KR100964078B1 - 5'-이노신산 생산능이 향상된 코리네박테리움암모니아게네스 및 그를 이용한 5'-이노신산 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당신생 과정(gluconeogenesis)에 관여하는 프룩토오스 1,6-비스포스파타제(Fructose 1,6-Bisphosphatase)의 활성이 강화된 5'-이노신산의 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 암모니아게네스, 5'-이노신산, 프룩토오스 1,6-비스포스파타제, fbp

Description

5'-이노신산 생산능이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스 및 그를 이용한 5'-이노신산 생산 방법{CORYNEBACTERIUM AMMONIAGENES HAVING ENHANCED 5'-INOSINIC ACID PRODUCTIVITY AND METHOD OF PRODUCING 5'-INOSINIC ACID USING THE SAME}
본 발명은 프룩토오스 1,6-비스포스파타제 (Fructose 1,6-Bisphosphatase)의 활성을 강화시킴으로써 5'-이노신산의 생산능이 강화된 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산방법에 관한 것이다.
5'-이노신산(5'-inosinic acid)은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라, 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며, 특히 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다.
5'-이노신산을 제조하는 방법으로, 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소적으로 분해하는 방법(일본 특허공고 제1614/1957호 등), 발효에 의해 생산된 이노 신을 화학적으로 인산화하는 방법 (Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 등) 및 5'-이노신산을 생산할 수 있는 미생물을 배양하고 배지에 축적된 5'-이노신산을 회수하는 방법이 있다. 이러한 방법 중에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법이다. 5'-이노신산을 생산하는데 이용하는 미생물 중 코리네박테리움 속 균주, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네스를 발효시킴으로써 제조하는 방법(대한민국 특허공개 제2003-42972호 등) 등이 공지되어 있다.
프룩토오스 1,6-비스포스파타제 (Fructose 1,6-Bisphosphatase)는 프룩토오스 1,6-비스포스파테이트(Fructose 1,6-bisphosphatate)를 프룩토오스 6-포스파테이트(Fructose 6-phosphatate)로 전환하는 글루코네오제네시스(gluconeogenesis) 경로에 관여하는 주요 효소이다. 글루코네오제네시스 경로는 글루코네오제닉 아미노산 (예, 알라닌, 글라이신)과 글라이세롤 또는 락테이트 등이 이용할 수 있다. 또한 코리네박테리움 글루타미쿰에서 프룩토오스 1,6-비스포스파타제는 코리네박테리움 글루타미쿰이 아세테이트, 사이트레이트, 글루타메이트 등과 같은 비카본 소스에서도 자랄 수 있게 하는 주요 효소로 알려졌다(Arch Microbiol, 2003, 180:285-292). 이외에 프룩토오스 1,6-비스포스파타제 효소의 활성을 증가시켜 펜토스 포스페이트 경로가 강화되었다는 보고가 있었다(Applied and Environmental Microbiology, Dec. 2005, p.8587-8596).
이에, 본 발명자는 코리네박테리움 속 균주로부터 5'-이노신산을 고농도로 생산할 수 있는 균주를 개발하고자 5'-이노신산 생합성 경로와 그 전구체 합성 경로인 펜토스 포스페이트 경로를 연구하던 중, 코리네박테리움 암모니아게네스에서 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제의 활성을 증가시킴으로써 궁극적으로 이노신산 생합성 전구체 경로인 펜토스 포스페이트 경로가 강화되어 5'-이노신산이 고농도로 생산된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 프룩토오스 1,6-비스포스타파아제의 활성을 강화시킴으로써 5'-이노신산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제를 암호화하는 fbp 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시키거나 또는 내재적 fbp 유전자에 더하여 1 카피 이상의 fbp 유전자를 새로 도입하여 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제의 활성을 강화시킴으로써 5'-이노신산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스의 프룩토오스 1,6-비스포스파타제 효소 활성을 강화시킴으로써 5'-이노신산을 고농도로 생산하여, 수율 향상에 의한 생산 원가 절감을 이룰 수 있다.
본 발명은 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제를 암호화하는 fbp 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시키거나 또는 내재적 fbp 유전자에 더하여 1 카피 이상의 fbp 유전자를 새로 도입하여 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제의 활성을 강화시킴으로써 5'-이노신산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스를 제공한다.
프룩토오스 1,6-비스포스파타아제는 당신생 과정에서 프룩토오스 1,6-디포스페이트를 프룩토오스-6-포스페이트로 전환하는 효소이며, 당신생 과정에 관여하고 있다.
상기 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제를 암호화하는 fbp 유전자의 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에서의 서열 및 특성에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.
