JP6839763B2 - 新規ポリペプチド及びこれを用いたimpの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明の他の目的は、本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のタンパク質変異体及び前記本発明のベクターを含む5’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明の微生物を培地で培養する段階を含む5’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明の5’−イノシン酸排出タンパク質変異体をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、高収率の5’−イノシン酸の排出増加方法を提供することにある。
前記目的を達成するための本発明の一つの様態は、5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を提供することにある。
本明細書において、用語、「5’−イノシン酸を排出するタンパク質」は、5’−イノシン酸(5'-inosine monophosphate;IMP)を細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味する。本発明の目的上、前記用語はIMP排出能を有するタンパク質、IMP排出タンパク質、5’−イノシン酸排出能を有するタンパク質、5’−イノシン酸排出タンパク質などと混用して使用してもよい。具体的には、前記タンパク質はImpEで示してもよく、より具体的には、ImpE1またはImpE2で示してもよいが、これに制限されるものではない。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
すなわち、本発明で「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質」または「特定配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質」と記載されていても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、前記変異型タンパク質と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異(silent mutation)または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属することは自明である。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか(homologous)または同一(identical)の配列は、中間または高い厳しい条件(stringent conditions)で、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
任意の2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献2と同じデフォルトのパラメータを用いて「FASTA」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献3)(バージョン5.0.0またはそれ以降のバージョン)で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(非特許文献4)を使用して決定してもよい。(GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990);Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのBLAST、またはClustalWを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
具体的な例として、前記5’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は、配列番号141、142、145、147、149または151からなるアミノ酸配列、または配列番号153または154のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列またはこれと少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。さらに、このような相同性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用されることは自明である。
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー(polymer)であって、一定の長さ以上のDNAまたはRNA鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、コドン縮退性(codon degeneracy)によって前記配列番号141、142、145、147、149または151のアミノ酸配列、または配列番号153または154のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはこれと相同性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれることは自明である。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号143、144、146、148、150、152、153または154の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、より具体的には143、144、146、148、150、152、153または154の塩基配列で構成されたポリヌクレオチドであってもよい。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化し、配列番号141、142、145、147、149または151のアミノ酸配列、または配列番号153または154のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコード(つまり、暗号化)するポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。
ハイブリダイズは、たとえハイブリッド化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリッド化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、DNAに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイズ段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Tm値は、60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている(非特許文献8参照)。
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、及びCharon21Aなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系とpET系などを用いてもよい。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いてもよい。
本発明の一具現例として、本発明の微生物は、アデニロコハク酸シンテターゼ(adenylosuccinate synthetase)、及び/またはIMPデヒドロゲナーゼ(IMP dehydrogenase)の活性がさらに弱化されたコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum )、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)などであるが、必ずこれに限定されるものではない。
本発明のもう一つの様態として、前記5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、5’−イノシン酸の製造方法を提供する。
具体的には、本発明の方法は、前記微生物または培地から5’−イノシン酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5〜9、具体的には、pH6〜8、最も具体的には、pH6.8)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20〜45℃、具体的には、25〜40℃を維持してもよく、約10〜160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された5’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
本発明の組成物は、さらに、前記ポリヌクレオチドを作動させることができる構成を制限なく含んでもよい。本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させうるようにベクター内に含まれた形態であってもよい。
