JP6652687B2 - 5’−イノシン酸を生産する微生物及びこれを用いた5’−イノシン酸の生産方法 - Google Patents
5’−イノシン酸を生産する微生物及びこれを用いた5’−イノシン酸の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6652687B2 JP6652687B2 JP2019535338A JP2019535338A JP6652687B2 JP 6652687 B2 JP6652687 B2 JP 6652687B2 JP 2019535338 A JP2019535338 A JP 2019535338A JP 2019535338 A JP2019535338 A JP 2019535338A JP 6652687 B2 JP6652687 B2 JP 6652687B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- imp
- seq
- impe1
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 101
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 title claims description 99
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 38
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 title claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 120
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 73
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 39
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 28
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 21
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 53
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 53
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 53
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 23
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 101100340952 Drosophila melanogaster ImpE2 gene Proteins 0.000 description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 9
- PCLIRWBVOVZTOK-UHFFFAOYSA-M 2-(1-methylpyrrolidin-1-ium-1-yl)ethyl 2-hydroxy-2,2-diphenylacetate;iodide Chemical compound [I-].C=1C=CC=CC=1C(O)(C=1C=CC=CC=1)C(=O)OCC[N+]1(C)CCCC1 PCLIRWBVOVZTOK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 108010087227 IMP Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006674 IMP dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 2
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940086388 thiamine hydrochloride 5 mg Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N (S)-azetidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUJMXIQZWPZMNQ-XYYGWQPLSA-N 13,14-dihydro-15-oxo-prostaglandin E2 Chemical compound CCCCCC(=O)CC[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O CUJMXIQZWPZMNQ-XYYGWQPLSA-N 0.000 description 1
- OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydro-1h-pyrrol-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1NCC=C1 OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056443 Adenylosuccinate synthase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100350224 Bacillus subtilis (strain 168) pdhB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 101100236536 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) glcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100126053 Dictyostelium discoideum impdh gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010049977 Peptide Elongation Factor Tu Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100406344 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceF gene Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 102000005130 adenylosuccinate synthetase Human genes 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 1