본 발명의 구체적 실시예에서는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 염색체 서열분석을 통하여, 상기 fbp 유전자가 약 1,029bp 크기로 존재함을 확인하였다. 본 발명의 상기 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제를 암호화하는 fbp 유전자의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 효소의 활성을 강화시키는 것은 당해 효소를 암호화 하는 유전자의 발현을 증가시킴으로써 달성된다. 당해 유전자의 발현 증가는 당해 효소의 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 달성된다. 예를 들면, 상기 효소를 암호화하는 유전자 단편을 벡터에 연결하여 코리네박테리움 속 미생물에 도입하여 형질전환시킴으로써 달성된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 fbp 유전자를 포함한 재조합 벡터는 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 유전자를 DNA 제한효소, 예를 들어 BamHI 및 Xbal 등으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 제조할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pECCG117 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)를 사용할 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 상기 pECCG117 벡터에 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 fbp 유전자를 삽입시켜 제조한 pECCG117-fbp 벡터가 바람직하다. 또한 본 발명의 재조합 벡터는 약 500bp의 프로모터, 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 유전자, 및 약 500bp의 터미네이터를 포함하고 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 재조합 벡터, 예를 들어 pECCG117-fbp를 사용하여 선형 DNA단편을 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) KCCM-10610, 대한민국 특허공고 제10-2006-0060404호)에 전달하고, 선별마커인 항생제 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 선별된 변이주 내의 pECCG117-fbp 벡터의 삽입은 중합효소 연쇄반응을 통하여 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제의 활성을 강화시키기 위하여, 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 fbp 유전자에 더하여 1카피 이상의 fbp 유전자를 도입함으로써 활성을 강화시킬 수 있다. 이와 같이, 염색체 DNA에 목적 유전자를 삽입하기 위한 벡터로는 염색체 삽입용 pDZ벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 염색체 내로 fbp 유전자를 삽입하기 한 염색체 삽입용 벡터는 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 유전자 단편 2개를 DNA 제한효소, 예를 들어 BamHI 및 Xbal 등으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 제조할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 pDZ 벡터(대한민국 출원번호 제07-94433)이다. 상기 염색체 내2카피 삽입용 벡터는 pDZ 벡터에 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 유전자 2개를 삽입시켜 제조한 pDZ-2fbp 벡터가 바람직하다(도1 또는 도3 참고). 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
구체적 실시예에서, 상기 재조합 벡터, 예를 들어 pDZ-2fbp를 사용하여 선형 DNA단편을 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) KCCM-10610, 대한민국 특허공고 제10-2006-0060404호)에 전달하고, 선별마커인 항 생제 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 배지 및 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함하는 배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 선별된 균주 내의 2카피 삽입은 중합효소 연쇄반응을 통하여 확인할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 양태는 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제 활성을 증가시켜 5'-이노신산을 고농도로 생산하도록 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0205 (수탁번호:KCCM 10917P) 이다.
또한, 본 발명은 상기의 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스를 배양하여 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제를 암호화하는 fbp 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 염색체내 fbp 유전자 2 카피 삽입용 벡터로 형질전환시켜 5'-이노신산의 생산성이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0204 및 CN01-0205(KCCM 10917P)에 의한 직접 발효법으로 배양액 중에 5'-이노신산을 축적시켜 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기의 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
탄소원으로는 글루코오스와 프룩토오스가 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.
배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 5 내지 6일 동안 수행할 수 있으며, 직접 발효에 의해 축적된 5'-이노신산을 통상의 방법으로 회수할 수 있다. 구체적 실시예에서, 본 발명에 의하여 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스는 형질전환하지 않은 코리네박테리움 속 미생물에 비하여 높은 수율로 5'-이노신산을 생산하였다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : fbp 유전자 클로닝 및 플라스미드 증폭용 벡터 제작
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 하여 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 프룩토오스 1,6-비스포스파타제 유전자를 코딩하는 fbp 유전자(서열번호1)를 얻었다.
얻어진 fbp 유전자의 단편을 제한효소 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 Xbal(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여, 상기 유전자 단편을 BamHI 와 XalI 제한효소로 절단시킨 선상의 pECCG117 벡터에 접합하였다. 제조된 벡터를 pECCG117-fbp로 명명하였다.
상기 pECCG117-fbp 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스(KCCM-10610)에 일렉트로포레이션 (electroporation)을 통하여 형질전환하고, 1리터 당 카나마이신 (kanamycin) 25 ㎎을 포함하는 CM 고체배지 (육즙 10g/L, 효모엑기스 10g/L, 박토펩톤 10g/L, 염화나트륨 2.5g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 배양하여 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 CM 액체배지에서 키운 다음, 플라스미드를 분리하여 그 크기를 일차로 확인하고, 2차로 pECCG117의 다중클로닝 부위의 양끝단을 포함하는 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행함으로써, 삽입된 DNA의 크기를 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 상기 클로닝 과정 및 클로닝된 pECCG117- fbp 벡터는 도1과 같다.
상기 fbp 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.
