KR100937326B1 - 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로서, 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈(oxidoreductase)를 코딩하는 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 가지는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 고수율 및 고농도로 5'-이노신산을 제조하는 방법을 제공한다.

코리네박테리움 암모니아게네스, 5'-이노신산, 옥시도리덕테이즈

Description

옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법{MICROORGANISMS OF CORYNEBACTERIUM HAVING AN INACTIVATED GENE ENCODING OXIDOREDUCTASE AND PROCESSES FOR THE PREPARATION OF 5'-INOSINIC ACID USING THE SAME}

본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물로서, 옥시도리덕테이즈(oxidoreductase)를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은　 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 치환함으로써 옥시도리덕테이즈를 불활성화시키는 유전자에 관한 것이다.

5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다. 현재, 5'-이노신산은 코리네박테리움 속 균주, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네 스(Corynebacterium ammoniagenes)를 발효시킴으로써 제조하는 방법이 알려져 있다 (대한민국 특허공개 제2003-42972호 등).

이러한 코리네박테리움 균주를 이용한 5'-이노신산 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다. 그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정유전자를 파괴시키거나, 감쇄 발현시킴으로써 5'-이노신산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 또한 NTG를 이용하여 무작위적인 변이를 가하여 5'-이노신산 생산능력을 향상시키려는 연구도 병행되었다. 그러나, 상기한 종래 방법에 의하더라도 여전히 5'-이노신산의 생산능이 향상된 균주가 요구되고 있다.

종래의 NTG를 이용한 무작위적 변이법은 불필요한 변이를 유발시켜 성장을 지연시킬수 있으며, 스트레스 내성을 약화시킬 수도 있다. 더욱이 정확한 변이위치를 알지 못해 정확한 유전적정보를 파악하기 어려운 문제점을 가지고 있다.

5'-이노신산의 전구물질인 중의 하나인 L-아스파테이트는 세포 내의 질소 대사의 중추적 대사체로서, 세포의 구성이나 단백질 합성의 단위체 또는 조절인자로서 작용한다. L-아스파테이트는 세포 구성 단위체로서는 세포의 핵산, 아미노산 또는 지방질 합성에 사용되며, 단백질 합성의 단위체로서는 단백질의 구조나 주요 작용기로서 사용된다.

그러나, 세포 내에서 세포의 생장, 유지 및 조절에 필수적이지 않은 비필수 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 구성하는데 이 L-아스파테이트가 다량으로 사용되고 있다. 따라서, 이러한 L-아스파테이트의 함량이 높은 비필수 단백질을 코딩하는 유전자를 제거하거나 불활성화시키면 그 유전자의 산물 합성에 소요되는 다량의 L-아스파테이트의 불필요한 소비를 감소시키거나 제거할 수 있다. 즉 불필요한 L-아스파테이트의 소비를 줄인다는 측면에서 궁극적으로는, 동일조건에서 5'-이노신산 생산에는 유리하게 작용할 것으로 생각된다.

이에 본 발명자들은 상기와 같이 L-아스파테이트 함량이 높은 비필수 단백질인 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시켜, 5'-이노신산의 생산수율이 증가된 코리네박테리움 속 미생물을 개발하였다.

코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈 유전자는 아직 보고되어 있지 아니하며, 더욱이 이러한 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시킨 변이주도 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물로서, 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 미생물을 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자와 치환됨으로써 상기 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시키는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 선행기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 및 이와 치환되어 상기 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시키는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물은 5'-이노신산을 고수율 및 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물로서, 이를 이용한 본 발명의 제조방법은 높은 수율로 5'-이노신산을 제조할 수 있도록 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물은 5'-이노신산을 생산할 수 있는 것으로 알려진 미생물이며, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)이다.

본 발명의 한 실시예에서, 발명자들은 5'-이노신산을 생성하는 미생물로 코 리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 서열분석을 수행하고, 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자의 DNA염기서열을 분석하였다. 그 결과, 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자는 426bp의 서열번호 1의 염기서열을 갖는다는 것을 밝혀냈다.