- 229950011321 azaserine Drugs 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088129 calcium pantothenate 10 mg Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 101150035744 guaB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 nitrogen-containing organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N sulfaguanidine Chemical compound NC(=N)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004257 sulfaguanidine Drugs 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- DZLNHFMRPBPULJ-UHFFFAOYSA-N thioproline Chemical compound OC(=O)C1CSCN1 DZLNHFMRPBPULJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229950001139 timonacic Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明の他の目的は、本発明のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、5’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、本発明のIMP排出タンパク質の活性が強化されたタンパク質を含む、5’−イノシン酸生産用組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、本発明のIMP排出タンパク質をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、5’−イノシン酸の排出増加方法を提供することにある。
本発明において、用語、「5’−イノシン酸排出タンパク質」は、5’−イノシン酸(5’-inosine monophosphate;以下IMP)を細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味する。本発明の目的上、前記用語はIMP排出能を有するタンパク質、5’−イノシン酸排出能を有するタンパク質、5’−イノシン酸排出タンパク質などと混用して使用してもよく、具体的には、ImpEで示してもよく、より具体的には、ImpE1、ImpE2で示してもよいが、これに制限されるものではない。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。例えば、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であり、5’−イノシン酸排出能を有するタンパク質として相応する活性を有するタンパク質は、本発明のタンパク質として用いられてもよい。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか(homologous)または同一(identical)の配列は、中間または高い厳しい条件(stringent conditions)で、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
本明細書において、用語、「活性の強化」は、タンパク質の活性が導入されたり、微生物が有する内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記活性の「導入」は、自然的あるいは人為的に微生物が本来有していなかった特定タンパク質の活性が現れるようになることを意味する。「内在的活性 」は、自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質の変化前に親菌株が本来に有していた特定タンパク質の活性をいう。
例えば、前記活性の強化は、外来のIMP排出タンパク質を宿主細胞に導入したり、導入して強化すること、または内在的IMP排出タンパク質の活性を増加させることをすべて含んでもよい。
1)前記タンパク質をコード(つまり、暗号化)するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
2)前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
3)前記タンパク質の活性が増強されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
4)その組み合わせによって強化されるように変形する方法
などにより行われてもよいが、これに制限されない。
前記1)ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で実行されるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって実行されてもよい。また、コピー数の増加の一様態として、タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行ってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一/類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく用いてもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行ってもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりタンパク質が生成され、その活性が増加されうる。前記コピー数の増加は、ポリヌクレオチドがタンデム(tandem)形態で連続的に存在してもよく、この場合、互いに異なるIMP排出タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が交差的、順次的、同じ配列が反復的に存在することができ、タンデム形態で連続的に存在する場合、互いにオーバーラップが生じることがあるが、これに制限されない。具体的には、本発明は、配列番号3、配列番号4または配列番号5で記載されたポリヌクレオチド配列のコピー数が増加したものであってもよい。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリッド化段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Tm値は、60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている(非特許文献8参照)。
作動可能な連結は、当業界に公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよく、
部位特異的DNA切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
本明細書において、用語、「5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属(the genus Corynebacterium)微生物」とは、天然型または変異を介して5’−イノシン酸生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本発明で5’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型菌株それ自体または外部5’−イノシン酸の生産メカニズムと関連された遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり弱化させて向上された5’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、形質変化前の親菌株または非変形微生物より、5’−イノシン酸生産能が向上された微生物であってもよい。
具体的には、本発明の方法は、前記微生物または培地から5’−イノシン酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5〜9、具体的には、pH6〜8、最も具体的には、pH6.8)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20〜45℃、具体的には、25〜40℃を維持してもよく、約10〜160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された5’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された5’−イノシン酸は、精製された形態または5’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい。
