KR100376537B1

KR100376537B1 - 엘-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰씨제이31-0211 및 그를 이용한 엘-라이신의 생산방법

Info

Publication number: KR100376537B1
Application number: KR10-2000-0021578A
Authority: KR
Inventors: 임상조; 김성준; 신현철; 성진식; 장기창; 고중환; 이재흥
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2000-04-24
Filing date: 2000-04-24
Publication date: 2003-03-17
Also published as: KR20010097468A

Abstract

본 발명은 퓨린유사체의 일종인 6-머캅토퓨린에 대해 내성을 갖는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CJ31-0211 (기탁번호 제 KFCC-11137호) 및 상기 균주를 직접발효법으로 배양하여 그 배양액 내에 L-라이신을 축적시키는 L-라이신 제조방법에 관한 것이다.

Description

엘-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 씨제이31-0211 및 그를 이용한 엘-라이신의 생산방법{Microorganism Corynebacterium glutamicum producing L-lysine and process for producing L-lysine by use thereof}

본 발명은 퓨린유사체의 일종인 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine) 500 mg/l 의 농도에서 내성을 가지는 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) CJ31-0211 및 이를 이용하여 L-라이신을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대한민국 특허출원 제 98-39305 호(1998년 9월 22일 출원)에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043으로부터 유래된 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) CJ31-0211 및 이것을 이용하여 L-라이신의 발효시간을 단축시키고 생산성을 증가시키는 L-라이신의 제조방법에 관한 것이다.

L-라이신은 필수 아미노산의 일종으로 가축의 사료첨가제, 식품첨가제, 의약원료 등으로 사용되고 있다. 특히 L-라이신을 이것의 함량이 적은 가축의 곡류 사료에 첨가하면 사료의 효율을 향상시킬 수 있으며, 최근 가축 분뇨에 있어서 질소, 인 등의 성분의 배출을 규제하려는 경향이 강화됨에 따라 그 수요가 더욱 증가하고있는 실정이다. 이러한 L-라이신의 사료첨가제로서의 시장규모는 1998년에 약 50여 만톤에 이르고 있으며 연평균 12 - 15% 의 지속적인 수요증대가 기대되고 있다. 따라서 L-라이신 생산 균주의 개발 또는 발효공정의 개선에 의한 L-라이신의 생산성 향상은 큰 경제적 효과를 기대할 수 있다.

현재까지 L-라이신의 생산방법으로는 예컨대 생합성 전구물질(예: α-아미노아디프산, α-케토아디프산)을 가하여 대사시키는 방법, 변이주를 사용하는 2단법(디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)을 통한 생산법), 효소에 의한 생산법(DL-α-아미노카프로락탐의 전환) 및 미생물을 이용하는 직접발효법등이 알려져 있고, 최근에는 세포융합법, 유전자재조합법 등의 첨단기술을 응용하여 균주개량기술이 획기적으로 발달함에 따라 미생물을 이용한 직접발효법이 주축을 이루고 있다.

또한, L-라이신을 생산하는 미생물에 대한 특허는 대한민국 특허공고 79-1782, 81-1746 및 92-7402, 일본특허공개 평10-165180, 평5-111386, 평4-166092등에 기술되어 있는데, 종래에는 인공돌연변이법에 의해 아미노산 요구성, 아미노산 유사체에 대한 내성, 항생제 등에 대한 내성 등을 부여한 균주가 주를 이루고 있다.

한편 본 출원인은 L-루이신(L-leucine) 비영양요구성 및 초산(acetic acid) 비자화성의 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 대한민국 특허출원 제 98-39305 호로 출원한 바 있다. 그러나, 상기 균주는 계속된 인공돌연변이로 인해 발효시간이 길어지는 경향을 보이고 있어 개선의 여지를 여전히 갖고 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043과 같은 종래의 미생물들보다 발효능이 개선되고 퓨린유사체의 일종인 6-머캅토퓨린 등에 대한 내성이 개선된 신규의 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 상기 신규한 미생물을 사용하여 L-라이신을 소수율로 생산하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명자들은, 대한민국 특허출원 제 98-39305 호에 공시된 바 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 모균주로 하여 이로부터 발효시간이 단축되는 신균주를 개발하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 상기 모균주로부터 발효시간을 단축할 수 있고 퓨린유사체의 일종인 6-머캅토퓨린에 대해서 내성을 갖는 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211을 개발하게 되었으며, 상기 균주가 상기 목적에 부합할 뿐 아니라 기존에 공지된 바 없는 신규한 균주임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 출원인은 상기 미생물 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211을 제 3자에게 일반분양될 수 있도록 서울 서대문구 홍제동 소재 한국미생물보존센터에 2000년 1월 29일에 수탁번호 제KFCC-11137호로 기탁하였다.

본 발명의 일면에 따르면, L-라이신을 생산능을 가지고 6-머캅토퓨린에 대해 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CJ31-0211 (기탁번호 제 KFCC-11137호)가 제공된다.

