JP2002238591A - Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
Ｌ−グルタミン酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物の生育を阻害する有機酸を含有する材
料を糖源として用いた場合にも、効率的にＬ−グルタミ
ン酸を製造できる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製
造法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有す
る微生物を、ｐＨが５．０以下である培地であって、こ
のｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が
微生物の生育を阻害しない量である培地中で培養するこ
とにより、Ｌ−グルタミン酸を製造する。
料を糖源として用いた場合にも、効率的にＬ−グルタミ
ン酸を製造できる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製
造法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有す
る微生物を、ｐＨが５．０以下である培地であって、こ
のｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が
微生物の生育を阻害しない量である培地中で培養するこ
とにより、Ｌ−グルタミン酸を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調
味料原料等として広く用いられている。
グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調
味料原料等として広く用いられている。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバ
クテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリ
ウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産
菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造され
ている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２
１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法に
よるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、
ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用い
る方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュード
モナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンデ
ィダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６
３，８５７号）、バチルス属、シュードモナス属、セラ
チア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバ
クター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（特公
昭３２−９３９３号）、エシェリヒア・コリの変異株を
用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られて
いる。また、本発明者らは、クレブシエラ属、エルビニ
ア属又はパントテア属に属する微生物を用いたＬ−グル
タミン酸の製造法を提案している（特開２０００−１０
６８６９号）。
クテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリ
ウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産
菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造され
ている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２
１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法に
よるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、
ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用い
る方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュード
モナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンデ
ィダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６
３，８５７号）、バチルス属、シュードモナス属、セラ
チア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバ
クター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（特公
昭３２−９３９３号）、エシェリヒア・コリの変異株を
用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られて
いる。また、本発明者らは、クレブシエラ属、エルビニ
ア属又はパントテア属に属する微生物を用いたＬ−グル
タミン酸の製造法を提案している（特開２０００−１０
６８６９号）。
【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタ
ミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ
−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示
されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又
はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シ
ンターゼをコードする遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン
酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている
（特公平７−１２１２２８号）。また、特開昭６１−２
６８１８５号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来
のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さらに、特開
昭６３−２１４１８９号公報には、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シ
ンターゼ遺伝子を増幅することによって、Ｌ−グルタミ
ン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
ミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ
−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示
されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又
はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シ
ンターゼをコードする遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン
酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている
（特公平７−１２１２２８号）。また、特開昭６１−２
６８１８５号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来
のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さらに、特開
昭６３−２１４１８９号公報には、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シ
ンターゼ遺伝子を増幅することによって、Ｌ−グルタミ
ン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００４】上記のような微生物の育種や製造法の改良
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まっては
いるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さ
らに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発
が求められている。
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まっては
いるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さ
らに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発
が求められている。
【０００５】一方、培養液中に蓄積するＬ−アミノ酸を
晶析せしめながら発酵を行う方法が知られている（特開
昭６２−２８８号）。この方法は、培養液中に蓄積する
Ｌ−アミノ酸を析出させることにより、培養液中のＬ−
アミノ酸の濃度を一定量以下に維持するというものであ
る。具体的には、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン又
はＬ−ロイシンは、培養の温度及びｐＨの調整、又は界
面活性剤の培地への添加によって、発酵中に析出する。
晶析せしめながら発酵を行う方法が知られている（特開
昭６２−２８８号）。この方法は、培養液中に蓄積する
Ｌ−アミノ酸を析出させることにより、培養液中のＬ−
アミノ酸の濃度を一定量以下に維持するというものであ
る。具体的には、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン又
はＬ−ロイシンは、培養の温度及びｐＨの調整、又は界
面活性剤の培地への添加によって、発酵中に析出する。
【０００６】上記のように、Ｌ−アミノ酸を析出せしめ
ながら発酵を行う方法が知られているが、同方法に好適
なアミノ酸は、比較的水溶性の低いアミノ酸であって、
Ｌ−グルタミン酸のように水溶性の高いアミノ酸に適用
した例は知られていない。また、Ｌ−グルタミン酸を析
出させるためには培地を低ｐＨにする必要があるが、前
記のようなＬ−グルタミン酸生産菌は酸性条件下では生
育できず、Ｌ−グルタミン酸発酵は中性で行われており
（米国特許第3,220,929号、第3,032,474号、K.C. Chao
& J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, 715-725 (195
9)）、析出を伴うＬ−グルタミン酸の発酵生産は知られ
ていない。さらに、ほとんどの好酸菌の生育が酢酸、乳
酸、コハク酸等の有機酸により阻害されることが知られ
ている（大島泰郎監修「極限環境微生物ハンドブック」
第２３１頁、SCIENCE FORUM；R.M. Borichewski, J. Ba
cteriol., 93, 597-599 1967)等）。したがって、同じ
く有機酸であるＬ−グルタミン酸に対して多くの微生物
が酸性条件下で感受性であると考えられ、酸性条件下で
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物の検索自体、試
みられたという報告はない。
ながら発酵を行う方法が知られているが、同方法に好適
なアミノ酸は、比較的水溶性の低いアミノ酸であって、
Ｌ−グルタミン酸のように水溶性の高いアミノ酸に適用
した例は知られていない。また、Ｌ−グルタミン酸を析
出させるためには培地を低ｐＨにする必要があるが、前
記のようなＬ−グルタミン酸生産菌は酸性条件下では生
育できず、Ｌ−グルタミン酸発酵は中性で行われており
（米国特許第3,220,929号、第3,032,474号、K.C. Chao
& J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, 715-725 (195
9)）、析出を伴うＬ−グルタミン酸の発酵生産は知られ
ていない。さらに、ほとんどの好酸菌の生育が酢酸、乳
酸、コハク酸等の有機酸により阻害されることが知られ
ている（大島泰郎監修「極限環境微生物ハンドブック」
第２３１頁、SCIENCE FORUM；R.M. Borichewski, J. Ba
cteriol., 93, 597-599 1967)等）。したがって、同じ
く有機酸であるＬ−グルタミン酸に対して多くの微生物
が酸性条件下で感受性であると考えられ、酸性条件下で
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物の検索自体、試
みられたという報告はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、低ｐＨで微
生物の生育を阻害する有機酸を含有する材料を糖源とし
て用いた場合にも、効率的にＬ−グルタミン酸を製造で
きる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供す
ることを課題とするものである。
生物の生育を阻害する有機酸を含有する材料を糖源とし
て用いた場合にも、効率的にＬ−グルタミン酸を製造で
きる、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供す
ることを課題とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−グル
タミン酸生産菌が中性ｐＨでは、低ｐＨでＬ−グルタミ
ン酸生産菌の生育を阻害する有機酸を消費すること、及
び、この性質を利用することで、低ｐＨで微生物の生育
を阻害する有機酸を含有する材料を糖源として用いて効
率的にＬ−グルタミン酸を製造することを見出し、本発
明を完成するに至った。
タミン酸生産菌が中性ｐＨでは、低ｐＨでＬ−グルタミ
ン酸生産菌の生育を阻害する有機酸を消費すること、及
び、この性質を利用することで、低ｐＨで微生物の生育
を阻害する有機酸を含有する材料を糖源として用いて効
率的にＬ−グルタミン酸を製造することを見出し、本発
明を完成するに至った。
【０００９】本発明は、以下のものを提供する。 （１）Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物
を、ｐＨが５．０以下である培地であって、このｐＨで
微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が微生物の
生育を阻害しない量である培地中で培養することを含
む、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。 （２）培地中での培養により、培地中にＬ−グルタミン
酸が析出しながら生成蓄積する（１）記載の製造法。 （３）有機酸の合計含有量が０．４ｇ／Ｌ以下である
（１）又は（２）記載の製造法。 （４）有機酸が炭素数１〜３の有機酸である（１）〜
（３）のいずれかに記載の製造法。 （５）微生物がエンテロバクター属に属する（１）〜
（４）のいずれかに記載の製造法。 （６）微生物がエンテロバクター・アグロメランスであ
る（５）記載の製造法。 （７）微生物が、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グ
ルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝
することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グ
ルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を
蓄積する能力を有する微生物である（１）〜（６）のい
ずれかに記載の製造法。 （８）前記特定のｐＨが５．０又はそれ以下である
（７）に記載の製造法。 （９）Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物
を、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害が生じな
い第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタ
ミン酸の生産に適した、第１のｐＨより低い第２のｐＨ
で培養することを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸
の製造法。 （１０）有機酸が炭素数１〜３の有機酸である（９）記
載の製造法。 （１１）第２のｐＨが３．０〜５．０である（９）又は
（１０）記載の製造法。 （１２）第１のｐＨでの培養を、アルカリ化物質を培地
に添加することにより培地のｐＨを第１のｐＨに維持し
ながら行う（９）〜（１１）のいずれかに記載の製造
法。 （１３）第１のｐＨでの培養後、アルカリ化物質の添加
量を調整することにより、培地のｐＨを低下させること
を含む（１２）記載の製造法。 （１４）第１のｐＨでの培養が、培地中の有機酸が枯渇
するまで継続される（９）〜（１３）のいずれかに記載
の製造法。 （１５）微生物がエンテロバクター属に属する（９）〜
（１４）のいずれかに記載の製造法。 （１６）微生物がエンテロバクター・アグロメランスで
ある（１５）記載の製造法。 （１７）微生物が、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−
グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代
謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−
グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸
を蓄積する能力を有する微生物である（９）〜（１６）
のいずれかに記載の製造法。 （１８）前記特定のｐＨが５．０又はそれ以下である
（１７）に記載の製造法。 （１９）Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨが、前記
微生物が生産したＬ−グルタミン酸が培地中に析出する
ｐＨであり、このｐＨでの培養により培地中にＬ−グル
タミン酸が析出しながら生成蓄積する（１７）又は（１
８）に記載の製造法。
を、ｐＨが５．０以下である培地であって、このｐＨで
微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が微生物の
生育を阻害しない量である培地中で培養することを含
む、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。 （２）培地中での培養により、培地中にＬ−グルタミン
酸が析出しながら生成蓄積する（１）記載の製造法。 （３）有機酸の合計含有量が０．４ｇ／Ｌ以下である
（１）又は（２）記載の製造法。 （４）有機酸が炭素数１〜３の有機酸である（１）〜
（３）のいずれかに記載の製造法。 （５）微生物がエンテロバクター属に属する（１）〜
（４）のいずれかに記載の製造法。 （６）微生物がエンテロバクター・アグロメランスであ
る（５）記載の製造法。 （７）微生物が、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グ
ルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝
することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グ
ルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を
蓄積する能力を有する微生物である（１）〜（６）のい
ずれかに記載の製造法。 （８）前記特定のｐＨが５．０又はそれ以下である
（７）に記載の製造法。 （９）Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有する微生物
を、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害が生じな
い第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ−グルタ
ミン酸の生産に適した、第１のｐＨより低い第２のｐＨ
で培養することを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸
の製造法。 （１０）有機酸が炭素数１〜３の有機酸である（９）記
載の製造法。 （１１）第２のｐＨが３．０〜５．０である（９）又は
（１０）記載の製造法。 （１２）第１のｐＨでの培養を、アルカリ化物質を培地
に添加することにより培地のｐＨを第１のｐＨに維持し
ながら行う（９）〜（１１）のいずれかに記載の製造
法。 （１３）第１のｐＨでの培養後、アルカリ化物質の添加
量を調整することにより、培地のｐＨを低下させること
を含む（１２）記載の製造法。 （１４）第１のｐＨでの培養が、培地中の有機酸が枯渇
するまで継続される（９）〜（１３）のいずれかに記載
の製造法。 （１５）微生物がエンテロバクター属に属する（９）〜
（１４）のいずれかに記載の製造法。 （１６）微生物がエンテロバクター・アグロメランスで
ある（１５）記載の製造法。 （１７）微生物が、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−
グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代
謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−
グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸
を蓄積する能力を有する微生物である（９）〜（１６）
のいずれかに記載の製造法。 （１８）前記特定のｐＨが５．０又はそれ以下である
（１７）に記載の製造法。 （１９）Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨが、前記
微生物が生産したＬ−グルタミン酸が培地中に析出する
ｐＨであり、このｐＨでの培養により培地中にＬ−グル
タミン酸が析出しながら生成蓄積する（１７）又は（１
８）に記載の製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】第１の態様の本発明の製造法（以下、「第
１の本発明製造法」ともいう）は、Ｌ−グルタミン酸を
生産する能力を有する微生物（以下、「Ｌ−グルタミン
酸生産菌」ともいう）を、ｐＨが５．０以下である培地
であって、このｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸の
合計含有量が微生物の生育を阻害しない量である培地中
で培養することを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸
の製造法である。
１の本発明製造法」ともいう）は、Ｌ−グルタミン酸を
生産する能力を有する微生物（以下、「Ｌ−グルタミン
酸生産菌」ともいう）を、ｐＨが５．０以下である培地
であって、このｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸の
合計含有量が微生物の生育を阻害しない量である培地中
で培養することを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸
の製造法である。
【００１２】第１の本発明製造法では、培地中での培養
により、培地中にＬ−グルタミン酸が析出しながら生成
蓄積することが好ましい。これは、培地のｐＨを、生産
されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨにすることによ
って達成できる。このようなｐＨは、通常には、３．０
〜５．０である。発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造
においては、培地中に蓄積された高濃度のＬ−グルタミ
ン酸による生産性の阻害が、生産性向上の障害の一つと
なっていると考えられる。例えば、微生物細胞はＬ−グ
ルタミン酸の排出系と取り込み系を有しているが、一旦
培地中に排出されたＬ−グルタミン酸が再び細胞内に取
り込まれると、生産効率が低下するばかりでなく、Ｌ−
グルタミン酸の生合成反応が阻害される結果にもなる。
生産されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨで培養する
ことにより、このようなＬ−グルタミン酸の高濃度蓄積
による生産性の阻害を回避できる。
により、培地中にＬ−グルタミン酸が析出しながら生成
蓄積することが好ましい。これは、培地のｐＨを、生産
されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨにすることによ
って達成できる。このようなｐＨは、通常には、３．０
〜５．０である。発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造
においては、培地中に蓄積された高濃度のＬ−グルタミ
ン酸による生産性の阻害が、生産性向上の障害の一つと
なっていると考えられる。例えば、微生物細胞はＬ−グ
ルタミン酸の排出系と取り込み系を有しているが、一旦
培地中に排出されたＬ−グルタミン酸が再び細胞内に取
り込まれると、生産効率が低下するばかりでなく、Ｌ−
グルタミン酸の生合成反応が阻害される結果にもなる。
生産されたＬ−グルタミン酸が析出するｐＨで培養する
ことにより、このようなＬ−グルタミン酸の高濃度蓄積
による生産性の阻害を回避できる。
【００１３】培地のｐＨは、好ましくは４．５以下、よ
り好ましくは４．０以下である。
り好ましくは４．０以下である。
【００１４】この態様において、培地のｐＨで微生物の
生育を阻害する有機酸は、そのｐＨの培地中に或る程度
の濃度（通常には0.5g/L以上）で存在するときに微生物
の生育の阻害を示す有機酸を意味し、通常には、炭素数
１〜３の有機酸、すなわち、蟻酸、酢酸及びプロピオン
酸である。
生育を阻害する有機酸は、そのｐＨの培地中に或る程度
の濃度（通常には0.5g/L以上）で存在するときに微生物
の生育の阻害を示す有機酸を意味し、通常には、炭素数
１〜３の有機酸、すなわち、蟻酸、酢酸及びプロピオン
酸である。
【００１５】有機酸の合計含有量は、好ましくは０．４
ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ以下、さらに
好ましくは０．２ｇ／Ｌ以下である。
ｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ以下、さらに
好ましくは０．２ｇ／Ｌ以下である。
【００１６】第２の態様の本発明の製造法（以下、「第
２の本発明製造法」ともいう）は、Ｌ−グルタミン酸を
生産する能力を有する微生物を、培地中の有機酸による
微生物の生育の阻害が生じない第１のｐＨで培養し、次
いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第
１のｐＨより低い第２のｐＨで培養することを含む、発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法である。
２の本発明製造法」ともいう）は、Ｌ−グルタミン酸を
生産する能力を有する微生物を、培地中の有機酸による
微生物の生育の阻害が生じない第１のｐＨで培養し、次
いで微生物によるＬ−グルタミン酸の生産に適した、第
１のｐＨより低い第２のｐＨで培養することを含む、発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法である。
【００１７】Ｌ−グルタミン酸生産菌は、一般に、酸性
条件下で有機酸による生育の阻害を受ける一方、中性条
件下では有機酸を消費できることが判明した。この性質
を利用して中性ｐＨで菌体生育を行い、その後ｐＨを酸
性に変化させてＬ−グルタミン酸を生成させることによ
り、より高い生産性を得るとともに、広範な材料を糖源
として使用することが可能となる。
条件下で有機酸による生育の阻害を受ける一方、中性条
件下では有機酸を消費できることが判明した。この性質
を利用して中性ｐＨで菌体生育を行い、その後ｐＨを酸
性に変化させてＬ−グルタミン酸を生成させることによ
り、より高い生産性を得るとともに、広範な材料を糖源
として使用することが可能となる。
【００１８】この態様において、有機酸は、第２のｐＨ
の培地中に或る程度の濃度（通常には0.5g/L以上）で存
在するときに微生物の生育の阻害を示す有機酸を意味
し、通常には、炭素数１〜３の有機酸、すなわち、蟻
酸、酢酸及びプロピオン酸である。
の培地中に或る程度の濃度（通常には0.5g/L以上）で存
在するときに微生物の生育の阻害を示す有機酸を意味
し、通常には、炭素数１〜３の有機酸、すなわち、蟻
酸、酢酸及びプロピオン酸である。
【００１９】第１のｐＨ及び第２のｐＨは、使用される
Ｌ−グルタミン酸生産菌の性質に適合するように選択さ
れる。これらのｐＨは、当業者であれば容易に測定でき
る。例えば、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害
が生じないｐＨは、種々のｐＨに調整した有機酸含有培
地でＬ−グルタミン酸生産菌を培養し、吸光度などによ
り菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含有しな
いこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタミン酸
生産菌の菌体量と比較することにより決定できる。Ｌ−
グルタミン酸の生産に適したｐＨは、種々のｐＨの培地
でＬ−グルタミン酸生産菌を培養し、培地中にＬ−グル
タミン酸が蓄積されるときのｐＨをいう。具体的には、
当該種々のｐＨの培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸
量を測定して比較することにより決定できる。
Ｌ−グルタミン酸生産菌の性質に適合するように選択さ
れる。これらのｐＨは、当業者であれば容易に測定でき
る。例えば、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害
が生じないｐＨは、種々のｐＨに調整した有機酸含有培
地でＬ−グルタミン酸生産菌を培養し、吸光度などによ
り菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含有しな
いこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタミン酸
生産菌の菌体量と比較することにより決定できる。Ｌ−
グルタミン酸の生産に適したｐＨは、種々のｐＨの培地
でＬ−グルタミン酸生産菌を培養し、培地中にＬ−グル
タミン酸が蓄積されるときのｐＨをいう。具体的には、
当該種々のｐＨの培地中に蓄積されたＬ−グルタミン酸
量を測定して比較することにより決定できる。
【００２０】第１のｐＨは、培地中の有機酸による微生
物の成育の阻害が生じなければ特に制限はなく、通常に
は５．０〜８．０である。
物の成育の阻害が生じなければ特に制限はなく、通常に
は５．０〜８．０である。
【００２１】第２のｐＨは、生産されたＬ−グルタミン
酸が析出するｐＨであることが好ましく、このようなｐ
Ｈは、通常には、３．０〜５．０である。第１の本発明
製造法に関して説明したように、生産されたＬ−グルタ
ミン酸が析出するｐＨで培養することにより、Ｌ−グル
タミン酸の高濃度蓄積による生産性の阻害を回避でき
る。
酸が析出するｐＨであることが好ましく、このようなｐ
Ｈは、通常には、３．０〜５．０である。第１の本発明
製造法に関して説明したように、生産されたＬ−グルタ
ミン酸が析出するｐＨで培養することにより、Ｌ−グル
タミン酸の高濃度蓄積による生産性の阻害を回避でき
る。
【００２２】第１のｐＨ及び第２のｐＨは、本発明の効
果が得られる限り、培養中において厳密に一定の値を示
す必要はなく、変動しても差し支えない。
果が得られる限り、培養中において厳密に一定の値を示
す必要はなく、変動しても差し支えない。
【００２３】第１のｐＨでの培養は、このｐＨであって
も、Ｌ−グルタミン酸生産菌がＬ−グルタミン酸を生産
するので、生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低
下が生じるため、アルカリ化物質を培地に添加すること
により培地のｐＨを第１のｐＨに維持しながら行うこと
が好ましい。
も、Ｌ−グルタミン酸生産菌がＬ−グルタミン酸を生産
するので、生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低
下が生じるため、アルカリ化物質を培地に添加すること
により培地のｐＨを第１のｐＨに維持しながら行うこと
が好ましい。
【００２４】アルカリ化物質は、Ｌ−グルタミン酸生産
菌の生育やＬ−グルタミン酸生産に悪影響を与えないも
のであれば特に限定されないが、アンモニアガスが好ま
しい。
菌の生育やＬ−グルタミン酸生産に悪影響を与えないも
のであれば特に限定されないが、アンモニアガスが好ま
しい。
【００２５】第１のｐＨから第２のｐＨへの、培地のｐ
Ｈの低下は、酸性物質を培地に添加することにより行っ
てもよいが、上述のように、Ｌ−グルタミン酸生産菌に
より生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低下が培
養中に生じるので、第１のｐＨから第２のｐＨへの、培
地のｐＨの低下は、アルカリ化物質の添加量を調整する
ことにより行うことが、酸性物質の添加を省略できるの
で好ましい。
Ｈの低下は、酸性物質を培地に添加することにより行っ
てもよいが、上述のように、Ｌ−グルタミン酸生産菌に
より生産されるＬ−グルタミン酸によるｐＨの低下が培
養中に生じるので、第１のｐＨから第２のｐＨへの、培
地のｐＨの低下は、アルカリ化物質の添加量を調整する
ことにより行うことが、酸性物質の添加を省略できるの
で好ましい。
【００２６】第１のｐＨでの培養は、培地中の有機酸が
枯渇するまで継続すればよい。枯渇とは、有機酸の量が
第２のｐＨにおける培養において、Ｌ−グルタミン酸生
産菌の生育を阻害しないレベルに低下することをいう。
このような有機酸のレベルを測定することは当業者にと
って容易である。例えば、第２のｐＨにおいて種々の濃
度の有機酸を含む培地で培養を行い、Ｌ−グルタミン酸
生産菌の菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含
有しないこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタ
ミン酸生産菌の菌体量と比較することにより決定でき
る。一般に、第２のｐＨが低くなればなるほど、有機酸
のレベルも低くなる。
枯渇するまで継続すればよい。枯渇とは、有機酸の量が
第２のｐＨにおける培養において、Ｌ−グルタミン酸生
産菌の生育を阻害しないレベルに低下することをいう。
このような有機酸のレベルを測定することは当業者にと
って容易である。例えば、第２のｐＨにおいて種々の濃
度の有機酸を含む培地で培養を行い、Ｌ−グルタミン酸
生産菌の菌体量を測定して、その菌体量を、有機酸を含
有しないこと以外は同一の条件で培養されたＬ−グルタ
ミン酸生産菌の菌体量と比較することにより決定でき
る。一般に、第２のｐＨが低くなればなるほど、有機酸
のレベルも低くなる。
【００２７】第１の本発明製造法及び第２の本発明製造
法で使用するＬ−グルタミン酸生産菌とは、それを培地
に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−グルタミン
酸を蓄積する微生物である。例としては、エンテロバク
ター属に属する微生物が挙げられる。好ましいものは、
エンテロバクター・アグロメランスである。
法で使用するＬ−グルタミン酸生産菌とは、それを培地
に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−グルタミン
酸を蓄積する微生物である。例としては、エンテロバク
ター属に属する微生物が挙げられる。好ましいものは、
エンテロバクター・アグロメランスである。
【００２８】また、第１及び第２の本発明製造法で使用
するＬ−グルタミン酸生産菌としては、特定のｐＨにお
いて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体
培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨ
の液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量
のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物（以
下、「Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物」ともいう）である
ことが好ましい。前記特定のｐＨは、培地中にＬ−グル
タミン酸が析出するｐＨであることが好ましく、このよ
うなｐＨは通常には５．０又はそれ以下である。
するＬ−グルタミン酸生産菌としては、特定のｐＨにお
いて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体
培地で同炭素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨ
の液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量
のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物（以
下、「Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物」ともいう）である
ことが好ましい。前記特定のｐＨは、培地中にＬ−グル
タミン酸が析出するｐＨであることが好ましく、このよ
うなｐＨは通常には５．０又はそれ以下である。
【００２９】「飽和濃度」とは、液体培地がＬ−グルタ
ミン酸で飽和しているときの液体培地に溶解しているＬ
−グルタミン酸の濃度をいう。
ミン酸で飽和しているときの液体培地に溶解しているＬ
−グルタミン酸の濃度をいう。
【００３０】Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を使用する場
合には、Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨが、Ｌ−
グルタミン酸が培地中に析出するｐＨであることが好ま
しい。このｐＨでの培養により培地中にＬ−グルタミン
酸が析出しながら生成蓄積する。
合には、Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨが、Ｌ−
グルタミン酸が培地中に析出するｐＨであることが好ま
しい。このｐＨでの培養により培地中にＬ−グルタミン
酸が析出しながら生成蓄積する。
【００３１】Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、以下のよ
うにして取得することができる。微生物を含む試料を、
特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭
素源を含む液体培地に接種し、炭素源を代謝する菌株を
選抜する。特定のｐＨとは、特に制限されないが、通
常、約５．０以下、好ましくは約４．５以下、さらに好
ましくは約４．３以下である。Ｌ−グルタミン酸蓄積微
生物はＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵生産する
のに用いられるものであるが、前記ｐＨが高すぎると、
析出させるのに十分なＬ−グルタミン酸を微生物に生産
させることが困難になる。したがってｐＨは前記の範囲
が好ましい。
うにして取得することができる。微生物を含む試料を、
特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭
素源を含む液体培地に接種し、炭素源を代謝する菌株を
選抜する。特定のｐＨとは、特に制限されないが、通
常、約５．０以下、好ましくは約４．５以下、さらに好
ましくは約４．３以下である。Ｌ−グルタミン酸蓄積微
生物はＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵生産する
のに用いられるものであるが、前記ｐＨが高すぎると、
析出させるのに十分なＬ−グルタミン酸を微生物に生産
させることが困難になる。したがってｐＨは前記の範囲
が好ましい。
【００３２】Ｌ−グルタミン酸を含む水溶液のｐＨを低
下させると、Ｌ−グルタミン酸はγ−カルボキシル基の
ｐＫａ（４．２５、２５℃）付近で溶解度は著しく減少
し、等電点（ｐＨ３．２）で溶解度は最も低くなり、飽
和濃度を越えるＬ−グルタミン酸は析出する。培地組成
によっても異なるが、通常には、Ｌ−グルタミン酸は約
３０℃においては、ｐＨ３．２では１０〜２０ｇ／Ｌ、
ｐＨ４．０では３０〜４０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．７では５０
〜６０ｇ／Ｌ溶解する。尚、ｐＨが一定の値を下回ると
Ｌ−グルタミン酸を析出させる効果は頭打ちになるの
で、通常３．０以下にする必要はない。しかし、ｐＨが
３．０以下であっても差し支えない。
下させると、Ｌ−グルタミン酸はγ−カルボキシル基の
ｐＫａ（４．２５、２５℃）付近で溶解度は著しく減少
し、等電点（ｐＨ３．２）で溶解度は最も低くなり、飽
和濃度を越えるＬ−グルタミン酸は析出する。培地組成
によっても異なるが、通常には、Ｌ−グルタミン酸は約
３０℃においては、ｐＨ３．２では１０〜２０ｇ／Ｌ、
ｐＨ４．０では３０〜４０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．７では５０
〜６０ｇ／Ｌ溶解する。尚、ｐＨが一定の値を下回ると
Ｌ−グルタミン酸を析出させる効果は頭打ちになるの
で、通常３．０以下にする必要はない。しかし、ｐＨが
３．０以下であっても差し支えない。
【００３３】「炭素源を代謝できる」とは、増殖できる
か、あるいは増殖しなくても炭素源を消費することがで
きることをいい、すなわち、糖類、有機酸類等の炭素源
を異化することをいう。具体的には、例えば、飽和濃度
のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好まし
くはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３
〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体培地中で、
適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２
〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で
炭素源を代謝できる微生物である。さらに、例えば、飽
和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、
好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ
４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体合成
培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０
℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地
中の炭素源を消費する微生物は、同培地中で炭素源を代
謝できる微生物である。炭素源を代謝できる微生物は、
上記液体培地で生育できる微生物を包含する。
か、あるいは増殖しなくても炭素源を消費することがで
きることをいい、すなわち、糖類、有機酸類等の炭素源
を異化することをいう。具体的には、例えば、飽和濃度
のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好まし
くはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３
〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体培地中で、
適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２
〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で
炭素源を代謝できる微生物である。さらに、例えば、飽
和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、
好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ
４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体合成
培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０
℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地
中の炭素源を消費する微生物は、同培地中で炭素源を代
謝できる微生物である。炭素源を代謝できる微生物は、
上記液体培地で生育できる微生物を包含する。
【００３４】「生育できる」とは、増殖できるか、ある
いは増殖しなくてもＬ−グルタミン酸を生産することが
できることをいう。具体的には、例えば、飽和濃度のＬ
−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくは
ｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜
４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体培地中で、適
当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜
４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で生
育できる微生物である。さらに、例えば、飽和濃度のＬ
−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくは
ｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜
４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体合成培地中
で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃に
て、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地中の
Ｌ−グルタミン酸の量を増加させる微生物は、同培地中
で生育できる微生物である。
いは増殖しなくてもＬ−グルタミン酸を生産することが
できることをいう。具体的には、例えば、飽和濃度のＬ
−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくは
ｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜
４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体培地中で、適
当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２〜
４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で生
育できる微生物である。さらに、例えば、飽和濃度のＬ
−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好ましくは
ｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜
４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体合成培地中
で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃に
て、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地中の
Ｌ−グルタミン酸の量を増加させる微生物は、同培地中
で生育できる微生物である。
【００３５】上記の選抜は、同じ条件で、又はｐＨもし
くはＬ−グルタミン酸の濃度を変えて２回又は３回以上
繰り返してもよい。また、初期の選抜は、飽和濃度より
低い濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行い、後の選
抜を飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行っても
よい。さらに、増殖速度に優れる菌株等、好ましい特性
を有する菌株を選抜する操作を行ってもよい。
くはＬ−グルタミン酸の濃度を変えて２回又は３回以上
繰り返してもよい。また、初期の選抜は、飽和濃度より
低い濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行い、後の選
抜を飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行っても
よい。さらに、増殖速度に優れる菌株等、好ましい特性
を有する菌株を選抜する操作を行ってもよい。
【００３６】Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、上記性質
に加えて、液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を
越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微
生物である。前記液体培地のｐＨは、前記の性質を有す
る微生物のスクリーニングに用いた培地のｐＨと同じ
か、又はそれに近いｐＨであることが好ましい。通常、
微生物はｐＨが低くなると高濃度のＬ−グルタミン酸に
対して感受性となるため、Ｌ−グルタミン酸に対する耐
性という観点からはｐＨは低くない方が好ましいが、Ｌ
−グルタミン酸を析出させながら生産させるという観点
からは、ｐＨは低い方が好ましい。これらの条件を満足
するｐＨ条件としては、３〜５、好ましくは４〜５、よ
り好ましくは４．０〜４．７、さらに好ましくは４．０
〜４．５、特に好ましくは４．０〜４．３が挙げられ
る。
に加えて、液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を
越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微
生物である。前記液体培地のｐＨは、前記の性質を有す
る微生物のスクリーニングに用いた培地のｐＨと同じ
か、又はそれに近いｐＨであることが好ましい。通常、
微生物はｐＨが低くなると高濃度のＬ−グルタミン酸に
対して感受性となるため、Ｌ−グルタミン酸に対する耐
性という観点からはｐＨは低くない方が好ましいが、Ｌ
−グルタミン酸を析出させながら生産させるという観点
からは、ｐＨは低い方が好ましい。これらの条件を満足
するｐＨ条件としては、３〜５、好ましくは４〜５、よ
り好ましくは４．０〜４．７、さらに好ましくは４．０
〜４．５、特に好ましくは４．０〜４．３が挙げられ
る。
【００３７】Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物又はその育種
の材料としては、例えば、エンテロバクター（Enteroba
cter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア
（Serratia）属、パントテア（Pantoea）属、エルビニ
ア（Erwinia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、コ
リネバクテリウム（Corynebacterium）属、アリサイク
ロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacill
us）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属
する微生物が挙げられる。これらの中ではエンテロバク
ター属に属する微生物が好ましい。以下、Ｌ−グルタミ
ン酸蓄積微生物について、エンテロバクター属に属する
微生物を中心に説明するが、エンテロバクター属に限ら
れず他の属に属する微生物も同様に使用できる。
の材料としては、例えば、エンテロバクター（Enteroba
cter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア
（Serratia）属、パントテア（Pantoea）属、エルビニ
ア（Erwinia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、コ
リネバクテリウム（Corynebacterium）属、アリサイク
ロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacill
us）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属
する微生物が挙げられる。これらの中ではエンテロバク
ター属に属する微生物が好ましい。以下、Ｌ−グルタミ
ン酸蓄積微生物について、エンテロバクター属に属する
微生物を中心に説明するが、エンテロバクター属に限ら
れず他の属に属する微生物も同様に使用できる。
【００３８】エンテロバクター属に属する微生物として
具体的には、エンテロバクター・アグロメランス（Ente
robacter agglomerans）が、好ましくはエンテロバクタ
ー・アグロメランスＡＪ１３３５５株が挙げられる。同
株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミ
ン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離さ
れた株である。
具体的には、エンテロバクター・アグロメランス（Ente
robacter agglomerans）が、好ましくはエンテロバクタ
ー・アグロメランスＡＪ１３３５５株が挙げられる。同
株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミ
ン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離さ
れた株である。
【００３９】ＡＪ１３３５５の生理的性質を記す。 （１）グラム染色性：陰性 （２）酸素に対する挙動：通性嫌気性 （３）カタラーゼ：ポジティブ （４）オキシダーゼ：ネガティブ （５）硝酸還元能：ネガティブ （６）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ （７）メチルレッド試験：ネガティブ （８）ウレアーゼ：ネガティブ （９）インドール生成：ポジティブ （１０）運動性：有り （１１）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：微弱な活性あり （１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ （１３）糖資化性： アラビノース：ポジティブ シュークロース：ポジティブ ラクトース：ポジティブ キシロース：ポジティブ ソルビトール：ポジティブ イノシトール：ポジティブ トレハロース：ポジティブ マルトース：ポジティブ グルコース：ポジティブ アドニトール：ネガティブ ラフィノース：ポジティブ サリシン：ネガティブ メリビオース：ポジティブ （１４）グリセロール資化性：ポジティブ （１５）有機酸資化性： クエン酸：ポジティブ 酒石酸：ネガティブ グルコン酸：ポジティブ 酢酸：ポジティブ マロン酸：ネガティブ （１６）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ （１７）オルチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ （１８）リジンデカルボキシラーゼ：ネガティブ （１９）フェニルアラニンデアミナーゼ：ネガティブ （２０）色素形成 黄色 （２１）ゼラチン液化能：ポジティブ （２２）生育ｐＨ ｐＨ４．０生育可、ｐＨ４．５〜７
生育良好 （２３）生育温度 ２５℃生育良好、３０℃生育良好、
３７℃生育良好、４２℃生育可、４５℃生育不可
生育良好 （２３）生育温度 ２５℃生育良好、３０℃生育良好、
３７℃生育良好、４２℃生育可、４５℃生育不可
【００４０】これらの菌学的性質からＡＪ１３３５５は
エンテロバクター・アグロメランスと判定された。
エンテロバクター・アグロメランスと判定された。
【００４１】エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１
３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究
所生命工学工業技術研究所）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。
３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究
所生命工学工業技術研究所）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。
【００４２】Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物は、元来Ｌ−
グルタミン酸生産能を有していてもよいし、変異処理又
は組換えＤＮＡ技術等による育種によってＬ−グルタミ
ン酸生産能を付与、又は増強したものであってもよい。
グルタミン酸生産能を有していてもよいし、変異処理又
は組換えＤＮＡ技術等による育種によってＬ−グルタミ
ン酸生産能を付与、又は増強したものであってもよい。
【００４３】Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、Ｌ−
グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性を高め
ることによって、付与又は増強することができる。ま
た、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グ
ルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
の活性を低下または欠損させることによっても、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を増強することができる。
グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性を高め
ることによって、付与又は増強することができる。ま
た、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グ
ルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
の活性を低下または欠損させることによっても、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を増強することができる。
【００４４】Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する
酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、
「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンセターゼ、グル
タミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以
下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラ
ーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビ
スリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵
素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１
種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、Ｌ−グ
ルタミン酸蓄積微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよ
びＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められているこ
とが好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタ
ミン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好まし
いものである。
酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、
「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンセターゼ、グル
タミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以
下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラ
ーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビ
スリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵
素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１
種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、Ｌ−グ
ルタミン酸蓄積微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよ
びＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められているこ
とが好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタ
ミン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好まし
いものである。
【００４５】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
には、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードす
る遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得ら
れたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換すればよ
い。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨを
コードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔ
Ａ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と
略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣ
及びＧＤＨ活性が高められる。
には、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードす
る遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得ら
れたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換すればよ
い。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨを
コードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔ
Ａ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と
略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣ
及びＧＤＨ活性が高められる。
【００４６】クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐ
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の
２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入され
る。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種
類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化
されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類
または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて
宿主に導入される。
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の
２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入され
る。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種
類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化
されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類
または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて
宿主に導入される。
【００４７】尚、同種の酵素をコードする遺伝子であっ
て、由来が異なる２又は３以上の遺伝子を同一の宿主に
導入してもよい。
て、由来が異なる２又は３以上の遺伝子を同一の宿主に
導入してもよい。
【００４８】上記プラスミドとしては、例えばエンテロ
バクター属等に属する微生物の細胞中で自律複製可能な
プラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC1
9、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG3
98、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC
177、pACYC184等が挙げられる。他にもファージＤＮＡ
のベクターも利用できる。
バクター属等に属する微生物の細胞中で自律複製可能な
プラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC1
9、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG3
98、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC
177、pACYC184等が挙げられる。他にもファージＤＮＡ
のベクターも利用できる。
【００４９】形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法
（Methods in Enzymology 68, 326(1979)）、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(197
0)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.
H., “A Short Course in Bacterial Genetics”,Cold
Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992）等に
より行うことができる。
（Methods in Enzymology 68, 326(1979)）、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(197
0)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.
H., “A Short Course in Bacterial Genetics”,Cold
Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992）等に
より行うことができる。
【００５０】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
ことは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ
遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによっても達成できる。エンテ
ロバクター属等に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌ
ｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多
コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子
の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色
体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。ある
いは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ
遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、
またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果Ｃ
Ｓ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
ことは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ
遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによっても達成できる。エンテ
ロバクター属等に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌ
ｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多
コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子
の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色
体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。ある
いは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ
遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、
またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果Ｃ
Ｓ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００５１】コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物
としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物
ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細
菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エ
ルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バ
チルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例として
は、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐ
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生
物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
ｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物
としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物
ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細
菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エ
ルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バ
チルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例として
は、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐ
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生
物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００５２】ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇ
ｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤ
Ｈ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補
するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離す
ることによって取得できる。またエシェリヒア属のこれ
ら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は
既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、
１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９
〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３
〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３
９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２
年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得する
ことが可能である。
ｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤ
Ｈ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補
するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離す
ることによって取得できる。またエシェリヒア属のこれ
ら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は
既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、
１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９
〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３
〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３
９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２
年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得する
ことが可能である。
【００５３】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
には、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化
されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモータ
ーをそれよりも強力な他のプロモーターに置換すること
によって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、
ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にク
ローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレ
ペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、また
はトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ
上に導入される。
には、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化
されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモータ
ーをそれよりも強力な他のプロモーターに置換すること
によって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、
ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にク
ローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレ
ペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、また
はトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ
上に導入される。
【００５４】また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を
高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子
またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも
強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６
号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれ
ぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモータ
ーを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241 参照）
によっても達成することができる。具体的には、強力な
プロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝
子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤ
ＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換え
を起こさせればよい。
高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子
またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも
強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６
号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれ
ぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモータ
ーを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241 参照）
によっても達成することができる。具体的には、強力な
プロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝
子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤ
ＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換え
を起こさせればよい。
【００５５】Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐し
てＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒
する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リ
アーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナ
ーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シン
ターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピ
ロリンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中で
は、αＫＧＤＨが好ましい。
てＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒
する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リ
アーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナ
ーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シン
ターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピ
ロリンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中で
は、αＫＧＤＨが好ましい。
【００５６】エンテロバクター属等に属する微生物にお
いて、上記のような酵素の活性を低下または欠損させる
には、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学
的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵
素の活性が低下または欠損するような変異を導入すれば
よい。
いて、上記のような酵素の活性を低下または欠損させる
には、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学
的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵
素の活性が低下または欠損するような変異を導入すれば
よい。
【００５７】変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外
線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等が
ある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク
質をコードするコード領域であってもよく、プロモータ
ー等の発現制御領域であってもよい。
線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等が
ある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク
質をコードするコード領域であってもよく、プロモータ
ー等の発現制御領域であってもよい。
【００５８】また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝
子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法が
ある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬
剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺
伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子を宿主微
生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上
の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破
壊）。
子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法が
ある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬
剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺
伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子を宿主微
生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上
の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破
壊）。
【００５９】細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損
していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌
体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と
比較することによって確認することができる。例えば、
αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.M
ukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-6
1）に従って測定することができる。
していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌
体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と
比較することによって確認することができる。例えば、
αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.M
ukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-6
1）に従って測定することができる。
【００６０】また、目的とする酵素によっては、変異株
の表現型によって目的変異株を選択することができる。
例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株
は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あ
るいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として
含む最少培地で増殖できないか、または増殖速度が著し
く低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む
最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジ
アミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が
可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
の表現型によって目的変異株を選択することができる。
例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株
は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あ
るいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として
含む最少培地で増殖できないか、または増殖速度が著し
く低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む
最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジ
アミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が
可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
【００６１】相同組換えを利用したブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作
製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、他
の微生物にも同様の方法を適用することができる。
・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作
製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、他
の微生物にも同様の方法を適用することができる。
【００６２】その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの
切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press
(1989)）等に詳述されている。
切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press
(1989)）等に詳述されている。
【００６３】以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、エン
テロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６が挙げ
られる。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３
３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所
生命工学工業技術研究所）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。エンテロバ
クター・アグロメランス ＡＪ１３３５６は、αＫＧＤ
Ｈ−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）が破壊された
結果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。
が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、エン
テロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６が挙げ
られる。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３
３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所
生命工学工業技術研究所）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。エンテロバ
クター・アグロメランス ＡＪ１３３５６は、αＫＧＤ
Ｈ−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）が破壊された
結果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。
【００６４】また、本発明に用いられる微生物の一例で
あるエンテロバクター・アグロメランスは、糖を含有す
る培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するため
に、操作効率がよくないことがある。したがって、この
ような粘液質を生成する性質を有するエンテロバクター
・アグロメランスを用いる場合には、粘液質の生成量が
野生株よりも低下した変異株を用いることが好ましい。
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する
方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。また、
粘液質の生成量が低下した変異株は、変異処理した菌株
を、糖を含む培地、例えば５ｇ／Ｌのグルコースを含む
ＬＢ培地プレートに撒き、プレートを約４５°傾けて培
養したときに、液質が流れ落ちないようになったコロニ
ーを選抜することによって選択することができる。
あるエンテロバクター・アグロメランスは、糖を含有す
る培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するため
に、操作効率がよくないことがある。したがって、この
ような粘液質を生成する性質を有するエンテロバクター
・アグロメランスを用いる場合には、粘液質の生成量が
野生株よりも低下した変異株を用いることが好ましい。
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する
方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。また、
粘液質の生成量が低下した変異株は、変異処理した菌株
を、糖を含む培地、例えば５ｇ／Ｌのグルコースを含む
ＬＢ培地プレートに撒き、プレートを約４５°傾けて培
養したときに、液質が流れ落ちないようになったコロニ
ーを選抜することによって選択することができる。
【００６５】本発明において、Ｌ−グルタミン酸生産能
の付与又は増強、及び上記の粘液質低生産変異等の好ま
しい性質の付与は、任意の順序で行うことができる。
の付与又は増強、及び上記の粘液質低生産変異等の好ま
しい性質の付与は、任意の順序で行うことができる。
【００６６】Ｌ−グルタミン酸蓄積微生物を、ｐＨがＬ
−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に
培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を析出
させながら生成蓄積させることができる。
−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地に
培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を析出
させながら生成蓄積させることができる。
【００６７】ここで「前記微生物が生産したＬ−グルタ
ミン酸が析出する条件」とは、Ｌ−グルタミン酸蓄積微
生物がＬ−グルタミン酸を生成蓄積したときにＬ−グル
タミン酸が析出する条件をいう。この条件のｐＨは、微
生物のＬ−グルタミン酸生産能に応じて変動するが、微
生物がエンテロバクター属細菌の場合には、通常には、
３〜５である。
ミン酸が析出する条件」とは、Ｌ−グルタミン酸蓄積微
生物がＬ−グルタミン酸を生成蓄積したときにＬ−グル
タミン酸が析出する条件をいう。この条件のｐＨは、微
生物のＬ−グルタミン酸生産能に応じて変動するが、微
生物がエンテロバクター属細菌の場合には、通常には、
３〜５である。
【００６８】第１の本発明製造法における培養ならびに
第２の本発明製造法における第１のｐＨでの培養及び第
２のｐＨでの培養に用いられる培地としては、ｐＨが所
定の条件に調整されること以外は、炭素源、窒素源、無
機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることが
できる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能で
ある。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養す
る菌株の利用可能なものならばよい。
第２の本発明製造法における第１のｐＨでの培養及び第
２のｐＨでの培養に用いられる培地としては、ｐＨが所
定の条件に調整されること以外は、炭素源、窒素源、無
機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることが
できる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能で
ある。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養す
る菌株の利用可能なものならばよい。
【００６９】炭素源としてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００７０】窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。
【００７１】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、代謝又は生育にアミノ酸等を要求する栄養要
求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添
する事が必要である。
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、代謝又は生育にアミノ酸等を要求する栄養要
求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添
する事が必要である。
【００７２】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
【００７３】培養方法は、ｐＨが所定の値に調整される
以外は、通常には、発酵温度２０ないし４２℃での通気
培養である。
以外は、通常には、発酵温度２０ないし４２℃での通気
培養である。
【００７４】培養終了後、培養液中に析出したＬ−グル
タミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することが
できる。また、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸
は、公知の方法に従って採取することができる。例え
ば、濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフィー等によって単離することができる。培養液中に
析出したＬ−グルタミン酸は、培地中に溶解しているＬ
−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよ
い。
タミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することが
できる。また、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸
は、公知の方法に従って採取することができる。例え
ば、濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフィー等によって単離することができる。培養液中に
析出したＬ−グルタミン酸は、培地中に溶解しているＬ
−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよ
い。
【００７５】飽和濃度を超えるＬ−グルタミン酸が析出
する態様では、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸
の濃度は一定量に保たれ、微生物が高濃度のＬ−グルタ
ミン酸から受ける影響を低減することができる。したが
って、Ｌ−グルタミン酸生産能が一層向上した微生物を
育種することも可能となる。また、Ｌ−グルタミン酸は
結晶として析出してくるため、Ｌ−グルタミン酸の蓄積
に伴う培養液の酸性化が少なく、培養液のｐＨを維持す
るために使用されるアルカリの量を大幅に削減すること
が可能となる。
する態様では、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸
の濃度は一定量に保たれ、微生物が高濃度のＬ−グルタ
ミン酸から受ける影響を低減することができる。したが
って、Ｌ−グルタミン酸生産能が一層向上した微生物を
育種することも可能となる。また、Ｌ−グルタミン酸は
結晶として析出してくるため、Ｌ−グルタミン酸の蓄積
に伴う培養液の酸性化が少なく、培養液のｐＨを維持す
るために使用されるアルカリの量を大幅に削減すること
が可能となる。
【００７６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例において、特記しない限りアミノ酸は
Ｌ型である。
説明する。実施例において、特記しない限りアミノ酸は
Ｌ型である。
【００７７】
【参考例１】＜１＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐
性を有する微生物の探索 酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の
探索は、以下のようにして行った。1gの土壌、果実、植
物体、河川水などの自然界より得られたサンプルおよそ
500点を、それぞれ5mLの滅菌水に懸だくし、そのうち20
0μLを塩酸にてpHを4.0に調製した固体培地20mLに塗布
した。同培地の組成は、以下のとおりである。グルコー
ス3g/L、硫酸アンモニウム1g/L、硫酸マグネシウム七水
塩0.2g/L、リン酸二水素カリウム0.5g/L、塩化ナトリウ
ム0.2g/L、塩化カルシウム二水塩0.1g/L、硫酸第一鉄七
水塩0.01g/L、硫酸マンガン四水塩0.01g/L、硫酸亜鉛二
水塩0.72mg/L、硫酸銅五水塩0.64mg/L、塩化コバルト六
水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウ
ム２水塩1.2mg/L、ビオチン50μg/L、パントテン酸カル
シウム50μg/L、葉酸50μg/L、イノシトール50μg/L、
ナイアシン50μg/L、パラアミノ安息香酸50μg/L、ピリ
ドキシン塩酸塩50μg/L、リボフラビン50μg/L、チアミ
ン塩酸塩50μg/L、シクロヘキシミド50mg/L、寒天20g/
L。
性を有する微生物の探索 酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の
探索は、以下のようにして行った。1gの土壌、果実、植
物体、河川水などの自然界より得られたサンプルおよそ
500点を、それぞれ5mLの滅菌水に懸だくし、そのうち20
0μLを塩酸にてpHを4.0に調製した固体培地20mLに塗布
した。同培地の組成は、以下のとおりである。グルコー
ス3g/L、硫酸アンモニウム1g/L、硫酸マグネシウム七水
塩0.2g/L、リン酸二水素カリウム0.5g/L、塩化ナトリウ
ム0.2g/L、塩化カルシウム二水塩0.1g/L、硫酸第一鉄七
水塩0.01g/L、硫酸マンガン四水塩0.01g/L、硫酸亜鉛二
水塩0.72mg/L、硫酸銅五水塩0.64mg/L、塩化コバルト六
水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウ
ム２水塩1.2mg/L、ビオチン50μg/L、パントテン酸カル
シウム50μg/L、葉酸50μg/L、イノシトール50μg/L、
ナイアシン50μg/L、パラアミノ安息香酸50μg/L、ピリ
ドキシン塩酸塩50μg/L、リボフラビン50μg/L、チアミ
ン塩酸塩50μg/L、シクロヘキシミド50mg/L、寒天20g/
L。
【００７８】上記のサンプルを塗布した培地を、28℃、
37℃又は50℃にて、２〜４日間培養し、コロニーを形成
する菌株を378株取得した。
37℃又は50℃にて、２〜４日間培養し、コロニーを形成
する菌株を378株取得した。
【００７９】続いて、上記のようにして得られた菌株
を、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む液体培地（塩酸
にてpH4.0に調整）3mLを注入した長さ16.5cm、径14mmの
試験管に植菌し、24時間〜３日間、28℃、37℃又は50℃
にて振とう培養を行い、増殖する菌株を選抜した。前記
培地の組成は、以下のとおりである。グルコース40g/
L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグネシウム七水塩0.
5g/L、リン酸二水素カリウム2g/L、塩化ナトリウム0.5g
/L、塩化カルシウム二水塩0.25g/L、硫酸第一鉄七水塩
0.02g/L、硫酸マンガン四水塩0.02g/L、硫酸亜鉛二水塩
0.72mg/L、硫酸銅五水塩0.64mg/L、塩化コバルト六水塩
0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウム二
水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L。
を、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む液体培地（塩酸
にてpH4.0に調整）3mLを注入した長さ16.5cm、径14mmの
試験管に植菌し、24時間〜３日間、28℃、37℃又は50℃
にて振とう培養を行い、増殖する菌株を選抜した。前記
培地の組成は、以下のとおりである。グルコース40g/
L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグネシウム七水塩0.
5g/L、リン酸二水素カリウム2g/L、塩化ナトリウム0.5g
/L、塩化カルシウム二水塩0.25g/L、硫酸第一鉄七水塩
0.02g/L、硫酸マンガン四水塩0.02g/L、硫酸亜鉛二水塩
0.72mg/L、硫酸銅五水塩0.64mg/L、塩化コバルト六水塩
0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウム二
水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L。
【００８０】このようにして、酸性環境下にてＬ−グル
タミン酸耐性を有する微生物７８株を取得することに成
功した。
タミン酸耐性を有する微生物７８株を取得することに成
功した。
【００８１】＜２＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐
性を有する微生物からの増殖速度に優れた菌株の選抜 上記のようにして得られた、酸性環境下にてＬ−グルタ
ミン酸耐性を有する種々の微生物を、M9培地（J. Sambr
ook, E.F.Fritsh, T.Maniatis “Molecular Cloning”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 198
9）に20g/Lのグルタミン酸と2g/Lのグルコースを加え、
pHを塩酸で4.0に調整した培地3mLを注入した長さ16.5c
m、径14mmの試験管に植菌し、培地の濁度を経時的に測
定することによって、増殖速度の良好な菌株の選抜を行
った。その結果、生育が良好な菌株として、静岡県磐田
市の土壌より採取されたAJ13355株が得られた。本菌株
は、前記の菌学的性質から、エンテロバクター・アグロ
メランスと判定された。
性を有する微生物からの増殖速度に優れた菌株の選抜 上記のようにして得られた、酸性環境下にてＬ−グルタ
ミン酸耐性を有する種々の微生物を、M9培地（J. Sambr
ook, E.F.Fritsh, T.Maniatis “Molecular Cloning”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 198
9）に20g/Lのグルタミン酸と2g/Lのグルコースを加え、
pHを塩酸で4.0に調整した培地3mLを注入した長さ16.5c
m、径14mmの試験管に植菌し、培地の濁度を経時的に測
定することによって、増殖速度の良好な菌株の選抜を行
った。その結果、生育が良好な菌株として、静岡県磐田
市の土壌より採取されたAJ13355株が得られた。本菌株
は、前記の菌学的性質から、エンテロバクター・アグロ
メランスと判定された。
【００８２】＜３＞エンテロバクター・アグロメランス
AJ13355株からの粘液質低生産株の取得 エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株は糖を含
有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成する
ために、操作効率がよくない。そこで、粘液質低生産株
の取得を、紫外線照射法（Miller, J.H. et al., "A Sh
ort Cource inBacterial Genetics; Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
p.150, 1992）により行った。
AJ13355株からの粘液質低生産株の取得 エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株は糖を含
有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成する
ために、操作効率がよくない。そこで、粘液質低生産株
の取得を、紫外線照射法（Miller, J.H. et al., "A Sh
ort Cource inBacterial Genetics; Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
p.150, 1992）により行った。
【００８３】６０Ｗの紫外線ランプから６０ｃｍ離した
位置で、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株
に紫外線を２分間照射した後、ＬＢ培地で終夜培養して
変異を固定した。変異処理した菌株を、５ｇ／Ｌのグル
コースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地に、プレート
当たり約１００個程度のコロニーが出現するように希釈
して撒き、プレートを約４５°傾けて３０℃で終夜培養
を行い、粘液質が流れ落ちないようになったコロニーを
２０個選抜した。
位置で、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株
に紫外線を２分間照射した後、ＬＢ培地で終夜培養して
変異を固定した。変異処理した菌株を、５ｇ／Ｌのグル
コースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地に、プレート
当たり約１００個程度のコロニーが出現するように希釈
して撒き、プレートを約４５°傾けて３０℃で終夜培養
を行い、粘液質が流れ落ちないようになったコロニーを
２０個選抜した。
【００８４】選抜された株の中から、５ｇ／Ｌのグルコ
ースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地で５回継代培養
を行っても復帰変異株が出現せず、さらに、ＬＢ培地及
び５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地ならびにＭ９培
地（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2nd ed
ition, Cold Spring Harbor press, U.S.A. (1989)）に
２０ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコース
を加え、ｐＨを塩酸で４．５に調製した培地で親株と同
等の生育を示すという条件を満たす菌株として、ＳＣ１
７株を選抜した。
ースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地で５回継代培養
を行っても復帰変異株が出現せず、さらに、ＬＢ培地及
び５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地ならびにＭ９培
地（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2nd ed
ition, Cold Spring Harbor press, U.S.A. (1989)）に
２０ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコース
を加え、ｐＨを塩酸で４．５に調製した培地で親株と同
等の生育を示すという条件を満たす菌株として、ＳＣ１
７株を選抜した。
【００８５】＜４＞エンテロバクター・アグロメランス
ＳＣ１７株からのグルタミン酸生産菌の構築 （１）エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７株か
らのαＫＧＤＨ欠損株の作製 エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７株から、α
ＫＧＤＨを欠損し、さらにＬ−グルタミン酸生合成系が
強化された株を作製した。
ＳＣ１７株からのグルタミン酸生産菌の構築 （１）エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７株か
らのαＫＧＤＨ欠損株の作製 エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７株から、α
ＫＧＤＨを欠損し、さらにＬ−グルタミン酸生合成系が
強化された株を作製した。
【００８６】（ｉ）エンテロバクター・アグロメランス
ＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃＡ
Ｂ」という）のクローニング エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株
のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤ
Ｈ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」とい
う）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、エ
ンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株染
色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングし
た。
ＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃＡ
Ｂ」という）のクローニング エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株
のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤ
Ｈ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」とい
う）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、エ
ンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株染
色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングし
た。
【００８７】エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ
１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリに
おいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと
同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７
−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクター
として使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は
宝酒造社製の市販品を用いた。
１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリに
おいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと
同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７
−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクター
として使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は
宝酒造社製の市販品を用いた。
【００８８】ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡをＥｃｏ
Ｔ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓ
ｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕ
ｃＡ欠損のエシェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株（Ｈｅ
ｒｂｅｒｔ Ｊ．ら Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。
こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて増殖す
る株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶ
ＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシ
ェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という
形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチ
オニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶ
ＥＫ１０１にはエンテロバクター・アグロメランスのｓ
ｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。
Ｔ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓ
ｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕ
ｃＡ欠損のエシェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株（Ｈｅ
ｒｂｅｒｔ Ｊ．ら Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。
こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて増殖す
る株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶ
ＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシ
ェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という
形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチ
オニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶ
ＥＫ１０１にはエンテロバクター・アグロメランスのｓ
ｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。
【００８９】ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・
アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に
示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列を決定し
た結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つ
の完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われ
る塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその
部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順
に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をし
た結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒ
ドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子
（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃ
ＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃ
Ｂ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット遺
伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んでいる
ことが明らかとなった。これらの塩基配列から推定され
るアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのもの
（Eur.J. Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Bio
chem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 6245
-6252 (1985)）と比較した結果を図２〜５に示す。この
ように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。ま
た、エンテロバクター・アグロメランス染色体上でもエ
シェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem., 141,351
-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (198
4)、Biochemistry, 24,6245-6252 (1985)）、ｓｄｈＢ
−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成し
ていることが判明した。
アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に
示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列を決定し
た結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つ
の完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われ
る塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその
部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順
に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をし
た結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒ
ドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子
（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃ
ＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃ
Ｂ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット遺
伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んでいる
ことが明らかとなった。これらの塩基配列から推定され
るアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのもの
（Eur.J. Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Bio
chem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 6245
-6252 (1985)）と比較した結果を図２〜５に示す。この
ように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。ま
た、エンテロバクター・アグロメランス染色体上でもエ
シェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem., 141,351
-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (198
4)、Biochemistry, 24,6245-6252 (1985)）、ｓｄｈＢ
−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成し
ていることが判明した。
【００９０】（ii）エンテロバクター・アグロメランス
ＳＣ１７株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得 上記のようにして取得されたエンテロバクター・アグロ
メランスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えにより
エンテロバクター・アグロメランスのαＫＧＤＨ欠損株
の取得を行った。
ＳＣ１７株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得 上記のようにして取得されたエンテロバクター・アグロ
メランスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えにより
エンテロバクター・アグロメランスのαＫＧＤＨ欠損株
の取得を行った。
【００９１】ｐＴＷＶＥＫ１０１をＳｐｈＩで切断して
ｓｕｃＡを含む断片を切り出した後、クレノーフラグメ
ント（宝酒造（株））で平滑末端化した断片を、Ｅｃｏ
ＲＩで切断しクレノーフラグメントで平滑末端化したｐ
ＢＲ３２２（宝酒造（株））とを、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造（株））を用いて結合した。得られたプラス
ミドを、ｓｕｃＡのほぼ中央部分に位置する制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩ認識部位で同酵素を用いて切断し、クレノーフ
ラグメントで平滑末端化し、再びＴ４ ＤＮＡリガーゼ
で結合した。以上の操作によって、新たに構築されたプ
ラスミド中のｓｕｃＡにはフレームシフト変異が導入さ
れ、同遺伝子は機能しなくなると考えられた。
ｓｕｃＡを含む断片を切り出した後、クレノーフラグメ
ント（宝酒造（株））で平滑末端化した断片を、Ｅｃｏ
ＲＩで切断しクレノーフラグメントで平滑末端化したｐ
ＢＲ３２２（宝酒造（株））とを、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造（株））を用いて結合した。得られたプラス
ミドを、ｓｕｃＡのほぼ中央部分に位置する制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩ認識部位で同酵素を用いて切断し、クレノーフ
ラグメントで平滑末端化し、再びＴ４ ＤＮＡリガーゼ
で結合した。以上の操作によって、新たに構築されたプ
ラスミド中のｓｕｃＡにはフレームシフト変異が導入さ
れ、同遺伝子は機能しなくなると考えられた。
【００９２】上記のようにして構築されたプラスミドを
制限酵素ＡｐａＬＩで切断した後、アガロースゲル電気
泳動を行い、フレームシフト変異が導入されたｓｕｃＡ
及びｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を
含むＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を再び
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合し、αＫＧＤＨ遺伝子破壊
用プラスミドを構築した。
制限酵素ＡｐａＬＩで切断した後、アガロースゲル電気
泳動を行い、フレームシフト変異が導入されたｓｕｃＡ
及びｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を
含むＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を再び
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合し、αＫＧＤＨ遺伝子破壊
用プラスミドを構築した。
【００９３】上記のようにして得られたαＫＧＤＨ遺伝
子破壊用プラスミドを用いて、エンテロバクター・アグ
ロメランスＳＣ１７株を、エレクトロポレーション法
（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genet
ics; Handbook”, Cold SpringHarbor Laboratory Pres
s, U.S.A., p.279, 1992）によって形質転換し、テトラ
サイクリン耐性を指標にプラスミドが相同組換えによっ
て染色体上のｓｕｃＡが変異型に置換された菌株を取得
した。取得された株をＳＣ１７ｓｕｃＡ株と命名した。
子破壊用プラスミドを用いて、エンテロバクター・アグ
ロメランスＳＣ１７株を、エレクトロポレーション法
（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genet
ics; Handbook”, Cold SpringHarbor Laboratory Pres
s, U.S.A., p.279, 1992）によって形質転換し、テトラ
サイクリン耐性を指標にプラスミドが相同組換えによっ
て染色体上のｓｕｃＡが変異型に置換された菌株を取得
した。取得された株をＳＣ１７ｓｕｃＡ株と命名した。
【００９４】ＳＣ１７ｓｕｃＡ株がαＫＧＤＨ活性を欠
損していることを確認するために、ＬＢ培地で対数増殖
期まで培養した同株の菌体を用いて、Reedらの方法（L.
J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 19
69, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その
結果、ＳＣ１７株からは０．０７３（ΔＡＢＳ／min／m
gタンパク）のαＫＧＤＨ活性が検出されたのに対し、
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、
目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
損していることを確認するために、ＬＢ培地で対数増殖
期まで培養した同株の菌体を用いて、Reedらの方法（L.
J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 19
69, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その
結果、ＳＣ１７株からは０．０７３（ΔＡＢＳ／min／m
gタンパク）のαＫＧＤＨ活性が検出されたのに対し、
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、
目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。
【００９５】（２）エンテロバクター・アグロメランス
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株のＬ−グルタミン酸生合成系の強化 続いてＳＣ１７ｓｕｃＡ株に、エシェリヒア・コリ由来
のクエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子、およびグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子を導入した。
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株のＬ−グルタミン酸生合成系の強化 続いてＳＣ１７ｓｕｃＡ株に、エシェリヒア・コリ由来
のクエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子、およびグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子を導入した。
【００９６】（ｉ）エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ
遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有する
プラスミドの作製 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドの作成の手順を、図６、７に基づい
て説明する。
遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有する
プラスミドの作製 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドの作成の手順を、図６、７に基づい
て説明する。
【００９７】エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９
８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、
エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ
遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８
２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇ
ｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガー
ゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭
載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図６）。
を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９
８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、
エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ
遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８
２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇ
ｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガー
ゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭
載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図６）。
【００９８】同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１
０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平
８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４Ｉ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、
Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点
及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦ−Ｔｅｔを得た（図７）。
０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平
８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４Ｉ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、
Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点
及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦ−Ｔｅｔを得た（図７）。
【００９９】次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−
Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１
０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したも
のと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅ
ｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ
遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図
８）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を発現している
ことは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ
遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の
相補と各酵素活性の測定によって確認した。
Ｉ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−
Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１
０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したも
のと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅ
ｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ
遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図
８）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を発現している
ことは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ
遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の
相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【０１００】（ii）ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌ
ｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構
築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ
遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-18
28）をもとに、配列番号６及び７に示す塩基配列を有す
るプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子
断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐ
ＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラ
スミドｐＨＳＧＣＢを得た（図９）。次に、ｐＨＳＧＣ
ＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇ
ｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミド
ｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラ
スミドｐＳＴＶＣＢを得た（図９）。得られたプラスミ
ドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していること
は、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５
株中での酵素活性の測定によって確認した。
メンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌ
ｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構
築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ
遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-18
28）をもとに、配列番号６及び７に示す塩基配列を有す
るプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子
断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐ
ＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラ
スミドｐＨＳＧＣＢを得た（図９）。次に、ｐＨＳＧＣ
ＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇ
ｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミド
ｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラ
スミドｐＳＴＶＣＢを得た（図９）。得られたプラスミ
ドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していること
は、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５
株中での酵素活性の測定によって確認した。
【０１０１】(iii)ＲＳＦＣＰＧ及びｐＳＴＶＣＢのＳ
Ｃ１７ｓｕｃＡ株への導入 エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７ｓｕｃＡ株
を、ＲＳＦＣＰＧを用いてエレクトロポレーション法に
て形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体
SC17sucA/RSFCPG株を取得した。さらにSC17sucA/RSFCPG
株をｐＳＴＶＣＢを用いてエレクトロポレーション法に
て形質転換し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転
換体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株を取得した。
Ｃ１７ｓｕｃＡ株への導入 エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７ｓｕｃＡ株
を、ＲＳＦＣＰＧを用いてエレクトロポレーション法に
て形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体
SC17sucA/RSFCPG株を取得した。さらにSC17sucA/RSFCPG
株をｐＳＴＶＣＢを用いてエレクトロポレーション法に
て形質転換し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転
換体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株を取得した。
【０１０２】＜４＞低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に
対する耐性が向上した菌株の取得 エンテロバクター・アグロメランスSC17sucA/RSFCPG+pS
TVCB株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸
に対する耐性が向上した菌株（以下、「低pH下高濃度Gl
u耐性株」ともいう）の分離を行った。
対する耐性が向上した菌株の取得 エンテロバクター・アグロメランスSC17sucA/RSFCPG+pS
TVCB株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸
に対する耐性が向上した菌株（以下、「低pH下高濃度Gl
u耐性株」ともいう）の分離を行った。
【０１０３】SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株をＬＢＧ培地
（トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、グ
ルコース5g/L）にて30℃一夜培養後、生理食塩水にて洗
浄した菌体を適宜希釈して、Ｍ９−Ｅ培地（グルコース
4g/L、Na2HPO4・12H2O 17g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/
L、NH4Cl 1g/L、10mM MgSO4、10μM CaCl2、L-リジン 5
0mg/L、L-メチオニン 50mg/L、DL-ジアミノピメリン酸
50mg/L、テトラサイクリン 25mg/L、クロラムフェニコ
ール 25mg/L、L-グルタミン酸 30g/L、アンモニア水に
てpH4.5に調整）プレートに塗布した。32℃、２日間培
養後出現したコロニーを低pH下高濃度Glu耐性株として
取得した。
（トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、グ
ルコース5g/L）にて30℃一夜培養後、生理食塩水にて洗
浄した菌体を適宜希釈して、Ｍ９−Ｅ培地（グルコース
4g/L、Na2HPO4・12H2O 17g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/
L、NH4Cl 1g/L、10mM MgSO4、10μM CaCl2、L-リジン 5
0mg/L、L-メチオニン 50mg/L、DL-ジアミノピメリン酸
50mg/L、テトラサイクリン 25mg/L、クロラムフェニコ
ール 25mg/L、L-グルタミン酸 30g/L、アンモニア水に
てpH4.5に調整）プレートに塗布した。32℃、２日間培
養後出現したコロニーを低pH下高濃度Glu耐性株として
取得した。
【０１０４】得られた株について、Ｍ９−Ｅ液体培地で
の増殖度の測定、及びＬ−グルタミン酸生産試験培地
（グルコース40g/L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグ
ネシウム七水塩0.5g/L、リン酸二水素カリウム2g/L、塩
化ナトリウム0.5g/L、塩化カルシウム二水塩0.25g/L、
硫酸第一鉄七水塩0.02g/L、硫酸マンガン四水塩0.02g/
L、硫酸亜鉛二水塩0.72mg/L、硫酸銅五水塩0.64mg/L、
塩化コバルト六水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブ
デン酸ナトリウム二水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L、L-
リジン塩酸塩200mg/L、L-メチオニン200mg/L、DL-α,ε
-ジアミノピメリン酸200mg/L、テトラサイクリン塩酸塩
25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L）5mlを注入した5
0ml容大型試験管におけるＬ−グルタミン酸生産能の検
定を実施し、増殖度が最もよく、Ｌ−グルタミン酸生産
能が親株SC17/RSFCPG+pSTVCB株と変わらなかった株は、
エンテロバクター・アグロメランスAJ13601と命名され
た。AJ13601株は、１９９９年８月１８日に、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技
術総合研究所生命工学工業技術研究所）（郵便番号305-
8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番
号FERM P-17516として寄託され、２０００年７月６日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号
FERM BP-7207が付与されている。
の増殖度の測定、及びＬ−グルタミン酸生産試験培地
（グルコース40g/L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグ
ネシウム七水塩0.5g/L、リン酸二水素カリウム2g/L、塩
化ナトリウム0.5g/L、塩化カルシウム二水塩0.25g/L、
硫酸第一鉄七水塩0.02g/L、硫酸マンガン四水塩0.02g/
L、硫酸亜鉛二水塩0.72mg/L、硫酸銅五水塩0.64mg/L、
塩化コバルト六水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブ
デン酸ナトリウム二水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L、L-
リジン塩酸塩200mg/L、L-メチオニン200mg/L、DL-α,ε
-ジアミノピメリン酸200mg/L、テトラサイクリン塩酸塩
25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L）5mlを注入した5
0ml容大型試験管におけるＬ−グルタミン酸生産能の検
定を実施し、増殖度が最もよく、Ｌ−グルタミン酸生産
能が親株SC17/RSFCPG+pSTVCB株と変わらなかった株は、
エンテロバクター・アグロメランスAJ13601と命名され
た。AJ13601株は、１９９９年８月１８日に、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技
術総合研究所生命工学工業技術研究所）（郵便番号305-
8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番
号FERM P-17516として寄託され、２０００年７月６日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号
FERM BP-7207が付与されている。
【０１０５】
【実施例１】酸性pHにおける有機酸による生育阻害 エンテロバクター・アグロメランスAJ13601株は中性pH
から酸性pHに渡る広い範囲のpHでの生育が可能である
が、酸性pHでは、特に有機酸による生育の阻害が顕著で
ある。そこで、酸性pHでの有機酸の生育阻害に関する実
験を行った。
から酸性pHに渡る広い範囲のpHでの生育が可能である
が、酸性pHでは、特に有機酸による生育の阻害が顕著で
ある。そこで、酸性pHでの有機酸の生育阻害に関する実
験を行った。
【０１０６】エンテロバクター・アグロメランスAJ1360
1株を、テトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフェ
ニコール25mg/Lを含有するLBG寒天培地（トリプトン10g
/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、寒天15g/L）にて30
℃で14時間培養した菌体を１白金耳掻き取り、以下に示
す組成の種培養培地300mLを注入した1L容ジャーファー
メンターに植菌を行い、34℃及びpH6.0の条件で種培養
を行った。
1株を、テトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフェ
ニコール25mg/Lを含有するLBG寒天培地（トリプトン10g
/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、寒天15g/L）にて30
℃で14時間培養した菌体を１白金耳掻き取り、以下に示
す組成の種培養培地300mLを注入した1L容ジャーファー
メンターに植菌を行い、34℃及びpH6.0の条件で種培養
を行った。
【０１０７】［種培養培地組成］シュークロース50g/
L、硫酸マグネシウム七水塩0.4g/L、硫酸アンモニウム
4.0g/L、燐酸二水素一カリウム2.0g/L、酵母エキス4.0g
/L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/L、硫酸マンガン五水塩0.0
1g/L、L-リジン塩酸塩0.4g/L、DL-メチオニン0.4g/L、D
L-α,ε-ジアミノピメリン酸0.4g/L、テトラサイクリン
塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L
L、硫酸マグネシウム七水塩0.4g/L、硫酸アンモニウム
4.0g/L、燐酸二水素一カリウム2.0g/L、酵母エキス4.0g
/L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/L、硫酸マンガン五水塩0.0
1g/L、L-リジン塩酸塩0.4g/L、DL-メチオニン0.4g/L、D
L-α,ε-ジアミノピメリン酸0.4g/L、テトラサイクリン
塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L
【０１０８】培養中のpHは、アンモニアガスを添加する
ことにより調整を行った。種培養培地中の糖の枯渇を指
標に種培養を終了し、本培養培地300Lを注入した1L容ジ
ャーファーメンターに、本培養培地体積の20%に当たる
種培養液を植菌し、本培養を行った。本培養培地組成は
以下に示す。有機酸の生育阻害実験を行う際は、本培地
に所定の濃度になるように有機酸を添加して実験を行っ
た。
ことにより調整を行った。種培養培地中の糖の枯渇を指
標に種培養を終了し、本培養培地300Lを注入した1L容ジ
ャーファーメンターに、本培養培地体積の20%に当たる
種培養液を植菌し、本培養を行った。本培養培地組成は
以下に示す。有機酸の生育阻害実験を行う際は、本培地
に所定の濃度になるように有機酸を添加して実験を行っ
た。
【０１０９】［本培養培地組成］グルコース20g/L、硫
酸マグネシウム七水塩0.4g/L、硫酸アンモニウム5.0g/
L、燐酸二水素一カリウム6.0g/L、塩化ナトリウム1.5g/
L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/L、硫酸マンガン五水塩0.01
g/L、L-リジン塩酸塩0.8g/L、DL-メチオニン0.6g/L、DL
-α,ε-ジアミノピメリン酸0.6g/L、テトラサイクリン
塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L、酵母エキ
ス6.0g/L、塩化カルシウム二水塩0.75g/L
酸マグネシウム七水塩0.4g/L、硫酸アンモニウム5.0g/
L、燐酸二水素一カリウム6.0g/L、塩化ナトリウム1.5g/
L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/L、硫酸マンガン五水塩0.01
g/L、L-リジン塩酸塩0.8g/L、DL-メチオニン0.6g/L、DL
-α,ε-ジアミノピメリン酸0.6g/L、テトラサイクリン
塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L、酵母エキ
ス6.0g/L、塩化カルシウム二水塩0.75g/L
【０１１０】培養温度は34℃として、pHは、所定のpHに
なるようにアンモニアガスを添加して調整を行った。
なるようにアンモニアガスを添加して調整を行った。
【０１１１】始めに各種有機酸の酸性pH（pH4.5）にお
ける生育阻害効果の実験を行った。実験は、蟻酸、酢
酸、乳酸、プロピオン酸、吉草酸、コハク酸、フマル
酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸及びクエン酸を0.5g/Lの濃
度になるように本培地に添加して行った。この結果の一
部を図１０に示す。
ける生育阻害効果の実験を行った。実験は、蟻酸、酢
酸、乳酸、プロピオン酸、吉草酸、コハク酸、フマル
酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸及びクエン酸を0.5g/Lの濃
度になるように本培地に添加して行った。この結果の一
部を図１０に示す。
【０１１２】この結果より、蟻酸、酢酸及びプロピオン
酸は明らかな生育阻害を示した。一方、乳酸は対照有機
酸無添加培地と同等の生育速度を示した（この他にもコ
ハク酸、フマル酸及びリンゴ酸も生育阻害を示さなかっ
た。）。酸性pHにおける有機酸による微生物の生育阻害
は酸性pH条件下で電荷を失った有機酸が細胞膜を通過
し、細胞内の中性pH条件下で再び解離することにより発
生するとの報告もあり、この考え方は有機酸の解離定数
pKaにより説明されている。
酸は明らかな生育阻害を示した。一方、乳酸は対照有機
酸無添加培地と同等の生育速度を示した（この他にもコ
ハク酸、フマル酸及びリンゴ酸も生育阻害を示さなかっ
た。）。酸性pHにおける有機酸による微生物の生育阻害
は酸性pH条件下で電荷を失った有機酸が細胞膜を通過
し、細胞内の中性pH条件下で再び解離することにより発
生するとの報告もあり、この考え方は有機酸の解離定数
pKaにより説明されている。
【０１１３】
【表１】表１ ────────────────── 有機酸 PKa 生育阻害 ────────────────── 蟻酸 3.75 あり 乳酸 3.86 なし コハク酸 4.21 なし 酢酸 4.76 あり プロピオン酸 4.87 あり ──────────────────
【０１１４】一方、本実験の結果をpKaに基づいて説明
することは出来ず、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸による
エンテロバクター・アグロメランスAJ13601株の生育阻
害は、先の報告では説明できない別の阻害機構であると
考えられる。
することは出来ず、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸による
エンテロバクター・アグロメランスAJ13601株の生育阻
害は、先の報告では説明できない別の阻害機構であると
考えられる。
【０１１５】次に蟻酸（濃度0.5g/L）を用いて生育阻害
が起こるpHの検討を行った。結果を図１１に示す。蟻酸
による生育阻害はpH5.5以上のpH域では見られず、それ
以下のpHで見られることが明らかになった。特にpH4.5
では菌体の生育がほとんど見られない。
が起こるpHの検討を行った。結果を図１１に示す。蟻酸
による生育阻害はpH5.5以上のpH域では見られず、それ
以下のpHで見られることが明らかになった。特にpH4.5
では菌体の生育がほとんど見られない。
【０１１６】また、pH4.5の条件下で生育阻害を示す蟻
酸濃度の検討も行った。結果を図１２に示す。この結果
より培地中の蟻酸濃度が0.20g/L以下の時は生育阻害は
見られないが、0.2〜0.5g/Lの或る濃度以上で生育阻害
を示すことが明らかになった。
酸濃度の検討も行った。結果を図１２に示す。この結果
より培地中の蟻酸濃度が0.20g/L以下の時は生育阻害は
見られないが、0.2〜0.5g/Lの或る濃度以上で生育阻害
を示すことが明らかになった。
【０１１７】以上の実験結果より、エンテロバクター・
アグロメランスAJ13601株を、有機酸を含有する、ビー
トモラセス、ケインモラセスを始めとする炭素源
（糖）、及びコーンスティープリカー(CSL)、大豆タン
パク質塩加水分解溶液、動物タンパク質加水分解液（肉
エキス）、カゼイン加水分解物などの窒素源を利用して
酸性pHで培養を可能にするためには、培地中の蟻酸、酢
酸などの阻害を示す有機酸の濃度を低い濃度にするか、
後に示す実施例２のように生育阻害の見られないpH域で
菌体培養を行い、阻害を示す有機酸を消費させた後、pH
を酸性pHにシフトして培養する培養方法が酸性pHでグル
タミン酸の生成を行うためには必要である。
アグロメランスAJ13601株を、有機酸を含有する、ビー
トモラセス、ケインモラセスを始めとする炭素源
（糖）、及びコーンスティープリカー(CSL)、大豆タン
パク質塩加水分解溶液、動物タンパク質加水分解液（肉
エキス）、カゼイン加水分解物などの窒素源を利用して
酸性pHで培養を可能にするためには、培地中の蟻酸、酢
酸などの阻害を示す有機酸の濃度を低い濃度にするか、
後に示す実施例２のように生育阻害の見られないpH域で
菌体培養を行い、阻害を示す有機酸を消費させた後、pH
を酸性pHにシフトして培養する培養方法が酸性pHでグル
タミン酸の生成を行うためには必要である。
【０１１８】
【実施例２】pHシフト培養による有機酸生育阻害の低減 エンテロバクター・アグロメランスAJ13601株は、実施
例１に示されるように、酸性pHにおいて蟻酸等の低分子
有機酸により菌体生育が阻害される。この為、ビートモ
ラセスやケインモラセスを始めとする多くの天然原料は
これらの有機酸を著量含んでいるため、エンテロバクタ
ー・アグロメランスAJ13601株を、天然原料を使用して
酸性pHで培養することは出来ない。しかし、これらの有
機酸の生育阻害は酸性pHでのみ見られ、中性pHでは見ら
れないことから、培養初期に中性pHで培養を行い、生育
阻害を示す有機酸を消費させ、その後、酸性pHにpHをシ
フトさせてグルタミン酸を生成させることを試みた。
例１に示されるように、酸性pHにおいて蟻酸等の低分子
有機酸により菌体生育が阻害される。この為、ビートモ
ラセスやケインモラセスを始めとする多くの天然原料は
これらの有機酸を著量含んでいるため、エンテロバクタ
ー・アグロメランスAJ13601株を、天然原料を使用して
酸性pHで培養することは出来ない。しかし、これらの有
機酸の生育阻害は酸性pHでのみ見られ、中性pHでは見ら
れないことから、培養初期に中性pHで培養を行い、生育
阻害を示す有機酸を消費させ、その後、酸性pHにpHをシ
フトさせてグルタミン酸を生成させることを試みた。
【０１１９】エンテロバクター・アグロメランスAJ1360
1株をテトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフェニ
コール25mg/Lを含有するLBG寒天培地（トリプトン10g/
L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、寒天15g/L）にて30℃
で14時間培養した菌体を１白金耳掻き取り、以下に示す
組成の種培養培地300mLを注入した1L容ジャーファーメ
ンターに植菌を行い、34℃及びpH6.0の条件で種培養を
行った。
1株をテトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフェニ
コール25mg/Lを含有するLBG寒天培地（トリプトン10g/
L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、寒天15g/L）にて30℃
で14時間培養した菌体を１白金耳掻き取り、以下に示す
組成の種培養培地300mLを注入した1L容ジャーファーメ
ンターに植菌を行い、34℃及びpH6.0の条件で種培養を
行った。
【０１２０】［種培養培地組成］シュークロース50g/
L、硫酸マグネシウム七水塩0.4g/L、硫酸アンモニウム
4.0g/L、燐酸二水素一カリウム2.0g/L、酵母エキス4.0g
/L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/L、硫酸マンガン五水塩0.0
1g/L、L-リジン塩酸塩0.4g/L、DL-メチオニン0.4g/L、D
L-α,ε-ジアミノピメリン酸0.4g/L、テトラサイクリン
塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L
L、硫酸マグネシウム七水塩0.4g/L、硫酸アンモニウム
4.0g/L、燐酸二水素一カリウム2.0g/L、酵母エキス4.0g
/L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/L、硫酸マンガン五水塩0.0
1g/L、L-リジン塩酸塩0.4g/L、DL-メチオニン0.4g/L、D
L-α,ε-ジアミノピメリン酸0.4g/L、テトラサイクリン
塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L
【０１２１】培養中のpHはアンモニアガスを添加するこ
とにより調整を行った。種培養培地中の糖の枯渇を指標
に種培養を終了し、本培養培地300Lを注入した1L容ジャ
ーファーメンターに、本培養培地体積の20%に当たる種
培養液を植菌し、本培養を行った。本培養培地組成は以
下に示す。
とにより調整を行った。種培養培地中の糖の枯渇を指標
に種培養を終了し、本培養培地300Lを注入した1L容ジャ
ーファーメンターに、本培養培地体積の20%に当たる種
培養液を植菌し、本培養を行った。本培養培地組成は以
下に示す。
【０１２２】［本培養培地組成］ビートモラセス（又は
ケインモラセス）20g/L、硫酸マグネシウム七水塩0.4g/
L、硫酸アンモニウム5.0g/L、燐酸二水素一カリウム6.0
g/L、塩化ナトリウム1.5g/L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/
L、硫酸マンガン五水塩0.01g/L、L-リジン塩酸塩0.8g/
L、DL-メチオニン0.6g/L、DL-α,ε-ジアミノピメリン
酸0.6g/L、テトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフ
ェニコール25mg/L、酵母エキス6.0g/L、塩化カルシウム
二水塩0.75g/L
ケインモラセス）20g/L、硫酸マグネシウム七水塩0.4g/
L、硫酸アンモニウム5.0g/L、燐酸二水素一カリウム6.0
g/L、塩化ナトリウム1.5g/L、硫酸第一鉄七水塩0.01g/
L、硫酸マンガン五水塩0.01g/L、L-リジン塩酸塩0.8g/
L、DL-メチオニン0.6g/L、DL-α,ε-ジアミノピメリン
酸0.6g/L、テトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフ
ェニコール25mg/L、酵母エキス6.0g/L、塩化カルシウム
二水塩0.75g/L
【０１２３】培養温度は34℃とし、pHは所定のpHになる
ようにアンモニアガスを添加して調整を行った。培養開
始から本培養培地中の糖及び有機酸が消費されるまでpH
6.0にて培養を行った。糖枯渇後は700g/Lのグルコース
水溶液を連続的に添加した（5ml/hr）。グルコースの連
続添加と同時にアンモニアガスの添加量を調整し、グル
タミン酸生成に伴うpH低下を利用して、約2時間でpH4.5
まで低下させ、その後pH4.5で培養を継続した。培養液
中のグルタミン酸濃度が45g/Lに達した段階でグルタミ
ン酸結晶1.0gを種晶として本培養培地に添加し、培養液
中の結晶の析出を促した。
ようにアンモニアガスを添加して調整を行った。培養開
始から本培養培地中の糖及び有機酸が消費されるまでpH
6.0にて培養を行った。糖枯渇後は700g/Lのグルコース
水溶液を連続的に添加した（5ml/hr）。グルコースの連
続添加と同時にアンモニアガスの添加量を調整し、グル
タミン酸生成に伴うpH低下を利用して、約2時間でpH4.5
まで低下させ、その後pH4.5で培養を継続した。培養液
中のグルタミン酸濃度が45g/Lに達した段階でグルタミ
ン酸結晶1.0gを種晶として本培養培地に添加し、培養液
中の結晶の析出を促した。
【０１２４】本培養を50時間行った結果、ジャーファー
メンター内には著量のグルタミン酸結晶が析出した。そ
の後、アンモニアガスを添加し、pHを6.0に上昇させ、
ジャーファーメンター内の全てのグルタミン酸結晶を溶
解させた後、生成グルタミン酸量の測定を行った。ま
た、培養初期からｐＨを４．５に保つ他は同様にして、
培養を行い、生成グルタミン酸量の測定を行った。この
場合には、菌体の減少が生じたため、培養を28時間で中
止した。結果を表２に示す。
メンター内には著量のグルタミン酸結晶が析出した。そ
の後、アンモニアガスを添加し、pHを6.0に上昇させ、
ジャーファーメンター内の全てのグルタミン酸結晶を溶
解させた後、生成グルタミン酸量の測定を行った。ま
た、培養初期からｐＨを４．５に保つ他は同様にして、
培養を行い、生成グルタミン酸量の測定を行った。この
場合には、菌体の減少が生じたため、培養を28時間で中
止した。結果を表２に示す。
【０１２５】
【表２】 表２ 発酵成績の比較 ─────────────────────────── 培養方法 OD(x101) 生成グルタミン酸量(g) ─────────────────────────── pHシフト 0.753 50.4 pH4.5一定 0.078 2.6 ───────────────────────────
【０１２６】また、培養中の菌体の生育の経時変化を、
波長620nmの光学密度（ＯＤ）により測定した。結果を
図１３に示す。
波長620nmの光学密度（ＯＤ）により測定した。結果を
図１３に示す。
【０１２７】その結果、培養初期から酸性pHで培養を行
った実験区では菌体生育が阻害され、グルタミン酸生成
もほとんど見られなかったが、pHシフト培養を行った実
験区ではグルタミン酸の結晶が培養液中に析出され、同
方法により有機酸含有の天然原料が使用可能であること
が示された。
った実験区では菌体生育が阻害され、グルタミン酸生成
もほとんど見られなかったが、pHシフト培養を行った実
験区ではグルタミン酸の結晶が培養液中に析出され、同
方法により有機酸含有の天然原料が使用可能であること
が示された。
【０１２８】以上の結果から、pHシフト培養を行うこと
により、有機酸が含まれる天然原料を使用しても、酸性
pHでグルタミン酸の結晶を析出させる培養が可能となる
ことが確認された。
により、有機酸が含まれる天然原料を使用しても、酸性
pHでグルタミン酸の結晶を析出させる培養が可能となる
ことが確認された。
【０１２９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、廃糖蜜などの、
微生物の生育を阻害する有機酸を含有する材料を糖源と
して用いた場合にも、効率的にＬ−グルタミン酸を製造
できる。
微生物の生育を阻害する有機酸を含有する材料を糖源と
して用いた場合にも、効率的にＬ−グルタミン酸を製造
できる。
【図１】 ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・ア
グロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。
グロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。
【図２】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＡ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
上段：エンテロバクター・アグロメランス、下段：エシ
ェリヒア・コリ（以下、同様）。
ｕｃＡ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
上段：エンテロバクター・アグロメランス、下段：エシ
ェリヒア・コリ（以下、同様）。
【図３】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
ｕｃＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【図４】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【図５】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
ｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【図６】 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈ
Ａ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す
図。
Ａ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す
図。
【図７】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起
点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳ
Ｆ−Ｔｅｔの構築を示す図である。
点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳ
Ｆ−Ｔｅｔの構築を示す図である。
【図８】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起
点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦＣＰＧの構築を示す図。
点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦＣＰＧの構築を示す図。
【図９】 ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶ
ＣＢの構築を示す図。
ＣＢの構築を示す図。
【図１０】 種々の有機酸の酸性pH（pH4.5）における
生育阻害効果を示す図。
生育阻害効果を示す図。
【図１１】 蟻酸を用いて生育阻害が起こるpHの検討を
行った結果を示す図。
行った結果を示す図。
【図１２】 pH4.5の条件下で生育阻害を示す蟻酸濃度
の検討を行った結果を示す図。
の検討を行った結果を示す図。
【図１３】 培養中の菌体の生育の経時変化を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月２２日（２００１．８．２
２）
２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８９】ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・
アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に
示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列の中に
は、２つの完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列
と思われる塩基配列が見いだされた。これらのホモロジ
ー検索をした結果、塩基配列を決定した部分は、サクシ
ネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイ
ン遺伝子（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長
のｓｕｃＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓ
ｕｃＢ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニッ
ト遺伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んで
いることが明らかとなった。これらの塩基配列から推定
されるアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのも
の（Eur.J.Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Bi
ochem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 624
5-6252 (1985)）と比較した結果を図２〜５に示す。こ
のように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。
また、エンテロバクター・アグロメランス染色体上でも
エシェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem., 141,
351-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (198
4)、Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)）、ｓｄｈＢ
−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成し
ていることが判明した。
アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に
示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列の中に
は、２つの完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列
と思われる塩基配列が見いだされた。これらのホモロジ
ー検索をした結果、塩基配列を決定した部分は、サクシ
ネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイ
ン遺伝子（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長
のｓｕｃＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓ
ｕｃＢ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニッ
ト遺伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んで
いることが明らかとなった。これらの塩基配列から推定
されるアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのも
の（Eur.J.Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Bi
ochem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 624
5-6252 (1985)）と比較した結果を図２〜５に示す。こ
のように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。
また、エンテロバクター・アグロメランス染色体上でも
エシェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem., 141,
351-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (198
4)、Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)）、ｓｄｈＢ
−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成し
ていることが判明した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１００】（ii）ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌ
ｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構
築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ
遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-18
28）をもとに作成されたプライマーＤＮＡを用い、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋ
ｂのｇｌｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消
化したプラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購
入）に挿入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図
９）。次に、ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切
り出された約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化したプラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）よ
り購入）に挿入し、プラスミドｐＳＴＶＣＢを得た（図
９）。得られたプラスミドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝
子を発現していることは、エンテロバクター・アグロメ
ランスＡＪ１３３５５株中での酵素活性の測定によって
確認した。
メンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌ
ｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構
築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ
遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-18
28）をもとに作成されたプライマーＤＮＡを用い、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋ
ｂのｇｌｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消
化したプラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購
入）に挿入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図
９）。次に、ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切
り出された約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化したプラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）よ
り購入）に挿入し、プラスミドｐＳＴＶＣＢを得た（図
９）。得られたプラスミドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝
子を発現していることは、エンテロバクター・アグロメ
ランスＡＪ１３３５５株中での酵素活性の測定によって
確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
ｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） ） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA74 CA02 DA10 4B064 AE19 CA02 CA19 CC07 CC09 CC24 DA10 4B065 AA01X AB01 AC04 AC14 AC15 BB01 BB22 BC02 BC13 BC15 CA17 CA42
Claims (19)
- 【請求項１】 Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有す
る微生物を、ｐＨが５．０以下である培地であって、こ
のｐＨで微生物の生育を阻害する有機酸の合計含有量が
微生物の生育を阻害しない量である培地中で培養するこ
とを含む、発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。 - 【請求項２】 培地中での培養により、培地中にＬ−グ
ルタミン酸が析出しながら生成蓄積する請求項１記載の
製造法。 - 【請求項３】 有機酸の合計含有量が０．４ｇ／Ｌ以下
である請求項１又は２記載の製造法。 - 【請求項４】 有機酸が炭素数１〜３の有機酸である請
求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。 - 【請求項５】 微生物がエンテロバクター属に属する請
求項１〜４のいずれか一項に記載の製造法。 - 【請求項６】 微生物がエンテロバクター・アグロメラ
ンスである請求項５記載の製造法。 - 【請求項７】 微生物が、特定のｐＨにおいて飽和濃度
のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素
源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中
にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グルタ
ミン酸を蓄積する能力を有する微生物である請求項１〜
６のいずれか１項に記載の製造法。 - 【請求項８】 前記特定のｐＨが５．０又はそれ以下で
ある請求項７に記載の製造法。 - 【請求項９】 Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有す
る微生物を、培地中の有機酸による微生物の生育の阻害
が生じない第１のｐＨで培養し、次いで微生物によるＬ
−グルタミン酸の生産に適した、第１のｐＨより低い第
２のｐＨで培養することを含む、発酵法によるＬ−グル
タミン酸の製造法。 - 【請求項１０】 有機酸が炭素数１〜３の有機酸である
請求項９記載の製造法。 - 【請求項１１】 第２のｐＨが３．０〜５．０である請
求項９又は１０記載の製造法。 - 【請求項１２】 第１のｐＨでの培養を、アルカリ化物
質を培地に添加することにより培地のｐＨを第１のｐＨ
に維持しながら行う請求項９〜１１のいずれか１項に記
載の製造法。 - 【請求項１３】 第１のｐＨでの培養後、アルカリ化物
質の添加量を調整することにより、培地のｐＨを低下さ
せることを含む請求項１２記載の製造法。 - 【請求項１４】 第１のｐＨでの培養が、培地中の有機
酸が枯渇するまで継続される請求項９〜１３のいずれか
１項に記載の製造法。 - 【請求項１５】 微生物がエンテロバクター属に属する
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の製造法。 - 【請求項１６】 微生物がエンテロバクター・アグロメ
ランスである請求項１５記載の製造法。 - 【請求項１７】 微生物が、特定のｐＨにおいて飽和濃
度のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭
素源を代謝することができ、かつ、前記ｐＨの液体培地
中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を超える量のＬ−グル
タミン酸を蓄積する能力を有する微生物である請求項９
〜１６のいずれか１項に記載の製造法。 - 【請求項１８】 前記特定のｐＨが５．０又はそれ以下
である請求項１７に記載の製造法。 - 【請求項１９】 Ｌ−グルタミン酸の生産に適したｐＨ
が、前記微生物が生産したＬ−グルタミン酸が培地中に
析出するｐＨであり、このｐＨでの培養により培地中に
Ｌ−グルタミン酸が析出しながら生成蓄積する請求項１
７又は１８に記載の製造法。
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001044135A JP4599725B2 (ja) | 2001-02-20 | 2001-02-20 | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
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