KR100466253B1 - Ｌ-아르기닌을 대량으로 생산할 수 있는 코리네박테리움글루타미쿰 및 동 균주를 이용한 ｌ-아르기닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-아르기닌을 공업적으로 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 동 균주를 이용한 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는, L-아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰으로서, 특히 생육에 특정 아미노산을 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이를 이용한 L-아르기닌의 제조방법을 개시한다.

Description

Ｌ-아르기닌을 대량으로 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 동 균주를 이용한 Ｌ-아르기닌의 제조방법{Corynebacterium glutamicum Having High Productivity of L-Arginine and Method for Manufacturing of L-Arginine Using The Microorganism}

본 발명은 L-아르기닌을 공업적으로 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 동 균주를 이용한 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는, L-아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰으로서, 특히 생육에 특정 아미노산을 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이를 이용한 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것이다.

L-아르기닌은 의약품, 식품, 기타 동물 사료 등에 널리 이용되는 천연 아미노산의 일종으로 의약용으로는 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품 용도로는 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가용, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광을 받고 있는 물질이다.

종래에 알려져 있는 미생물 발효에 의한 L-아르기닌의 제조방법은 탄소원,질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로서 글루타민산 생산 균주인 브레비박테리움 또는 코리네박테리움속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본 공개 소화57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본 공개 소화59-158185), 재조합 유전자가 형질전환된 균주를 이용하는 방법(일본 공개 소화63-79597, 미국특허 4,775,623) 등이 알려져 있다.

하지만 상기 개시된 균주들은 본 발명의 균주와는 상이하며, 모두 최종 산물인 L-아르기닌에 대한 피드백 저해가 있어 L-아르기닌을 공업적으로 대량생산하는 데에는 한계가 있다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 극복하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 L-아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지고 또한 특정 아미노산을 생육에 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여, 배양물로부터 L-아르기닌을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명은 아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함하며, 특히 특정 아미노산을 생육에 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공한다.

본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-아르기닌의 생산능을 가지며, 바람직하게는 L-아르기닌의 아날로그, 예를 들면 카나바딘, D-아르기닌 등에 내성을 가지며, L-아르기닌의 분해능이 결손된 균주(MWE-1010 이라 명명함) 중에서 아르기닌 히드록사메이트 내성과 L-알라닌에 의하여 생육이 촉진되는 것으로 알려진 균주 MWEX-46(KCTC 8485P)로부터 소정의 변이 처리과정을 거쳐 얻을 수 있다.

상기 변이처리는 종래 통상적으로 사용되어온 변이처리 수단이면 충분하며, 따라서 자외선 조사나 NTG(N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘)등의 통상적인 처리수단이 이용될 수 있다.

이하 상기 MWEX-46(KCTC 8485P) 균주를 친주로 하여 L-아르기닌 내성을 가지는 균주의 분리과정을 보다 상세히 설명한다.

하기 표 1조성의 완전평판배지에서 30℃, 24시간 배양된 MWEX-46(KCTC 8485P) 균주를 완전 액체 배지에 접종하여 30℃, 24시간 배양하였다. 배양 후 원심분리한 다음 0.05M TM 완충액(pH6.2)으로 2회 수세하였다. 동일한 완충액으로 균체농도가 10⁶∼10⁸Cell/㎖ 가 되도록 적당히 희석한 후, NTG를 250㎍/㎖ 되도록 가하여 30℃에서 30분간 처리하였다. 처리된 균체를 생리식염수로 2회 수세한 후 L-아르기닌 60㎎/㎖ 첨가된 하기 표 2조성의 최소평판배지에 도말하고 30℃에서 3∼5일간 배양한 후 생육된 콜로니를 분리하고 이때 얻어진 균주를 AX40-34로 명명하였다(기탁기관: 생명공학연구소 유전자 은행, 기탁번호: KCTC 10423BP, 기탁일자: 2003.02.07).