本発明の組成物は、さらに、前記ポリヌクレオチドを作動させることができる構成を制限なく含んでもよい。また、本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させうるようにベクター内に含まれた形態であってもよい。
本発明は、もう一つの様態として、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質の、コリネバクテリウム属微生物の5’−イノシン酸の生産増加のための用途を提供する。
本発明は、もう一つの様態として、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、5’−イノシン酸の排出増加方法を提供する。
本発明は、もう一つの様態として、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質の、コリネバクテリウム属微生物の5’−イノシン酸の排出増加のための用途を提供する。
前記用語、「配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質」、「強化」及び「コリネバクテリウム属微生物」は、前述した通りである。
IMP排出に関与するコリネバクテリウム属の膜タンパク質を同定するためにコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872のゲノミックDNAライブラリを製作した。
以後、コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても、非常に極微量が生産されるだけなので、IMP生産能を確認するために、IMP生産能を有するATCC6872由来のCJI0323菌株を作製した。製作されたCJI0323菌株に前記ATCC6872のゲノミックDNAライブラリを形質転換し、IMP排出に関与する野生型の膜タンパク質のスクリーニングを行った。具体的な実験は、以下の通りである。
ATCC6872由来のIMP生産株を製作するために、ATCC6872をリン酸塩緩衝液(pH7.0)、またはクエン酸緩衝液(pH5.5)に107〜108細胞/mlで懸濁させた。ここにUV処理して突然変異を誘発させた。2回にかけて0.85%食塩水で洗浄して希釈した後、1.7%寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で24時間培養した。発酵培地で3〜4日間培養した後、培養液に蓄積されたIMP生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度IMP生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、3,4−デヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてIMP生産能の優れたCJI0323を最終選別した。下記の表1にATCC6872に比べたCJI0323の耐性程度を比較して示した。
−栄養培地:ペプトン1%、肉汁1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
−種培地:ブドウ糖1%、ペプトン1%、肉汁1%、酵母エキス1%、塩化ナトリウム0.25%、アデニン100mg/l、グアニン100mg/l、pH7.5
−発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ブドウ糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI0323をそれぞれ接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表2の通りである。
1.7%の寒天を添加した最小培地内にさらにIMPを添加してCJI0323菌株の生育低下(growth inhibition)を示すスクリーニング条件を確立した。ATCC6872ゲノミックライブラリプラスミドをCJI0323菌株に電気穿孔法で形質転換させて(非特許文献9)、過量のIMPが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得し、シーケンスの技法により塩基配列を分析した。このことから、過量のIMP添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の1種を同定した。
前記の1種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列、及び配列番号5の塩基配列(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter)と確認された。前記膜タンパク質は、MFSトランスポーターとして知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにIMP排出に関する機能は知られていない。本発明では、これをImpE2(WT)と命名した。
実施例2−1:impE1、impE2の確認
前記膜タンパク質ImpE2の機能を調べるため、NCBIから配列番号5の遺伝子構造を確認した(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter)。配列番号5(impE2)はORFの開始部分の7bpがimpE2の上流に位置した遺伝子(NCBI GenBank:NZ_CP014279、WP_066795119、transcriptional regulator)とオーバーラップされることを確認した。impE2 の上流に位置した該当遺伝子及び遺伝子からコードされるタンパク質は、まだ機能が確認されなかったので、本発明でこれをImpE1(WT)と命名した(配列番号1のアミノ酸配列及び配列番号4の塩基配列)。
実施例1と2−1を介して同定したIMPによる生育低下を解除させるのに関与するImpE1またはImpE2をIMP生産菌株で欠損させた場合、IMPの排出能が減少するのかを確認するために、各遺伝子の欠損ベクターを製作した。
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ATCC6872ゲノミックDNAを鋳型としてPCRを介して獲得した。
具体的には、前記impE1のPCRは、配列番号6、7のプライマー及び配列番号8、9のプライマーを、impE2のPCRは、配列番号10、11のプライマー及び配列番号12、13のプライマーを用いた(表3)。
PCR条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、52℃で3分のアニーリング、72℃で1分重合を25回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。配列番号6と7のプライマー、配列番号8と9のプライマーを用いて増幅されたimpE1遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.8kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZ(特許文献2及び3)のベクターにクローニングしてpDZ−△impE1を製作した。また、配列番号10と11のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子断片と配列番号12と13のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、1.7kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素XbaI、speIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−△impE2を製作した。