본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 유전자 또는 통상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 서열번호 1의 유전자에 대하여 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 유전자이다. 바람직하게는, 본 발명은 본 발명의 다른 실시예에 따라 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 유전자에 대하여 90% 이상의 상동성을 가지는 유전자를 포함한다.

본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시키는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자로서, 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자의 앞부분 113bp와 뒷부분의 58bp가 제거되어 불활성화된 유전자(truncated oxidoreductase), 즉 서열번호 1의 114bp부터 368bp까지를 의미한다.

상기 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 유전자 또는 통상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 서열번호 2의 유전자에 대하여 약 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 유전자이다. 바람직하게는, 본 발명은 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 서열번호 2의 유전자 또는 서열번호 2의 유전자에 대하여 80% 이상의 상동성을 가지는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명에 따른 미생물은 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 상기 서열번호 1의 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물이며, 서열번호 1의 유전자에 대하여 통상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 서열번호 1의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 포함한다.　

바람직하게는, 본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물로서, 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 가지는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 상기 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열에 대하여 90% 이상의 상동성을 가지는 유전자가 치환(replacement)에 의해 불활성화된 미생물이 가장 바람직하다.

상기 치환은 코리네박테리움 암모니아게네스의 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 유전자에 의해 이루어지는 것이 바람직하며, 또한 서열번호 2의 유전자에 대한 통상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 서열번호 2의 유전자에 대하여 약 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 유전자에 의해 이루어지는 것을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 상기 서열번호 2의 유전자 또는 서열번호 2의 서열에 대하여 80% 이상의 상동성을 가지는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환시키고, 옥시도리덕테이즈가 불활성화된 균주를 선별하여 얻어진 미생물이다.

상기 재조합 벡터는 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 상기 서열번호 2의 유전자 또는 서열번호 2의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 유전자를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chaine Reaction, PCR)을 통하여 증폭시키고, 그 DNA 단편을 공지된 발현벡터인 pCR2.1 벡터 (TOPO TA Cloning Kit Invitrogen, USA)에 삽입시켜 제조할 수 있다.

사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 재조합 벡터는 대장균(Escherichia coli)에 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 전달할 수 있으며, 공지의 방법에 따라 재조합 벡터를 수거할 수 있다(Quiagen plasmid preparation KIT). 따라서, 상기 재조합 벡터는 상기 pCR2.1 벡터에 서열번호 2의 유전자를 삽입시켜 제조한 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈가 바람직하다.

상기 재조합 벡터는 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation)을 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330), 대한민국 특허공개 제2003-42972호)에 전달한다. 미생물 변이주는 재조합 벡터, 예를 들어 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈 벡터에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위와 상동인 미생물 염색체 상의 부위에서 상동 재조합에 의하여 상기 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈 벡터를 미생물 균주 염색체의 옥시도리덕테이즈 유전자의 내부에 치환시켜 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시킨 후, 선별마커인 항생제 카나마이신(Kanamycin)을 포함하는 배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 이렇게 선별된 변이주 내에서 동성 재조합에 의한 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈의 유전체 내로의 삽입은 PCR을 통하여 확인 할 수 있다. 상기 유전자의 클로닝 과정을 간략히 나타내면 도1과 같다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0209 (KCCM-10908P)이다.

본 발명은 또한 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 상기 재조합 벡터로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환시켜 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화시키는 단계; 상기 형질전환된 균주를 선별하여 배양하는 단계; 및 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 분리하는 단계를 포함하는 5'-이노신산의 제조방법을 제공한다.

상기 본 발명의 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀)등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및　 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기등이 첨가될 수 있다.

배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반배양에 의해, 바람직하게는 20 ~ 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 5 ~ 6일 동안 수행할 수 있으며 직접발효법에 의해서 축적된 5'-이노신산을 통상의 방법으로 회수할 수 있다.

