BR0200487B1

BR0200487B1 - Método para produzir ácido l-glutâmico pela fermentação

Info

Publication number: BR0200487B1
Application number: BRPI0200487-9A
Authority: BR
Inventors: Masakazu Sato; Naoki Akiyoshi
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2014-02-18
Also published as: RU2288271C2; CN100415893C; DE60207914D1; PE20020887A1; BR0200487A; KR20020068294A; ATE312937T1; AU1565802A; EP1233070A2; DE60207914T2; ES2252331T3; US20020192772A1; JP4599725B2; EP1233070A3; EP1233070B1; MY128886A; JP2002238591A; CN1377972A; AU783280B2; US6653110B2

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO PELA FERMENTAÇÃO”.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação. O ácido L-glutâmico é amplamente usado como uma matéria prima de temperos e assim por diante. O ácido L-glutâmico é produzido principalmente pela fermentação utilizando as chamadas bactérias corineformes produtoras de ácido L-glutâmico pertencentes aos gêneros Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ou cepas mutantes destes (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pelo menos um. 195 a 215, 1986).

Como métodos para produzir o ácido L-glutâmico pela fermentação usando- · se outras cepas bacterianas, existe um método conhecido que usa um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium ou coisa parecida (Patente U.S. Ne 3.220.929), um método usando um microorganismo pertencente ao gênero Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, ou coisa parecida (Patente U.S. N° 3.563.857), um método que usa um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (correntemente chamado de Enterobacter aerogenes) ou coisa parecida (Pedido de Patente Japonesa (Kokoku) Ns 32-9393), um método que usa uma cepa mutante da Escherichia coli (Pedido de Patente Japonês aberto ao público (Kokai) N° 5-244970) e assim por diante. Além disso, os inventores da presente invenção propuseram um método para produzir ácido L-glutâmico pelo uso de um microorganismo pertencente ao gênero Klebsiella, Erwinia ou Pantoea (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N-2000-106869).

Além disso, foram divulgadas várias técnicas para melhorar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico realçando-se as atividades das enzimas biossintéticas do ácido L-glutâmico através do uso de técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, foi reportado que a introdução de um gene que codifica a citrato sintase derivado da Escherichia coli ou da Corynebacterium. glutamicum foi eficaz para o realce da capacidade produtora de ácido L-glutâmico nas bactérias Corynebacterium ou Brevibacterium (Pedido de Patente Japonês (Kokoku) N- 7-121228). Além disso, o Pedido de Patente Japonês aberto ao público N° 61-268185 divulga uma célula que abriga DNA recombinante contendo um gene da glutamato desidrogenase derivado das bactérias Corynebacterium. Além disso, o Pedido de Patente Japonês aberto ao público N° 63-214189 divulgam a técnica para aumentar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico pela amplificação de um gene da glutamato desidrogenase, um gene da isocitrato desidrogenase, um gene da aconitato hidratase e um gene da citrato sintase.

Embora a produtividade do ácido L-glutâmico tenha sido consideravelmente aumentada pelo cruzamento anteriormente mencionado de microorganismos ou melhora dos métodos de produção, o crescimento de métodos para produzir mais eficientemente o ácido L-glutâmico a um custo mais baixo é requerido para atingir aumento adicional da demanda no futuro. r E conhecido um método em que a fermentação é realizada conforme o L-aminoácido acumulado na cultura é cristalizado (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N2 62-288). Neste método, a concentração de L-aminoácido na cultura é mantida abaixo de um certo nível pela precipitação do L-aminoácido acumulado na cultura. Especificamente, o L- triptofano, a L-tirosina ou a L-leucina são precipitados durante a fermentação ajustando-se a temperatura e o pH da cultura ou adicionando-se um tensoativo ao meio.

Embora um método de realizar a fermentação com precipitação de L-aminoácido associada seja conhecido como descrito acima, os aminoácidos adequados para este método são aqueles que apresentam uma solubilidade em água relativamente baixa e nenhum exemplo de aplicação do método a aminoácidos altamente solúveis em água, tais como o ácido L- glutâmico é conhecido. Além disso, o meio deve ter pH baixo para precipitar o ácido L-glutâmico. Entretanto, as bactérias produtoras de ácido L- glutâmico tais como aquelas mencionadas acima não podem crescer-se sob uma condição ácida e portanto a fermentação do ácido L-glutâmico é realizada sob condições neutras (Patentes U.S. N~ 3.220.929 e 3.023.474; K. C. Chao & J. W. Foster, J. Bacteriol., 77, pp. 715 a 725 (1959)). Assim, a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação associada com precipitação não é conhecida. Além disso, é conhecido que o cultivo da maioria das bactérias acidófilas é inibido pelos ácidos orgânicos tais como o ácido acético, o ácido lático e o ácido succínico (Yasuro Oshima Ed., “Extreme Environment Microorganism Handbook”, p. 231, Science Forum; R. M.

Borichewski, J. Bacteriol., 93, pp. 597 a 599 (1967) etc.). Portanto, é considerado que muitos microorganismos sejam suscetíveis ao ácido L- glutâmico, que é também um ácido orgânico, sob condições ácidas e não existe nenhum relato de que a pesquisa de microorganismos que apresentem capacidade produtora de ácido L-glutâmico sob condições ácidas tenha sido tentada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que permita a produção eficiente de ácido L-glutâmico mesmo quando um material contendo um ácido orgânico que iniba o crescimento de um microorganismo em um pH baixo seja usado como uma fonte de açúcar.

Os inventores da presente invenção verificaram que, em um pH neutro, uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico consumiu um ácido orgânico que inibiu o crescimento da bactéria produtora de ácido L-glutâmico em um pH baixo e que com base nesta propriedade, o ácido L-glutâmico pôde ser eficientemente produzido usando-se um material contendo um ácido orgânico que inibiu o crescimento de um microorganismo em um pH baixo como uma fonte de açúcar. Assim, realizaram a presente invenção. A presente invenção fornece os seguintes. (1) um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um meio tendo pH de 5,0 ou menos, em que um teor total de um ácido orgânico que inibe o crescimento do microorganismo no pH é um no qual o crescimento do microorganismo não é inibido. (2) O método de acordo com (1), em que o ácido L-glutâmico é produzido e acumulado no meio com a precipitação do ácido L-glutâmico associada durante a cultura no meio. (3) O método de acordo com (1) ou (2), em que o teor total do ácido orgânico é 0,4 g/litro ou menos. (4) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o ácido orgânico é um ácido orgânico tendo número de carbono de 1 a 3. (5) O método de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o microorganismo pertence ao gênero Enterobacter. (6) O método de acordo com (5), em que o microorganismo é Enterobacter agglomerans. (7) O método de acordo com qualquer um de (1) a (6), o microorganismo pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em um pH específico e tem a capacidade para acumular ácido L- glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH. (8) O método de acordo com (7), em que o pH específico é 5,0 ou menos. (9) O método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um primeiro pH no qual o crescimento do microorganismo não é inibido por um ácido orgânico em um meio e depois cultivar o microorganismo em um segundo pH que seja adequado para a produção de ácido L-glutâmico pelo microorganismo e seja mais baixo do que o primeiro pH. (10) O método de acordo com (9), em que o ácido orgânico é um ácido orgânico tendo número de carbono de 1 a 3. (11) O método de acordo com (9) ou (10), em que o segundo pH é de 3,0 a 5,0. (12) O método de acordo com qualquer um de (9) a (11), em que a cultura no primeiro pH é realizada enquanto pH do meio é mantido para ser o primeiro pH pela adição de uma substância alcalinizante ao meio. (13) O método de acordo com (12), que compreende diminuir o pH do meio controlando-se a quantidade de adição da substância alcalinizante depois da cultura no primeiro pH. (14) O método de acordo com qualquer um de (9) a (13), em que a cultura no primeiro pH é continuada até que o ácido orgânico no meio seja esgotado. (15) O método de acordo com qualquer um de (9) a (14), em que o microorganismo pertence ao gênero Enterobacter. (16) O método de acordo com (15), em que o microorganismo é o Enterobacter agglomerans. (17) O método de acordo com qualquer um de (9) a (16), em que o microorganismo pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em um pH específico e tem a capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH. (18) O método de acordo com (17), em que o pH específico é 5,0 ou menos.

(19) O método de acordo com (17) ou (18), em que o pH adequado para a produção de ácido L-glutâmico é um pH no qual o ácido L- glutâmico produzido pelo microorganismo precipita no meio e o ácido L- glutâmico é produzido e acumulado com a precipitação do ácido L-glutâmico associada, durante a cultura no meio naquele pH.

De acordo com os métodos da presente invenção, o ácido L- glutâmico pode ser eficientemente produzido mesmo quando um material contendo um ácido orgânico que iniba o crescimento de um microorganismo, tal como melaço “faixa negra”, é usado como uma fonte de açúcar.

EXPLANAÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS A Figura 1 é um mapa da enzima de restrição de um fragmento de DNA derivado da Enterobacter agglomerans em pTWVEKlOl. A Figura 2 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sucA derivado da Enterobacter agglomerans e aquela derivada da Escherichia coli (superior: Enterobacter agglomerans, coluna: Escherichia coli, o mesmo deve-se aplicar às seguintes). A Figura 3 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sucB derivado da Enterobacter agglomerans e aquela derivada da Escherichia coli. A Figura 4 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sucC derivado da Enterobacter agglomerans e aquela derivada da Escherichia coli. A Figura 5 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sdhB derivado da Enterobacter agglomerans e aquela derivada da Escherichia coli.

