく含んでもよい。前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるように、ベクター内に含まれた形であってもよい。
また、前記組成物はプリンヌクレオチド生産用組成物に通常用いられる任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。これらの賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記用語、「変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ」、「コリネバクテリウム属微生物」、「培養」及び「ホモセリンまたはホモセリン由来のL−アミノ酸」は、前述した通りである。
本発明のもう一つの様態として、プリンヌクレオチドの生産、またはプリンヌクレオチドの生産用組成物の製造のための、前記ポリヌクレオチドの用途を提供する。
本発明のもう一つの様態として、プリンヌクレオチドの生産、またはプリンヌクレオチド生産用組成物の製造のための、前記コリネバクテリウム属微生物の用途を提供する。
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても非常に極微量を生産することができる。したがって、野生型のコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を基にIMP生産株を製作した。具体的には、アデニロコハク酸シンテターゼをコードするpurA及び5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードするguaB の活性を弱化させたIMP生産菌株を製造した。
purAの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まず、purAが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにpurA遺伝子をクローニングするために、PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872のゲノミックDNA(genomic DNA)を鋳型として、配列番号3と4、配列番号5と6のプライマーを用いて行い、94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(extension)過程を30回繰り返した。前記PCR反応で獲得した2つのDNA切片を鋳型として、配列番号3と6のプライマーを用いて94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(extension)過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、DNA断片を獲得した。得られたDNA断片を制限酵素XbaIで切断した後、同じ制限酵素で切断されたpDZ(特許文献1及び2)ベクターにクローニングした。前記方法で製作したベクターをpDZ−purA−a1tと命名した。
guaBの開始コドンが変更された菌株を製作するために、guaBの開始コドンが変形された菌株を製作するために、まず、guaBが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにguaB遺伝子をクローニングするために、具体的に、PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872のゲノミックDNAを鋳型として、配列番号7と8及び配列番号9と10のプライマーを用いて行った。前記PCR産物を鋳型として、配列番号7と10をプライマーに再びPCRを行い、得られたDNA断片を実施例1−1と同様にクローニングを進めた。製作されたベクターをpDZ−guaB−a1tと命名した。
最終的に選別された、野生型コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872基盤の前記IMP生産菌株をCJI9088と命名した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI9088をそれぞれ接種して30℃の温度で24時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表3の通りである。下記のような結果は、purA及びguaBを弱化させた菌株がIMPの生産能を有することを示唆する。
− 種培地:ぶどう糖1%、ペプトン1%、肉汁1%、酵母エキス1%、塩化ナトリウム0.25%、アデニン100mg/l、グアニン100mg/l、pH7.5
− 発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ぶどう糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
IMP生産能を向上させるために、IMP生合性経路の1番目の酵素である、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの活性を強化するために、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるpurFの変異ライブラリを製作し、IMP生産能が増加される強化変異を発掘した。
purF変異ライブラリを製作するために、まずpurFを含む組換えベクターを製作した。PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872のゲノミックDNAを鋳型として、配列番号11及び配列番号12のプライマーを用いて行い、前記増幅産物をTOPO Cloning Kit(Invitrogen)を用いて大腸菌ベクターpCR2.1にクローニングしてPCR−purFを得た。
前記実施例2−1で製作したベクターを基にpurF変異ライブラリを製作した。ライブラリは、error−prone PCR kit(clontech Diversify(R) PCR Random Mutagenesis Kit)を用いて製作した。変異が発生しうる条件で、配列番号13及び配列番号14をプライマーとしてPCR反応を行った。具体的には、1000bp当たり0〜3つの変異が発生する条件で、94℃で30秒予熱した後、94℃で30秒、68℃で1分30秒の過程を25回繰り返して行った。このとき得られたPCR産物をメガプライマー(500〜125ng)とし、95℃で50秒、60℃で50秒、68℃で12分の過程を25回繰り返した。その後、DpnIを処理して大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー20種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、2変異/kbの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約20,000個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをpTOPO−purF−libraryと命名した。
前記実施例2−2で製作したpTOPO−purF−libraryを実施例1で製作した菌株CJI9088に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン25mg/lを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株から10,000個のコロニーを確保し、各コロニーをCJI9088_pTOPO_purF(mt)1からCJI9088_pTOPO_purF(mt)10000までと命名した。
−栄養培地:ペプトン1%、肉汁1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
確保された10,000個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した種培地200μlに接種した96ディープウェルプレートを、マイクロプレート振とう機(Microplate shaker(TAITEC))を用いて30℃の温度、1200rpmで24時間振とう培養し、種培養液として用いた。加圧殺菌した発酵培地290μlを96ディープウェルプレートに分注した後、種培養液20μlずつ接種し、前記条件と同様に72時間振とう培養した。
培養液から生産された5’−イノシン酸の生産量を分析するために、培養終了後の培養上澄み液3μlを蒸留水が197μlずつ分注された96ウェルUVプレートに移した。次に、マイクロプレートリーダー(Microplate reader)を用いて30秒間振とうし、25℃、波長270nmで分光光度計で吸光度を測定し、CJI9088菌株の吸光度と比較して10%以上増加した吸光度を示す50個の変異菌株コロニーを選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
選別された50個の菌株は、前記と同様に吸光度を測定し、5’−イノシン酸生産量の確認を繰り返して行った。そして、CJI9088菌株に比べて5’−イノシン酸の生産能が著しく向上されたCJI9088_pTOPO_purF(mt)201、CJI9088_pTOPO_purF(mt)5674菌株2種を選別した。
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号15と16のプライマーを用いて、CJI9088_pTOPO_purF(mt)201、CJI9088_pTOPO_purF(mt)5674菌株でPCRを行い、シーケンシングを進めて、purF遺伝子を、野生型purF遺伝子を含む菌株であるATCC6872及びCJI9088と比較した。
その結果、前記菌株2種とも、それぞれpurF遺伝子とは異なる位置に変異を含んでいることを確認した。
具体的には、CJI9088_pTOPO_purF(mt)201菌株は、配列番号2で表われるpurFアミノ酸配列から2番目のバリンがメチオニンに置換された変異を、CJI9088_pTOPO_purF(mt)5674菌株は、配列番号2で表われるpurFアミノ酸配列で445番目のグリシンがアルギニンに置換された変異を確認した。
ATCC6872由来のIMP生産菌株であるCJI9088に前記実施例2で確認した変異を導入してIMPの生産能を確認した。
前記実施例2で選別された変異を菌株内に導入するために、挿入用ベクターを製作した。purF変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。
ATCC6872のゲノミックDNAを鋳型とし、それぞれ配列番号17と配列番号18、配列番号19と配列番号20をプライマーとして用いPCRを行った。PCRは、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果得られたDNA断片をそれぞれ鋳型として、配列番号17と配列番号20をプライマーとし、PCRを行った。得られたDNA断片をXbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記DNA断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングし、pDZ−purF(V2M)を製作した。前記と同様の方法で配列番号21と配列番号22、配列番号23と配列番号24をプライマーとしてPCRを行い、得られた各DNA断片を鋳型として配列番号21と配列番号24をプライマーとしてPCRを行った。得られたDNA断片をXbaIで切断し、T4リガーゼを用いて前記DNA断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングし、pDZ−purF(G445R)を製作した。
前記実施例3−1で製作したpDZ-purF(V2M)、pDZ-purF(G445R)ベクターをCJI9088に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross-over)を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号15と配列番号16のプライマーを用いてPCRを行って塩基配列を分析することにより、菌株内に変異が導入されたことを確認した。具体的には、purF遺伝子のV2Mの変異が導入された前記菌株をCJI9088_purF_m1、G445Rの変異が導入された菌株をCJI9088_purF_m2と命名した。また、V2MとG445Rの変異をすべて含む変異菌株を製作するために、CJI9088_purF_m1の菌株にpDZ−purF(G445R)ベクターを形質転換し、前記と同様の方法でコロニーを確保した。確保したコロニーの遺伝子配列解析を行い、purF遺伝子のV2MとG445Rの変異がすべて導入された菌株を選別し、これはCJI9088_purF_m1m2と命名した。
下記の結果から分かるように、対照群であるCJI9088菌株に比べてpurF遺伝子内のV2M変異またはG445変異を有するCJI9088_purF_m1及びCJI9088_purF_m2菌株の場合、IMP濃度がそれぞれ0.15g/L(128%)、0.09g/L (117%)が向上されたことを確認した。また、V2MとG445R変異をすべて含んでいる CJI9088_purF_m1m2菌株の場合、IMP濃度が0.31g/L(159%)向上され、2つの変異を一緒に含んでいるときにIMP濃度の向上に最も大きな効果があることを確認した。
高濃度のIMP生産菌株に基づいて、実施例2で見つかったpurF変異体の効果を確認するために、高濃度のIMP生産菌株CJI0323(寄託番号KCCM12151P、特許文献3)に変異体を導入してIMP生産能を確認した。