상기 본 발명의 제조방법에 따라 5'-이노신산을 제조할 경우, 옥시도리덕테이즈 유전자가 불활성됨으로써, 높은 수율로 5'-이노신산을 제조할 수 있다. 이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 옥시도리덕테이즈 불활성화시키는 서열번호 2의 유전자 클로닝

pTOPO KO-옥시도리덕테이즈 벡터를 도1에 간략하게 나타낸 바와 같이 제작하 였다. pCR2.1 벡터는 KmR 유전자를 포함한다. 서열번호 2의 유전자는 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 서열번호 1의 유전자의 일부, 즉 앞부분의 113bp와 뒷부분의 58bp를 제거하여 얻었다. 중합효소연쇄반응을 통하여 얻은 서열번호 2의 유전자 단편을 TOPO KIT를 이용하여 pCR2.1 벡터에 접합하였다.

접합된 DNA를 대장균 GM2525(Escherichia coli genetic stock center, Yale University, New Haven, Connecticut)에 일렉트로포레이션(electroporation)을 통하여 형질전환하고, 1리터 당 카나마이신(kanamycin)이 25 ㎎ 되도록 항생제가 포함된 LB 고체배지(효모엑기스 10 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나트륨 10 g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 배양하였다. 자란 단일 콜로니들을 회수하고, 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하였다. 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고, 2차로 다시 Xba I과 BamHI으로 2중 절단하여 487 bp 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써, 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자 단편이 포함된 재조합 플라스미드 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈 (4.5 kb)를 제작하였다.　

여기에 사용된 프라이머들은 각각 다음과 같다.

프라이머 옥시도리덕테이즈-F (서열번호 3) : 5'- tgtatgcgggctcttgctgg- 3'

프라이머 옥시도리덕테이즈-B (서열번호 4) : 5'- aggcttccccagtcaagcgc- 3'

실시예 2. 재조합 플라스미드의 삽입에 의해 염색체 상의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된 균주의 선별

대장균 GM2525로부터 분리한 재조합 플라스미드 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈 를 사용하여, 5'-이노신산　 생산균주인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)를 형질전환시켰다. 이를 0.05 mg/L 젠타마이신이 첨가된 CM 고체배지 (효모엑기스 10 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나트륨 2.5 g/L, 박토아가 1.7%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.0)에 도말하여 32℃에서 96시간 동안 배양하였다.　 단일 콜로니들을 중합효소연쇄반응을 통해서 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 염색체의 특정 위치에 삽입된 재조합 균주를 선별하였다. 여기에 사용된 프라이머는 다음과 같으며, pTOPO KO-옥시도리덕테이즈를 염색체 DNA로 삽입함으로써 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 불활성화하는 과정은 도 2와 같다.

프라이머 옥시도리덕테이즈-FC (서열번호 5) : 5'- AGATAGGTCTCAATCAACTGC -3'

프라이머 옥시도리덕테이즈-FB (서열번호 6) : 5'- cgatggtgttggcaaacacaccc -3'

상기 과정을 통해 선별된, 염색체 상의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성된 미생물을 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0209로 명명하였으며, 2007년 12월 20일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10908P).

실시예 3.　 삼각플라스크 발효역가 시험

종배지 3ml을 지름18mm 시험관에 분주하고 가압살균한 후, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0209(KCCM 10908P)를 접종하고, 30℃ 온도에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고, 120℃ 온도에서 10분간 가압살균하여 종배양액 3ml을 접종한 다음 5 ~ 6일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 32℃, pH 7.2로 조절하였다. 배지 내 5'-이노신산의 축적량은 모균주인 CJHB100(KCCM-10330)보다 약 5 % 향상되었다.

상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌100mg/l, pH7.2

플라스크 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8% 되게 첨가하여 사용

실시예 4. 5-L 발효조에서의 발효역가 실험

실시예 3의 종배지 50ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 가압살균한 후, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0209(KCCM 10908P)를 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효조 종배지 1000ml를 2.5L-발효조에 넣고, 120℃에서 15분간 가압살균하여 종배양액 50ml를 접종한 다음, 1~2일간 배양하였다.

회전수는 분당 900회, 온도 28 ~ 34℃, pH 7.2 로 조절하였다. 또한, 발효조 본배지 1250ml을 5L-발효조에 넣고, 120℃에서 15분간 가압살균하여 발효조 종배지액 250ml을 접종한다. 그 후, 배양하면서 배양액 내에 환원당이 2%가 되었을때, 1차, 2차, 3차 및 4차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 32% 되도록 첨가하여 5 ~ 6일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 32℃, pH 7.2로 조절하였다. 이때 배지 내 5'-이노신산의 축적량은 모균주인 CJHB100(KCCM-10330)보다 3 % 향상되었다.