<표 1> 완전 배지 조성

성분	pH
포도당		육즙	효모추출물	펩톤	식염	한천
1.0%	0.5%	0.5%	1.0%	0.25%	1.5∼2.0%	7.2

<표 2> 최소 배지 조성

성분 및 pH
포도당	0.5%
황산암모늄	0.15%
요소	0.15%
제1인산칼륨	0.1%
제2인산칼륨	0.1%
황산마그네슘7수염	0.01%
염화칼슘2수염	1㎎/ℓ
바이오틴	10㎍/ℓ
치아민 염산염	100㎍/ℓ
미량원소*	1㎎/ℓ
한천	1.5∼2.0%
pH	7.2

*미량원소: 황산 제2동 270㎎/ℓ, 황산아연 10㎎/ℓ, 염화제1철 870㎎/ℓ, 염화망간 7.2㎎/ℓ, 붕산 나트륨 88㎎/ℓ, 몰리브덴 암모늄 40㎎/ℓ, 단 요구주 실험시 해당 아미노산을 20㎎/ℓ첨가

미생물에 있어서 L-아르기닌은 L-글루타민산으로부터 출발하여 N-아세틸글루타민산, N-아세틸글루타밀인산, N-아세틸글루타민산세미알데히드, N-아세틸오르니틴, 오르니틴, 시투룰린, 아르기노 숙신산을 경유하여 생합성된다. 이러한 중간 대사산물은 N-아세틸글루타민산신타제, N-아세틸글루타민산키나아제, N-아세틸글루타밀인산리덕타아제, 아세틸오르니틴아미노트랜스퍼라제, N-아세틸오르니티나제, 오르니틴카바밀트랜스퍼라제, 알르기노숙신산신타제에 의해 촉매된 반응에 의해 생성된다.

코리네박테리움은 대장균과 대부분의 생합성 경로는 동일하나, N-아세틸오르니틴으로부터 유리된 아세트산이 N-아세틸글루타민산을 합성하는데 재활용되는 점이 다른 점으로 이 반응은 오르니틴아세틸트랜스퍼라제에 의해 촉매된다.

또한 코리네박테리움속 균주의 경우 생합성 경로 중에서 최종산물인 L-아르기닌에 의한 피드백 저해는 N-아세틸글루타민산키나아제가 받는 것으로 알려져 있다.

상기 과정에 의해 선발된 균주가 다량의 L-아르기닌을 배지내 더욱 축적시키는 기작에 대해서는 분명하지 않으나, L-아르기닌 생합성의 주요 속도조절 단계 효소인 N-아세틸글루타민산키나아제 활성이 친주에 비해 강화되고, 또한 상기 효소가 최종 산물인 L-아르기닌에 의한 피드백 저해나 억제를 받지 않는 것으로 생각된다.

또한 본 발명은 상기 L-아르기닌에 내성을 가지는 균주로부터 균체의 과다생육에 따른 산소 결핍의 문제를 해결하기 위해서 발효공정 중 원하는 정도의 균체량을 유지하는 것이 가능하도록 변이처리된 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함한다.

상기 조건을 만족하는 변이 균주의 획득과정은 바람직하게는 특정 아미노산 요구주를 선별하는 과정이 포함된다. 이러한 아미노산의 예로는 L-시스테인, L-타이로신, L-메치오닌 등이 있으나 이하에서는 발명의 이해를 위해 L-시스테인을 대표적인 예로서 보다 상세히 설명하기로 한다.

상기 표 1조성의 완전평판배지에서 30℃, 24시간 배양된 AX40-34(KCTC 10423BP) 균주를 완전 액체 배지에 접종하여 30℃, 24시간 배양하였다. 배양 후 원심분리한 다음 0.05M TM 완충액(pH6.2)으로 2회 수세하였다. 동일한 완충액으로 균체 농도가 10⁶∼10⁸Cell/㎖가 되도록 적당히 희석한 후, NTG를 250㎍/㎖되도록 가하여 30℃에서 30분간 처리하였다. 처리된 균체를 생리식염수로 2회 수세한 후 상기 표 2조성의 최소 평판배지와 L-시스테인 (20 ㎎/ℓ)이 첨가된 최소평판배지에 순서대로 리플리카를 실시하였다. 그 결과 최소배지에서 생육이 불가능하나 L-시스테인이 첨가된 배지에서 생육이 가능한 균주를 선발하고 동 균주를 ACX40-5 라 명명하였다.