A Figura 6 mostra a construção de um plasmídeo pMWCPG contendo um gene gltA, um gene ppc e um gene gdhA. A Figura 7 mostra a construção de um plasmídeo RSF-Tet contendo uma origem de replicação de um plasmídeo RSF1010 de faixa de hospedeiro ampla e um gene de resistência à tetraciclina.

A Figura 8 mostra a construção de um plasmídeo RSFCPG contendo uma origem de replicação de um plasmídeo RSF1010 de faixa de hospedeiro ampla, um gene de resistência à tetraciclina, um gene gltA, um gene ppc e um gene gdhA.

A Figura 9 mostra a construção de um plasmídeo pSTVCB contendo um gene gltA. A Figura 10 mostra o efeito na inibição de crescimento de vários ácidos orgânicos em um pH ácido (pH 4,5). A Figura 11 mostra os resultados de investigação usando-se ácido fórmico para o pFÍ no qual a inibição de crescimento é causada. A Figura 12 mostra os resultados de investigação para a concentração de ácido fórmico que causa inibição de crescimento sob uma condição de pH 4,5. A Figura 13 mostra um curso de tempo de crescimento celular durante a cultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes. O método de produção de acordo com a primeira forma de realização da presente invenção (daqui por diante também chamado de “primeiro método de produção da presente invenção”) é um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico (daqui por diante também chamado de “bactéria produtora de ácido L-glutâmico”) em um meio tendo pH de 5,0 ou menos, em que um teor total de um ácido orgânico que iniba o crescimento do microorganismo no pH seja um no qual o crescimento do microorganismo não seja inibido.

No primeiro método de produção da presente invenção é preferido que o ácido L-glutâmico seja produzido e acumulado pela cultura em um meio com precipitação do ácido L-glutâmico associada. Isto pode ser conseguido ajustando-se o pH do meio em um pH no qual o ácido L- glutâmico produzido precipite. Tal pH é usualmente de 3,0 a 5,0. É considerado que, na produção de ácido L-glutâmico pela fermentação, a redução da produtividade pelo ácido L-glutâmico acumulado no meio em uma concentração alta constitua um obstáculo para a melhora da produtividade. Por exemplo, uma célula microbiana tem um sistema de descarga e um sistema de absorção para o ácido L-glutâmico e se o ácido L- glutâmico uma vez descarregado no meio é novamente absorvido na célula, não apenas a eficiência de produção é reduzida, mas também resulta na inibição das reações para a biossíntese do ácido L-glutâmico. Realizando-se a cultura em um pH no qual o ácido L-glutâmico produzido precipita, tal redução de produtividade devido ao acúmulo de ácido L-glutâmico a uma concentração alta pode ser prevenido. O meio tem um pH de preferivelmente 4,5 ou menos, mais preferivelmente 4,0 ou menos.

Nesta forma de realização, o ácido orgânico que inibe o crescimento de um microorganismo no pH do meio significa um ácido orgânico que tem um efeito inibidor sobre a inibição de crescimento do microorganismo quando existe em uma certa concentração (usualmente 0,5 g/litro ou mais) no meio no pH e é usualmente um ácido orgânico tendo número de carbono de 1 a 3, isto é, ácido fórmico, ácido acético ou ácido propiônico. O teor total do ácido orgânico é preferivelmente 0,4 g/litro ou menos, mais preferivelmente 0,3 g/litro ou menos, ainda mais preferivelmente 0,2 g/litro ou menos, O método de produção de acordo com a segunda forma de realização da presente invenção (daqui por diante também chamada de “o segundo método de produção da presente invenção”) é um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um primeiro pH no qual o crescimento do microorganismo não seja inibido por um ácido orgânico em um meio e depois cultivar o microorganismo em um segundo pH que seja adequado para a produção de ácido L-glutâmico pelo microorganismo e seja mais baixo do que o primeiro pH.

Foi verificado que uma bactéria produtora de ácido L- glutâmico, no geral, sofre da inibição de crescimento por um ácido orgânico sob uma condição ácida, ao passo que esta pode consumir um ácido orgânico sob uma condição neutra. Com base nesta propriedade, efetuando-se o crescimento celular em um pH neutro e depois mudando o pH para o pH ácido para produzir o ácido L-glutâmico, toma-se possível obter produtividade mais alta e toma-se também possível usar vários materiais como uma fonte de açúcar.

Nesta forma de realização, o ácido orgânico significa um ácido orgânico que tenha um efeito inibidor sobre o crescimento de microorganismo quando exista em uma certa concentração (usualmente 0,5 g/litro ou mais) em um meio no segundo pH e este é usualmente um ácido orgânico tendo um número de carbono de 1 a 3, isto é, ácido fórmico, ácido acético ou ácido propiônico. O primeiro pH e o segundo pH são selecionados de modo que devam atingir as propriedades de uma bactéria produtora de ácido L- glutâmico a ser usada. Estes valores de pH podem ser facilmente medidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, o pH no qual a inibição de crescimento do microorganismo não seja causada por um ácido orgânico em um meio pode ser determinado cultivando-se uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico no meio contendo um ácido orgânico ajustado em vários valores de pH, medindo-se as quantidades de célula com base na absorbância ou coisa parecida e comparando-se as quantidades de célula com as quantidades de célula da bactéria produtora de ácido L-glutâmico cultivada sob as mesmas condições, exceto que o meio não contém o ácido orgânico. O pH adequado para a produção do ácido L-glutâmico refere-se ao pH no qual o ácido L-glutâmico é acumulado em um meio, determinável cultivando-se uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico em meio de vários valores de pH.

Especificamente, este pode ser determinado medindo-se as quantidades de ácido L-glutâmico acumuladas em meio de vários valores de pH e comparando-as. O primeiro pH não é particularmente limitado contanto que o crescimento de microorganismo não seja inibido pelo ácido orgânico no meio, mas é usualmente de 5,0 a 8,0. O segundo pH é preferivelmente um pH no qual o ácido L- glutâmico produzido precipita e tal pH é usualmente de 3,0 a 5,0. Como explicado para o primeiro método de produção da presente invenção, a redução da produtividade pelo acúmulo de ácido L-glutâmico em uma concentração alta pode ser prevenido realizando-se a cultura no pH no qual o ácido L-glutâmico produzido precipita. O primeiro pH e o segundo pH podem não ser estritamente constantes durante a cultura contanto que a vantagem da presente invenção possa ser obtida e podem flutuar. A bactéria produtora de ácido L-glutâmico produz ácido L- glutâmico mesmo no primeiro pH e portanto o pH é diminuído pelo ácido L- glutâmico produzido. Portanto, a cultura no primeiro pH é preferivelmente realizada enquanto se mantém o pH do meio no primeiro pH pela adição de uma substância alcalinizante ao meio.

Embora a substância alcalinizante não seja particularmente limitada, contanto que não afete adversamente o crescimento da bactéria produtora de ácido L-glutâmico ou a produção do ácido L-glutâmico, o gás amônia é preferido. O pH do meio pode ser diminuído do primeiro pH para o segundo pH pela adição de uma substância ácida. Entretanto, o pH é diminuído pelo ácido L-glutâmico produzido pela bactéria produtora de ácido L-glutâmico durante a cultura como descrito acima. Portanto, é preferível diminuir o pH do meio do primeiro pH para o segundo pH controlando-se a quantidade de adição da substância alcalinizante, porque a adição da substância ácida pode ser omitida. A cultura no primeiro pH pode ser continuada até que o ácido orgânico no meio seja esgotado. O esgotamento significa que a quantidade do ácido orgânico diminui a um nível no qual o crescimento da bactéria produtora de ácido L-glutâmico não é inibido durante a cultura no segundo pH. Tal nível do ácido orgânico pode ser facilmente medido por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, o nível pode ser determinado cultivando- se uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico em meio contendo um ácido orgânico em várias concentrações no segundo pH, medindo-se as quantidades de célula da bactéria produtora de ácido L-glutâmico e comparando-se as quantidades de célula com as quantidades de célula da bactéria produtora de ácido L-glutâmico cultivadas sob as mesmas condições, exceto que o meio não contém o ácido orgânico. No geral, conforme o segundo pH toma-se mais baixo, o nível do ácido orgânico também toma-se mais baixo. A bactéria produtora de ácido L-glutâmico usada no primeiro método de produção da presente invenção e o segundo método de produção da presente invenção é um microorganismo que acumula uma quantidade significante de ácido L-glutâmico em um meio quando é cultivado no meio.

Os exemplos destes incluem microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter. O preferido é o Enterobacter agglomerans.

Além disso, a bactéria produtora de ácido L-glutâmico usada no primeiro e no segundo métodos de produção da presente invenção é preferivelmente um microorganismo que possa metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em um pH específico e tenha uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH anteriormente mencionado (daqui por diante também chamado de “microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico”). O pH específico anteriormente mencionado é preferivelmente um pH no qual o ácido L- glutâmico precipita no meio e tal pH é usualmente 5,0 ou menos. A “concentração de saturação” significa uma concentração de ácido L-glutâmico dissolvida no meio líquido quando o meio líquido está saturado com ácido L-glutâmico.

Quando um microorganismo acumulador de ácido L- glutâmico é usado, o pH adequado para a produção de ácido L-glutâmico é preferivelmente um pH no qual o ácido L-glutâmico precipita no meio.

Realizando-se a cultura neste pH o ácido L-glutâmico é produzido e acumulado no meio com a sua precipitação associada. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico pode ser obtido como segue. Uma amostra contendo microorganismos é inoculada em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e uma fonte de carbono, em um pH específico e uma cepa que metabolize a fonte de carbono é selecionada. Embora o pH específico não seja particularmente limitado, é usualmente cerca de 5,0 ou menos, preferivelmente cerca de 4,5 ou menos, mais preferivelmente cerca de 4,3 ou menos. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é usado para a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação com precipitação do ácido L-glutâmico associada. Se o pH for muito alto, toma-se difícil permitir que o microorganismo produza o ácido L-glutâmico em uma quantidade suficiente para a precipitação. Portanto, o pH está preferivelmente na faixa anteriormente mencionada.

Se o pH de uma solução aquosa contendo ácido L-glutâmico for diminuída, a solubilidade do ácido L-glutâmico cai significantemente em tomo do pKa do grupo γ-carboxila (4,25, 25° C). A solubilidade toma-se a mais baixa no ponto isoelétrico (pH 3,2) e o ácido L-glutâmico que excede a quantidade correspondente à concentração de saturação é precipitado.

Embora dependa da composição do meio, o ácido L-glutâmico é dissolvido em uma quantidade de 10 a 20 g/litro no pH 3,2, de 30 a 40 g/litro no pH 4,0 e de 50 a 60 g/litro no pH 4,7, a cerca de 30° C. Usualmente, o pH não necessita ser feito a 3,0 ou mais baixo, porque o efeito de precipitação do ácido L-glutâmico atinge o seu limite superior quando pH vai abaixo de um certo valor. Entretanto, o pH pode ser 3,0 ou menos.

Além disso, a expressão que um microorganismo “pode metabolizar uma fonte de carbono” significa que pode proliferar ou pode consumir uma fonte de carbono mesmo que não possa proliferar, isto é, indica que cataboliza uma fonte de carbono tal como açúcares ou ácidos orgânicos. Especificamente, por exemplo, se um microorganismo prolifera quando é cultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28° C, 37° C ou 50° C, durante 2 a 4 dias, este microorganismo pode metabolizar a fonte de carbono no meio.

Além disso, por exemplo, se um microorganismo consome uma fonte de carbono mesmo que o microorganismo não prolifere, quando é cultivado em um meio líquido sintético contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28° C, 37° C ou 50° C, durante 2 a 4 dias, o microorganismo é um microorganismo que pode metabolizar a fonte de carbono no meio. O microorganismo que pode metabolizar uma fonte de carbono inclui um microorganismo que pode crescer no meio líquido anteriormente mencionado.

Além disso, a expressão que um microorganismo “pode crescer” significa que o mesmo pode proliferar ou pode produzir ácido L- glutâmico mesmo que não possa proliferar. Especificamente, por exemplo, se um microorganismo prolifera quando é cultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28° C, 37° C ou 50° C, durante 2 a 4 dias, este microorganismo pode crescer-se no meio. Além disso, por exemplo, se um microorganismo aumenta uma quantidade de ácido L-glutâmico em um meio líquido sintético mesmo que o microorganismo não prolifere, quando o microorganismo é cultivado no meio líquido sintético contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28° C, 37° C ou 50° C, durante 2 a 4 dias, este microorganismo é um microorganismo que pode crescer-se no meio. A seleção descrita acima pode ser repetida duas ou mais vezes sob as mesmas condições ou com mudança do pH ou da concentração de ácido L-glutâmico. Uma seleção para um estágio anterior pode ser realizada em um meio contendo ácido L-glutâmico em uma concentração mais baixo do que a concentração de saturação e depois disso uma seleção subseqüente pode ser realizada em um meio contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação. Além disso, as cepas com propriedades favoráveis tais como taxa de proliferação superior podem ser selecionadas. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é um microorganismo que tenha uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a quantidade correspondente à concentração de saturação do ácido L-glutâmico em um meio líquido, além das propriedades descritas acima. O pH do meio líquido anteriormente mencionado é preferivelmente o mesmo ou próximo daquele do meio usado para avaliar um microorganismo tendo as propriedades anteriormente mencionadas. Usualmente, um microorganismo toma-se suscetível ao ácido L-glutâmico em uma concentração alta conforme o pH toma-se mais baixo.

Portanto, é preferido que o pH não seja baixo em vista da resistência ao ácido L-glutâmico, mas o pH baixo é preferido em vista da produção de ácido L- glutâmico com a sua precipitação associada. Para satisfazer estas condições, o pH pode estar na faixa de 3 a 5, preferivelmente de 4 a 5, mais preferivelmente de 4 a 4,7, ainda mais preferivelmente de 4 a 4,5, particular e preferivelmente de 4,0 a 4,3.

Como o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico ou os materiais de reprodução para estes, podem ser mencionados, por exemplo, os microorganismos pertencentes aos gêneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces ou coisa parecida. Entre estes, os microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter são preferidos. A seguir, o microorganismo da presente invenção será explicado principalmente para os microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter. Entretanto, o microorganismo não está limitado àqueles pertencentes ao gênero Enterobacter e aqueles pertencentes a outros gêneros podem ser similarmente usados.

Como um microorganismo pertencente ao Enterobacter, pode ser especificamente mencionado o Enterobacter agglomerans, preferivelmente o Enterobacter agglomerans da cepa AJ13355. Esta cepa foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão como uma cepa que pode proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em pH baixo.

As propriedades fisiológicas da AJ13355 estão mostradas abaixo: (1) Marcação Gram: negativo (2) Comportamento contra oxigênio: anaeróbica facultativa (3) Catalase: positivo (4) Oxidase: negativo (5) Capacidade redutora de nitrato: negativo (6) Teste de Voges-Proskauer: positivo (7) Teste de Vermelho de Metila: negativo (8) Urease: negativo (9) Produção de indol: positivo (10) Motilidade: capaz de mover-se (11) Produção de H2S no meio TSI: fracamente ativa (12) β-Galactosidase: positivo (13) Propriedade assimiladora de sacarídeo: Arabinose: positivo Sacarose: positivo Lactose: positivo Xilose: positivo Sorbitol: positivo Inositol: positivo Trealose: positivo Maltose: positivo Glicose: positivo Adonitol: negativo Rafinose: positivo Salicina: negativo Melibiose: positivo (14) Propriedade assimiladora de glicerose: positivo (15) Propriedade assimiladora de ácido orgânico: f Acido cítrico: positivo Acido tartárico: negativo r Acido glicônico: positivo Acido acético: positivo r Acido malônico: negativo (16) Arginina desidratase: negativo (17) Omitina descarboxilase: negativo (18) Lisina descarboxilase: negativo (19) Fenilalanina desaminase: negativo (20) Formação de pigmento: amarelo (21) Capacidade de liquefação de gelatina: positivo (22) pH de crescimento: crescimento possível no pH 4, bom crescimento no pH 4,5 a 7,0 (23) Temperatura de crescimento: bom crescimento a 25° C, bom crescimento a 30° C, bom crescimento a 37° C, crescimento possível a 42° C, crescimento impossível a 45° C.

Com base nestas propriedades bacteriológicas, a AJ13355 foi determinada como Eníerobacter agglomerans. A Eníerobacter agglomerans AJ13355 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science anda Technology) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16644. Esta foi depois transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6614. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico pode ser um microorganismo tendo originalmente capacidade produtora de ácido L- glutâmico ou um que tenha capacidade produtora de ácido L-glutâmico comunicada ou realçada pelo cmzamento através do uso de tratamento de mutagênese, técnicas de DNA recombinante ou coisa parecida. A capacidade produtora de ácido L-glutâmico pode ser comunicada ou realçada, por exemplo, aumentando-se a atividade de uma enzima que catalise uma reação para a biossíntese de ácido L-glutâmico. A capacidade produtora de ácido L-glutâmico também pode ser realçada diminuindo-se ou eliminando-se a atividade de uma enzima que catalise uma reação que ramifica do caminho biossintético do ácido L-glutâmico e gera um composto outro que não o ácido L-glutâmico.

Como exemplos da enzima que catalisa a reação para a biossíntese de ácido L-glutâmico podem ser mencionados a glutamato desidrogenase (a seguir, também chamada de “GDH”), glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (a seguir, também chamada de “CS”), fosfoenolpiruvato carboxilase (a seguir também chamada de “PEPC”), piruvato desidrogenase, piruvato cinase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato cinase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, triosefosfato isomerase, frutose bisfosfato aldolase, fosfoffutocinase, glicose fosfato isomerase e assim por diante. Entre estas enzimas, uma, duas ou três de CS, PEPC e GDH são preferidas. Além disso, é preferido que as atividades de todas as três enzimas, CS, PEPC e GDH sejam realçadas no microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico. Em particular, a CS da Brevebacterium lactofermeníum é preferida, porque não sofre da inibição pelo ácido a-cetoglutárico, ácido L-glutâmico e NADH.

De modo a realçar a atividade de CS, PEPC ou GDH, por exemplo, um gene codificador para CS, PEPC ou GDH pode ser clonado em um plasmídeo apropriado e um microorganismo hospedeiro pode ser transformado com o plasmídeo obtido. O número de cópia do gene que codifica a CS, PEPC ou GDH (daqui em diante, abreviado como “gene gltA”, “gene ppc” e “gene gdhA”, respectivamente) na célula da cepa transformada aumenta, resultando no aumento da atividade de CS, PEPC ou GDH.

Os genes gltA, ppc e gdhA clonados são introduzidos na cepa precursora de partida anteriormente mencionada sozinhos ou em combinação de dois ou três tipos arbitrários deles. Quando dois ou três tipos dos genes são introduzidos, dois ou três tipos dos genes podem ser clonados em um tipo de plasmídeo e introduzidos no hospedeiro ou separadamente clonados em dois ou três tipos de plasmídeos que possam coexistir e introduzidos no hospedeiro.

Dois ou mais tipos de genes que codificam uma enzima do mesmo tipo, mas derivada de microorganismos diferentes, podem ser introduzidos no mesmo hospedeiro.

Os plasmídeos descritos acima não são particularmente limitados contanto que sejam autonomamente replicáveis em uma célula de um microorganismo pertencente, por exemplo, ao gênero Enterobacter ou coisa parecida. Entretanto, podem ser mencionados, por exemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMWl 19, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 e assim por diante. Além destes, os vetores de DNA de fago também podem ser usados. A transformação pode ser realizada, por exemplo, pelo método de D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), pelo método em que a permeabilidade das células da bactéria receptora para o DNA é aumentada tratando-se as células com cloreto de cálcio (Mandei M. e Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), eletroporação (Miller J. Η., “A Short Course in Bacterial Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) ou coisa parecida. A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada permitindo-se que cópias múltiplas do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA estejam presentes no DNA cromossômico da cepa precursora de partida anteriormente mencionada a ser um hospedeiro. De modo a introduzir cópias múltiplas do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA no DNA cromossômico de um microorganismo pertencente ao gênero Enterobacter ou coisa parecida, uma seqüência, da qual cópias múltiplas estão presentes no DNA cromossômico, tal como DNA repetitivo e repetições invertidas presentes nos términos de um elemento transponível, pode ser usada. Altemativamente, cópias múltiplas dos genes podem ser introduzidas no DNA cromossômico utilizando-se a transferência de um transposon contendo o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA. Como um resultado, o número de cópia do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA em uma célula da cepa transformada é aumentado e assim a atividade de CS, PEPC ou GDH é aumentada.

Como organismos usados como uma fonte do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA dos quais o número de cópia deva ser aumentado, qualquer organismo pode ser usado contanto que tenha atividade de CS, PEPC ou GDH. Inter alia, as bactérias, que sejam procariotas, por exemplo, aquelas pertencentes aos gêneros Enterobacter, Klebsiella, Erwínia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium ou Bacillus são preferidos. Como exemplos específicos podem ser mencionados Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum e assim por diante. O gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA podem ser obtidos a partir do DNA cromossômico dos microorganismos descritos acima. O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA podem ser obtidos usando-se uma cepa mutante que seja deficiente na atividade de CS, PEPC ou GDH para isolar um fragmento de DNA que suplemente a sua auxotrofía a partir do DNA cromossômico dos microorganismos anteriormente mencionados. Além, visto que as seqüências de nucleotídeo destes genes das bactérias Escherichia e Corynebacterium já foram elucidadas (Biochemistry, 22, pp. 5243 a 5249, (1983); J. Biochem., 95, pp. 909 a 916, (1984); Gene, 27, pp. 193 a 199, (1984); Microbiology, 140, pp. 1817 a 1828, (1994); Mol.

Gen. Genet., 218, pp. 330 a 339, (1989); Molecular Microbiology, 6, pp. 317 a 326, (1992)), também podem ser obtidas por PCR utilizando-se iniciadores sintetizados com base em cada seqüência de nucleotídeo e DNA cromossômico como um padrão. A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada realçando-se a expressão do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA, além da amplificação anteriormente mencionada dos genes. Por exemplo, a expressão pode ser realçada substituindo-se um promotor para o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA com um outro promotor mais forte. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor tac, o promotor PR e o promotor PL do fago lambda e assim por diante são conhecidos como promotores fortes. O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA dos quais o promotor é substituído são clonados em um plasmídeo e introduzidos no microorganismo hospedeiro ou introduzidos no DNA cromossômico do microorganismo hospedeiro usando-se o DNA repetitivo, a repetição invertida, o transposon ou coisa parecida. A atividade de CS, PEPC ou GBH também pode ser aumentada substituindo-se o promotor do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA no cromossoma por um outro promotor mais forte (ver a WO 87/03.006 e o Pedido de Patente Japonês aberto ao público N° 61-268183) ou inserindo- se um promotor forte à montante da seqüência codificadora de cada gene (ver, Gene, 29, pp. 231 a 241 (1984)). Especificamente, a recombinação homóloga pode ser realizada entre o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA dos quais o promotor é substituído com um mais forte ou DNA contendo uma parte deste e o gene correspondente no cromossoma.

Os exemplos da enzima que catalisa a reação com as ramificações do caminho biossintético do ácido L-glutâmico e gera um •Λ composto outro que não o ácido L-glutâmico incluem a-cetoglutarato desidrogenase (a seguir, também chamado de “aKGDH”), isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato cinase, ácido acetoidróxi sintase, acetolactato sintase, formiato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, 1 -pirrolina desidrogenase e assim por diante. Entre estas enzimas, a aKGDH é preferida.

De modo a diminuir ou eliminar as atividades das enzimas anteriormente mencionadas em um microorganismo pertencente ao gênero Enterobacter ou coisa parecida, mutações para diminuir ou eliminar a atividade intracelular das enzimas podem ser introduzidas nos genes das enzimas anteriormente mencionadas por um método de tratamento de mutagênese usual ou um método de engenharia genética.

Os exemplos de método de tratamento de mutagênese incluem por exemplo, métodos que utilizam irradiação com raio X ou raio ultravioleta, os métodos que utilizam tratamento com um agente de mutagênese tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina e assim por diante. O local de um gene onde a mutação é introduzida pode estar em uma região codificadora que codifica uma proteína de enzima ou uma região para regular a expressão tal como um promotor.

Os exemplos dos métodos de engenharia genética incluem por exemplo, métodos que utilizam a recombinação de gene, transdução, fusão de célula e assim por diante. Por exemplo, um gene de resistência a medicamento é inserido em um gene alvo clonado para preparar um gene que tenha perdido a sua função (gene defeituoso). Subseqüentemente, este gene defeituoso é introduzido em uma célula de um microorganismo hospedeiro e o gene alvo no cromossoma é substituído com o gene defeituoso anteriormente mencionado utilizando-se a recombinação homóloga (rompimento de gene). A diminuição ou deficiência da atividade intracelular da enzima alvo e o grau de diminuição da atividade podem ser confirmados medindo-se a atividade da enzima de um extrato celular ou uma fração purificada deste obtidos de uma cepa candidata e comparando-os com aqueles de uma cepa selvagem. Por exemplo, a atividade de aKGDH pode ser medida pelo método de Reed et al., (Reed L. J. e Mukhetjee B. B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55 a 61 (1969)).

Dependendo da enzima alvo, uma cepa mutante alvo pode ser selecionada com base em um fenótipo da cepa mutante. Por exemplo, uma cepa mutante em que a atividade de aKGDH é eliminada ou diminuída não pode proliferar ou apresenta uma taxa de proliferação acentuadamente reduzida em um meio mínimo contendo glicose ou um meio mínimo contendo ácido acético ou ácido L-glutâmico como uma fonte de carbono exclusiva sob uma condição de cultura aeróbica. Entretanto, a proliferação normal é capacitada mesmo sob a mesma condição pela adição de ácido succínico ou lisina, metionina e ácido diaminopimélico a um meio mínimo contendo glicose. Pela utilização deste fenômeno como indicadores, uma cepa mutante com atividade de aKGDH diminuída ou deficiente na atividade pode ser selecionada.

Um método para preparar uma cepa deficiente no gene α KGDH da Brevibacterium lacíofermentum pela utilização da recombinação homóloga é descrito em detalhes na WO 95/34672. Métodos similares podem ser aplicados a outros microorganismos.

Além disso, técnicas tais como a clonagem de genes e a digestão e ligação de DNA, a transformação e assim por diante estão descritas em detalhes em Molecular Cloning, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press (1989) e assim por diante.

Como um exemplo específico de uma cepa mutante deficiente na atividade de aKGDH ou com a atividade de aKGDH diminuída obtido como descrito acima, pode ser mencionada a Enterobacter agglomerans AJ13356. A Enterobacter agglomerans AJ12356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science anda Technology) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16645. Esta foi depois transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. A

Enterobacter agglomerans AJ12356 é deficiente na atividade de aKGDH como um resultado do rompimento do gene da subunidade aKGDH-El (sucA).

Quando a Enterobacter agglomerans, que é um exemplo do microorganismo usado na presente invenção, é cultivada em um meio contendo um sacarídeo, muco é extracelularmente secretado, ocasionalmente resultando em baixa eficiência de operação. Portanto, quando a Enterobacter agglomerans tendo tal propriedade de secretar muco é usada, é preferível usar uma cepa mutante que secrete menos muco comparado com uma cepa selvagem. Os exemplos de tratamento de mutagênese incluem por exemplo, métodos que utilizam irradiação com raio X ou raio ultravioleta, método que utiliza tratamento com um agente de mutagênese tal como N-metil-N’-nitro- N-nitrosoguanidina e assim por diante. Uma cepa mutante com secreção diminuída de muco pode ser selecionada pela inoculação de células bacterianas mutagenizadas em um meio contendo um sacarídeo, por exemplo, placa de meio LB contendo 5 g/litro de glicose, cultivando-as com inclinação da placa em cerca de 45 graus e selecionando-se uma colônia que não apresente corrimento de muco.

Na presente invenção, a comunicação ou realce da capacidade produtora de ácido L-glutâmico e a comunicação de outras propriedades favoráveis tais como mutação para a secreção de menos muco descrita acima podem ser realizados em uma ordem arbitrária.

Cultivando-se o microorganismo acumulador de ácido L- glutâmico em um meio líquido que esteja ajustado para a condição de pH que permita a precipitação do ácido L-glutâmico, o ácido L-glutâmico pode ser produzido e acumulado com a sua precipitação no meio associada. A “condição que permite a precipitação do ácido L-glutâmico produzido pelo microorganismo” aqui referida significa uma condição que permite a precipitação do ácido L-glutâmico quando o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico produz e acumula ácido L-glutâmico.

Embora o pH desta condição possa variar dependendo da capacidade produtora de ácido L-glutâmico do microorganismo, este é usualmente de 3 a 5 quando o microorganismo é uma bactéria Enterobacíer.

Como o meio usado para a cultura no primeiro método de produção da presente invenção, a cultura no primeiro pH e a cultura no segundo pH no segundo método de produção da presente invenção, um meio nutriente usual contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais minerais e nutrientes traço orgânicos tais como aminoácidos e vitaminas como requerido pode ser usado contanto que o pH seja ajustado de modo a satisfazer a condição pré determinada. Um meio sintético ou um meio natural podem ser usados. A fonte de carbono e a fonte de nitrogênio usadas no meio podem ser qualquer uma contanto que possam ser usadas pela cepa a ser cultivada.

Como a fonte de carbono, sacarídeos tais como glicose, glicerol, ffutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido e melaços são usados. Além disso, ácidos orgânicos tais como o ácido acético e o ácido cítrico podem ser usados cada um sozinho ou em combinação com uma outra fonte de carbono.

Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, nitratos e assim por diante são usados.

Como os nutrientes traço orgânicos, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, aqueles contendo estas substâncias tais como peptona, ácido de casamino, extrato de levedura e produtos da decomposição da proteína de soja são usados. Quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um aminoácido e assim por diante para a metabolização ou crescimento é usada, o nutriente requerido deve ser suplementado.

Como sais minerais, fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante são usados.

Como para o método de cultura, cultura de aeração de 20 a 42° C é usualmente realizada contanto que o pH seja controlado para estar em um valor pré determinado.

Depois de completar a cultura, o ácido L-glutâmico precipitado na cultura pode ser coletado por centrifugação, filtração ou coisa parecida. O ácido L-glutâmico dissolvido no meio também pode ser coletado por métodos conhecidos. Por exemplo, o ácido L-glutâmico pode ser isolado pela concentração do caldo de cultura para cristalizá-lo ou isolado pela cromatografia de troca iônica ou coisa parecida. Também é possível cristalizar o ácido L-glutâmico dissolvido no meio e depois coletar o ácido L- glutâmico precipitado no caldo de cultura junto com o ácido L-glutâmico cristalizado.

Em uma forma de realização onde o ácido L-glutâmico que excede uma concentração de saturação precipita, a concentração de ácido L- glutâmico dissolvido no meio é mantida em um nível constante. Portanto, a influência do ácido L-glutâmico em uma concentração alta sobre os microorganismos pode ser reduzida. Conseqüentemente, isto também toma possível reproduzir um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico ainda mais melhorada. Além disso, visto que o ácido L- glutâmico é precipitado como cristais, a acidulação do caldo de cultura pelo acúmulo de ácido L-glutâmico é suprimida e portanto a quantidade de álcali usada para manter o pH da cultura pode ser significantemente reduzida.

EXEMPLOS A seguir, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos seguintes exemplos. Nos exemplos, os aminoácidos são L-aminoácidos a menos que de outro modo indicado. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 <1> Avaliação de microorganismo tendo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido A avaliação de um microorganismo tendo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido foi realizada como segue. Um (1) grama de cada uma de cerca de 500 amostras obtidas da natureza incluindo solo, frutas, corpos vegetais, água de rio e assim por diante foi colocado em suspensão em 5 ml de água esterilizada e 200 μΐ desta foram revestidos sobre 20 ml de meio sólido ajustado ao pH 4,0 com HC1. A composição do meio foi como segue: 3 g/litro de glicose, 1 g/litro de sulfato de amônio, 0,2 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 0,5 g/litro de diidrogenofosfato de potássio, 0,2 g/litro de cloreto de sódio, 0,1 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 0,01 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g/litro de sulfato de manganês tetraidratado, 0,72 mg/litro de sulfato de zinco diidratado, 0,64 mg/litro de sulfato de cobre pentaidratado, 0,72 mg/litro de cloreto de cobalto hexaidratado, 0,4 mg/litro de ácido bórico, 1,2 mg/litro de molibdato de sódio diidratado, 50 pg/litro de biotina, 50 pg/litro de pantotenato de cálcio, 50 p g/litro de ácido fólico, 50 pg/litro de inositol, 50 pg/litro de niacina, 50 p g/litro de ácido p-aminobenzóico, 50 pg/litro de cloridreto de piridoxina, 50 pg/litro de riboflavina, 50 pg/litro de cloridreto de tiamina, 50 mg/litro de ciclo-heximida e 20 g/litro de agar. O meio plaqueado com as amostras acima foram incubados a 28° C, 37° C ou 50° C durante 2 a 4 dias e 378 cepas que formaram colônias foram obtidas.

Subseqüentemente, cada uma das cepas obtidas como acima descrito foi inoculada em um tubo de teste de 16,5 cm no comprimento e 14 mm no diâmetro contendo 3 ml de meio líquido (ajustado ao pH 4,0 com HC1) contendo uma concentração de saturação de ácido L-glutâmico e cultivada a 28° C, 37° C ou 50° C durante 24 horas a 3 dias com agitação.

Depois, as cepas cultivadas foram selecionadas. A composição do meio anteriormente mencionado foi como segue: 40 g/litro de glicose, 20 g/litro de sulfato de amônio, 0,5 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 2 g/litro de diidrogenofosfato de potássio, 0,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,25 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 0,02 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,02 g/litro de sulfato de manganês tetraidratado, 0,72 mg/litro de sulfato de zinco diidratado, 0,64 mg/litro de sulfato de cobre pentaidratado, 0,72 mg/litro de cloreto de cobalto hexaidratado, 0,4 mg/litro de ácido bórico, 1,2 mg/litro de molibdato de sódio diidratado e 2 g/litro de extrato de levedura.

Assim, 78 cepas de microorganismos apresentando resistência ao ácido L-glutâmico em um ambiente ácido foram obtidas com sucesso. <2> Seleção de cepas que apresentam taxa de crescimento superior de microorganismos tendo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido.

Os vários microorganismos tendo resistência ao ácido L- glutâmico em um ambiente ácido obtidos como descrito acima são cada um inoculados em um tubo de teste de 16,5 cm no comprimento e 14 mm no diâmetro contendo 3 ml de meio (ajustado ao pH 4,0 com HC1) obtido pela adição de 20 g/litro de ácido glutâmico e 2 g/litro de glicose ao meio M9 (Sambrook, J., Fritsh, E. F. e Maniatis, T., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) e a turbidez do meio foi medida no curso de tempo para selecionar cepas que apresentassem uma taxa de crescimento favorável. Como um resultado, como uma cepa apresentando crescimento favorável, a cepa AJ13355 foi obtida do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão. Esta cepa foi determinada como Enterobacter agglomerans com base nas suas propriedades bacteriológicas acima descritas. <3> Aquisição de cepa com menos secreção de muco a partir da cepa AJ 13555 da Enterobacter agglomerans Visto que a cepa AJ13555 da Enterobacter agglomerans secreta extracelularmente muco quando cultivada em um meio contendo um sacarídeo, a eficiência de operação não é favorável. Portanto, uma cepa com menos secreção de muco foi obtida pelo método da irradiação ultravioleta (Miller, J. H. et al., “A Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual”, p. 150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.). A cepa AJ13555 da Enterobacter agglomerans foi irradiada com raio ultravioleta durante 2 minutos em uma posição a 60 cm distante de uma lâmpada de ultravioleta de 60 W e cultivada em meio LB durante a noite para fixar a mutação. A cepa mutagenizada foi diluída e inoculada em meio LB contendo 5 g/litro de glicose e 20 g/litro de agar de modo que cerca de 100 colônias por placa emergiram e foram cultivadas a 30° C durante a noite com inclinação da placa em cerca de 45 graus e depois 20 colônias que não apresentaram corrimento de muco foram selecionadas.

Como uma cepa que satisfaz as condições de que nenhum reversor emergiu mesmo depois de 5 vezes de subcultura em meio LB contendo 5 g/litro de glicose e 20 g/litro de agar e que e que foi observado crescimento equivalente à cepa precursora em meio LB, meio LB contendo 5 g/litro de glicose e meio M9 (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) suplementado com 20 g/litro de ácido L-glutâmico e 2 g/litro de glicose e ajustado ao pH 4,5 com HC1, a cepa SC 17 foi selecionada das cepas selecionadas acima. <4> Construção de bactéria produtora de ácido L-glutâmico a partir da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans (1) Preparação de cepa deficiente em aKGDH a partir da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans Uma cepa que foi deficiente em aKGDH e teve o sistema biossintético do ácido L-glutâmico realçado foi preparada a partir da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans. (i) Clonagem do gene aKGDH (a seguir, chamado de “sucAB”) da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans. O gene sucAB da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans foi clonado selecionando-se um fragmento de DNA que complementasse a propriedade de desassimilação de ácido acético da cepa deficiente no gene da subunidade aKGDH-El (a seguir, chamado de “sucA”) da Escherichia coli do DNA cromossômico da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans. O DNA cromossômico da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans foi isolado por um método usualmente utilizado para extrair DNA cromossômico da Escherichia coli (Text for Bioengineering Experiments, editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp. 97 e 98, Baifukan, 1992). O pTWV228 (resistente à ampicilina) usado como um vetor foi um produto comercial de Takara Shuzo Co., Ltd. O DNA cromossômico da cepa AJ13355 digerido com EcoT221 e o pTWV228 digerido com/tol foram ligados usando-se T4 ligase e usados para transformar a cepa JRG465 da Escherichia coli deficiente em sucA (Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Uma cepa que cresce em um meio mínimo de acetato foi selecionada a partir das cepas transformantes obtidas acima e um plasmídeo foi extraído desta e designado como pTWVEKlOl. A cepa JRG465 da Escherichia coli que abriga o pTWVEKlOl recuperou a auxotrofia para o ácido succínico ou L-lisina e L- metionina, além da característica da propriedade desassimiladora de ácido acético. Isto sugere que o pTWVEKlOl continha o gene sucA da Enterobacter agglomerans. A Figura 1 mostra um mapa de enzima de restrição de um fragmento de DNA derivado da Enterobacter agglomerans no pTWVEKlOl.

Na seqüência de nucleotídeo da porção tracejada na Figura 1, as seqüências de nucleotídeo consideradas serem duas ORFs de comprimento completo e duas seqüências de nucleotídeo consideradas serem seqüências parciais das ORFs foram descobertas. Como resultado da pesquisa de homologia para estas, foi revelado que as porções de cujas seqüências de nucleotídeo foram determinadas continham uma seqüência parcial de extremidade 3 ’ do gene da proteína da succinato desidrogenase ferro-enxoffe (sdhB), o sucA de comprimento completo e o gene da subunidade ocKGDH-E2 (gene sucB) e uma seqüência parcial da extremidade 5’ do gene da subunidade β da succinil CoA sintetase (gene sucC). Os resultados de comparação das seqüências de aminoácido deduzidos destas seqüências de nucleotídeo com aquelas derivadas da Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, pp. 351 a 359 (1984);

Eur. J. Biochem., 141, pp. 361 a 374 (1984); Biochemistry, 24, pp. 6245 a 6252 (1985)) são apresentados nas figuras de 2 a 5. Assim, as seqüências de aminoácido apresentaram homologia muito alta umas às outras. Além disso, foi descoberto que um cacho de sdhB-sucA-sucB-sucC foi constituído no cromossoma da Enterobacter agglomerans como na Escherichia coli (Eur. J.

Biochem., 141, pp. 351 a 359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, pp. 361 a 374 (1984); Biochemistry, 24, pp. 6245 a 6252 (1985)). (ii) Aquisição de cepa deficiente em aKGDH derivada da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans A recombinação homóloga foi realizada usando-se o gene sucAB da Enterobacter agglomerans obtido como descrito acima para se obter uma cepa deficiente em aKGDH da Enterobacter agglomerans.

Depois que o pTWVEKlOl foi digerido com Sphl para excisar um fragmento contendo sucA, o fragmento foi abruptamente terminado com o fragmento Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd.) e ligado com pBR322 digerido com EcoBl e abmptamente terminado com o fragmento Klenow, usando-se a T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi digerido no sítio de reconhecimento da enzima de restrição BglII posicionado aproximadamente no centro de sucA usando-se a enzima, abmptamente terminada com o fragmento Klenow, e depois novamente ligado usando-se a T4 DNA ligase. Foi considerado que o gene sucA tomou-se não funcional porque uma mutação de mudança na matriz foi introduzida no sucA do plasmídeo recentemente construído através do procedimento acima. O plasmídeo construído como descrito acima foi digerido com uma enzima de restrição ApaLl, e submetido à eletroforese em gel de agarose para recuperar um fragmento de DNA contendo sucA, no qual a mutação de mudança na matriz foi introduzida e um gene de resistência à tetraciclina derivado do pBR322. O fragmento de DNA recuperado foi novamente ligado usando-se a T4 DNA ligase para construir um plasmídeo para romper o gene aKGDH. O plasmídeo para romper o gene aKGDH obtido como descrito acima foi usado para transformar a cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans pela eletroporação (Miller J. Η., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, p. 279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) e uma cepa em que o sucA no cromossoma foi substituído por um do tipo mutante do plasmídeo pela recombinação homóloga foi obtida usando-se a resistência à tetraciclina como um marcador. A cepa obtida foi designada como cepa SC17sucA.

De modo a confirmar que a cepa SC17sucA era deficiente na atividade de aKGDH, a atividade da enzima foi medida pelo método de Reed et al., (Reed L. J. e Mukheijee B. B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55 a 61 (1969)) usando-se as células da cepa cultivada em meio LB para a fase de crescimento logarítmico. Como um resultado, a atividade de aKGDH de 0,073 (AABS/min/mg de proteína) foi detectada a partir da cepa SCI7, ao passo que nenhuma atividade de aKGDH foi detectada a partir da cepa SC17sucA e assim foi confirmado que o sucA foi eliminado como pretendido. (2) Realce do sistema de biossíntese do ácido L-glutâmico da cepa SC17sucA da Enterobacter agglomerans.

Subseqüentemente, o gene da citrato sintase, o gene da fosfoenolpiruvato carboxilase e o gene da glutamato desidrogenase derivados da Escherichia coli foram introduzidos na cepa SC17sucA.

(i) Preparação de plasmídeo tendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA derivados da Escherichia coli Os procedimentos de preparar um plasmídeo tendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA será explicado referindo-se às Figuras 6 e 7.

Um plasmídeo tendo o gene gdhA derivado da Escherichia coli pBRGDH (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N° 7-203980) foi digerido com Hindlll e Sphl, ambas as extremidades foram abruptamente terminadas pelo tratamento com a T4 DNA polimerase e depois o fragmento de DNA tendo o gene gdhA foi purificado e recuperado. Separadamente, um plasmídeo tendo o gene gltA e o gene ppc da Escherichia coli pMWCP (WO 97/08294), foi digerido com Xbal e depois ambas as extremidades foram abruptamente terminadas usando-se a T4 DNA polimerase. Este foi misturado com o fragmento de DNA purificado acima tendo o gene gdhA e ligado usando-se a T4 ligase para se obter um plasmídeo pMWCPG, que correspondeu ao pMWCP contendo ainda o gene gdhA (Figura 6).

Ao mesmo tempo, o plasmídeo pVIC40 (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N° 8-047397) tendo a origem de replicação do plasmídeo de faixa hospedeira ampla RSF1010 foi digerido com Notl, tratado com T4 DNA polimerase e digerido com Pstl. O pBR322 foi digerido com EcoT14I, tratado com T4 DNA polimerase e digerido com Pstl. Ambos os produtos foram misturados e ligados usando-se T4 ligase para se obter um plasmídeo RSF-Tet tendo a origem de replicação do TSF1010 e o gene da resistência à tetraciclina (Figura 7).

Subseqüentemente, o pMWCPG foi digerido com EcoBl e Pstl, e um fragmento tendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA foi purificado e recuperado. O RSF-Tet foi similarmente digerido com £coRI e Pstl, e um fragmento de DNA tendo a origem de replicação do RSF1010 foi purificado e recuperado. Ambos os produtos foram misturados e ligados usando-se a T4 ligase para se obter um plasmídeo RSFCPG, que correspondeu ao RSF-Tet contendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA (Figura 8). Foi confirmado que o plasmídeo RSFCPG obtido expressou o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA com base na suplementação da auxotrofia da cepa deficiente no gene gltA, no gene ppc ou no gene gdhA derivada da Escherichia coli e nas medições de cada atividade de enzima. (ii) Preparação de plasmídeo tendo o gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum Um plasmídeo tendo o gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum foi construído como segue. A PCR foi realizada usando-se os DNAs iniciadores que foram preparados com base na seqüência de nucleotídeo do gene gltA da Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, pp. 1817 a 1828 (1994)) e DNA cromossômico da Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como um padrão para se obter um fragmento de gene gltA de cerca de 3 kb. Este fragmento foi inserido em um plasmídeo pHSG399 (adquirido da Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Smal para se obter um plasmídeo pHSGCB (Figura 9). Subseqüentemente, o pHSGCB foi digerido com Hindlll e o fragmento de gene gltA excisado de cerca de 3 kb foi inserido em um plasmídeo pSTV29 (adquirido da Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Hindlll para se obter um plasmídeo pSTVCB expressado no gene gltA medindo-se a atividade da enzima na cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans.

(iii) Introdução de RSFCPG e pSTVCB na cepa SC17sucA A cepa SC17sucA da Enterobacter agglomerans foi transformada com RFSCPG pela eletroporação para se obter uma cepa SC17sucA/RSFCPG transformante que apresenta resistência à tetraciclina.

Além disso, a cepa SC17sucA/RSFCPG foi transformada com pSTVCB pela eletroporação para se obter uma cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB que apresenta resistência ao cloranfenicol. <5> Aquisição de cepa com resistência melhorada ao ácido L-glutâmico em ambiente de pH baixo Uma cepa com resistência melhorada ao ácido L-glutâmico em uma concentração alta, em um ambiente de pH baixo (a seguir, também chamada de “cepa com resistência à concentração alta de Glu em pH baixo”) foi isolada da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB da Enterobacter agglomerans. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi cultivada durante a noite a 30° C em meio LBG (10 g/litro de tripton, 5 g/litro de extrato de levedura, 10 g/litro de NaCl, 5 g/litro de glicose) e as células lavadas com solução salina foram apropriadamente diluídas e plaqueadas em uma placa de meio M9-E (4 g/litro de glicose, 17 g/litro de Na2HP04.12H20, 3 g/litro de KH2P04, 0,5 g/litro de NaCl, 1 g/litro de NH4C1, 10 mM de MgS04, 10 μΜ de CaCl2, 50 mg/litro de L-lisina, 50 mg/litro de ácido DL-diaminopimélico, 25 mg/litro de tetraciclina, 25 mg/litro de cloranfenicol, 30 g/litro de ácido L- glutâmico, ajustado ao pH 4,5 com amônia aquosa). Uma colônia emergida depois da cultura a 32° C durante 2 dias foi obtida como uma cepa com resistência à alta concentração de Glu no pH baixo.

Para a cepa obtida, o nível de crescimento no meio líquido M9-E foi medido e a capacidade produtora de ácido L-glutâmico foi testada em um tubo de teste de volume grande de 50 ml contendo 5 ml do meio de teste da produção de ácido L-glutâmico (40 g/litro de glicose, 20 g/litro de sulfato de amônio, 0,5 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 2 g/litro de diidrogenofosfato de potássio, 0,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,25 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 0,02 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,02 g/litro de sulfato de manganês tetraidratado, 0,72 mg/litro de sulfato de zinco diidratado, 0,64 mg/litro de sulfato de cobre pentaidratado, 0,72 mg/litro de cloreto de cobalto hexaidratado, 0,4 mg/litro de ácido bórico, 1,2 mg/litro de molibdato de sódio diidratado, 2 g/litro de extrato de levedura, 200 mg/litro de cloridreto de L-lisina, 200 mg/litro de L-metionina, 200 mg/litro de ácido DL-a,8-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol). Uma cepa que exibiu o melhor nível de crescimento e a mesma capacidade produtora de g/litro de glicose como aquela da sua cepa precursora, a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi designada como AJ13601 da Enterobacter agglomerans. A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japão) em 18 de agosto de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM P-17516. Esta foi depois transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000 e recebeu um número de acesso de FERM ΒΡ-7207. EXEMPLO 1: Inibição do crescimento pelo ácido orgânico no pH ácido Embora a cepa AJ13601 da Enterobacter agglomerans possa crescer em uma faixa ampla de pH do pH neutro ao pH ácido a inibição do crescimento por um ácido orgânico é particularmente acentuável em um pH ácido. Portanto um experimento que diz respeito à inibição de crescimento por um ácido orgânico foi realizado em um pH ácido. A cepa AJ13601 da Enterobacter agglomerans foi cultivada em meio LBG agar (10 g/litro de tripton, 5 g/litro de extrato de levedura, 10 g/litro de NaCl e 15 g/litro de agar) contendo 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol a 30° C durante 14 horas e um laço de platina das células foi coletado e inoculado em 300 ml de um meio de cultura de semente tendo a seguinte composição em um fermentador de jarro de um litro de volume para realizar a cultura de semente a 34° C no pH 6,0. [Composição do meio de cultura de semente] 50 g/litro de sacarose, 0,4 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 4,0 g/litro de sulfato de amônio, 2,0 g/litro de diidrogenofosfato de monopotássio, 4,0 g/litro de extrato de levedura, 0,01 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g/litro de sulfato de manganês pentaidratado, 0,4 g/litro de cloridreto de L-lisina, 0,4 g/litro de DL- metionina, 0,4 g/litro de ácido DL-a,s-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol. O pH foi controlado pela adição de gás amônia durante a cultura. A cultura de semente foi terminada observando-se o esgotamento do sacarídeo no meio de cultura de semente como um marcador e o caldo de cultura de semente foi inoculado em 300 ml de um meio de cultura principal contidos em fermentadores de jarro de 1 litro de volume em uma quantidade de 20 % do volume do meio de cultura principal para realizar a cultura principal. A composição do meio de cultura principal é mostrado abaixo.

Quando um experimento para a inibição de crescimento por um ácido orgânico é realizado, o experimento foi realizado adicionando-se o ácido inorgânico a uma concentração pré determinada. [Composição do meio de cultura principal] 20 g/litro de glicose, 0,4 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 5,0 g/litro de sulfato de amônio, 6,0 g/litro de diidrogenofosfato de monopotássio, 1,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,01 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g/litro de sulfato de manganês pentaidratado, 0,8 g/litro de cloridreto de L-lisina, 0,6 g/litro de DL- metionina, 0,6 g/litro de ácido DL-a,s-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina, 25 mg/litro de cloranfenicol, 6,0 g/litro de extrato de levedura e 0,75 g/litro de cloreto de cálcio diidratado. A temperatura da cultura foi ajustada a 34° C e o pH foi controlado a um pH pré determinado pela adição de gás amônia.

Os experimentos para o efeito de inibição de crescimento em um pH ácido (pH 4,5) foram primeiro realizados com vários ácidos orgânicos. Os experimentos foram realizados pela adição de cada um de ácido fórmico, ácido acético, ácido lático, ácido propiônico, ácido valérico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido oxalacético e ácido cítrico a uma concentração de 0,5 g/litro ao meio de cultura principal. Uma parte dos resultados destes experimentos está apresentada na Figura 10.

Como mostrado por estes resultados, o ácido fórmico, o ácido acético e o ácido propiônico apresentaram inibição de crescimento evidente.

Por outro lado, o ácido lático permitiu uma taxa de crescimento comparável àquela obtida com o meio de controle não suplementada com um ácido orgânico (Além do que o ácido succínico, o ácido fumárico e o ácido málico não apresentaram inibição de crescimento). Existe também um relato de que a inibição do crescimento microbiano por um ácido orgânico em um pH ácido seja causado porque o ácido orgânico que perde carga sob uma condição de pH ácido passa através de uma membrana citoplásmica e é novamente dissociado sob uma condição de pH neutro em uma célula e este conceito é explicado usando-se uma constante de dissociação pKa de um ácido orgânico. TABELA 1 Entretanto, os resultados dos experimentos acima não podem ser explicados com base no pKa e a inibição de crescimento da cepa AJ13601 da Eníerobacter agglomerans pelo ácido fórmico, acetato e ácido propiônico é considerada ser causada por um outro mecanismo de inibição, que não pode ser explicado pelo conceito do relato anterior.

Então, o pH que causa a inibição do crescimento foi investigado usando-se ácido fórmico (concentração: 0,5 g/litro). Os resultados estão apresentados na Figura 11. Toma-se claro que a inibição de crescimento pelo ácido fórmico não foi observada em uma região de pH de 5,5 ou mais, mas foi observada em um pH mais baixo do que este. Em particular, no pH 4,5, o crescimento de células foi dificilmente observado.

Além disso, as concentrações de ácido fórmico que causam a inibição de crescimento sob uma condição de pH 4,5 também foi investigada.

Os resultados estão apresentados na Figura 12. A partir dos resultados, toma- se claro que a inibição de crescimento não foi observada quando a concentração de ácido fórmico no meio foi de 0,20 g/litro ou menos, mas a inibição de crescimento foi observada em uma concentração mais alta do que um certo nível dentro da faixa de 0,2 a 0,5 g/litro.

Com base nos resultados experimentais acima, foi concluído que, de modo a permitir a cultura da cepa AJ13601 da Eníerobacter agglomerans em um pH ácido utilizando uma fonte de carbono (sacarídeo) contendo um ácido inorgânico tal como melaço de beterraba e melaço de cana de açúcar e uma fonte de nitrogênio tal como líquido da maceração do milho (CSL), solução da hidrólise da proteína da soja, solução da hidrólise de proteína animal (extrato de carne) e hidrolisado de caseína é necessário diminuir uma concentração de um ácido orgânico que apresenta a inibição tal como o ácido fórmico e o ácido acético em um meio ou de modo a produzir g/litro de glicose em um pH ácido, é requerido um método de cultura que compreende cultivar células em uma faixa de pH onde a inibição do crescimento não seja observada de modo que o ácido orgânico que apresenta a inibição seja consumido e depois cultivar as células em um pH ácido alterado, como no Exemplo 2 mencionado abaixo. EXEMPLO 2: Redução da inibição de crescimento por ácido orgânico através da cultura com mudança de pH O crescimento celular da cepa AJ13601 da Enterobacter agglomerans é inibido por um ácido orgânico de peso molecular baixo tal como o ácido fórmico em um pH ácido como demonstrado no exemplo 1.

Portanto, porque muitas de tais matérias primas naturais, incluindo melaço de beterraba e melaço de cana de açúcar, contêm quantidades acentuadas de tais ácidos orgânicos, a cepa AJ13601 da Enterobacter agglomerans não pode ser cultivada em um pH ácido usando-se as matérias primas naturais. Entretanto, porque a inibição de crescimento pelos ácidos orgânicos foi observada apenas em um pH ácido, mas não observada em um pH neutro, foi tentado produzir ácido glutâmico realizando-se a cultura em um pH neutro para um estágio inicial da cultura para consumir os ácidos orgânicos que causam a inibição do crescimento e depois mudar o pH para um pH ácido para produzir o ácido glutâmico. A cepa AJ13601 da Enterobacter agglomerans foi cultivada em meio LBG agar (10 g/litro de tripton, 5 g/litro de extrato de levedura, 10 g/litro de NaCl e 15 g/litro de agar) contendo 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol a 30° C durante 14 horas e um laço de platina das células foi coletado e inoculado em 300 ml de um meio de cultura de semente tendo a seguinte composição em um fermentador de jarro de 1 litro de volume para realizar a cultura de semente a 34° C no pH 6,0. [Composição do meio de cultura de semente] 50 g/litro de sacarose, 0,4 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 4,0 g/litro de sulfato de amônio, 2,0 g/litro de diidrogenofosfato de monopotássio, 4,0 g/litro de extrato de levedura, 0,01 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g/litro de sulfato de manganês pentaidratado, 0,4 g/litro de cloridreto de L-lisina, 0,4 g/litro de DL- metionina, 0,4 g/litro de ácido DL-a,s-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol. O pH foi controlado pela adição de gás amônia durante a cultura. A cultura de semente foi terminada observando-se o esgotamento do sacarídeo no meio de cultura de semente como um marcador e o caldo de cultura de semente foi inoculado em 300 ml de um meio de cultura principal contidos em um fermentador de jarro de 1 litro de volume em uma quantidade de 20 % do volume do meio de cultura principal para realizar a cultura principal. A composição do meio de cultura principal é mostrado abaixo. [Composição do meio de cultura principal] 20 g/litro de melaço de beterraba (ou melaço de cana de açúcar), 0,4 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 5,0 g/litro de sulfato de amônio, 6,0 g/litro de diidrogenofosfato de monopotássio, 1,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,01 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g/litro de sulfato de manganês pentaidratado, 0,8 g/litro de cloridreto de L-lisina, 0,6 g/litro de DL-metionina, 0,6 g/litro de ácido DL-a,s-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina, 25 mg/litro de cloranfenicol, 6,0 g/litro de extrato de levedura e 0,75 g/litro de cloreto de cálcio diidratado. A temperatura da cultura foi ajustada a 34° C e o pH foi controlado a um pH pré determinado pela adição de gás amônia. A cultura foi iniciada em um pH 6,0 e realizada até que o sacarídeo e o ácido orgânico no meio de cultura principal foram consumidos. Depois que o sacarídeo foi esgotado, 700 g/litro de uma solução aquosa de glicose foi continuamente adicionada (5 ml/hora). Enquanto a glicose foi continuamente adicionada, a quantidade de adição de gás amônia foi controlada e a redução do pH em conecção com a produção de ácido glutâmico foi utilizada para diminuir o pH

a um nível de 4,5 em cerca de 2 horas e depois a cultura foi continuada no pH 4,5. Quando a concentração do ácido glutâmico no caldo de cultura atingiu 45 g/litro, 1,0 g de cristais de ácido glutâmico foi adicionado ao meio da cultura principal como cristais de semente para promover a precipitação dos cristais no caldo de cultura.

Como resultado da cultura durante 50 horas, uma quantidade acentuada de cristais de ácido glutâmico foi precipitada no fermentador de jarro. Depois, gás amônia foi adicionado de modo a aumentar o pH para 6,0 para dissolver os cristais de ácido glutâmico totais no fermentador de jarro e depois a quantidade do ácido glutâmico produzido foi medida. Neste caso, porque as células foram diminuídas, a cultura foi terminada em 28 horas. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. TABELA 2: Comparação dos resultados de fermentação Além disso, um curso de tempo de crescimento das células foi medido com base na densidade ótica (OD) em um comprimento de onda de 620 nm. Os resultados estão apresentados na Figura 13.

Como um resultado, foi verificado que, no experimento onde a cultura foi realizada em um pH ácido de um estágio inicial da cultura, o crescimento celular foi inibido e assim a produção de ácido L-glutâmico foi dificilmente observada, ao passo que, no experimento onde a cultura foi realizada usando-se a mudança de pH, cristais de ácido glutâmico precipitaram no caldo de cultura e assim foi demonstrado que matérias primas naturais contendo um ácido orgânico puderam ser usadas no método. A partir dos resultados mencionados acima, foi confirmado que a cultura usando a mudança de pH permitiu a cultura com precipitação de cristais de ácido glutâmico em um pH ácido mesmo usando matérias primas naturais contendo ácidos orgânicos. T7 LISTAGEM DAS SEOÜÊNCIAS <100> Ajinomoto Co., Inc.

<120> MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO <140> JP 2001-44135 <141> 20-02-2001 <160> 8 <210> 1 <211> 935 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 1 Met Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asn Gin Ser Tyr Ile Glu Gin Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr 20 25 30 Asp Pro Asp Ser Vai Asp Ala Vai Trp Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu 35 40 45 Pro Gly Thr Gly Vai Lys Pro Glu Gin Phe His Ser Ala Thr Arg Glu 50 55 60 Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Vai 65 70 75 80 Thr·Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin Vai Lys Vai Leu Gin Leu Ile 85 90 95 Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110 Gly Leu Trp Lys Gin Asp Arg Vai Ala Asp Leu Asp.Pro Ala Phe His 115 120 125 Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu Ser Phe Asn Vai Gly Ser Phe 130 135 140 Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu 145 150 155 160 Lys Gin Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn 165 170 175 Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gin Gin Arg Ile Glu Ser Gly Ala 180 185 190 Ser Gin Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu 195 200 205 Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro , 210 215 220 Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Vai Pro Met 225 230 235 240 Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Vai , 245 250 255 Vai Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Vai Leu Ile Asn Vai 260 265 270 Leu Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His 275 280 285 Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Vai Lys Tyr His Met Gly Phe Ser 290 295 300 Ser Asp Πβ Olu Thr 01a Gly Giy leu Vai Hls tea Ala Leu Ala Phe Asa Pro Ser Bis tea 01a Ile Vai Ser Pro Vai Vai Met Oly Ser Vai . ., 330 ooe S Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Vai Ser Asn Lys Vai Leu Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Vai Ile Gly Gin Gly Vai Vai Gin Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly TJr Glu Vai Gly Gly ar Vai Ars Ile Vai Ile Asa Asa 01a Vai Oly Phe Thr Thr Ser Asa Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Oly lys jfet Vai leu Ala Pro Ile Phe Hls Vai Asa Ala Asp Asp Pro Olu Ala Vai Ala Phe Vai ttr Arg teu Ala leu Asp Tyr Arg Aso Thr Phe lys Arg Asp V|1 Phe Ile Asp Leu Vai Cys Tyr Arg Arg His Gly His Aso Olu 465 ^ 0,U Pr° Ser Thr GI» pro U» Het Gla lys Ile lys lys His Pro Thr Pro Arg lys Ile Tyr Ala Asp Arg leu Glu Gly Glü Gly Vai Ala Ser 01a Glu Asp Ala Thr Glu Het Vai Asa tea Tyr Arg Asp Ala teu Asp Al, Oly Glu Cys Vai Vai Pro Glu Trp líg Pro Het Ser teu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr leu Asa Htt Glu Trp Asp Gl« Pro Tyr Pro Ala Gla V.l Asp Met lys Arg £ lys Glu leu Ala lea Arg Ile Ser Gla Vai Pro Gla Gla Ile Gla Vai Gla Ser Arg M n t * ooo 570 c?2 Ala lys Ile Tyr Asa Asp Arg lys teu Met Ala Glu Gly Glu lys Ala Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asa teu Ala Tyr Ala Thr LeS Vai Asp Glu Gly Ile Pro Vai Arg teu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly ttr 625 Phe His ^ His $} Vl1 Vai His Asa Gla AU Asa Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asa Ser Gla Gly Glu Phe tys Sal Trp Asp Ser Vai teu Ser Glu Glu Ala Vai Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala ttr Ala Glu Pro Arg Vai Leu Thr Ile Trp Glu AU Gla Phe Gly Asp Phe Ala Asa GI, Al, Gla Vai Vai Ile Asp GU Phe Ile Ser % 01)Γ G'“ GI° lPS S,y Ars *· ffc ™ Vai Het leu teu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gla Gly Pr0 Glu His Ser Ser Ala Arg K

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Claims

1. Método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um meio tendo pH de 5.0 ou menos, em que um teor total de um ácido orgânico que inibe o crescimento do micro-organismo no pH é um no qual o crescimento do micro- organismo não é inibido, e o teor total de ácido fórmico, ácido acético e ácido propiônico é 0,4 g/L ou menos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido L-glutâmico é produzido e acumulado no meio com a precipitação do ácido L-glutâmico associada, durante a cultura no meio.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo pertence ao gênero Enterobacíer.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Enterobacíer agglomerans.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em um pH 5,0 ou menos, e tem uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH.

6. Método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um primeiro pH de pH 5.0 a 8,0, e depois cultivar o micro-organismo em um segundo pH de pH 3,0 a 5,0, em que a cultura no primeiro pH é realizada enquanto o pH do meio é mantido em pH 5,0 a 8,0 pela adição de uma substância alcalinizante ao meio, e depois o pH do meio é reduzido para o segundo pH de pH 3,0 a 5,0 pelo controle da quantidade de adição da substância alcalinizante.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cultura no primeiro pH é continuada até que o ácido orgânico tendo número de carbono de 1 a 3 no meio seja esgotado.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo pertence ao gênero Enterobacter.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é o Enterobacter agglomerans.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em pH 5,0 ou menos, e tem uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH.