CN1318574C - 发酵制备l－苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种发酵制备L-苏氨酸的方法，其中通过补料方法培养肠细菌科中生产L-苏氨酸的微生物，然后分离除去一部分发酵肉汤，以便用于接种另外的培养基。

Description

发酵制备L-苏氨酸的方法
本发明提供了一种用肠细菌科细菌经发酵制备L-苏氨酸的方法。
现有技术
L-苏氨酸用于动物营养，人用药及制药工业。
已知L-苏氨酸可通过肠细菌科菌株，尤其大肠杆菌的发酵而生产。由于这种氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
从现有技术得知，如US-A-5538873和EP-B-0593792所述，或Okamoto等(生物科学、生物技术和生物化学61(11)，1877-1882，1997)所述，苏氨酸是通过分批方法(分批)或补料分批方法(补料分批)经发酵而制备的。
发明目的
本发明目的是提供新的发酵制备L-苏氨酸的改良方法。
发明概述
本发明提供了一种发酵方法，其特征在于：
a)将肠细菌科的一种生产L-苏氨酸的微生物以已知方式通过补料方法(补料分批)培养，随后
b)分离除去一部分发酵肉汤，在发酵罐中余留占发酵肉汤总体积1-90vol％，尤其1-50vol％，优选1-25vol％及特别优选5-50vol％的发酵肉汤，随后
c)将余留的发酵肉汤用生长培养基加满，并且优选地在生长期后，通过所述补料方法(补料分批方法)进行进一步发酵，
d)将b)和c)步骤任选地进行若干次，及
e)从收集的发酵肉汤中分离L-苏氨酸。
发明详述
本发明方法所用的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，或从甘油和乙醇中生产L-苏氨酸，从葡萄糖，蔗糖或糖蜜中生产L-苏氨酸是优选的。所述微生物可以是肠细菌科的代表菌，尤其是埃希氏杆菌属，沙雷氏菌属和普罗威登斯菌属(Providencia)。在埃希氏杆菌属中尤其应提及的是大肠杆菌，在沙雷氏菌属中尤其应提及的是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
埃希氏杆菌属尤其大肠杆菌中生产L-苏氨酸的适当菌株是例如：
大肠杆菌TF427
大肠杆菌H-4225
大肠杆菌H-4226
大肠杆菌H-4257
大肠杆菌H-4258
大肠杆菌H-4435
大肠杆菌H-4436
大肠杆菌H-4578
大肠杆菌H-7256
大肠杆菌H-7263
大肠杆菌H-7293
大肠杆菌H-7294
大肠杆菌H-7700
大肠杆菌H-7729
大肠杆菌H-8309
大肠杆菌H-8311
大肠杆菌H-9244
大肠杆菌KY10935
大肠杆菌EL1003
大肠杆菌VNIIgenetika MG-442
大肠杆菌VNIIgenetika VL334/pYN7
大肠杆菌VNIIgenetika M1
大肠杆菌VNIIgenetika 472T23
大肠杆菌VNIIgenetika TDH-6
大肠杆菌BKIIM B-3996
大肠杆菌BKIIM B-5318
大肠杆菌B-3996-C43
大肠杆菌B-3996-C80
大肠杆菌B-3996/pTWV-pps
大肠杆菌B-3996(pMW::THY)
大肠杆菌B-3996/pBP5
大肠杆菌Ferm BP-3756
大肠杆菌Ferm BP-4072
大肠杆菌Ferm BP-1411
大肠杆菌kat13
大肠杆菌KCCM-10132
大肠杆菌KCCM-10133。
沙雷氏菌属尤其粘质沙雷氏菌中生产L-苏氨酸的适当菌株是例如：
粘质沙雷氏菌HNr21
粘质沙雷氏菌TLr156
粘质沙雷氏菌T2000。
肠细菌科生产L-苏氨酸的菌株优选具有选自以下的一或多个遗传或表型特征：α-氨基-β-羟基戊酸抗性，thialysine抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋体素抗性，利福平抗性，缬氨酸类似物例如氧肟酸缬氨酸抗性，嘌呤类似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性，需要L-甲硫氨酸，任选地部分和可补偿性地需要L-异亮氨酸，需要间-二氨基庚二酸，针对含苏氨酸二肽的辅源营养，L-苏氨酸抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，对氟丙酮酸的敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，任选地蔗糖利用能力，苏氨酸操纵子的增强，高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I的增强，优选呈反馈抗性形式，高丝氨酸激酶的增强，苏氨酸合酶的增强，天冬氨酸激酶的增强，任选呈反馈抗性形式，天冬氨酸半醛脱氢酶的增强，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增强，任选地呈反馈抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强，转氢酶的增强，RhtB基因产物的增强，RhtC基因产物的增强，YfiK基因产物的增强，丙酮酸羧化酶的增强，及乙酸形成的弱化。