상기 표 2의 최소배지를 이용하여 친주 MWE-1010, MWEX-46과 L-아르기닌 내성변이주 AX40-34와 L-시스테인 요구주인 ACX40-5의 약제 내성도를 비교한 결과는 하기 표 3과 같다.

<표 3> 아르기닌 아날로그에 대한 내성 비교

아르기닌아날로그2)	㎎/㎖	생육도1)
		MWE-1010	MWEX-46	AX40-34	ACX40-53)
무첨가		0.425	0.429	0.402	0.024
ARG-HX	1.0	0.048	0.291	0.452	0.482
	2.0	0.035	0.205	0.360	0.358
CAN	1.0	0.402	0.433	0.398	0.458
	2.0	0.399	0.401	0.402	0.410
D-ARG	1.0	0.195	0.240	0.213	0.250
	2.0	0.120	0.184	0.199	0.188
L-ARG	40.0	0.152	0.230	0.405	0.420
	60.0	0.104	0.188	0.366	0.392

1) 최소 액체 배지에서 48시간 진탕배양한 배양액을 1/10로 희석하여 610mm에서 흡광도 측정

2) ARG-HX: 아르기닌 하이드록사메이트, CAN: 카나바닌, D-ARG: D-아르기닌, L-ARG:L-아르기닌

3) ACX40-5 의 경우에는 L-시스테인을 20㎎/ℓ첨가

상기 표 3의 결과에 의하면 친주인 MWEX-46의 성질과는 다르게 신균주 AX40-34와 ACX40-5는 60mg/㎖의 L-아르기닌에서 생육이 강화된 내성주임을 확인할 수 있다.

한편 최소 배지에서 L-시스테인의 농도별 생육도를 확인한 결과 하기 표 4에서와 같이 신균주 ACX40-5가 L-시스테인을 요구한다는 사실을 확인할 수 있다.

<표 4> 시스테인 첨가에 따른 생육도 비교

L-시스테인 농도(㎎/ℓ)	생육도
	AX40-34	ACX40-5
0	0.402	0.024
10	0.398	0.115
20	0.409	0.252
30	0.410	0.359
40	0.399	0.428
50	0.421	0.458

본 발명은 아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여, 배양물로부터 L-아르기닌을 제조하는 방법을 포함한다.

배양배지는 통상의 탄소원, 질소원, 무기물 및 기타 영양물질을 함유한다. 탄소원의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 포도당, 설탕, 전분 가수분해물, 폐당밀 등의 당류로부터 선택되는 단독 또는 2종 이상의 혼합성분 등이 가능하다. 질소원의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 황산암모늄, 염화암모늄, 요소, 암모니아가스, 펩톤, 육즙, 효모추출물, 탈지대두박 가수분해물 등에서 선택되는 단독 또는 2종 이상의 혼합성분 등이 가능하다. 무기물의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 인산칼륨, 황산마그네슘, 식염, 황산제1철, 황산망간 등에서 선택되는 단독 또는 2종 이상의 혼합성분 등이 가능하다. 상기 사용 균주가 아미노산 요구주인 경우에는 해당 아미노산을 적당량 배지에 첨가할 것이 요구된다.

배양은 통상의 호기적 조건 하에서 수행되며, 특별히 한정되는 것은 아니지만 배양온도 25∼35℃, pH 5.5∼7.5의 범위에서 1∼5일간 배양하는 것이 좋다. 배양 중의 pH 조절은 암모니아가스 또는 암모니아수, 탄산칼슘 등으로 조절이 가능하다.