前記IMPによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質をコードする遺伝子impE1とimpE2はオーバーラップされているので、二つの遺伝子は同時に調節されるべく必要性がある。したがって、impE1とimpE2の両方が欠損したベクターを製作した。
impE1とimpE2PCRは、配列番号6と14のプライマー及び配列番号15と13のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク(NIH GenBank)に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス(ATCC6872)遺伝子(NCBI Genbank:NZ_CP014279)及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。配列番号6と14のプライマーを用いて増幅されたimpE1遺伝子断片と配列番号15と13のプライマーを用いて増幅されたimpE2遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、2.0kbpのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を、それぞれXbaI、speIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングして、pDZ−△impE1E2を製作した。
実施例2−2で製作した2種と実施例2−3で製作した1種のプラスミドをそれぞれCJI0323に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が欠損されたかどうかは、配列番号6、9及び配列番号10、13及び配列番号6、13のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。
選別された菌株は、CJI0323_△impE1、CJI0323_△impE2、CJI0323_△impE1E2と命名し、前記菌株のIMPの生産能を評価した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、CJI0323、CJI0323_△impE1、CJI0323_△impE2、CJI0323_△impE1E2を接種し、30℃の温度で24時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表4の通りである。
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても非常に極微量が生産されるだけなので、IMP生産能を有するCJI0323菌株でImpEタンパク質を欠損した後、野生型のImpEタンパク質を導入することにより復元し、また、ImpEタンパク質の活性を強化することにより野生型ImpEタンパク質強化によるIMP排出能の増加を確認した。前記タンパク質の活性強化は、強化の方法の一つである「コピー数の増加」の方法及びプロモーター強化の方法を用いた。
ImpEが野生型に導入された菌株を製作するために、まず、ベクターを製作するための遺伝子断片をATCC6872ゲノミックDNAを鋳型とし、PCRを介して獲得した。野生型impE1とimpE2のPCRは、配列番号6と13のプライマーを用いた。配列番号6と13のプライマーを用いて増幅された野生型impE1−impE2遺伝子全体の断片はXbaI、SpeI制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングして、pDZ−impE1E2(WT)を作製した。
ImpE1強化ベクターを製作するために、まず、ベクターを製作するための遺伝子断片をATCC6872ゲノミックDNAを鋳型とし、PCRを介して獲得した。impE1を強化するためにプロモーター部位と思われるimpE1上流の約370bpを含む配列番号16と17のプライマーを用いて増幅した。増幅されたimpE1遺伝子断片をXbaIの制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングして、pDZ−impE1(WT)2−1を作製した。その後、2コピーベクター製作のために、impE1は配列番号18と19のプライマー対でPCRを行った。確保された各DNA断片は、DNA制限酵素であるNotIで切断し、同じDNA制限酵素で切断したpDZ−impE1(WT)2−1にクローニングした。製造されたベクターは、pDZ−impE1(WT)2×と命名した。
impE1とimpE2が統合強化された菌株を製作するために、野生型impE1とimpE2の統合遺伝子を配列番号16と20のプライマーを用い、PCRを介して増幅した。増幅された遺伝子断片をXbaIの制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングして、pDZ−impE1E2(WT)2−1を作製した。その後、2コピーベクターの製作のために、impE1E2は配列番号18と21のプライマー対でPCRを行った。確保された各DNA断片は、DNA制限酵素であるNotIで切断し、同じDNA制限酵素で切断したpDZ−impE1E2(WT)2−1にクローニングした。製造されたベクターは、pDZ−impE1E2(WT)2×と命名した。
実施例3−1で製作したpDZ−impE1E2(WT)を、実施例2で製作したCJI0323_△impE1E2菌株に電気穿孔法で形質転換した後、(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号6、13のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。その後に製作された菌株CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)を評価して、CJI0323菌株にimpE1及びimpE2の野生型が導入された場合のIMP生産能を確認した。
また、CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)菌株に電気穿孔法でpDZ−impE1(WT)2×、pDZ−impE1E2(WT)2×ベクターを形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が強化されたかどうかは、配列番号16、19及び配列番号16、21のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)、CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_impE1(WT)2×及びCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT)2×を実施例2−4と同様の方法で培養し、菌株を獲得して、前記菌株のIMP生産能を評価した。培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表6の通りである。
前記製作されたCJI0323及びCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT)2×(CJI2236)は、それぞれコリネバクテリウム・スタティオニスCN01−0323及びコリネバクテリウム・スタティオニスCN01−2236と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean CultureCenter of Microorganisms、KCCM)にそれぞれ2017年11月7日付で寄託して寄託番号KCCM12151Pを、2017年10月25日付で寄託して寄託番号KCCM12137Pを与えられた。