因此，例如菌株472T23(US-A-5,631,157)特别地具有增强的“反馈”抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，弱化的苏氨酸脱氨酶，对至少5g/l L-苏氨酸的抗性及利用蔗糖作为碳源的能力。
因此，例如菌株B-3996(US-A-5175107)特别地具有增强的“反馈”抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，弱化的苏氨酸脱氨酶，弱化的苏氨酸脱氢酶，对至少5g/l L-苏氨酸的抗性及利用蔗糖作为碳源的能力。
因此，例如菌株kat-13(US-A-5,939,307)特别地具有增强的“反馈”抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，弱化的苏氨酸脱氢酶，对疏螺旋体素的抗性及利用蔗糖作为碳源的能力。
因此，例如菌株KCCM-10132(WO 00/09660)具有α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，对氟丙酮酸的敏感性，L-谷氨酸抗性和对至少7％L-苏氨酸的抗性。该菌株还需要L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸。
文中术语“增强”是指提高微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性，例如通过提高所述基因或等位基因的拷贝数，使用强启动子或使用编码具有高活性相应酶的基因或等位基因，及任选地组合这些措施。
通过增强措施，尤其过表达，相应蛋白质的活性或浓度一般比起始微生物水平提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最多1000％或2000％。
文中术语“弱化”是指降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性，例如使用弱启动子，或使用编码具有低活性的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及任选地组合这些措施。
通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质活性或浓度的0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
根据本发明，生产L-苏氨酸的发酵装置的系统产量通过如下一种程序增加，其中在第一次发酵步骤之后，将以此方式获得的发酵肉汤的一部分余留在生产发酵罐中，并作为接种物进行一或多次进一步的发酵步骤(分批)。
根据本发明，发酵罐中余留发酵肉汤总体积的1-90vol％，优选1-50vol％，更优选1-25vol％，1-20vol％，1-15vol％，或1-10vol％，特别优选5-20vol％，5-15vol％或1-10vol％。
余留在发酵罐中的肉汤优选用生长培养基加满。在任选地＞0至＜10小时后，优选在1-10小时后，更优选在2-10小时后，及特别优选3-7小时后，补加生产培养基。或者，也可分别加入这一培养基的各种组分。在20-72小时后，优选20-48小时后，结束这一批次，并如上所述分离掉一部分发酵肉汤。然后任选地用余留物开始一新的发酵阶段。根据所用菌株的稳定性，所述方法可以重复至少一次，优选大约2-6次。重复大约2-8次或2-10次或2-4次也可以。
在所述加工过程中不丧失其生产性质的合适的稳定菌株特别适于所述加工方法。
所述生长培养基典型地包含糖，如葡萄糖，淀粉水解物，蔗糖或糖蜜，作为碳源。含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵，可以用作氮源。氮源可单独或混合使用。磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐，可以用作磷源。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还使用生长必需物质如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(如硫胺素)。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。
一般地，所述生产培养基只包含一种糖，例如蔗糖或葡萄糖，及任选地一种无机氮源，例如硫酸铵。或者，这些或其它组分也可以分别补加。
在生长或生产期间，温度设定在29℃-42℃，优选在33℃-40℃。温度范围也可在27℃-39℃。发酵可以在正常压力下进行，或任选在增加的压力下进行，优选在增加0-1.5巴的压力下。氧分压调节为5-50％，优选大约20％空气饱和度。可以用25％氨水将pH调节为6-8，优选6.5-7.5。
本发明的方法区别于所有常规方法之处在于空间/时间产量或产率提高。
本发明借助于以下实施例进行更详细的阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有限制酶切方法，Klenow和碱性磷酸酶处理方法，均是通过Sambrook等所述方法进行的(分子克隆实验指导(1989)，冷泉港实验室出版社)。除非特别说明，转化大肠杆菌通过Chung等所述方法进行(美国科学院院报(1989)86：2172-2175)。
实施例1：制备大肠杆菌K-12菌株DM1265
