KR100253424B1

KR100253424B1 - 코리네박테리움 글루타미컴 cj88 및 이 균주를 이용한l-라이신의 제조방법

Info

Publication number: KR100253424B1
Application number: KR1019970068670A
Authority: KR
Inventors: 신현철; 임상조; 성진석; 김용욱; 오미섭; 고중환; 이재흥
Original assignee: 손 경 식; 제일제당주식회사
Priority date: 1997-12-15
Filing date: 1997-12-15
Publication date: 2000-04-15
Also published as: KR19990049691A

Abstract

본 발명은 신규한 L-라이신 생성 미생물인 코리네박테리움 글루타미컴 CJ88에 관한 것으로 코리테박테리움 글루타미컴 KFCC10881을 모균주로하여, L-루이신을 영양요구로 하지 않으나 L-루이신 및 구아닌 누출(leaky)특성을 동시에 지닌 L-라이신 생성 고역가 돌연변이 균주로 모균주에 비해 L-라이신의 발효농도 및 대당수율이 획기적으로 향상되었다.

Description

코리네박테리움 글루타미컴 ＣＪ88 및 이 균주를 이용한 Ｌ-라이신의 제조 방법(Corynebacterium glutamicum CJ88 and Process for Producing L-lysine Using the Said Strain)

본 발명은 L-라이신을 고역가로 생성하는 신규한 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 돌연변이주에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 L-루이신 영양요구성 L-라이신 생성 변이주 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10881을 인공돌연변이시켜 L-루이신 누출형(leaky)으로 전환시킨 다음 재차 인공돌연변이 시켜 얻은 구아닌 누출형인 코리네박테리움 글루타미컴 돌연변이주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기된 신규한 코리네박테리움 글루타미컴 돌연변이주를 이용하여 고농도로 L-라이신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-라이신은 필수아미노산의 일종으로 가축의 사료, 식품첨가제, 의약원료 등으로 사용되고 있으며 특히 사료용으로서의 수요는 1997년 말 약40만 톤에 이를 전망으로 주로 미생물을 이용한 직접발효법이 사용되고 있다. 종래 미생물에 의한 L-라이신 제조방법으로는 대한민국 특허공고 92-7402, 대한민국 특허공개 92-18228, 대한민국 특허공개 92-14993, 일본 특허공개 소63-12292, 일본 특허공개 평4-88991, 일본 특허공개 평4-91793, 일본 특허공개 평4-91794, 일본 특허공개 평5-111386, 영국 특허 GB2152509A 등에 기술되어 있으며 아미노산 요구성, 아미노산 유도체 및 항생제등 기타 약제에 대해 내성을 부여하고 있다.

본 발명자들은 대한민국 특허원 제95-72246호(이의 전체내용은 본원에 참고사항으로 인용된다)로 출원계류중에 있는 특허균주인 코리네박테리움 글루타미컴 CH77 (L-루이신 영양요구성 균주)(1995년 12월 8일에 한국종균협회에 기탁되어 수탁번호 KFCC-10881을 부여받음, 본원에서는 "코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881"로 언급된다)을 모균주로 하여 인공돌연변이에 의해 L-루이신 누출형 균주를 획득하였으나 L-라이신 발효농도가 모균주에 비해 저하되는 현상이 발생하였다. 이를 해결하기 위해 본 발명자들은 재차 인공돌연변이에 의해 구아닌 누출형 세균을 얻어 플라스크 및 7L 발효조 실험을 행한 결과 발효농도가 모균주에 비해 획기적으로 증가한 돌연변이주 (코리네박테리움 글루타미컴 CJ88)을 획득하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881에서 유래된 균주로 L-루이신을 영양요구로 하지 않으나 L-루이신 및 구아닌 누출(leaky)특성을 동시에 지닌 L-라이신 생성 고역가 균주 코리네박테리움 글루타미컴 CJ88을 제공한다.