各遺伝子のプロモーターを強化されたプロモーターに交替するベクターを製作するための遺伝子断片は、ATCC6872ゲノミックDNAを鋳型としてPCRを介して獲得した。
前記強化されたプロモーターは、コリネバクテリウム・スタティオニスで強く発現されると報告されているPcj7(特許文献4)プロモーターを用いた。
impE1のPCRは、配列番号22と13のプライマー、24と25のプライマーを用いて増幅したそれぞれの遺伝子断片をXbaI、NdeIの制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングした。Pcj7遺伝子断片を増幅するためにATCC6872ゲノミックDNAを鋳型として配列番号30と31のプライマーでPCRを行い、得られた断片をNdeIで処理して、前記作製したベクターをNdeIで処理してpDZ−Pcj7_impE1(WT)ベクターを製作した。
impE2のPCRは、配列番号26と27のプライマー、28と29のプライマーを用いて増幅したそれぞれの遺伝子断片をXbaI、NdeIの制限酵素で処理し、pDZベクターのXbaI制限酵素の位置にクローニングした。前記得られたPcj7遺伝子断片と製作したベクターをNdeIで処理し、pDZ−Pcj7_impE2(WT)ベクターを作製した。
実施例4−1で製作した2種のプラスミドをそれぞれ実施例3−3で製作したCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)菌株に電気穿孔法で形質転換した後(非特許文献10による形質転換法利用)、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が強化されたかどうかは、配列番号22、25及び配列番号26、27のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。前記製作された2種の菌株は、CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)、CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)と命名した。また、製作したCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)菌株を基にしてpDZ−Pcj7_impE2(WT)を形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が強化されたかどうかは、配列番号26、29のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。前記製作された菌株は、CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT)と命名した。以後、前記製作された菌株CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)、CJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)、及びCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT )を実施例2−4と同様の方法でそれぞれ培養し、IMP生産能を評価した。
培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表8のとおりである。
前記製作したCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)及びCJI0323_△impE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM)に2018年11月2日付で寄託し、それぞれ寄託番号KCCM12357P及びKCCM12358Pを与えられた。
実施例4−1:IMP生産株基盤impE1、impE2強化菌株の製作
IMP生産菌株でimpE1、impE2の強化効果を確認するために、ATCC6872からIMPの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ(adenylosuccinate synthetase)及びIMPデヒドロゲナーゼ(IMP dehydrogenase)の活性が弱化された菌株を作製した。前記二つの酵素をコードする遺伝子purA及びguaBの各塩基配列から1番目の塩基をaからtに変更して開始コドンを変更した。ATCC6872から前記二つの遺伝子の発現が弱化された菌株は、CJI9088と命名した。製造されたCJI9088菌株に前記実施例3−3で製作したpDZ−impE1(WT)2×及びpDZ−impE1E2(WT)2×ベクターを電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross−over)を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号6、13のプライマー対を用いてPCRを行うことにより確認した。
製作されたCJI9088及びCJI9088_impE1(WT)2×、 CJI9088_impE1E2(WT)2×菌株のIMP生産能を評価した。培養終了後、HPLCを用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表9の通りである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (4)
- 配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が強化された、5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項1に記載の5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項1に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地から5’−イノシン酸を回収する段階を含む、5’−イノシン酸の製造方法。
- 前記5’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項3に記載の5’−イノシン酸の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2017-0173504 | 2017-12-15 | ||
KR1020170173504A KR101904675B1 (ko) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산 방법 |
PCT/KR2018/015935 WO2019117671A1 (ko) | 2017-12-15 | 2018-12-14 | 5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020505005A JP2020505005A (ja) | 2020-02-20 |
JP6652687B2 true JP6652687B2 (ja) | 2020-02-26 |
Family
ID=63863134
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019535338A Active JP6652687B2 (ja) | 2017-12-15 | 2018-12-14 | 5’−イノシン酸を生産する微生物及びこれを用いた5’−イノシン酸の生産方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11155849B2 (ja) |
EP (1) | EP3608410A4 (ja) |
JP (1) | JP6652687B2 (ja) |
KR (1) | KR101904675B1 (ja) |
CN (2) | CN109929787A (ja) |