大肠杆菌菌株472T23的一个无质粒变体得自美国典型培养物保藏中心(Manasas，VA.，美国)，保藏号ATCC98082。菌株ATCC98082在专利说明书US-A-5631157中阐述。大肠杆菌菌株VL334/pYN7得自俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM，俄罗斯，莫斯科)，保藏号CMIM B-1684。菌株CMIM B-1684在专利说明书US-A-4278765中阐述。
质粒pYN7得自菌株VL334/pYN7。一个长度为6.25kbp的携带thrABC操纵子的DNA片段通过进行琼脂糖凝胶电泳、借助于限制酶HindIII和BamHI得自质粒pYN7。
质粒pBR322(Bolivar等，基因2，95-113(1977))得自PharmaciaBiotech(瑞典乌普萨拉)，并用限制酶HindIII和BamHI处理。通过制备琼脂糖凝胶电泳分离长度为4.3kbp的DNA片段。将两个DNA片段混合，用T4 DNA连接酶处理，并用此连接混合物转化菌株DH5α。在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂上选择后，获得含有与质粒pYN7结构相应的质粒的转化体。
从一个转化体中分离质粒，用EcoRI酶部分酶切及用HindIII完全酶切，并与分离的parB基因区连接。为此，将质粒pKG1022(Gerdes，生物技术(1988)6：1402-1405)用EcoRI酶和HindIII酶切，将酶切混合物在1％琼脂糖凝胶中分离，并借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)分离大小为629bp的parB片段。将连接混合物用于转化菌株ATCC98082。在补加了50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1：190(1955))上选择携带质粒的细胞。在分离所述质粒DNA，用EcoRI和HindIII控制酶切及通过琼脂糖凝胶电泳分析所述酶切混合物后，可以检测parB基因的成功克隆。所述质粒称为pYN7parB。
ATCC98082/pYN7parB的转化体称为DM1265，并根据布达佩斯条约以纯培养物形式于1999年4月30日保藏于德意志微生物保藏中心(DSM，德国不伦瑞克)，保藏号DSM12790。
菌株DM1265特别具有增强的“反馈”抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，弱化的苏氨酸脱氨酶，对至少5g/l L-苏氨酸的抗性和利用蔗糖作为碳源的能力。
这个菌株具有高稳定性，尤其高分离稳定性。
对比例A：借助于大肠杆菌K-12菌株DM1265通过常规发酵制备L-苏氨酸
将菌株DM1265的一个菌落转接种于具有以下组分的基本培养基上：3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/lMgSO4·7H2O，2g/l蔗糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。将培养物在37℃温育大约5天。用一接种环接种具有以下组分的10ml预培养基，并在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上在37℃、180rpm温育16小时，所述预培养基的组分是2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l蔗糖，50mg/l氨苄青霉素。
将1ml的此第一种预培养物接种于1402g的营养培养基A1-144。在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中进行培养发酵。所述营养培养基A1-144含有的组分列于表1。将此第二种预培养物在37℃，0.71vvm(体积/体积/分钟)1体积充气，10％空气饱和度的氧分压，和pH7.0条件下培养22.5小时，直至达到光密度(OD)(660nm)为16.3。
为接种得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中含有的1233g生长培养基M1-463，加入157.6g在营养培养基A1-144中的第二种预培养物。生长培养基M1-463中含有的组分示于表2。将所述培养物在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至达到残留蔗糖浓度为大约3g/l。以此方式获得的肉汤随后在37℃，1l/分钟通气，pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下进一步培养30小时，直至OD(660nm)为33.4。在此期间，连续补加包含一种浓度为650g/l蔗糖溶液的450g生产培养基。
然后用得自Dr.Bruno Lange GmbH(德国柏林)的LP1W型数码光度计测定在波长660nm的光密度(OD)，并通过离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的L-苏氨酸浓度，所用氨基酸分析仪得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)。
在39.5小时后，在最后的发酵样品中发现L-苏氨酸浓度为69.6g/l的。在此实验中，空间/时间产量因此为1.76g/l·h。