또한, 본 발명은 발효균주로서 상기한 본 발명의 균주를 이용하여 L-라이신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 10881은 α-아미노-β-하이드록시 발레릭산, S-(β-아미노에틸)-L-시스테인, 메틸라이신 등의 내성 및 L-루이신 영양요구성, L-호모세린 누출(leaky) 및 호흡억제제인 소디움아자이드의 일정농도 이하에 대해 민감함 특성을 가지며 본 실험에 사용된 배지는 다음에 나타내었다. 한편, L-라이신 농도는 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로, 당량은 필요한 경우 버트란트(Bertrand)법을 사용하여 정량하였다.

실시예 1

우선 L-루이신 누출형세균을 얻기 위하여 루리아버타니(LB) 액체배지에서 대수기 중반까지 자란 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881을 사이트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷-10⁸균수/ml로 현탁시킨 뒤 N-메칠-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 최종농도가 500㎍/ml 되게 한 뒤 30℃ 진탕기에서 30분간 처리한 뒤 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척하고 5시간 동안 루리아버타니 배지에서 균체를 활성화시킨 후 하기의 한천 최소배지에 도말하였다.

한천 최소배지 성분:

글루코스 10 g, (NH₄)₂SO₄2 g, 우레아 2 g, KH₂PO₄1.0 g, K₂HPO₄3.0 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, FeSO₄·7H₂O 10 mg, MnSO₄·5H₂O 10 mg, 바이오틴 100 ㎍, 티아민·HCl 100 ㎍, CaCl₂·2H₂O 0.1 g, Na₂B₄O₇·10H₂O 80 ㎍, (NH₄)₆MoO₂₇·4H₂O 40 ㎍, ZnSO₄·7H₂O 10 ㎍, CuSO₄·7H₂O 300 ㎍, MnCl₂· 4H₂O 10 ㎍, FeCl₃·6H₂O 1 mg, 한천 20 g, 증류수 1리터당 (pH 7.0(살균 전))

30℃의 항온기에서 10일동안 배양시킨 후 성장한 미생물군락(colony)을 다시 한천 최소배지에 도말하여 L-루이신 비영양요구성을 확인하였다. 그 결과 12개의 L-루이신 비요구성 미생물군락을 최종 획득 할 수 있었는데 그것들은 30℃, 230 rpm, 72시간의 배양조건의 진탕배양기에서 하기의 플라스크 발효배지를 사용하여 그 발효농도를 다음 표1에 나타내었다. 그 결과 L-031만이 KFCC10881 대비 발효농도가 5.6% 저하되었고 나머지는 10%이상 저하되었다.

플라스크 발효배지:

당밀(환원당으로서) 100 g, 효모엑기스 4 g, (NH₄)₂SO₄40 g, 우레아 4 g, KH₂PO₄1 g, NaCl 2.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, FeSO₄·7H₂O 10 mg, MnSO₄· 5H₂O 10 mg, 바이오틴 100 ㎍, 티아민·HCL 200 ㎍, CaCO₄40 g, 공정수 1 리터당(pH 7.0(살균후))

코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881 및 L-루이신 누출형 변이주의 플라스크 실험결과

항목균주	발효농도(g/l)	대당수율(%)
KFCC10881	46.0	46.0
L-011	40.2	40.2
L-021	39.3	39.3
L-031	43.4	43.4
L-041	39.5	39.5
L-051	39.8	39.8
L-061	41.0	41.0
L-071	42.8	42.8
L-081	39.5	39.5
L-091	40.8	40.8
L-101	40.5	40.5
L-111	39.8	39.8
L-121	41.2	41.1

실시예 2

L-라이신 발효농도를 향상시키기 위하여 실시예 1에서 획득한 변이주 L-031을 모균주로 하여 구아닌 누출형 특성을 부여하였다. 인공돌연변이 처리방법은 전술한 방법대로 행하였으며 배양기에서 자란 미생물군락들은 구아닌이 포함된 한천 최소배지 및 구아닌이 포함되지 않은 한천 최소배지에 도말 작업을 거쳐 구아닌 누출형이라 판단되는 미생물군락 2종 (CJ88 및 CJ89)을 선별하였다. 2종의 미생물 군락은 순수분리 과정을 거쳐 액체 최소배지에서 30℃, 230 rpm, 24시간 배양 후 562nm에서 흡광도를 측정하여 그 상대 성장도로 구아닌 누출특성을 재확인하였다. 하기 표2에 나타나 있는 바와 같이 2종 모두 구아닌 누출형 특성을 지닌 것으로 확인되었으며 CJ88이 누출형 특성이 강화된 것임을 알 수 있었다.

코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881 및 L-031, 구아닌 누출형 변이주(CJ88, CJ99)의 액체 최소배지 배양결과

배지균주	상대성장도(%)
배지균주	KFCC10881	L-031	CJ88	CJ99
최소배지	102	98	65	80
최소배지+구아닌(0.4 g/l)	100	100	100	100

실시예 3

실시예 2에서 획득한 CJ88 및 CJ99의 L-라이신 발효농도는 상기된 플라스크 발효배지를 사용하여 30℃, 230 rpm, 72시간의 배양조건의 진탕배양기에서 발효실험을 행한 결과 KFCC10881 대비 발효농도가 획기적으로 증가한 CJ88을 획득 할 수 있었다. 이의 결과는 하기 표3에 나타나 있다.

코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881 및 L-031, CJ88, CJ99의 플라스크 실험결과

항목균주	발효농도(g/l)	대당수율(%)	PCV^*(%)
KFCC10881^**	46.5	46.5	10.5
L-031	43.8	43.8	11.0
CJ88	50.5	50.5	8.0
CJ99	48.3	48.3	9.5

*PCV: Packed Cell Volume

**KFCC1088은 배지에 L-루이신 0.2 g/l 첨가

실시예 4

플라스크 실험결과 우량균주라 판정된 CJ88 및 모균주 KFCC10881을 플라스크 종배지에서 일정시간 배양후 7L 발효조에 직접 접종한 뒤 추가당 및 추가물은 배양중에 첨가하는 유기식발효(fed-batch fermentation)방법으로 발효실험을 행하였으며 배지 및 배양조건은 다음과 같다.

종배양배지(A) 및 배양조건(B):

(A) 원당 50 g(별살), 펩톤 10 g, 효모엑기스 10 g, KH₂PO₄1.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 우레아 5 g, 바이오틴 50㎍, 공정수 1L (pH 7.0, 멸균전)

(B) 30℃, 220 rpm, 16시간 배양

7L발효조 배지성분(A) 및 배양조건(B):

(A) 당밀(환원당으로써) 280 g/l, 옥수수침지액 100ml/l, (NH₄)₂SO₄35 g/l, KH₂PO₄1.0 g/l, MgSO₄7H₂O 0.5 g/l, FeSO₄7H₂O 10 mg/l, 바이오틴 300 ㎍/l, 티아민 HCl 500 ㎍/l, (소포제 3 ml/l)

(B) 온도 30℃, pH 7.2, 교반속도 600 rpm, 통기량 1vvm (air volume/

medium volume/minute)

발효결과 코리네박테리움 글루타미컴 CJ88이 모균주 KFCC10881에 비해 발효농도가 획기적으로 증가한 우량균주임을 재확인하였고 이 균주를 1997년 11월 24일자로 한국종균협회에 기탁하고 미생물 수탁번호 KFCC-11001을 부여받았다.

코리네박테리움 글루타미컴 KFCC10881 및 CJ88의 7L발효조 실험결과

항목균주	발효농도(g/l)	발효시간 (hr)	대당수율(%)	총당(g/l)	PCV(%)	비 고
KFCC10881	126.3	65.0	45.1	280	13.5	60시간발효
CJ88	135.0	63.5	48.2	280	10.0	60시간발효

본 발명의 신규한 돌연변이균주 코리네박테리움 글루타미컴 CJ88은 L-라이신을 생산하는데 산업상 유용할 것으로 기대된다.

Claims

L-루이신을 영양요구로 하지 않으나 L-루이신 및 구아닌 누출(leaky)특성을 동시에 지닌 L-라이신 생성 고역가 균주 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CJ88 (KFCC-11001).
발효에의한 L-라이신의 제조방법에 있어서, 제1항의 코리네박테리움 글루타미컴 CJ88 균주를 사용함을 특징으로 하는 방법.