AU (1) | AU2018378011B2 (ja) |
BR (1) | BR112019013003B1 (ja) |
MX (1) | MX2019008018A (ja) |
RU (1) | RU2723038C1 (ja) |
WO (2) | WO2019117398A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201903518B (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101916611B1 (ko) | 2017-12-15 | 2018-11-07 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 |
KR101904675B1 (ko) | 2017-12-15 | 2018-10-04 | 씨제이제일제당 (주) | 5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산 방법 |
US11180754B2 (en) | 2017-12-15 | 2021-11-23 | Cj Cheiljedang Corporation | Polypeptide and method of producing IMP using the same |
KR101916622B1 (ko) | 2018-01-04 | 2018-11-07 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 |
KR102013873B1 (ko) | 2018-01-25 | 2019-08-23 | 씨제이제일제당 주식회사 | 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 |
KR102006976B1 (ko) | 2019-02-26 | 2019-08-06 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 프로모터 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법 |
KR102006977B1 (ko) | 2019-03-28 | 2019-08-05 | 씨제이제일제당 주식회사 | 변이형 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법 |
KR102254631B1 (ko) * | 2021-01-15 | 2021-05-21 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 펩타이드 메티오닌 설폭사이드 환원효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
CN115433289B (zh) * | 2022-08-22 | 2024-02-27 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种益生元、提取方法及在富集肠道益生菌中的应用 |
WO2024096545A1 (ko) * | 2022-11-01 | 2024-05-10 | 씨제이제일제당 (주) | 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법 |
KR102614733B1 (ko) * | 2023-04-06 | 2023-12-19 | 대상 주식회사 | 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 신규 변이체 및 이를 이용한 5’-이노신산 생산 방법 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8818560D0 (en) | 1988-08-04 | 1988-09-07 | Ici Plc | Novel compounds |
EP1076053B1 (en) | 1998-04-27 | 2006-11-29 | Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. | 3-arylphenyl sulfide derivatives and insecticides and miticides |
KR100446113B1 (ko) * | 2001-11-26 | 2004-08-30 | 씨제이 주식회사 | 5-이노신산을 생산하는 미생물 및 그를 이용한5-이노신산의 생산방법 |
KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
KR20070060208A (ko) | 2005-12-08 | 2007-06-13 | 씨제이 주식회사 | 증가된 푸마레이즈 유전자 발현량을 갖는 5'-이노신산생산성이 우수한 코리네박테리움 속 미생물 및 그를이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법 |
KR20070060207A (ko) | 2005-12-08 | 2007-06-13 | 씨제이 주식회사 | 증가된 리포아미드 디히드로게나제 유전자 발현량을 갖는5'-이노신산 생산성이 우수한 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법 |
KR100882418B1 (ko) * | 2007-01-15 | 2009-02-05 | 씨제이제일제당 (주) | 이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신 제조방법 |
KR100954052B1 (ko) * | 2007-12-26 | 2010-04-20 | 씨제이제일제당 (주) | Abc-트랜스포터를 코딩하는 유전자가 불활성화된코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조방법 |
KR100959662B1 (ko) * | 2008-01-04 | 2010-05-26 | 씨제이제일제당 (주) | 이노신 생산능을 갖는 코리네박테리움속 미생물 및 이를이용한 이노신의 생산 방법 |
KR100964078B1 (ko) * | 2008-03-05 | 2010-06-16 | 씨제이제일제당 (주) | 5'-이노신산 생산능이 향상된 코리네박테리움암모니아게네스 및 그를 이용한 5'-이노신산 생산 방법 |
WO2010100189A1 (en) | 2009-03-04 | 2010-09-10 | Basf Se | 3-arylquinazolin-4-one compounds for combating invertebrate pests |
KR101166027B1 (ko) * | 2009-04-01 | 2012-07-19 | 씨제이제일제당 (주) | 5'-이노신산 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산의 생산방법 |
US9271500B2 (en) | 2012-06-18 | 2016-03-01 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Fused heterocyclic compound |
MY185322A (en) * | 2013-05-13 | 2021-05-04 | Ajinomoto Kk | Method for producing l-amino acid |
JP6423873B2 (ja) | 2013-07-08 | 2018-11-14 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 有害生物防除剤としての6員c−n−結合アリールスルフィド誘導体及びアリールスルホキシド誘導体 |