前記実施例3−1で製作したpDZ-purF(V2M)、pDZ-purF(G445R)ベクターをCJI0323に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross-over)を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号15と配列番号16のプライマーを用いてPCRを行って塩基配列を分析することにより、菌株内に変異が導入されたことを確認した。具体的には、purF遺伝子のV2Mの変異が導入された前記菌株をCJI0323_purF_m1、G445Rの変異が導入された菌株をCJI0323_purF_m2と命名した。また、V2MとG445Rの変異をすべて含む変異菌株を製作するために、CJI0323_purF_m1の菌株にpDZ−purF(G445R)ベクターを形質転換し、前記と同様の方法でコロニーを確保した。確保したコロニーの遺伝子配列解析を行い、purF遺伝子のV2M及びG445Rの変異がすべて導入された菌株を選別し、これを CJI0323_purF_m1m2と命名した。
前記 CJI0323_purF_m1はCJI2353と呼ばれ、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年9月10日付で寄託し、受託番号KCCM12316Pを与えられた。また、前記製作したCJI0323_purF_m2菌株はCJI2354と呼ばれ、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年9月10日付で寄託し、受託番号KCCM12317Pを与えられた。
下記の結果から分かるように、対照群であるCJI0323菌株に比べてpurF遺伝子内のV2M変異またはG445変異を有するCJI0323_purF_m1及びCJI0323_purF_m2菌株の場合、IMP濃度がそれぞれ1.9g/L(119%)、0.95g/L (109%)が向上されたことを確認した。また、V2MとG445R変異をすべて含んでいるCJI0323_purF_m1m2菌株の場合、IMP濃度が3.33g/L(134%)向上され、2つの変異を一緒に含んでいるときにIMP濃度の向上に最も大きな効果があることを確認した。
XMP生産菌株に基づいて、実施例2で見つかったpurF変異体の効果を確認するために、高濃度のXMP生産菌株KCCM10530(特許文献4)に変異体を導入してXMP生産能を確認した。
前記実施例3−1で製作したpDZ-purF(V2M)、pDZ-purF(G445R)ベクターをKCCM10530に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross-over)を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号15と配列番号16のプライマーを用いてPCRを行って塩基配列を分析することにより、菌株内に変異が導入されたことを確認した。具体的には、purF遺伝子のV2Mの変異が導入された前記菌株をKCCM10530_purF_m1、G445Rの変異が導入された菌株をKCCM10530_purF_m2と命名した。また、V2MとG445Rの変異をすべて含む変異菌株を製作するために、KCCM10530_purF_m1の菌株にpDZ−purF(G445R)ベクターを形質転換し、前記と同様の方法でコロニーを確保した。確保したコロニーの遺伝子配列解析を行い、purF遺伝子のV2M及びG445Rの変異がすべて導入された菌株を選別し、これをKCCM10530_purF_m1m2と命名した。
前記KCCM10530_purF_m1はCJX1681と呼ばれ、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年9月10日付で寄託し、受託番号KCCM12312Pを与えられた。また、前記製作したKCCM10530_purF_m2はCJX1682と呼ばれ、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年9月10日付で寄託し、受託番号KCCM12313Pを与えられた。
下記の結果から分かるように、対照群であるKCCM10530菌株に比べてpurF遺伝子内のV2M変異またはG445変異を有するKCCM10530_purF_m1及びKCCM10530_purF_m2菌株の場合、XMP濃度がそれぞれ1.77g/L(115%)、0.8g/L (107%)が向上されたことを確認した。また、V2MとG445R変異をすべて含んでいるKCCM10530_purF_m1m2菌株の場合、XMP濃度が2.36g/L(120%)向上され、2つの変異を一緒に含んでいるときにXMP濃度の向上に最も大きな効果があることを確認した。
Claims (13)
- 配列番号2のアミノ酸配列でN末端からi)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換、ii)445番目のアミノ酸がアルギニン(Arginine)に置換、またはiii)2番目のアミノ酸がメチオニン(Methionine)に置換されて445番目のアミノ酸がアルギニンに置換された、変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ。
- 請求項1に記載の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項1に記載の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼを含む、プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項4に記載のプリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項4に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
- 前記培養する段階の後、前記微生物または培地からプリンヌクレオチドを回収する段階をさらに含む、請求項6に記載のプリンヌクレオチドの製造方法。
- 前記コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項6に記載のプリンヌクレオチドの製造方法。
- 請求項1に記載の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼまたは請求項4に記載の微生物を含む、プリンヌクレオチドの生産用組成物。
- 請求項1に記載の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼまたは請求項4に記載の微生物を含む、プリンヌクレオチドの生産増加方法。
- プリンヌクレオチドの生産のための、請求項1に記載の変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼの用途。
- プリンヌクレオチドの生産のための、請求項2に記載のポリヌクレオチドの用途。
- プリンヌクレオチドの生産のための、請求項4に記載のコリネバクテリウム属微生物の用途。
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