상기 발효조 종배지 및 발효조 본배지의 조성은 다음과 같다.

발효조 종배지: 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모엑기스 2%,　 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/l, 황산아연 40mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 80mg/l, 칼슘판토테네이트 60mg/l, 티아민 염산염 20mg/l, 비오틴 240㎍/l, 아데닌 1200mg/l, 구아닌 1200mg/l (pH7.2)

발효조 본배지: 염화칼슘 120mg/l, 황산구리 8mg/l, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/l, 황산아연 24mg/l, 황산망간 mg/l, L-시스테인 26.4mg/l, 글루타민산 나트륨 0.12%, 티아민 염산염 6mg/l, 비오틴 40㎍/l, 니코틴산 50mg/l, 알라닌 145mg/l, 아데닌 200mg/l, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32% 되게 첨가하여 사용 (pH 7.2)

도1은 옥시도리덕테이즈를 불활성화시키는 유전자의 클로닝 과정을 나타낸다.

도2는 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈를 염색체 DNA로 삽입함으로써 옥시도리덕테이즈를 불활성화시키는 과정을 나타낸다.

<110> CJ cheiljedang <120> Microorganisms of Corynebacterium having an inactivated gene encoding oxidoreductase and process for the preparation of 5'-inosinic acid using the same <130> PA07-0341 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 426 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 1 ttaatcgtca tcgtcgtcat tgtcgtcatc gtcccaatcg tcatcgtccc agtcatcatc 60 ccagtcgtca tcgtcgtccc agtcttgata ggtcaacggc acttgcgggg tgatgtatgc 120 gggctcttgc tggatgtcat cagatacatc gtcgctatca tcatcgcgtt ccgagctagg 180 agtaactggc gtggacgggc tctggtgatc ggagtgctct ttgcttatcg atggctcaac 240 cgtcaccgcg gaaggatcaa tctccggcgc agtgcgcgta ttagcaatgg cagagcccgc 300 aacaacaagg gtgcccatca aagcaacgat gccggccagg ggagcaaagc gcttgactgg 360 ggaagccttg gactctttct caggctcgaa agcggaagtg ttcggggtgt gtggtgcctc 420 ggacat 426 <210> 2 <211> 255 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 2 tgtatgcggg ctcttgctgg atgtcatcag atacatcgtc gctatcatca tcgcgttccg 60 agctaggagt aactggcgtg gacgggctct ggtgatcgga gtgctctttg cttatcgatg 120 gctcaaccgt caccgcggaa ggatcaatct ccggcgcagt gcgcgtatta gcaatggcag 180 agcccgcaac aacaagggtg cccatcaaag caacgatgcc ggccagggga gcaaagcgct 240 tgactgggga agcct 255 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oxidoreductase-F <400> 3 tgtatgcggg ctcttgctgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oxidoreductase-B <400> 4 aggcttcccc agtcaagcgc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oxidoreductase-FC <400> 5 agataggtct caatcaactg c 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oxidoreductase-FB <400> 6 cgatggtgtt ggcaaacaca ccc 23

Claims (9)

1. 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로서, 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈(oxidoreductase)를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 불활성화는 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자에 의한 치환에 의한 것임을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
3. 제2항에 있어서,

   상기 치환은 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자의 치환인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN01-0209(KCCM 10908P)인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
5. 제2항에 있어서,

   상기 불활성화는

   코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및

   상기 재조합 벡터로 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환시킴으로써 상기 코리네박테리움 속 미생물의 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 치환하여 불활성화시키는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
6. 제5항에 있어서,

   상기 재조합 벡터는 pCR2.1 벡터에 서열번호 2의 유전자 단편을 접합하여 제조된 벡터 pTOPO KO-옥시도리덕테이즈인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 분리하는 단계를 포함하는 5'-이노신산의 제조방법.
8. 서열번호 1의 유전자.
9. 서열번호 2의 유전자.

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