본 발명의 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 모균주로 하고 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine : NTG)을 10⁷내지 10⁸세포/㎖에 대하여 최종농도 1,000 ㎍/㎖으로 약 5분간 처리하여 인공돌연변이를 유발시킴으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 다른 일면에 따르면, 본 발명의 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211을 배양용 배지에 배양하여 그 배양액 내에 L-라이신을 축적시키는 방법이 제공된다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 있어서, 모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043은 이미 대한민국 특허출원 제 98-39305 호에 개시된 기탁된 균주로서, 상기 균주는 L-라이신의 생합성 경로에 있어서 중요한 대사조절 부위인 아스파토키나아제에 대한 L-라이신과 L-트레오닌의 피드백 저해가 해제되고 호모세린 디하이드로게나제에 대한 트레오닌의 저해만 지속되는, 라이신 유사체인 S(β-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 갖는 균주이므로 L-라이신 생산 균주로서 적합한 균주이다.

본 발명에서는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 모균주로 하여 이 균주를 인공돌연변이시킴으로써 퓨린유사체의 일종인 6-머캅토퓨린 500 mg/l의 농도에서 내성을 가지는 변이주를 획득하고자 하였다.

인공돌연변이 유발원으로는 알킬화제의 일종인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: NTG)을 10⁷내지 10⁸세포/㎖에 대하여 최종농도 1,000 ㎍/㎖으로 약 5분간 처리하였다. 그런 후 6-머캅토퓨린 500 mg/l 함유 포도당 최소배지에서 성장하는 균주를 선별하여 L-라이신 발효성을 시험해 본 결과, CJ31-0211 균주가 모균주인 KFCC 11043에 비하여 발효시간을 단축시킴을 확인하였다. 이에 상기 CJ31-0211 균주 및 모균주인 KFCC 11043을 5ℓ발효조에서 L-라이신 발효능에 대하여 재확인 실험을 행하였으며, 그 결과 역시 CJ31-0211균주가 KFCC 11043에 비하여 발효시간을 약 8% 단축시킴을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 상기 CJ31-0211 균주를 2000년 2월 9일자로 서울 서대문구 홍제동 소재 사단법인 한국종균협회에 기탁번호 제 KFCC-11137호로 기탁하였다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211을 개발하기 위한 과정을 상술하면 다음과 같다.

이하의 실험에서 변이주 선별을 위한 최소배지로는 하기의 한천 최소배지를 사용하였고, 선별된 변이주의 평가를 위한 배지로는 하기의 플라스크 발효배지를 사용하였다. L-라이신의 농도는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 측정하였고, 당농도는 필요한 경우 버트란트(Bertrand)법을 사용하여 정량하였다.

실시예

한천 최소배지

포도당 10g, (NH₄)₂SO₄2g, 요소 2g, KH₂PO₄1.0g, K₂HPO₄3.0g, MgSO_4·7H₂O 0.5g, FeSO_4·7H₂O 10mg, MnSO_4·5H₂O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 100㎍, CaCl₂·2H₂O 0.1g, Na₂B₄O₇·10H₂O 80㎍, (NH₄)₆MoO₂₇·4H₂O 40㎍, ZnSO₄·7H₂O 10㎍,CuSO₄·7H₂O 300㎍, MnCl₂·4H₂O 10㎍, FeCl₃·6H₂O 1mg, 한천 20g, 증류수 1리터당 (pH 7.0, 살균전).

플라스크 발효배지

당밀(환원당으로서) 100g, 효모엑기스 4g, (NH₄)₂SO₄40g, 요소 4g, KH₂PO₄1g, NaCl 2.5g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, FeSO₄·7H₂O 10mg, MnSO₄·5H₂O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 200㎍, CaCO₄40g, 공정수 1리터당 (pH 7.0, 살균후).

실시예 1

모균주인 KFCC 11043의 6-머캅토퓨린에 대한 내성을 시험하기 위하여 루리아 버타니(LB) 액체배지에서 16시간 성장시킨 세포를 멸균 생리식염수로 2회 세척한 후 적당히 희석하여 6-머캅토퓨린을 각각 100, 200, 300, 500 mg/l 함유한 포도당최소배지에 도말하여 30℃ 배양기에서 7일간 배양한 결과, 500 mg/l 농도에서 성장하지 못함을 알 수 있었다(표 1).

코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11043의 6-머캅토퓨린 내성도 시험

	6-머캅토퓨린 농도(mg/l)
	0	100	200	300	500
성장도	++++	++++	++	+	-

+ : 세포 성장 일어남

실시예 2

6-머캅토퓨린 500 mg/l 농도에서 성장하는 균을 개발하기 위하여 루리아 버타니 액체배지에서 대수기 중반까지 성장한 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷내지 10⁸세포/㎖로 현탁시킨 후, NTG를 최종농도가 1,000 ㎍/㎖이 되도록 첨가하고 30℃ 진탕기에서 5분간 처리하였다. 이어서 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척하고 6-머캅토퓨린을 500 mg/l 함유한 최소배지에 도말한 후 30℃의 항온기에서 7일간 배양시킨 후 성장한 미생물 군락을 선별하였다. 그 결과 100 여개의 6-머캅토퓨린 500 mg/l 내성균주를 획득할 수 있었다.

위에서 얻은 균주를 진탕배양기에서 배양온도 30℃, 교반속도 230 rpm(revolution per minute), 배양시간 72시간의 조건으로 L-라이신의 생산성을 측정하였다. 그 결과 모균주인 KFCC 11043에 비해서 농도가 상승 내지 비슷한 5개의 균주를 획득하였다(표 2).

코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043 및 6-머캅토퓨린 내성균주의 플라스크 실험결과

균주	발효농도(g/ℓ)	OD562
KFCC 11043	52.6	30
MP-03	52.1	33
MP-35	53.2	30
MP-64	53.5	32
MP-74	52.4	29
MP-77	53.1	29

위에서 획득한 5개 균주의 당 소모속도를 측정하기 위하여 최소배지에서 성장곡선을 측정한 결과 MP-64 균주가 다른 균주에 비해서 모균주인 KFCC 11043 대비 성장속도가 가장 빠른 균주임을 확인하였다.

실시예 3

실시예 2에서 획득한 MP-64를 CJ31-0211 균주라 명명하고, CJ31-0211 및 모균주인 KFCC 11043을 5ℓ 발효조에서 아래의 방법으로 발효실험을 진행하였다. 먼저 두 균주 모두 각각의 플라스크 1차 종배지에서 배양온도 30℃, 교반속도 220 rpm의 조건으로 20시간 동안 진탕배양기를 이용하여 배양한 후 5ℓ발효조 2차 종배지에 접종하였다. 접종한 후 배지내의 당성분이 모두 고갈되면 배양을 종료하고 이를 본배지에 접종량이 2.5%가 되도록 접종하였다. 본배양의 방법으로는 추가 당 및 추가물을 배양중에 첨가하는 유가식 발효법(fed-batch fermentation)을 이용하였다.

사용된 배지 및 배양조건은 다음과 같다.

플라스크 1차 종배양 배지성분 및 배양조건

원당 20g, 콘 스팁 리쿼 50 ml, 효모엑기스 3g, (NH₄)₂SO₄5g, KH₂PO₄4g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 1mg, 공정수 1ℓ(pH 7.0, 멸균전)

30℃, 220 rpm, 20시간 배양

5ℓ 발효조 2차 종배양 배지성분 및 배양조건

원당 70g/ℓ, 펩톤 3g/l, (NH₄)₂SO₄10g/ℓ, KH₂PO₄1.2g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.6 g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 20mg/ℓ, 바이오틴 200㎍/ℓ, 티아민·HCl 300㎍/ℓ, 소포제 3㎖/ℓ

온도 30℃, pH 7.2, 교반속도 600rpm, 통기량 1vvm(air volume/mediumvolume/minute)

5ℓ 발효조 본 배양배지 성분 및 배양 조건

- 당밀(환원당으로서) 280g/ℓ, 콘 스팁 리쿼(Corn steep liquor) 100㎖/ℓ, (NH₄)₂SO₄35g/ℓ, KH₂PO₄1.0g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 10mg/ℓ, 바이오틴 300㎍/ℓ, 티아민·HCl 500㎍/ℓ, 소포제 3㎖/ℓ

- 온도 30℃, pH 7.2, 교반속도 600rpm, 통기량 1vvm(air volume/medium volume/minute)

위의 조건에서 발효를 진행한 결과, CJ31-0211은 모균주 KFCC 11043에 비해 발효농도는 비슷했으나 발효시간이 약 8 % 정도 단축된 우수한 균주임을 확인하였다(표 3).

코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211 및 KFCC 11043의 5ℓ 발효조 실험결과

	CJ31-0211	KFCC 11043
발효농도(g/ℓ)	138.0	137.4
발효시간(hr)	59	64
PCV(%)	10	10.1

(PCV : 충전 세포 용적, Packed Cell Volume)

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211은 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 인공돌연변이시켜 6-머캅토퓨린에 대한 내성을 부여한 균주로서, 모균주에 비해 발효시간을 단축시킴으로써 L-라이신의 생산성 향상에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

L-라이신을 생산능을 가지고 6-머캅토퓨린에 대해 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CJ31-0211 (기탁번호 제 KFCC-11137호).
제 1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11043을 모균주로 하고 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: NTG)을 10⁷내지 10⁸세포/㎖에 대하여 최종농도 1,000 ㎍/㎖으로 5분간 처리하여 인공돌연변이를 유발시킴으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211.
제 1항에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ31-0211 (기탁번호 제 KFCC-11137호)을 배양용 배지에 배양하여 그 배양액 내에 L-라이신을 생산하는 방법.