배양 중의 L-아르기닌의 분석은 히타치 아미노산 전용분석기(L-8500A)를 이용하여 분석하였고, 생육도는 배양액을 100배 희석한 후 베크만 스펙트로포토미터(DU-70)를 이용하여 610nm에서 수행하였다. 단 탄산칼슘을 이용하여 pH를 조절한 경우에는 5N HCl로 탄산칼슘을 중화한 후 흡광도를 분석하였다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1>

사용균주: MWE-1010, MWEX-46, AX40-34, ACX40-5

종배지: 포도당 5%, 효모추출물 1.0%, 요소 0.3%, CSL(옥수수침지액) 0.5%, 펩톤 1.0%, 식염 0.25%, 바이오틴 50㎍/ℓ(pH 7.2를 5N 가성소오다 용액을 이용하여 조절)

발효배지: 포도당 10%, 염화암모늄 4.0%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수침지액) 2.0%, 바이오틴 50㎍/ℓ(pH 7.2를 5N 가성소오다 용액을 이용하여 조절)

배양과정: 상기 종배지 50㎖를 500㎖ 진탕 플라스크에 분주하여 121℃에서 20분간 가압 살균한 후 상기 각 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종균배양액으로 하였다. 발효배지를 탄산칼슘 1.5g 이 담겨져 121℃에서 20분간 가압 살균한 500㎖ 플라스크에 30㎖를 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 1㎖를 접종하여 30℃에서 40시간 왕복 진탕 배양하였다. ACX40-5의 경우 발효배지에 300㎎/ℓ의 L-시스테인을 첨가하였으며, 생육도와 배양액 중의 L-아르기닌 량을 측정한 결과는 하기 표 5와 같다.

<표 5>

사용균주	생육도	L-아르기닌 농도(g/ℓ)
MWE-1010	0.508	5.8
MWEX-46	0.489	25.8
AX40-34	0.465	31.6
ACX40-5	0.478	35.2

<실시예 2>

탄산칼슘을 제외한 실시예 1의 발효배지 2ℓ를 살균된 5ℓ 소형발효조에 넣고 마찬가지로 ACX40-5의 종균 배양액을 200㎖를 접종하고 600rpm, 1vvm의 조건으로 30℃에서 배양하였다. 배양 중 pH는 암모니아수로 7.0으로 조절하였으며 잔당 1%일 때 60% 포도당액을 3회 추가하였다. 발효에 사용된 총 당량은 215g/ℓ를 사용하였다. 이때 발효배지에 첨가한 L-시스테인의 농도별 생육도 및 아르기닌 생산성은 하기 표 6과 같다.

<표 6>

L-시스테인의 농도(㎎/ℓ)	최대 생육도	L-아르기닌 농도(g/ℓ)	발효시간(hr)
100	0.352	40.2	64
300	0.758	78.2	49
500	0.911	65.0	40

<실시예 3>

실시예 2와 동일한 방법으로 L-시스테인이 300㎎/ℓ첨가된 발효배지 20ℓ를 살균한 후 50ℓ발효조에 넣고 ACX40-5를 종균 배양액 2ℓ에 접종하여 350rpm, 1.0vvm, 내압 0.5kg/㎤ 의 조건으로 30℃에서 배양하였다. 배양 중 pH 는 암모니아 가스를 사용하여 7.0 으로 조절하였으며, 잔당 1% 일 때 60% 포도당액을 3회 추가하였다. 발효에 사용된 총 당량은 215g/ℓ를 사용하였다. 이때 발효조내 L-아르기닌의 축적량은 75g/ℓ였으며 발효시간은 51 시간이 소요되었다. 또한 배양액내에 축적된 L-아르기닌을 통상적인 이온교환 수지를 사용하여 분리하고 채취하였다.

본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용하면 최종 산물인 L-아르기닌에 대한 피드백 저해를 받지 않아 공업적으로 생산이 가능하다. 또한 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가짐과 동시에 아미노산 요구주를 이용하면 발효공정 중에 원하는 정도의 균체량을 유지시킬 수 있어 균체의 과다생육에 따른 산소 결핍의 문제도 해결할 수 있다.

Claims (5)

1. 아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네 박테리움 글루타미쿰(KCTC 10423BP)
2. 제 1항에 있어서,

   아미노산을 생육에 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰
3. 아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네 박테리움 글루타미쿰 (KCTC 10423BP)을 배양하여, 배양물로부터 L-아르기닌을 제조하는 방법
4. 제 3항에 있어서,

   배양균주는 특정 아미노산을 생육에 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰 인 L-아르기닌의 제조방법
5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,

   배양온도는 25∼35℃, pH 5.5∼7.5 범위의 호기적 조건하에 수행되는 L-아르기닌의 제조방법