本発明は、もう一つの様態として、5’−イノシン酸排出タンパク質変異体をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、5’−イノシン酸の排出増加方法を提供する。
前記用語、「5’−イノシン酸排出タンパク質」、「強化」及び「コリネバクテリウム属微生物」は、前述したとおりである。
IMP排出に関与するコリネバクテリウム属の膜タンパク質を同定するためにコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872のゲノミックDNAライブラリを製作した。以後、コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても、非常に極微量が生産されるだけなので、IMP生産能を確認するために、IMP生産能を有するATCC6872由来のCJI0323菌株を製作した。製作されたCJI0323菌株にATCC6872のゲノミックDNAライブラリを用いてIMP排出に関与する膜タンパク質のスクリーニングを行った。具体的な実験は、以下のとおりである。
ATCC6872由来のIMP生産株を製作するために、ATCC6872をリン酸塩緩衝液(pH7.0)、またはクエン酸緩衝液(pH5.5)に107〜108細胞/mlで懸濁させた。ここにUV処理して突然変異を誘発させた。2回にかけて0.85%食塩水で洗浄して希釈した後、1.7%寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地で培養し、種培地で24時間培養した。発酵培地で3〜4日間培養した後、培養液に蓄積されたIMP生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度IMP生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、3,4−デヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてIMP生産能の優れたCJI0323を最終選別した。下記の表1にATCC6872に比べたCJI0323の耐性程度を比較して示した。
−栄養培地:ペプトン1%、肉汁1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
−種培地:ブドウ糖1%、ペプトン1%、肉汁1%、酵母エキス1%、塩化ナトリウム0.25%、アデニン100mg/l、グアニン100mg/l、pH7.5
−発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ブドウ糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI0323をそれぞれ接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表2のとおりである。
1.7%の寒天を添加した最小培地内にさらにIMPを添加してCJI0323菌株の生育低下(growth inhibition)を示すスクリーニング条件を確立した。ATCC6872ゲノミックライブラリプラスミドをCJI0323菌株に電気穿孔法で形質転換させて(非特許文献9)、過量のIMPが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得し、シーケンスの技法により塩基配列を分析した。これから、過量のIMP添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の1種を同定した。
前記1種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列、及び配列番号4の塩基配列(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter)と確認された。前記膜タンパク質は、MFSトランスポーターとして知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにIMP排出に関する機能は知られていない。本明細書では、これをImpE2(WT)と命名した。
実施例2−1:impE1、impE2の確認
前記膜タンパク質ImpE2の機能を調べるため、NCBIから配列番号4の遺伝子構造を確認した(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter)。impE2(配列番号4)のORFの開始部分の7bpがその上流に位置した他の遺伝子(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795119、transcriptional regulator)と7bpオーバーラップされることを確認した。impE2 の上流に位置した遺伝子及び該当遺伝子からコードされるタンパク質は、まだ機能が確認されなかったので、本明細書ではこれをImpE1(WT)と命名した(配列番号1のアミノ酸配列及び配列番号3の塩基配列)。
実施例1と2−1を介して同定したIMPによる生育低下を解除させるのに関与するImpE1またはImpE2をIMP生産菌株で欠損させた場合、IMPの排出能が減少するのかを確認するために、各遺伝子の欠損ベクターを製作した。
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ATCC6872ゲノミックDNAを鋳型としてPCRを介して獲得した。
具体的には、前記impE1のPCRは、配列番号5、6のプライマー及び配列番号7、8のプライマーを、impE2のPCRは、配列番号9、10のプライマー及び配列番号11、12のプライマーを用いた(表3)。
PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、52℃で3分のアニーリング、72℃で1分の重合を25回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。配列番号5と6のプライマー、配列番号7と8のプライマーを用いて増幅されたimpE1遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZ(特許文献2及び3)のベクターにクローニングしてpDZ−△impE1を製作した。また、配列番号9と10のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子断片と配列番号11と12のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.7kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaI、speIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−△impE2を製作した。
前記IMPによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質をコードする遺伝子impE1とimpE2はオーバーラップされているので、二つの遺伝子は同時に調節される必要がある。したがって、impE1とimpE2の両方が欠損したベクターを製作した。
impE1とimpE2のPCRは、配列番号5と13のプライマー及び配列番号14と12のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク(NIH GenBank)に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis、ATCC6872)遺伝子(NCBI Genbank:NZ_CP014279)及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。配列番号5と13のプライマーを用いて増幅されたimpE1遺伝子断片と配列番号14と12のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、2.0kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を、それぞれXbaI、speIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−△impE1E2を製作した。
実施例2−2で製作した2種と実施例2−3で製作した1種のプラスミドをそれぞれCJI0323に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が欠損されたかどうかは、配列番号5、8及び配列番号9、12及び配列番号5、12のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。
選別された菌株は、CJI0323_△impE1、CJI0323_△impE2、CJI0323_△impE1E2と命名し、前記菌株のIMPの生産能を評価した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、CJI0323、CJI0323_△IMPE1、CJI0323_△IMPE2、CJI0323_△IMPE1E2を接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表4のとおりである。
前記実施例1で高濃度IMP生産をするCJI0323菌株の場合、高濃度のIMPを生産するためにIMP排出能が向上した可能性がある。したがって、CJI0323菌株のimpE1、impE2が変異されたかどうかを確認した。CJI0323の染色体DNAをポリメラーゼ連鎖反応の方法(以下「PCR法」という)を介して増幅した。具体的には、まず、前記CJI0323の染色体DNAを鋳型として、配列番号15と16のプライマーを用いて(表5)94℃で1分間変性、58℃で30秒間の結合、72℃で2分間Taq DNAポリメラーゼで重合する条件を28回繰り返すPCR方法を通じて、約2.8kbの塩基対の断片を増幅した。
また、impE2遺伝子の4番目のヌクレオチドであるgがaに置換されて(impE1遺伝子の666番目のヌクレオチドであるgがaに置換されたことを意味する)、191番目のヌクレオチドであるgがaに置換されていることを確認した。これはImpE2タンパク質の2番目のアミノ酸(ImpE1タンパク質の222番目のアミノ酸に該当)であるバリンがイソロイシンに置換され、64番目のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に置換されていることを意味する。
CJI0323菌株のimpE1ヌクレオチドはimpE1_CJI0323(配列番号143)、タンパク質はImpE1_CJI0323(配列番号141)と命名し、CJI0323菌株のimpE2ヌクレオチドはimpE2_CJI0323(配列番号144)、タンパク質はImpE2_CJI0323(配列番号142)と命名した。
実施例4−1:impE1またはimpE2 変異の復元 ベクターの製作
前記実施例3でIMP生産菌株CJI0323菌株でimpE1、impE2が変異されたかどうかを確認した結果、impE1に1つ、impE2に2つの変異が含まれていることを確認した。CJI0323菌株は高濃度でIMPを生産する菌株であるため、前記変異がIMP排出能を向上させる変異である可能性が高い。したがって、変異のない天然の野生型であるImpEに復元した後、それぞれの変異がIMP排出能を付与するかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
復元ベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を鋳型としてPCRを行った。配列番号17と18のプライマーを用いて増幅されたimpE1impE2遺伝子断片をXbaIの制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングして、pDZ−impE1E2(WT)を製作した。
ImpE1のE164K単独変異ベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を鋳型として配列番号19と20のプライマー及び配列番号21と22のプライマーを用いた。配列番号19と20のプライマーを用いて増幅されたE164K−1遺伝子断片と配列番号21と22のプライマーを用いて増幅されたE164K−2遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−impE1(E164K)を製作した。
ImpE2のG64E単独変異ベクターを製作するために、ATCC6872を鋳型として配列番号19と25のプライマー及び配列番号26と22のプライマーを用いた。配列番号19と25のプライマーを用いて増幅されたG64E−1遺伝子断片と配列番号26と22のプライマーを用いて増幅されたG64E−2遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−impE2(G64E)を製作した。
実施例4−1で製作したプラスミドをCJI0323に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えにによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株に対して再度2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が復元したかどうかは、配列番号15、16のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。以後、製作された菌株をCJI0323_impE1E2(WT)と命名した。
CJI0323_impE1E2(WT)菌株の実施例4−2で製作したプラスミドの3種を形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株に対して再度2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号15、16のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。選別された菌株は、CJI0323_impE1(E164K)、CJI0323_impE2(V2I)、CJI0323_impE2(G64E)と命名した。
前記コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323_impE1(E164K)、コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323_impE2(V2I)及びコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323_impE2(G64E)菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM)に2018年11月2日付で寄託し、それぞれ寄託番号KCCM12359P、KCCM12360P及びKCCM12361Pを与えられた。
実施例4−2で製作したpDZ−impE2(V2I)、pDZ−impE2(G64E)プラスミドをCJI0323_impE1(E164K)に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、 相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株に対して再度2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号15、16のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。以後、製作された菌株は、CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)、CJI0323_impE1(164K)_impE2(G64E)と命名した。
pDZ−impE2(G64E)プラスミドをCJI0323_impE2(V2I)に電気穿孔法で形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株に対して再度2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号15、16のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。選別された菌株は、CJI0323_impE2(V2I)(G64E)と命名した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、CJI0323_impE1E2(WT)、CJI0323_impE1(E164K)、CJI0323_impE2(V2I)、CJI0323_impE2(G64E)、CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)、CJI0323_impE1(E164K)_impE2(G64E)、CJI0323_impE2(V2I)(G64E)を接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表7のとおりである。
実施例5−1:impE1、impE2変異のアミノ酸置換挿入用ベクターの製作
前記の結果を通して5’−イノシン酸の生産能の向上された変異のうち、代表的な3種の変異(impE1(E164K)、impE2(V2I)、impE2(G64E))の位置的重要性を確認するために、impE1のアミノ酸配列で164番目のアミノ酸、impE2のアミノ酸配列で2番目のアミノ酸、または64番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異導入用ベクターを製作した。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号27と配列番号28〜45とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の0.7kbpのポリヌクレオチドを取得した。次に、コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離して、配列番号46と配列番号47〜64のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の0.7kbpのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して取得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長PCR法を行い、18種の1.4kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素SpeIで切断し、T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換して、カナマイシン(25mg/L)が含まれたLB固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列情報は、表8のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号65と配列番号66〜83とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の0.7kbpのポリヌクレオチドを取得した。次に、コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離して、配列番号84と配列番号85〜102のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の0.7kbpのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して取得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長PCR法を行い、18種の1.4kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断し、T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換して、カナマイシン(25mg/L)が含まれたLB固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列情報は、表10のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号103と配列番号104〜121とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の1kbpのポリヌクレオチドを取得した。次に、コリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323の染色体遺伝子を分離して、配列番号122と配列番号123〜140のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。PCR法の条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果、18種の1kbpのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して取得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長PCR法を行い、18種の2kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断し、T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターに連結した後、大腸菌DH5αに形質転換して、カナマイシン(25mg/L)が含まれたLB固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列情報は、表12のとおりである。
前記実施例5−1で製造した変異導入用ベクター54種をコリネバクテリウム・スタティオニスCJI0323に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株に対して再度2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号15、16のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。挿入された変異による菌株名は次の表14のとおりである。
実施例6−1:IMP生産株基盤impE1、impE2変異菌株の製作
IMP生産菌株でimpE1、impE2の変異導入効果を確認するために、ATCC6872でIMPの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ (adenylosuccinate synthetase)及びIMPデヒドロゲナーゼ(IMP dehydrogenase)の活性が弱化された菌株を製作した。前記二つの酵素をコードする遺伝子purA及びguaBの各塩基配列から1番目の塩基をaからtに変更して開始コドンを変更した。ATCC6872において、前記二つの遺伝子の発現が弱化された菌株はCJI9088と命名した。製造されたCJI9088菌株に前記実施例4−2で製作されたpDZ−impE1(E164K)、pDZ−impE2(V2I)、pDZ−impE2(G64E)を電気穿孔法で形質転換し、CJI9088_impE1(E164K)_impE2( V2I)に実施例5−1で製作したpDZ−impE2(G64D)のベクターを電気穿孔法で形質転換した。 相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株に対して再度2次交差を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号15、16のプライマー対を用いてPCRを行い、塩基配列を分析することで確認した。
製作されたCJI9088及びCJI9088_impE1(E164K)、CJI9088_impE2(V2I)、CJI9088_impE2(G64E)及びCJI9088_impE1(E164K)_impE2(V2I)(G64D)菌株のIMP生産能を評価した。培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表16のとおりである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (8)
- 配列番号1のアミノ酸配列と配列番号2のアミノ酸配列とを含む、5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体であって、
(A)配列番号1で164番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、又は
(B)配列番号2で2番目のアミノ酸、配列番号2で64番目のアミノ酸若しくは配列番号2で2番目のアミノ酸と64番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、
5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。 - (A)前記配列番号1で164番目のアミノ酸が、リジン、アルギニン、アスパラギン、グリシン、トレオニン若しくはプロリンに置換された、又は
(B)前記配列番号2で2番目のアミノ酸が、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、若しくはアスパラギンに置換された、前記配列番号2で64番目のアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、システイン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンに置換された、又は配列番号2で2番目のアミノ酸と64番目のアミノ酸が、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、イソロイシン及びフェニルアラニンから選ばれるアミノ酸に置換された、
請求項1に記載の5’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。 - 請求項1又は2に記載のタンパク質変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項1若しくは2に記載のタンパク質変異体、又は請求項1又は2に記載のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する、5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項5に記載の5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項5に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び、前記微生物または培地から5’−イノシン酸を回収する段階を含む、5’−イノシン酸の製造方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項7に記載の5’−イノシン酸の製造方法。
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