表1：营养培养基A1-144的组成
 组分  浓度(/kg)
 蔗糖  30g
 酵母膏  2g
 (NH4)2SO4  5g
 K2HPO4  2g
 NaCl  0.6g
 MgSO4·7H2O  0.4g
 FeSO4·7H2O  20mg
 MnSO4·H2O  20mg
 氨苄青霉素  50mg
 Structol  0.3g
表2：生长培养基M1-463的组成
 组分 浓度(/kg)
 蔗糖 27.7g
 酵母膏 1.87g
 NaCl 0.62g
 (NH4)2SO4 4.7g
 K2HPO4 1.9g
 MgSO4·7H2O 0.38g
 MnSO4·H2O 18mg
 FeSO4·7H2O 18mg
 氨苄青霉素 50mg
 Structol 0.1g
实施例2：借助于菌株DM1265，通过2次后续补料方法和在每种情况下使用10％接种物制备L-苏氨酸
将菌株DM1265的一个菌落转接种于具有以下组分的基本培养基上：3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/lMgSO4·7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。将培养物在37℃温育大约5天。用一接种环接种具有以下组分的10ml预培养基，并在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上在37℃、180rpm温育16小时，所述预培养基的组分是2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l蔗糖，50mg/l氨苄青霉素。
将1ml的此第一种预培养物接种于1402g的营养培养基A1-144。在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中进行培养发酵。所述营养培养基A1-144含有的组分列于表1。将此第二种预培养物在37℃，0.71vvm(体积/体积/分钟)体积充气，10％空气饱和度的氧分压，和pH7.0条件下培养22.5小时，直至达到光密度(OD)(660nm)为16.3。
为接种得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中含有的1233g生长培养基M1-463，加入157.6g在营养培养基A1-144中的第二种预培养物。生长培养基M1-463中含有的组分示于表2。如对比例A所述将所述培养物在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至9.5小时后达到残留蔗糖浓度为大约3g/l。以此方式获得的肉汤随后在37℃，1l/分钟通气，pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下进一步培养30小时，直至OD(660nm)为33.4。在此期间，连续补加包含一种浓度为650g/l蔗糖溶液的450g生产培养基。在补充溶液已被消耗及第一轮发酵肉汤中的残留蔗糖已经消耗之后，泵出发酵罐中90％的发酵肉汤(1656g)。将余留的10％(184g)发酵肉汤用1200g生长培养基M1-474加满，并再次开始发酵。所述生长培养基的组分示于表3。将此第二轮的培养物如对比例A所述在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在5小时后残留蔗糖浓度达到大约3g/l。然后将此肉汤在37℃，1l/分钟通气，pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下进一步培养31.25小时，直至OD(660nm)达到35.7。在此期间，连续补加包含一种浓度为650g/l蔗糖溶液的450g生产培养基。在补加溶液已经消耗及发酵肉汤中的残留蔗糖已经消耗之后，泵出发酵罐中90％的发酵肉汤(1656g)。
将余留的10％(184g)发酵肉汤用1200g生长培养基M1-474加满，并再次开始发酵。生长培养基M1-474的组分示于表3。将此第3轮的培养物如对比例A所述在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在5.25小时后残留蔗糖浓度达到大约3g/l。然后将此培养物在37℃，1l/分钟通气，pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下进一步培养30.5小时，直至OD(660nm)达到32.5。在此期间，连续补加包含一种浓度为650g/l蔗糖溶液的450g生产培养基。
在每轮发酵后，如对比例A所述确定OD和L-苏氨酸的浓度。结果示于表4。
文中术语“空间/时间”产量是指体积产率，即在发酵末期L-苏氨酸的浓度与发酵时间的商数。
表3：生长培养基M1-474的组分
 组分 浓度(/kg)
 蔗糖 27.7g
 酵母膏 1.68g
 NaCl 0.62g
 (NH4)2SO4 4.7g
 K2HPO4 1.9g
 MgSO4·7H2O 0.38g
 FeSO4·7H2O 18mg
 MnSO4·H2O 18mg
 氨苄青霉素 50mg
 Structol 0.1g
表4：实施例2结果
    轮次 时间(小时) L-苏氨酸(g/l) OD(660nm) 空间/时间产量(g/l/h)
    1 39.5 68.4 33.4 1.73
    2 36.25 69.8 35.7 1.93
    3 35.75 69.2 32.5 1.94
实施例3：借助于菌株DM1265，通过4次后续补料方法及在每种情况使用25％接种物制备L-苏氨酸
将菌株DM1265的一个菌落转接种于具有以下组分的基本培养基上：3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/lMgSO4·7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。将培养物在37℃温育大约5天。用一接种环接种具有以下组分的10ml预培养基，并在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上在37℃、180rpm温育16小时，所述预培养基的组分是2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l蔗糖，50mg/l氨苄青霉素。
将1ml的此第一种预培养物接种于1402g的营养培养基A1-144。在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中进行培养发酵。所述营养培养基A1-144含有的组分列于表1。将此第二种预培养物在37℃，0.71vvm(体积/体积/分钟)体积充气，10％空气饱和度的氧分压，和pH7.0条件下培养22.5小时，直至达到光密度(OD)(660nm)为16.3。
为接种得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中含有的1233g生长培养基M1-463，加入157.6g在营养培养基A1-144中的第二种预培养物。生长培养基M1-463中含有的组分示于表2。如对比例A所述将所述培养物在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在9.5小时后达到残留蔗糖浓度为大约3g/l。以此方式获得的肉汤随后在37℃，1l/分钟通气，pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下进一步培养32小时，直至OD(660nm)为35.8。在此期间，连续补加包含一种浓度为650g/l蔗糖溶液的450g生产培养基。在补加溶液已经消耗及第一轮的发酵肉汤中的残留蔗糖已经消耗之后，泵出发酵罐中75％的发酵肉汤。在41.5小时后结束第一次发酵(第一轮)，并达到滴定为67.1g/l的苏氨酸。
将余留的25％(453g)发酵肉汤用700g生长培养基M1-527加满，并再次开始发酵。生长培养基M1-527的组分示于表5。将此第二轮的培养物如对比例A所述在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至残留蔗糖浓度达到大约3g/l。然后将此培养物在37℃，1l/分钟通气，pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下进一步培养30小时，直至OD(660nm)达到36.2。在此期间，如第一轮一样连续补加包含一种浓度为650g/l蔗糖溶液的450g生产培养基。将发酵肉汤引流余留25％，并用M1-527将发酵罐加满，总共重复4次。
在每轮发酵末期，如对比例A所述确定OD和形成的L-苏氨酸浓度。
结果示于表6。术语“形成的总L-苏氨酸”是指在每一轮发酵期间有效形成或产生的L-苏氨酸。为计算形成的总L-苏氨酸，将通过接种物导入的L-苏氨酸的量从每轮末期发酵罐中存在的L-苏氨酸数量中减去。术语“产率”是指每轮发酵形成的总L-苏氨酸和每轮发酵时间的商数。
表5：生长培养基M1-527的组分
组分 浓度(/kg)
蔗糖 34.10g
酵母膏 2.31g
NaCl 0.76g
(NH4)2SO4 5.78g
K2HPO4 2.314g
MgSO4·7H2O 0.464g
MnSO4·H2O 22.7mg
FeSO4·7H2O 22.7mg
氨苄青霉素 60mg
Structol 120mg
表6：实施例3的结果
    轮次     时间(小时) L-苏氨酸(g/l) OD(660nm) 形成的总L-苏氨酸(g) 产率(g/h)
    1     41.5 67.1 35.8 120.7 2.91
    2     35.7 74.5 36.2 100.5 2.82
    3     34.5 80.0 31.4 108.0 3.13
    4     35.0 76.3 33.4 103.0 2.94
    5     41.5 73.0 31.7 98.6 2.37
对比例B：借助于大肠杆菌K-12菌株kat-13，通过常规发酵制备L-苏氨酸
生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株kat-13在US-A-5939307中阐述，并保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心(Peoria，美国伊利诺斯州)，保藏号NRRL B-21593。
菌株kat-13特别具有增强的“反馈”抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，弱化的苏氨酸脱氢酶，对疏螺旋体素的抗性及利用蔗糖作为碳源的能力。
将菌株kat-13的一个菌落转接种于具有以下组分的基本培养基上：3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/lMgSO4·7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂。将培养物在37℃温育大约5天。用一接种环接种具有以下组分的10ml预培养基，并在得自KuhnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上在37℃、180rpm温育16小时，所述预培养基的组分是2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/lKH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖。
将0.45ml的此第一种预培养物接种于1500g的营养培养基A1-158。在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中进行培养发酵。所述营养培养基A1-158含有的组分列于表7。将此第二种预培养物在1.16vvm(体积/体积/分钟)体积充气，20％空气饱和度的氧分压，和pH6.9条件下培养19.75小时，直至所有的葡萄糖被消耗。所述发酵在39℃开始，在18小时的发酵时间后，温度降至37℃。
为接种得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中含有的725g生长培养基M1-530，加入110g在营养培养基A1-158中的第二种预培养物。生长培养基M1-530中含有的组分示于表8。将所述培养物在37℃，1.3l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在8小时后最初导入的葡萄糖已经消耗。以此方式获得的肉汤随后在37℃，20％空气饱和度的氧分压，1.5l/分钟通气，及pH7.0条件下进一步培养57小时。在此期间，连续补加包含一种浓度为550g/l的葡萄糖·H2O溶液的1000g生产培养基。
如对比例A所述确定OD和形成的L-苏氨酸的浓度。
在65小时后，在最后的发酵样品中发现浓度为101.3g/l的L-苏氨酸。在此实验中，空间/时间产量因此为1.56g/l·h。
表7：营养培养基A1-158的组分
组分 浓度(/kg)
葡萄糖·H2O 88g
玉米浸液(50％) 20g
(NH4)2SO4 0.5g
K2HPO4 2.5g
柠檬酸 0.192g
MgSO4·7H2O 2g
FeSO4·7H2O 30mg
MnSO4·H2O 21mg
卡那霉素 50mg
Structol 0.3g
表8：生长培养基M1-530的组分
组分 浓度(/kg)
葡萄糖·H2O 88g
玉米浸液(50％) 20g
柠檬酸 0.192g
(NH4)2SO4 0.5g
K2HPO4 2.5g
MgSO4·7H2O 2.0g
MnSO4·H2O 21mg
FeSO4·7H2O 30mg
卡那霉素 50mg
Structol 0.3g
实施例4：借助于菌株kat-13，通过一次补料方法和使用10％接种物制备L-苏氨酸
将菌株kat-13的一个菌落转接种于具有以下组分的基本培养基上：3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/lMgSO4·7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂。将培养物在37℃温育大约5天。用一接种环接种具有以下组分的10ml预培养基，并在得自KuhnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上在37℃、180rpm温育16小时，所述预培养基的组分是2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖。
将0.45ml的此第一种预培养物接种于1500g的营养培养基A1-158。在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中进行培养发酵。所述营养培养基A1-158含有的组分列于表7。将此第二种预培养物在1.16vvm的体积充气，20％空气饱和度的氧分压，和pH6.9条件下培养19.75小时，直至所有的葡萄糖被消耗。发酵是在39℃开始的，在18小时发酵时间后，温度降至37℃。
为接种得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中含有的725g生长培养基M1-530，加入110g在营养培养基A1-158中的第二种预培养物。生长培养基M1-530中含有的组分示于表8。将所述培养物在37℃，1.3l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在8小时后最初导入的葡萄糖被消耗。以此方式获得的肉汤随后在37℃，20％空气饱和度的氧分压，1.5l/分钟通气，及pH7.0条件下进一步培养57小时，直至OD(660nm)为46.4。在此期间，连续补加包含一种浓度为550g/l的葡萄糖·H2O溶液的1000g生产培养基。在补加溶液已经消耗及第一轮的发酵肉汤中的残留糖已经消耗之后，泵出发酵罐中90％的发酵肉汤(1651g)。
将余留的10％(184g)发酵肉汤用650g生长培养基M1-531加满，并再次开始发酵。所述生长培养基M1-531的组分示于表9。将此培养物在37℃，1.5l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH7.0，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养。在此期间，连续补加包含一种浓度为550g/l的葡萄糖·H2O溶液的1000g生产培养基。
在每次发酵后，如对比例A所述确定OD和L-苏氨酸的浓度。
两轮结果示于表10。术语“形成的总L-苏氨酸”是指在每一轮发酵期间有效形成或产生的L-苏氨酸。为计算形成的总L-苏氨酸数量，将通过接种导入的L-苏氨酸数量从在每一轮末期发酵罐中存在的L-苏氨酸数量中减去。术语“产率”是指每次发酵形成的总L-苏氨酸与每轮发酵时间的商数。
表9：生长培养基M1-531的组分
组分 浓度(/kg)
玉米浸液(50％) 22.3g
柠檬酸 0.214g
(NH4)2SO4 0.56g
K2HPO4 2.79g
MgSO4·7H2O 2.23g
MnSO4·H2O 24mg
FeSO4·7H2O 34mg
卡那霉素 50mg
Structol 0.3g
表10：实施例4结果
    轮次 时间(小时) L-苏氨酸(g/l) OD(660nm) 形成的总L-苏氨酸(g) 产率g/l/h)
    1 65.0 101.3 46.4 159.5 2.45
    2 59.0 102.6 49.0 147.9 2.51
对比例C：借助于大肠杆菌K-12菌株B-3996，通过常规发酵制备L-苏氨酸
生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株B-3996在US-A-5175107中阐述，并保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM，俄罗斯莫斯科)。
菌株B-3996特别具有增强的“反馈”抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，弱化的苏氨酸脱氨酶，弱化的苏氨酸脱氢酶，对至少5g/lL-苏氨酸的抗性，及利用蔗糖作为碳源的能力。
将菌株B-3996的一个菌落转接种于具有以下组分的基本培养基上：3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/lMgSO4·7H2O，2g/l蔗糖，20g/l琼脂，20μg/ml链霉素。将培养物在37℃温育大约5天。用一种接种环接种具有以下组分的10ml预培养基，并在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上在37℃在180rpm温育16小时，所述预培养基的组分是2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，lg/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l蔗糖，20μg/ml链霉素。
将1ml的此第一种预培养物接种于1000g的营养培养基M1-160。在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中进行培养发酵。所述营养培养基M1-160含有的组分列于表11。将此第二种预培养物在37℃，1.00vvm(体积/体积/分钟)体积充气，10％空气饱和度的氧分压，和pH6.9条件下培养14小时，直至所有蔗糖均被消耗。
为接种得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD型)的一个2L搅拌反应发酵罐中含有的1000g生长培养基M1-546，加入100g在营养培养基M1-160中的第二种预培养物。生长培养基M1-546中含有的组分示于表12。将所述培养物在37℃，1.0l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH6.9，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至最初导入的蔗糖在7小时后均被消耗。以此方式获得的肉汤随后在37℃，20％空气饱和度的氧分压，1.0l/分钟通气，及pH6.9条件下进一步培养29小时。在此期间，补充包含一种浓度为600g/l的蔗糖溶液的生产培养基，由此蔗糖浓度始终在0.5g/l以上。
然后用得自Dr.Bruno Lange GmbH(德国柏林)的LP1W型数码光度计确定在波长660nm的光密度(OD)，并通过经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定苏氨酸浓度，所用氨基酸分析仪得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)。
在36小时发酵期间产生63.8gL-苏氨酸。在此实验中，产率为1.77g/h。
表11：营养培养基M1-160的组分
 组分 浓度(/kg)
 蔗糖 40g
 酵母膏 2g
 (NH4)2SO4 5g
 K2HPO4 2g
 MgSO4·7H2O 0.4g
 FeSO4·7H2O 20mg
 MnSO4·H2O 20mg
 链霉素 100mg
 Structol 0.2g
表12：生长培养基M1-546的组分
 组分 浓度(/kg)
 蔗糖 30g
 酵母膏 2g
 (NH4)2SO4 5g
 K2HPO4 2g
 MgSO4·7H2O 0.4g
 MnSO4·H2O 20mg
 FeSO4·7H2O 20mg
 NaCl 0.6g
 Structol 0.3g
实施例5：借助于菌株大肠杆菌K-12菌株B-3996，通过5次随后的补料方法及在每种情况使用10％接种物制备L-苏氨酸
为接种包含在得自B.Braun(BBI，德国，Melsungen，Biostat MD模型)的一个2L搅拌反应发酵罐中的1000g的生长培养基M1-546，加入100g在营养培养基A1-160中的第二种预培养物，如实施例7所述。生长培养基M1-546的组分示于表12。将此培养物在37℃，1.0l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH6.9，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在7小时后最初导入的所有蔗糖均被消耗。以此方式获得的肉汤随后在37℃，20％空气饱和度的氧分压，1.0l/分钟通气，及pH6.9条件下进一步培养29小时。在此期间，连续补加包含一种浓度为600g/l蔗糖溶液的411.8g生产培养基。
然后将此发酵肉汤引流余留总量的10％。将余留的10％发酵肉汤用生长培养基M1-546加满至起始重量为1100g，并再次开始发酵。生长培养基M1-546的组分示于表13。将此第3轮的培养物如实施例7所述在37℃，1l/分钟通气，800rpm的最小搅拌和pH6.9，及20％空气饱和度的氧分压条件下培养，直至在8小时后最初导入的所有蔗糖均被消耗。然后将此培养物在37℃，20％空气饱和度的氧分压，及pH6.9条件下进一步培养28小时。在此期间，补充包含一种浓度为600g/l蔗糖溶液的生产培养基，以便发酵罐中蔗糖浓度总在0.5g/l以上。在总共36小时后，结束发酵。将发酵肉汤引流余留10％，并用M1-546将发酵罐加满，重复共5次。
在每次发酵末期，OD和形成的L-苏氨酸浓度如对比例A所述确定。
结果示于表13。术语“形成的总L-苏氨酸”是指在每一轮发酵期间有效形成或产生的L-苏氨酸。为计算形成的总L-苏氨酸，将通过接种导入的L-苏氨酸的数量从每一轮末期发酵罐中存在的L-苏氨酸数量中减去。术语“产率”是指每轮发酵形成的总L-苏氨酸与每轮的发酵时间的商数。
表13：实施例5的结果
轮次   时间(小时) L-苏氨酸产量(g/g蔗糖) OD(660nm) 形成的总L-苏氨酸(g) 产率(g/h)
1   36 22.7 39.1 63.8 1.77
2   36 25.9 26.2 45.2 1.26
3   36 19.9 39.0 47.5 1.32
4   36 27.5 40.0 79.3 2.20
5   36 21.3 40.0 63.2 1.76
6   36 26.3 41.7 82.4 2.29

Claims (10)

1.一种发酵制备L-苏氨酸的方法，包括进行以下步骤：
a)通过补料方法培养肠细菌科的一种生产L-苏氨酸的微生物，随后
b)分离除去一部分发酵肉汤，在发酵罐中余留发酵肉汤总体积的1-90vol％，随后
c)将余留发酵肉汤用生长培养基加满，在1-10小时后，通过加入生产培养基进行进一步发酵，
d)将步骤b)和c)进行1-10次，及
e)从收集的肉汤中分离L-苏氨酸。
2.权利要求1的方法，其中在步骤b)中在发酵罐中余留发酵肉汤总体积的1-50vol％。
3.权利要求1的方法，其中在步骤b)中在发酵罐中余留发酵肉汤总体积的1-25vol％。
4.权利要求1的方法，其中将b)和c)步骤进行2-6次，并从收集的发酵肉汤中分离L-苏氨酸。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中使用属于大肠杆菌的菌株。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中使用的肠细菌科中生产和分泌L-苏氨酸的微生物具有增强的反馈抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、弱化的苏氨酸脱氨酶、对至少5g/l苏氨酸的抗性、及利用蔗糖作为碳源的能力。
7.权利要求1-4任一项的方法，其中使用具有选自以下特征的肠细菌科中生产和分泌L-苏氨酸的微生物，所述的特征为：具有增强的反馈抗性天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、弱化的苏氨酸脱氨酶、对疏螺旋体素抗性、及利用蔗糖作为碳源的能力。
8.权利要求1-4任一项的方法，其中使用具有选自以下的一或多个特征的肠细菌科中生产和分泌L-苏氨酸的微生物，所述特征为：具有对α-甲基丝氨酸的抗性、对二氨基琥珀酸的抗性、对氟丙酮酸的敏感性、对L-谷氨酸的抗性、对至少7％L-苏氨酸的抗性、需要L-甲硫氨酸及需要L-异亮氨酸。
9.权利要求1-4任一项的方法，其中使用如下的肠细菌科中生产和分泌L-苏氨酸的微生物，其具有选自以下菌株的一或多种特征：DSM12790、B-3996、和kat13。
10.权利要求1-4任一项的方法，其中使用选自DSM12790、B-3996、kat13的一或多种菌株。
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