프라이머 fbp-1F (서열번호 2):
5'- GCT CGG ATC CCC AAT CCT CTG GCA CAT CGG GAA CGC -3'
프라이머 fbp -R (서열번호 3):
5'- GCC CTC TAG AGA CCT CGT TGG TGT TCA TGT TGG AAG -3'
이 과정을 통해 선별된 fbp 유전자를 포함하는 균주를 코리네박테리움 암모 니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0204로 명명하였다.
실시예 2 : 염색체 삽입용 벡터 ( pDZ )의 제작 및 이를 이용한 유전자의 삽입 방법
본 실시예에서는 대장균 클로닝용 벡터 pACYC177 (New England Biolab, GenBank accetion # X06402)를 기본 벡터로 사용하여, 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 제작하였으며, 제작 과정은 다음과 같다.
pACYC177 벡터를 AcuI 및 BanI 제한 효소로 처리한 후, 클레나우 효소처리를 통하여 평활말단화하였다. 선별 마커로 사용될 대장균 유래의 lacZ 유전자는 대장균 K12 W3110의 게놈 DNA로부터 PCR을 통하여 자체 프로모터를 포함하도록 증폭한 후, T4 DNA 폴리머라제 및 폴리뉴클레오티드 키나제 처리를 통하여 5' 말단 인산화 및 평활화함으로써 준비하였다. 이상과 같이 준비한 2종의 DNA 단편을 접합하였으며, 접합된 환상 DNA 분자의 제한효소 BamHI 부위로 인위적으로 합성한 다수의 제한효소 인식 부위를 포함하고 있는 아답터 (adaptor) 서열을 삽입하여, 코리네박테리움 암모니아게네스 내로의 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 완성하였다. 도 2는 코리네박테리움 내의 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 나타내는 도면이다.
이하의 실시예에서는 코리네박테리움 암모니아게네스의 염색체로 여분의 유전자를 삽입하기 위하여, 대상이 되는 유전자를 연속적으로 2 카피 포함하고 있는 pDZ 벡터를 5'-이노신산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10610에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후, 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다.
벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인 및 PCR을 통하여 유전자 구조 확인 과정을 거쳐 최종 선정되었다.
실시예 3 : fbp 유전자 클로닝 및 염색체 내 2 copy 삽입용 벡터 제작
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 하여 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 fbp 유전자 두 쌍 (fbp-A, fbp-B)을 얻었다. fbp-A 는 서열번호 2와 3을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, fbp-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트 (Invitrogen)를 이용하여 대장 균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-fbp-A와 pCR-fbp-B 벡터를 얻었다.
상기 pCR 벡터에 fbp-A와 fbp-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (fbp-A: BamHI + Xbal, fbp-B: XbaI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 fbp 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 BamHI과 Xbal가 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합 (3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 fbp 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2fbp 재조합 벡터를 제작하였다. 도 3은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2fbp를 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2fbp벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스(KCCM-10610)에 일렉트로포레이션 (electroporation)을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 fbp 유전자의 바로 옆에 1 카피의 fbp 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 fbp 유전자는 2 카피의 fbp 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 5과 6의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
pDZ-2fbp 제작하기 위한 유전자 증폭 및 제작된 2 카피 균주를 확인하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.
프라이머 fbp -R (서열번호 3):
5'- GCC CTC TAG AGA CCT CGT TGG TGT TCA TGT TGG AAG -3'
프라이머 fbp-2F (서열번호 4):
5'- GCC CTC TAG ACC AAT CCT CTG GCA CAT CGG GAA CGC -3'
프라이머 2fbp-1F (서열번호 5):
5'- CCG TAA TTG ACT ACT CCG ACC CC -3'
프라이머 2fbp-1R (서열번호 6):
5'- GTC TGG AAG TTC ACG ATC TCC-3'
이 과정을 통해 선별된 2 카피 fbp 유전자를 포함하는 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0205로 명명하였고, 그를 2008년 01월 08일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM 10917P 로 기탁하였다.
실시예 4 : 삼각 플라스크 발효역가 시험
종배지 3ml를 지름 18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0204와 CN01-0205 (KCCM 10917P)를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압 살균한 후, 종배양액 3ml을 접종하여 5 내지 6일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 200rpm, 온도32℃, pH 7.2로 조절하였다.
이때 배지 내 5'-이노신산 축적량을 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10610 과 비교한 결과는 하기 표1과 같으며, 이는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0204와 CN01-0205 (KCCM 10917P) 균주가 동일한 조건하에서 모균주 코리네박테리움 암모니아게네스KCCM-10610 대비 단위 시간당 생산하는 5'-이노신산 의 생산성이 4.4~8% 증가함을 나타낸다.
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.
종배지 : 포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH 7.2
플라스크 발효배지 : 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 포도당 4.2%, 원당 2.4% 되게 첨가하여 사용
균주명 Cell OD
(배양 5일후)		 생산성(g/l/hr)
(배양 5일후)
대조군(KCCM-10610) 30.2 0.136
CN01-0204 32.6 0.142
CN01-0205(KCCM 10917P) 31.5 0.147
도 1은 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 유전자 fbp의 클로닝 과정 및 클로닝된 pECCG117-fbp 벡터를 나타낸다.
도 2는 염색체내 유전자 삽입을 위한 pDZ 벡터를 나타낸다.
도 3는 프룩토오스 1,6-비스포스파타제를 암호화하는 유전자를 염색체내 2 copy 삽입하기 위한 pDZ-2fbp 벡터를 나타낸다.
<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> A microorganism of corynebacterium genus having enhanced 5'-inosinic acid productivity and method of producing 5'-inosinic aicd using the same <130> PA07-0415 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1029 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <400> 1 atgacaaata ctgctggaga tcgtgaactt ccagaccgca acctcgctat ggagctggtg 60 cgcgtcaccg aagctgcagc actagcctct ggtcggtggg ttggccgcgg catgaagaat 120 gaaggcgacg gcgcagcagt cgatgccatg cgtacgctca tcaactccgt atccatggac 180 ggcgtagttg ttatcggcga gggtgaaaaa gatgaagccc caatgctctt caacggcgaa 240 catgtaggca ccggtgaagg cgcagggatg gatatcgcag tcgatcctgt cgatggcacc 300 cgtttgatgg ctgaaggccg ccccaacgcg atttctgtca tcgccgctgc tgagcgcggc 360 acgatgtacg acccttccgc tgtgttttac atgaataagt tggttgtcgg cccagaagct 420 gccggcaagg tagacatcaa caagcctgtt gccttcaaca tcaacgctgt cgcagaagcc 480 aagggccttc gcccgcagga agttaccgtt gttgtgttgg accgtccacg ccacgatgag 540 ctaatcaagg aaatccgcga ggccggcgcc aaggttcgcc tcatcatgga cggcgacgtt 600 gccggtgcaa tcgccgctgc gcaggactcc aactccatcg acttactcat gggcatcgga 660 ggcactccag aagccatcat caccgcttgt gcactcaagt gcatgggcgg cgaaattcag 720 ggcaagctgt ggccaaccga cgagaaagaa gctgagcgtg ctcgcgccgc cggccacgac 780 cttgaccgcg tgctgtttac caacgacctg gttacctccg ataactgcta ctttgcagct 840 acaggtgtca ccaacggtga catgctcgac ggtgtctcct accgtgcaaa ctccgcaacg 900 acccgctcca tggtcatgcg ttccaaatcc ggcaccgtgc gctaccttga gtccattcac 960 caactgtcca agctgcagga gtactccgta attgactact ccgaccctgc gtcgaatccc 1020 gcacaatag 1029 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-fbp-1F <400> 2 gctcggatcc ccaatcctct ggcacatcgg gaacgc 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-fbp-R <400> 3 gccctctaga gacctcgttg gtgttcatgt tggaag 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-fbp-2F <400> 4 gccctctaga ccaatcctct ggcacatcgg gaacgc 36 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-2fbp-1F <400> 5 ccgtaattga ctactccgac ccc 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-2fbp-1R <400> 6 gtctggaagt tcacgatctc c 21

Claims (7)

  1. 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제(Fructose 1,6-bisphosphatase)의 활성이 강화된 것을 특징으로 하는, 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제의 활성은 상기 코리네박테리움 암모니아게네스를 프룩토오스 1,6-비스포스파타아제를 암호화하는 fbp 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시키거나 또는 내재적 fbp 유전자에 더하여 1 카피 이상의 fbp 유전자를 도입함으로써 강화되는 것을 특징으로 하는, 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 fbp 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 재조합 백터는 도1의 개열지도를 가지는 벡터 pECCG117-fbp인 것을 특징으로 하는, 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 도입은 코리네박테리움 속 미생물을 도3의 개열지도를 가지는 pDZ-2fbp 벡터로 형질전환시킴으로써 달성되는 것을 특징으로 하는, 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0205(수탁번호 : KCCM 10917P)인 것을 특징으로 하는, 5'-이노신산 생산능을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 생산하는 방법.
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WO2005059139A2 (en) 2003-12-18 2005-06-30 Basf Aktiengesellschaft Methods for the preparation of lysine by fermentation of corynebacterium glutamicum
US20070026505A1 (en) 2005-06-17 2007-02-01 Madden Kevin T Amino acid and metabolite biosynthesis
WO2007039532A2 (de) 2005-10-05 2007-04-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren unter verwendung coryneformer bakterien, die in der lage sind, glycerin als alleinige kohlenstoffquelle zu nutzen

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