CN105980366B (zh) | 2013-12-16 | 2018-12-14 | 拜耳作物科学股份公司 | 作为害虫防治剂的六元c-n-连接的芳基硫醚衍生物和芳基亚砜衍生物 |
CN104845923B (zh) * | 2014-02-14 | 2018-03-23 | 中国科学院微生物研究所 | 生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌 |
WO2016052455A1 (ja) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | 住友化学株式会社 | ピリダジン化合物 |
US9802930B1 (en) | 2014-10-03 | 2017-10-31 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Pyrimidinone compound |
KR101744958B1 (ko) * | 2014-12-24 | 2017-06-12 | 대상 주식회사 | 5’-이노신산의 고생성능 코리네박테리움 암모니아게네스 변이 균주 및 이를 이용한 5’-이노신산의 제조 방법 |
KR101919655B1 (ko) * | 2016-06-23 | 2019-02-11 | 주식회사 이노웨이브 | 현금자동입출금기 관리 모듈 |
KR101904675B1 (ko) | 2017-12-15 | 2018-10-04 | 씨제이제일제당 (주) | 5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산 방법 |
-
2017
- 2017-12-15 KR KR1020170173504A patent/KR101904675B1/ko active IP Right Grant
-
2018
- 2018-02-22 WO PCT/KR2018/002207 patent/WO2019117398A1/ko active Application Filing
- 2018-03-08 CN CN201810192653.2A patent/CN109929787A/zh active Pending
- 2018-12-14 RU RU2019113238A patent/RU2723038C1/ru active
- 2018-12-14 MX MX2019008018A patent/MX2019008018A/es unknown
- 2018-12-14 WO PCT/KR2018/015935 patent/WO2019117671A1/ko active Application Filing
- 2018-12-14 CN CN201880003824.0A patent/CN110249054B/zh active Active
- 2018-12-14 EP EP18889922.3A patent/EP3608410A4/en active Pending
- 2018-12-14 BR BR112019013003-9A patent/BR112019013003B1/pt active IP Right Grant
- 2018-12-14 JP JP2019535338A patent/JP6652687B2/ja active Active
- 2018-12-14 US US16/346,418 patent/US11155849B2/en active Active
- 2018-12-14 AU AU2018378011A patent/AU2018378011B2/en active Active
-
2019
- 2019-05-31 ZA ZA2019/03518A patent/ZA201903518B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2018378011A1 (en) | 2019-07-04 |
EP3608410A4 (en) | 2020-04-22 |
CN109929787A (zh) | 2019-06-25 |
US11155849B2 (en) | 2021-10-26 |
WO2019117398A1 (ko) | 2019-06-20 |
MX2019008018A (es) | 2019-08-29 |
JP2020505005A (ja) | 2020-02-20 |
WO2019117671A1 (ko) | 2019-06-20 |
EP3608410A1 (en) | 2020-02-12 |
KR101904675B1 (ko) | 2018-10-04 |
ZA201903518B (en) | 2020-02-26 |
CN110249054B (zh) | 2020-10-13 |
RU2723038C1 (ru) | 2020-06-08 |
AU2018378011B2 (en) | 2019-09-26 |
US20200377917A1 (en) | 2020-12-03 |
BR112019013003A2 (pt) | 2020-07-21 |
CN110249054A (zh) | 2019-09-17 |
BR112019013003B1 (pt) | 2023-05-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6652687B2 (ja) | 5’−イノシン酸を生産する微生物及びこれを用いた5’−イノシン酸の生産方法 | |
JP6839763B2 (ja) | 新規ポリペプチド及びこれを用いたimpの生産方法 | |
TWI694151B (zh) | Atp磷酸核糖基轉移酶變體及使用該變體製造l-組胺酸之方法 | |
CN111212904B (zh) | 腺苷酸琥珀酸合成酶和使用其产生嘌呤核苷酸的方法 | |
CN112055752B (zh) | 新型启动子和使用其产生嘌呤核苷酸的方法 | |
JP6648345B1 (ja) | 新規ポリペプチド及びこれを用いたimpの生産方法 | |
CN111183218B (zh) | 新型5’-肌苷酸脱氢酶以及使用其制备5’-肌苷酸的方法 | |
JP6891292B2 (ja) | 変異型ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法 | |
JP2020521431A (ja) | 5’−キサンチル酸を生産する微生物及びこれを用いた5’−キサンチル酸の製造方法 | |
US11987611B2 (en) | Polypeptide and method of producing IMP using the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190628 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190801 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190801 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20190801 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20191205 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200107 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200123 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6652687 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |