BRPI0411086B1 - Método para produzir ácido l-glutâmico por fermentação - Google Patents

Método para produzir ácido l-glutâmico por fermentação Download PDF

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BRPI0411086B1
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Yusuke Takahashi
Yasuhiro Tateyama
Masakazu Sato
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Ajinomoto Kk
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO POR FERMENTAÇÃO” Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método para produzir ácido L-glutâmico por fermentação. Ácido L-glutâmico é amplamente usado como uma matéria-prima de temperos etc. Técnica Anterior O ácido L-glutâmico é principalmente produzido por fermentação usando uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico da denominada bactéria corineforme pertencente ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ou uma sua cepa mutante. Ainda mais, métodos utilizando um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, Serratia, Aerobacter aerogenes (correntemente Enterobacter aerogenes), cepa mutante de Escherichia coli ou semelhantes são conhecidos. Em adição, os inventores da presente invenção propuseram um método de produzir ácido L-glutâmico usando um microorganismo pertencente ao gênero Klebsiella, Erwinia ou Pantoea (Patente U.S. No. 6.197.559) e um método de produzir ácido L-glutâmico usando uma bactéria Enterobacter (Patente U.S. No. 6.331.419).
Adicionalmente, várias técnicas para melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico por intensificação de atividades de enzimas biossintéticas de ácido L-glutâmico por intermédio do uso de técnicas de DNA recombinante têm sido descritas. Por exemplo, foi relatado que a introdução de um gene codificador de citrato sintase derivada de Escherichia coli ou de Corynebacterium glutamicum foi efetiva para intensificar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico em bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium (Publicação de Patente Japonesa (Publicação de Patente Japonesa JP 7.121228 B). Em adição, JP 61-268185 A descreve uma célula hospedando DNA recombinante contendo um gene de glutamato desidrogenase derivado de bactéria Corynebacterium. Ainda mais, JP 63-214189 A descreve uma técnica para aumentar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico pela amplificação de genes codificadores de glutamato desidrogenase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase e uma citrato sintase. A produtividade de ácido L-glutâmico tem sido consideravelmente aumentada pela procriação acima mencionada de microorganismos ou pela melhoria dos métodos de produção. Contudo, com o objetivo de responder aos aumentos adicionais em demanda no futuro, o desenvolvimento de métodos que proporcionem a produção mais eficiente de ácido L-glutâmico em um custo menor ainda é necessário, e portanto, ainda representa uma necessidade na técnica.
Os inventores da presente invenção desenvolveram um método de realizar a fermentação de ácido L-glutâmico enquanto se precipita ácido L- glutâmico que se acumula no caldo de cultura tem sido desenvolvido (EP 1078989 A). Devido ao fato de as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico normais não poderem crescer sob condições ácidas, a fermentação de ácido L- glutâmico foi convencionalmente conduzida sob condições neutras. Ao contrário de tais técnicas convencionais, os inventores da presente invenção foram bem sucedidos na restauração de um microorganismo possuindo uma capacidade para produzir ácido L-glutâmico sob condições ácidas. Em adição, pelo cultura do microorganismo obtido {Enterobacter agglomerans) em um meio líquido no qual o pH é controlado de maneira que o ácido L-glutâmico é precipitado, ácido L-glutâmico pode ser produzido e acumulado no meio enquanto se precipita ácido L-glutâmico.
Ainda mais, os inventores da presente invenção também descreveram um método para produzir ácido L-glutâmico incluindo a cultura de uma tal bactéria produtora de ácido L-glutâmico que pode crescer sob condições ácidas como descrito acima em um meio no qual o teor total de ácidos orgânicos que inibem o crescimento da bactéria é uma quantidade que não inibe o crescimento da bactéria (EP 1233070 A) e um método para produzir ácido L-glutâmico compreendendo a cultura de uma tal bactéria como descrito acima em um primeiro pH ótimo para o crescimento do microorganismo e depois a cultura da bactéria em um segundo pH ótimo para a produção de ácido L-glutâmico pelo microorganismo e menor do que o primeiro pH (EP 1233068 A). Em adição, também descreveram um método para produzir e acumular ácido L-glutâmico em um meio enquanto se precipita o ácido L-glutâmico no meio, no qual uma operação é realizada para preparar cristais de ácido L-glutâmico existentes no meio durante um período no qual a concentração de ácido L-glutâmico no meio é menor do que a concentração na qual ocorre cristalização natural de ácido L-glutâmico (EP 1233069 A).
Descrição da Invenção Um objetivo da presente invenção é proporcionar um método para produzir mais eficientemente ácido L-glutâmico comparado com as técnicas da técnica anteriores pelo uso de uma bactéria possuindo uma capacidade para produzir ácido L-glutâmico tal como uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea.
Os inventores da presente invenção verificaram que se uma alta capacidade de produção de ácido L-glutâmico for conferida a uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea, acetoína e 2,3-butanodiol também são produzidos juntamente com o ácido L-glutâmico. Ainda mais, consideraram que se for possível suprimir a produção destes subprodutos, o rendimento de ácido L-glutâmico por volume unitário de matéria-prima principal (açúcar) será melhorado. Assim, os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas e, como um resultado, verificaram que se ácido pantotênico foi adicionado em um meio, a subprodução de acetoína e de 2,3- butanodiol foi reduzida, e como um resultado, o rendimento da fermentação de ácido L-glutâmico foi melhorado. Assim, realizaram a presente invenção.
Isto é, a presente invenção é como segue. (1) Um método para produzir ácido L-glutâmico por fermentação, que compreende cultivar um microorganismo que pode metabolizar uma fonte de carbono em um pH específico em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono e possui uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em um meio líquido possuindo o pH em uma quantidade excedendo a quantidade correspondendo à concentração de saturação de ácido L-glutâmico em um meio cujo pH é controlado de maneira que ácido L-glutâmico é precipitado e que contém ácido pantotênico para causar o acúmulo de ácido L-glutâmico no meio enquanto se precipita o ácido L-glutâmico. (2) O método como descrito acima, no qual o microorganismo pertence ao gênero Pantoea. (3) O método descrito acima, no qual o microorganismo é Pantoea ananatis. (4) O método como descrito acima, no qual o ácido pantotênico no meio é um sal de ácido pantotênico, e o sal está contido em uma concentração de 1 mg/L ou maior.
Breve Descrição dos Desenhos [Fig. 1] Um mapa de restrição de um fragmento de DNA de pTWVEKlOl derivado de Pantoea ananatis. [Fig. 2] Uma figura mostrando a construção de um plasmídeo pMWCPG contendo os genes gltA,ppc e gdhA. [Fig. 3] Uma figura mostrando a construção de um plasmídeo RSF-Tet contendo a origem de replicação de plasmídeo RSF1010 de amplo espectro de hospedeiro e gene de resistência à tetraciclina. [Fig. 4] Uma figura mostrando a construção de um plasmídeo RSFCPC contendo a origem de replicação de plasmídeo RSF1010 de amplo espectro de hospedeiro, gene de resistência à tetraciclina, gene gltA, gene ppc e gene gdhA. [Fig. 5] Uma figura mostrando a construção de um plasmídeo pSTVCB contendo o gene gltA. [Fig. 6] Uma carta explanatória mostrando o princípio de melhoria de rendimento de ácido L-glutâmico proporcionado pela adição de ácido pantotênico. [Fig. 7] Um gráfico mostrando uma relação entre a concentração de pantotenato de cálcio adicionado a um meio e o rendimento de fermentação em ácido L-glutâmico.
Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas Daqui em diante, a presente invenção será explicada em detalhe. A presente invenção proporciona um método para produzir ácido L- glutâmico por fermentação, que é caracterizado pela cultura de um microorganismo que pode metabolizar uma fonte de carbono em um pH específico em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono e possui uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em um meio líquido possuindo o pH em uma quantidade excedendo a quantidade correspondendo à concentração de saturação de ácido L-glutâmico (daqui em diante também referido como um "microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico") em um meio cujo pH é controlado de maneira que o ácido L-glutâmico é precipitado e que contém ácido pantotênico para causar o acúmulo de ácido L-glutâmico no meio enquanto se precipita o ácido L-glutâmico. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico acima pode ser obtido, por exemplo, como segue. Uma amostra contendo microorganismos é inoculada em um meio líquido contendo ácido L- glutâmico em uma concentração de saturação e uma fonte de carbono, em um pH específico, e uma cepa que metaboliza a fonte de carbono é selecionada.
Embora o pH específico não seja particularmente limitado, ele é normalmente de cerca de 5,0 ou menor, preferivelmente de cerca de 4,5 ou menor, com maior preferência de cerca de 4,3 ou menor. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é usado para a produção de ácido L-glutâmico por fermentação com acompanhada precipitação do ácido L-glutâmico. Se o pH for muito alto, se tomará difícil permitir que o microorganismo produza ácido L-glutâmico em uma quantidade suficiente para precipitação. Portanto, o pH está preferivelmente na faixa acima mencionada.
Se o pH de uma solução aquosa contendo ácido L-glutâmico é abaixado, a solubilidade do ácido L-glutâmico cai significativamente ao redor do pKa do grupo y-carboxila (4,25, a 25°C). A solubilidade se toma mais baixa no ponto isoelétrico (pH 3,2) e o ácido L-glutâmico excedendo a quantidade correspondendo à concentração de saturação é precipitado.
Embora dependa da composição do meio, o ácido L-glutâmico é dissolvido em uma quantidade de 10-20 g/L em pH 3,2, 30-40 g/L em pH 4,0 e 50-60 g/L em pH 4,7, a cerca de 30°C. Normalmente o pH não precisa ser tomado 3,0 ou menor, porque o efeito de precipitação de ácido L-glutâmico alcança seu limite superior quando o pH cai para abaixo de um certo valor. Contudo, o pH pode ser 3,0 ou menor.
Em adição, a expressão na qual um microorganismo "pode metabolizar uma fonte de carbono" significa que o microorganismo pode se proliferar ou pode consumir uma fonte de carbono mesmo que ele não possa se proliferar, isto é, indica que o microorganismo cataboliza uma fonte de carbono tal como açúcares ou ácidos orgânicos. Especificamente, por exemplo, se um microorganismo se prolifera quando é cultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação em pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, com maior preferência pH 4,3 a 4,0, mais preferivelmente cerca de pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, por 2 dias a 4 dias, este microorganismo é um microorganismo que pode metabolizar a fonte de carbono no meio. Em adição, por exemplo, se um microorganismo consome uma fonte de carbono embora o microorganismo não se prolifere, quando é cultivado em um meio líquido sintético contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação em pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, com maior preferência pH 4,3 a 4,0, mais preferivelmente cerca de pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, por 2 dias a 4 dias, o microorganismo é um microorganismo que pode metabolizar a fonte de carbono no meio. O microorganismo que pode metabolizar uma fonte de carbono inclui um microorganismo que pode crescer no meio líquido acima mencionado. A expressão na qual um microorganismo "pode crescer" significa que ele pode se proliferar ou pode produzir ácido L-glutâmico embora não possa se proliferar. Especificamente, por exemplo se um microorganismo se prolifera quando é cultivado em um líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação em pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, com maior preferência pH 4,3 a 4,0, mais preferivelmente cerca de pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, por 2 dias a 4 dias, este microorganismo é um microorganismo que pode crescer no meio. Ainda mais, por exemplo, se um microorganismo aumenta uma quantidade de ácido L-glutâmico em um meio líquido sintético embora o microorganismo não se prolifere, quando o microorganismo é cultivado no meio líquido sintético contendo ácido L- glutâmico em uma concentração de saturação em pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, com maior preferência pH 4,3 a 4,0, mais preferivelmente cerca de pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, por 2 dias a 4 dias, o microorganismo é um microorganismo que pode crescer no meio. A seleção de um microorganismo como descrito acima pode ser repetida duas ou mais vezes sob as mesmas condições ou com mudança do pH ou da concentração de ácido L-glutâmico. Uma seleção para um estágio inicial pode ser conduzida em um meio contendo ácido L-glutâmico em uma concentração menor do que a concentração de saturação, e depois uma seleção subseqüente pode ser realizada em um meio contendo ácido L- glutâmico em uma concentração de saturação. Ainda mais, cepas com propriedades favoráveis tal como velocidade de proliferação superior podem ser selecionadas. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico possui uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade excedendo a quantidade correspondendo à concentração de saturação de ácido L-glutâmico em um meio líquido, em adição às propriedades descritas acima. O pH do meio líquido acima citado é preferivelmente igual ao ou próximo daquele do meio usado para triar um microorganismo possuindo as propriedades acima mencionadas. Normalmente, um microorganismo se toma sensível ao ácido L-glutâmico em uma concentração alta à medida que o pH se toma menor. Portanto, é preferido que o pH seja não baixo em vista da resistência ao ácido L-glutâmico, mas pH baixo é preferido em vista da produção de ácido L-glutâmico com sua precipitação acompanhante. Para satisfazer estas condições, o pH pode estar dentro da faixa de 3 a 5, preferivelmente 4 a 5, com maior preferência 4 a 4,7, adicionalmente preferivelmente 4 a 4,5, particularmente preferivelmente 4,0 a 4,3.
Exemplos de microorganismo acumulador de ácido L- glutâmico ou de materiais de procriação incluem portanto, mas não são limitados ao gênero Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces ou semelhantes. Dentre estes, microorganismos pertencentes ao gênero Pantoea são preferidos. Daqui em diante, o microorganismo da presente invenção será explicado principalmente para microorganismos pertencentes ao gênero Pantoea. Contudo, o microorganismo não é limitado àqueles pertencentes ao gênero Pantoea, e aqueles pertencendo a outros gêneros podem ser semelhantemente usados.
Um exemplo de um microorganismo pertencente ao gênero Pantoea inclui, mas não é limitado a, Pantoea ananatis, preferivelmente cepa AJ13355 de Pantoea ananatis. Esta cepa foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão como uma cepa que pode se proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em pH baixo. A cepa AJ13355 de Pantoea ananatis foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, National Institute of Advandec Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) aos 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16644. Foi então convertida ao depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERMBP-6614 A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como a cepa AJ 13355 de Enterobacter agglomerans. Contudo, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis tendo por base o seqüenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA etc. (veja a seção de exemplos).
Embora as cepas AJ13356 e AJ13601 que haviam sido derivadas da cepa AJ13355 também fossem depositadas no depositário acima mencionado como Enterobacter agglomerans, elas são descritas como Pantoea ananatis neste relatório descritivo. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico pode ser um microorganismo originalmente possuindo capacidade para produzir ácido L-glutâmico ou um possuindo capacidade para produzir ácido L-glutâmico conferida ou aumentada pela procriação por intermédio de mutagênese, técnicas de DNA recombinante ou semelhantes. A capacidade para produzir ácido L-glutâmico pode ser conferida ou aumentada por, por exemplo, aumento de uma atividade de uma enzima que catalisa uma reação biossintética de ácido L-glutâmico. A capacidade para produzir ácido L-glutâmico também pode ser aumentada por diminuição ou eliminação da atividade de uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica da rota biossintética de ácido L-glutâmico e gera um composto diferente de ácido L-glutâmico.
Um exemplo da enzima que catalisa a reação biossintética de ácido L-glutâmico inclui, mas não se limita a, glutamato desidrogenase (daqui em diante, também referida como "GDH"), glutamato sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (daqui em diante, também referida como "CS"), fosfoenolpiruvato carboxilase (daqui em diante, também referida como "PEPC"), purivato desidrogenase, piruvato cinase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato cinase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, triosefosfato isomerase, ffutose bisfosfato aldolase, fosfoffutocinase, glicose fosfato isomerase etc. Dentre estas enzimas, uma, duas ou três de CS, PEPC e GDH são preferidas. Ainda mais, é preferido que as atividades de todas as três enzimas, CS, PEPC e GDH, estejam intensificadas no microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico. Em particular, CS de Brevibacterium lactofermentum é preferida, porque não é sujeita à inibição pelo ácido a-ceto-glutárico, ácido L-glutâmico e NADH.
Com o propósito de intensificar a atividade de CS, PEPC ou GDH, por exemplo, um gene codificador de CS, PEPC ou GDH pode ser clonado em um plasmídeo apropriado e um microorganismo hospedeiro pode ser transformado com o plasmídeo obtido. O número de cópias do gene codificador de CS, PEPC ou GDH (daqui em diante abreviado por "gene gltA", geneppc" e "gene gdhA", respectivamente) na célula do transformante aumenta, resultando na elevação da atividade de CS, PEPC ou GDH.
Os genes gltA, ppc e gdhA clonados são introduzidos na cepa parental inicial acima mencionada sozinhos ou em combinação de dois ou três tipos arbitrários dos mesmos. Quando dois ou três tipos dos genes são introduzidos, dois ou três tipos dos genes podem ser clonados em um tipo de plasmídeo e introduzidos no hospedeiro, ou separadamente clonados em dois ou três tipos de plasmídeos que podem coexistir e introduzidos no hospedeiro.
Dois ou mais tipos de genes codificadores de uma enzima do mesmo tipo, mas derivados de microorganismos diferentes, podem ser introduzidos no mesmo hospedeiro.
Os plasmídeos descritos acima não são particularmente limitados desde que sejam autonomamente replicáveis em uma célula de um microorganismo pertencente, por exemplo, ao gênero Pantoea ou semelhante.
Exemplos de plasmídeos incluem pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 etc. Vetores de DNA de fago também podem ser usados para introduzir os genes acima mencionados. A transformação pode ser conduzida, por exemplo, pelo método de D.A. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), o método no qual a permeabilidade do DNA das células bacterianas recipientes é aumentada pelo tratamento das células com cloreto de cálcio (Mandei M. e Higa A., J. Mol BioL, 53, 159 (1970)), eletroporação (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) ou semelhantes. A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada ao se permitir que cópias múltiplas do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA estejam presentes no DNA cromossômico da cepa parental inicial acima mencionada. Cópias múltiplas de gene gltA, de gene ppc ou de gene gdhA podem ser introduzidas no DNA cromossômico por recombinação homóloga. Com o objetivo de introduzir o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA no DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea em número de cópias múltiplas, pode ser usada a seqüência presente no DNA cromossômico em número de cópias múltiplas tal como um DNA repetitivo e repetições invertidas presentes na extremidade de um elemento reversível.
Altemativamente, cópias múltiplas do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA podem ser introduzidas no DNA cromossômico por incorporação delas em um transposon e transferência do mesmo. Como um resultado, o número de cópias do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA nas células de uma cepa transformante é aumentado, e assim a atividade de CS, PEPC ou GDH é aumentada.
Como organismos usados como uma fonte do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA cujo número de cópias é para ser aumentado, qualquer organismo pode ser empregado desde que possua atividade de CS, PEPC ou GDH. Exemplos de organismos preferivelmente incluem, mas não são limitados a, bactérias, que são procariotos, pertencentes ao gênero Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Senatia, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium ou Bacillus. Especificamente, Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum etc estão incluídos na presente invenção.
O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA podem ser obtidos de DNA cromossômico dos microorganismos descritos acima. O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA podem ser obtidos usando uma cepa mutante que é deficiente na atividade de CS, PEPC ou GDH
para isolar um fragmento de DNA que suplementa sua auxotrofia do DNA cromossômico do microorganismo acima mencionado. Ainda mais, visto que as seqüência de nucleotídeos destes genes de bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia e Corynebacterium são conhecidas (.Biochemistry, 22, pp.5243-5249, (1983); J. Biochem., 95, pp.909-916, (1984); Gene, 27, ρρ.193-199, (1984); Microbiology, 140, ρρ.1817-1828, (1994); Mol. Gen.
Genet., 218, ρρ.330-339, (1989); Molecular Microbiology, 6, pp.317-326, (1992)), também podem ser obtidos por PCR utilizando iniciadores sintetizados baseados em cada seqüência de nucleotídeos e DNA cromossômico como um modelo. É sabido que, em enterobactérias tais como bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter ou Klebsiella, a introdução de um gene gltA de uma bactéria corineforme é mais efetiva sobre a intensificação da capacidade para produzir ácido L-glutâmico comparada com aquela de um gene gltA de uma bactéria de mesma espécie (EP 0999282 A).
Neste documento de patente, as cepas de Pantoea ananatis descritas neste relatório descritivo são descritas como Enterobacter agglomerans. A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada pela intensificação da expressão do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA, além da amplificação dos genes acima mencionada. Por exemplo, a expressão pode ser intensificada pela substituição de um promotor para o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA por outro promotor mais forte. Por exemplo, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR e promotor PL de fago lambda etc. são conhecidos como promotores fortes. O gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA cujo promotor está substituído são clonados em um plasmídeo e introduzidos no microorganismo hospedeiro, ou introduzidos no DNA cromossômico do microorganismo hospedeiro usando DNA repetitivo, repetição invertida, transposon ou semelhantes. A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada pela substituição do promotor do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA no cromossomo por outro promotor mais forte (veja WO 87/03006 e JP 61-268183 A), ou por inserção de um promotor mais forte na porção a montante da seqüência codificadora de cada gene (veja Gene, 29, pp. 231-241 (1984)). Especificamente, recombinação homóloga pode ser realizada entre o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA cujo promotor está substituído por um mais forte ou DNA contendo uma sua parte e o gene correspondente no cromossomo.
Exemplos da enzima que catalisa a reação que se ramifica da rota biossintética do ácido L-glutâmico e gera um composto diferente de ácido L-glutâmico incluem α-cetoglutarato desidrogenase (daqui em diante, também referida como "aKGDH"), isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato cinase, aceto-hidróxi-ácido sintase, acetolactato sintase, formiato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, 1-pirrolina desidrogenase etc. Dentre estas enzimas, aKGDH é preferida.
Com o propósito de diminuir ou eliminar as atividades das enzimas acima mencionadas em um microorganismo pertencente ao gênero Paníoea ou semelhante, mutações para diminuir ou eliminar a atividade intracelular das enzimas podem ser introduzidas nos genes das enzimas acima mencionadas por um método de tratamento de mutagênese normal ou um método de engenharia genética.
Exemplos de método de tratamento de mutagênese incluem, por exemplo, métodos utilizando irradiação com raios-X ou raio ultravioleta, métodos empregando tratamento com um agente de mutagênese tal como N- metil-N'-nitroso-guanidina, etc. O sítio de um gene onde a mutação é introduzida pode estar em uma região codifícadora que codifica uma proteína enzimática ou em uma região para regular a expressão de um tal promotor.
Exemplos de métodos de engenharia genética incluem, por exemplo, métodos utilizando recombinação de gene, transdução, fusão celular etc. Por exemplo, um gene de resistência a droga é inserido em um gene alvo clonado para preparar um gene que tem perdido sua função (gene defectivo).
Subseqüentemente, este gene defectivo é introduzido em uma célula de um microorganismo hospedeiro, e o gene alvo no cromossomo é substituído pelo gene defectivo acima mencionado por utilização de recombinação homóloga (disrupção de gene).
Diminuição ou deficiência da atividade intracelular da enzima alvo em uma célula e o grau de decréscimo da atividade podem ser confirmados pela medição da atividade da enzima de um extrato celular ou de uma sua fração purificada obtida de uma cepa candidata e comparando-a com aquela de uma cepa de tipo selvagem. Por exemplo, a atividade de aKGDH pode ser medida pelo método de Reed et al (Reer L. J. e Mukherjee B. B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61 (1969)).
Dependendo da enzima alvo, uma cepa mutante alvo pode ser selecionada baseando-se em um fenótipo da cepa mutante. Por exemplo, uma cepa mutante na qual a atividade de aKGDH está eliminada ou diminuída não pode se proliferar ou mostra uma velocidade de proliferação notavelmente reduzida em um meio mínimo contendo glicose ou em um meio mínimo contendo ácido acético ou ácido L-glutâmico como uma fonte de carbono exclusiva sob condições de cultura aeróbica. Contudo, proliferação normal é permitida até mesmo sob a mesma condição pela adição de ácido succínico ou lisina, metionina e ácido diamino-pimélico em um meio mínimo contendo glicose. Pela utilização destes fenômenos como indicadores, pode ser selecionada uma cepa mutante com atividade de aKGDH diminuída ou deficiente na atividade.
Um método para preparar uma cepa de Brevibacterium lactofermentum deficiente em gene aKGDH pela utilização de recombinação homóloga é descrito em detalhe em WO 95/34672. Métodos semelhantes podem ser aplicados a outros microorganismos.
Ainda mais, técnicas tais como clonagem de genes e digestão e ligação de DNA,transformação etc. são descritas em detalhe em "Molecular Cloning", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989) etc.
Exemplo específico de uma cepa mutante deficiente em atividade de aKGDH ou com atividade de aKGDH diminuída obtida como descrito acima inclui Pantoea ananatis AJ13356. Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, National Institute of Advandec Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) aos 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16645. Foi então convertida ao depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. A Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente em atividade de aKGDH como um resultado da disrupção de um gene de subunidade aKGDH-El (sucA).
Quando Pantoea ananatis, que é um exemplo do microorganismo usado na presente invenção, é cultivado em um meio contendo um sacarídeo, muco é secretado extracelularmente, ocasionalmente resultando em eficiência de operação baixa. Portanto, quando Pantoea ananatis possuindo uma tal propriedade de secreção de muco é usado, é preferível a utilização de uma cepa mutante que secreta menos muco comparada com a cepa de tipo selvagem. Exemplos de tratamento de mutagênese incluem, por exemplo, métodos utilizando irradiação com raios-X ou raio ultravioleta, método empregando tratamento com um agente de mutagênese tal como N-metil-N'-nitroso-guanidina, etc. Uma cepa mutante com secreção de muco diminuída pode ser selecionada pela inoculação de células bacterianas mutadas em um meio contendo um sacarídeo, por exemplo, placa de meio LB contendo 5 g/L de glicose, cultura delas com inclinação da placa a cerca de 45 graus e seleção de uma colônia que não mostra escoamento de muco.
Na presente invenção, fornecimento ou intensificação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico e fornecimento de outras propriedades favoráveis tal como mutação para menor secreção de muco descrita acima podem ser realizados em uma ordem arbitrária. A seqüência de nucleotídeos de gene sucA de Pantoea ananatis como um gene usado para a procriação de tal bactéria produtora de ácido L-glutâmico como descrito acima e a seqüência de aminoácidos de uma subunidade aKGDH-El codificada pelo gene são mostradas na SEQID NO: 1 ena SEQ IDNO: 3.
Ainda mais, a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo RSFCPG contendo o gene gltA, o gene gdhA e o gene ppc derivados de Escherichia coli (veja Exemplo de Referencia 1) é mostrada na SEQ ID NO: 8. Na SEQ ID NO: 8, as regiões codifícadoras do gene gltA, do gene gdhA e do gene ppc correspondem aos números de nucleotídeo 1770 a 487 (codificados pela fita complementar), 2598 a 3941 e 7869 a 5218 (codificados pela fita complementar), respectivamente. As seqüências de aminoácidos de CS, GDH e PEPC codificadas por estes genes são mostradas em SEQ. ID. NOS: 9, 10 e 11. Ainda mais, a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pSTVCB contendo o gene gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum (veja Exemplo de Referência 1) e a seqüência de aminoácidos de CS codificada por este gene são mostradas na SEQ ID NO: 12 e na SEQ ID NO: 13. CS, GDH e PEPC podem ser, além daquelas de tipo selvagem, aquelas incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de vários resíduos de aminoácido que não degradam substancialmente as atividades das enzimas. Embora o número de "vários" resíduos de aminoácido aqui referido dependa das posições nas estruturas tridimensionais das proteínas ou dos tipos de resíduos de aminoácido, pode estar especificamente entre 2 e 30, preferivelmente entre 2 e 20, com maior preferência entre 2 e 10. Portanto, mudanças em CS, GDH ou PEPC tais como aquelas descritas acima são tipicamente mudanças conservativas de modo a manter a atividade de CS, GDH ou PEPC. Mudanças de substituição incluem aquelas nas quais pelo menos um resíduo na seqüência de aminoácidos tem sido removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Exemplos de aminoácidos que podem ser substitutos de um aminoácido original em uma proteína CS, GDH ou PEPC e que são considerados como substituições conservativas incluem: Ala substituído com ser ou thr; arg substituído por gin, his, ou lys; asn substituído por glu, gin, lys, his, ou asp; asp substituído por asn, glu, ou gin; cys substituído por ser ou ala; gin substituído por asn, glu, lys, his, asp, ou arg; glu substituído por asn, gin, lys, ou asp; gly substituído por pro; his substituído por asn, lys, gin, arg, ou tyr; ile substituído com leu, met, vai, ou phe; leu substituído por ile, met, vai, ou phe; lys substituído por asn, glu, gin, his, ou arg; met substituído por ile, leu, vai, ou phe; phe substituído por trp, tyr, met, Ile, ou leu; ser substituído por thr, ou ala; thr substituído por ser ou ala; trp substituído por phe ou tyr; tyr substituído por his, phe, ou trp; e vai substituído por met, ile, ou leu.
Exemplos de DNA codificador de proteína ou peptídeo substancialmente igual a CS, GDH ou PEPC incluem DNA hibridizável com uma matriz de leitura aberta (ORF) da sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 12 ou 8 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificadora de uma proteína possuindo a atividade de CS, GDH ou PEPC. As "condições estringentes" aqui referidas incluem condições sob as quais o denominado r híbrido específico é formado, e o híbrido não específico não é formado. E difícil expressar claramente esta condição pelo uso de qualquer valor numérico. Contudo, por exemplo, as condições estringentes incluem condições sob as quais DNAs possuindo homologia alta, por exemplo, DNAs possuindo homologia não menor do que 50%, preferivelmente não menor do que 70%, com maior preferência não menor do que 90%, mais preferivelmente não menor do que 95% hibridizam um com o outro, mas DNAs possuindo homologia menor do que a acima não hibridizam um com o outro. Altemativamente, as condições estringentes incluem condições pelas quais DNAs hibridizam um com o outro em uma concentração de sal correspondendo a uma condição ordinária de lavagem em hibridização de Southern, i.e., 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60°C.
ORF da sequência de nucleotídeos de SEQID NO: 12 ou SEQ ID NO: 8 ou uma sua seqüência parcial também pode ser usada como a sonda.
Uma tal sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos produzidos baseando na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 ou 12 como iniciadores e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 ou 12 ou uma sua seqüência de nucleotídeos parcial como um modelo. Quando um fragmento de DNA possuindo um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem para a hibridização podem ser, por exemplo, de 2 x SSC e 0,1% SDS a 50°C. É suficiente que o gene sucA do tipo de deleção usado para dismpção de gene possua homologia em um tal grau que cause recombinação homóloga com o gene sucA em um DNA cromossômico de um microorganismo objetivo. Tal homologia é preferivelmente não menor do que 85%, com maior preferência não menor do que 90%, particularmente preferivelmente não menor do que 95%. Ainda mais, DNAs hibridizáveis sob condições estringentes podem causar recombinação homóloga.
Exemplos específicos de uma tal cepa obtida como descrito acima incluem a cepa AJ13601 derivada da cepa AJ1335 de Pantoea ananatis acima mencionada. Esta cepa foi obtida por seleção de uma cepa baixa produtora de muco a partir da cepa AJ13355, disrupção do gene akGDH, introdução dos genes gltA, ppc e gdhA derivados de Escherichia coli, e do gene gltA derivado de Brevíbacterium lactofermentum, seleção de uma cepa mostrando resistência ao ácido L-glutâmico de concentração alta em um pH baixo, e seleção de uma cepa mostrando capacidade de crescimento e capacidade de produção de ácido L-glutâmico superiores.
Pelo cultivo do microorganismo acumulador de ácido L- glutâmico em um meio líquido que é ajustado para condições de pH que permitem a precipitação de ácido L-glutâmico, ácido L-glutâmico pode ser produzido e acumulado com esta precipitação no meio acompanhante. As "condições que permitem a precipitação de ácido L-glutâmico produzido pelo microorganismo" referidas aqui significam que permitem a precipitação de ácido L-glutâmico quando o microorganismo acumulador de ácido L- glutâmico produz e acumula ácido L-glutâmico. Embora o pH destas condições possa variar dependendo da capacidade de produção de ácido L- glutâmico do microorganismo, ele é normalmente 3 a 5, preferivelmente 4,5 ou menor, com maior preferência 4 ou menor quando o microorganismo for uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea.
Em adição, como para as condições de pH acima mencionadas que permitem a precipitação de ácido L-glutâmico, o pH é determinado sobre as condições nas quais o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono e exibe uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico no meio em uma quantidade excedendo a quantidade correspondendo à concentração de saturação de ácido L-glutâmico no meio naquele pH.
Quando o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é cultivado em um meio sob as condições acima mencionadas, a quantidade acumulada de ácido L-glutâmico pode ser aumentada pela adição de ácido pantotênico no meio. Isto é presumido porque a produção secundária de acetoína e de 2,3-butanodiol é reduzida pela adição de ácido pantotênico no meio, e como um resultado, o rendimento da fermentação em ácido L- glutâmico é melhorado. O ácido pantotênico a estar contido no meio é preferivelmente adicionado como um sal de ácido pantotênico. Teor de sal de ácido pantotênico é preferivelmente de 1 mg/L ou maior, com maior preferência 4 mg/L ou maior, particularmente preferivelmente 8 mg/L ou maior. Tipo do sal de ácido pantotênico não é particularmente limitado, e exemplos incluem sal de cálcio, sal de sódio etc. Ácido pantotênico pode estar contido no meio durante todo o processo de cultura, ou o período de cultura em um meio contendo ácido pantotênico pode ser uma parte do processo. Por exemplo, quando o método da presente invenção compreende a etapa de proliferar o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico e a etapa de permitir produção de ácido L- glutâmico, o ácido pantotênico pode estar contido no meio durante pelo menos a etapa de permitir a produção de ácido L-glutâmico, e o ácido pantotênico pode estar ou pode não estar contido no meio durante a etapa de proliferar o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico. Ainda mais, como para a etapa de permitir a produção de ácido L-glutâmico, o teor de ácido pantotênico pode não estar necessariamente dentro da faixa acima mencionada durante todo o período da etapa. Isto é, ácido pantotênico pode estar contido de modo que o teor dentro da faixa acima mencionada durante um período inicial da etapa, e o teor pode reduzido com o tempo de cultura. Ácido pantotênico também pode ser adicionalmente adicionado intermitentemente.
Como o método da presente invenção, podem ser aplicados os métodos conhecidos de produção de ácido L-glutâmico usando microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico enquanto se precipita ácido L-glutâmico, exceto se um meio contendo ácido pantotênico for utilizado (por exemplo, JP 2001-333769 A (EP 1078989 A), JP 2002-238591 A (EP 1233070 A), JP 2002-238592 (EP 1233068 A), JP 2002-238593 A (EP 1233069 A)).
Por exemplo, uma das modalidades preferidas do método da presente invenção é um método para produzir ácido L-glutâmico que inclui cultivar um microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico em um meio contendo um sal de ácido pantotênico e possuindo pH de 5,0 ou menor no qual o teor total de ácidos orgânicos que inibem o crescimento do microorganismo é uma quantidade que não inibe o crescimento (veja JP 2002- 238591 A (EP 1233070)). Nesta modalidade, o ácido orgânico que inibe o crescimento de um microorganismo em pH do meio significa um ácido orgânico que possui um efeito inibitório sobre o crescimento do microorganismo quando ele existe em uma certa concentração (normalmente de 0,5 g/L ou maior) no meio no pH, e é normalmente um ácido orgânico possuído número de carbonos de 1 a 3, i.e., ácido fórmico, ácido acético ou ácido propiônico. O teor total do ácido orgânico é preferivelmente de 0,4 g/L ou menor, com maior preferência de 0,3 g/L ou menor, mais preferivelmente de 0,2 g/L ou menor.
Outra modalidade preferida do método da presente invenção é um método para produzir ácido L-glutâmico que inclui cultivar um microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico em um primeiro pH ótimo para o crescimento do microorganismo e depois cultivar o microorganismo em um segundo pH ótimo para a produção de ácido L-glutâmico pelo microorganismo e menor do que o primeiro pH, e no qual a bactéria acumuladora de ácido L-glutâmico é cultivada em um meio contendo ácido pantotênico durante pelo menos a cultura no segundo pH (veja JP 2002- 238592 A (EP 1233068 A)).
Outra modalidade preferida do método da presente invenção é um método para produzir ácido L-glutâmico que inclui cultivar um microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico em um primeiro pH no qual o crescimento do microorganismo não é inibido pelos ácidos orgânicos contidos no meio e depois cultivar o microorganismo em um segundo pH ótimo para a produção de ácido L-glutâmico pelo microorganismo e menor do que o primeiro pH da bactéria, e no qual a bactéria acumuladora de ácido L- glutâmico é cultivada em um meio contendo ácido pantotênico durante pelo menos a cultura no segundo pH (veja JP 2002-2385921 A (EP 1233070 A)).
Foi verificado que uma bactéria produtora de ácido L- glutâmico em geral sofrendo da inibição de crescimento por um ácido orgânico sob uma condição ácida, enquanto que ela podería consumir um ácido orgânico sob uma condição neutra (veja JP 2002-238591 (EP 1233070 A)). Baseado nesta propriedade, pela efetuação do crescimento de células em um pH neutro e depois pela mudança do pH para pH ácido para produzir ácido L-glutâmico, toma-se possível usar vários materiais como uma fonte de açúcar.
Nesta modalidade, o ácido orgânico significa um ácido orgânico que possui um efeito inibitório sobre o crescimento do microorganismo quando ele existe em uma certa concentração (normalmente de 0,5 g/L ou maior) no meio no segundo pH, e é normalmente um ácido orgânico possuindo um número de carbonos de 1 a 3, i.e., ácido fórmico, ácido acético ou ácido propiônico. O primeiro pH e o segundo pH são selecionados de modo que atendam às propriedades de uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico a ser usada. Estes valores de pH podem ser facilmente medidos por aquelas pessoas experientes na técnica. Por exemplo, o pH no qual inibição de crescimento de microorganismo não é causada por um ácido orgânico em um meio pode ser determinada pela cultura de uma bactéria produtora de ácido L- glutâmico em meio contendo um ácido orgânico ajustado para vários valores de pH, medição de quantidades de células baseada em absorbância ou semelhante, e comparação das quantidades de células com as quantidades de células da bactéria produtora de ácido L-glutâmico cultivada sob as mesmas condições exceto que o meio não contém o ácido orgânico. O pH adequado para a produção de ácido L-glutâmico refere-se ao pH no qual ácido L- glutâmico é acumulado no meio, determinável pelo cultivo de uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico no meio de vários valores de pH.
Especificamente, pode ser determinado pela medição das quantidades de ácido L-glutâmico acumuladas no meio de vários valores de pH e comparando-as. O primeiro pH não é particularmente limitado desde que o crescimento de microorganismo não seja inibido pelo ácido orgânico no meio, mas seja normalmente 5,0 a 8,0. O segundo pH é preferivelmente um pH no qual o ácido L- glutâmico produzido precipita, e tal pH é normalmente 3,0 a 5,0. A redução de produtividade pelo acúmulo de ácido L-glutâmico em uma concentração alta pode ser evitada pela realização da cultura em pH no qual o ácido L- glutâmico produzido precipita. O primeiro pH e o segundo pH podem não ser estritamente constantes durante a cultura desde que a vantagem da presente invenção possa ser obtida, e eles podem flutuar. A bactéria produtora de ácido L-glutâmico produz ácido L- glutâmico até mesmo no primeiro pH, e portanto o pH é abaixado pelo ácido L-glutâmico produzido. Portanto, a cultura no primeiro pH é preferivelmente realizada enquanto se mantém o pH do meio no primeiro pH pela adição de uma substância alcalinizante no meio.
Embora a substância alcalinizante não seja particularmente limitada desde que ela não afete adversamente o crescimento da bactéria produtora de ácido L-glutâmico ou a produção de ácido L-glutâmico, gás amônia é preferida. O pH do meio pode ser abaixado do primeiro pH para o segundo pH pela adição de uma substância ácida. Contudo, o pH é abaixado pelo ácido L-glutâmico produzido pela bactéria produtora de ácido L- glutâmico durante a cultura como descrito acima. Portanto, é preferível abaixar pH do meio do primeiro pH para o segundo pH pelo controle da quantidade de adição de substância alcalinizante, porque a adição de substância ácida pode ser omitida. A cultura no primeiro pH pode ser continuada até que o ácido orgânico no meio seja consumido. O consumo significa que a quantidade de ácido orgânico diminui para um nível no qual o crescimento da bactéria produtora de ácido L-glutâmico não é inibido durante a cultura no segundo pH. Um tal nível de ácido orgânico pode ser facilmente medido por aquelas pessoas experientes na técnica. Por exemplo, o nível pode ser determinado pelo cultivo de uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico no meio contendo um ácido orgânico em várias concentrações no segundo pH, medindo as quantidades de células de bactéria produtora de ácido L- glutâmico, e comparando as quantidades de células com as quantidades de células de bactéria produtora de ácido L-glutâmico cultivada sob as mesmas condições exceto que o meio não contém o ácido orgânico. Em geral, à medida que segundo pH se toma menor, o nível do ácido orgânico também se toma menor.
Uma outra modalidade preferida da presente invenção é um método para produzir ácido L-glutâmico por fermentação incluindo o cultivo de uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico em um meio cujo pH é controlado de modo que o ácido L-glutâmico produzido pelo microorganismo seja precipitado para causar o acúmulo de ácido L-glutâmico no meio ao mesmo tempo precipitando o ácido L-glutâmico, no qual uma operação é realizada para fazer com que existam cristais de ácido L-glutâmico no meio durante um período no qual a concentração de ácido L-glutâmico no meio é menor do que a concentração na qual ocorre a cristalização natural de ácido L-glutâmico e o meio contém ácido pantotênico (veja JP 2002-238593 A (EP 1233069 A)). A “cristalização natural” significa que, quando um microorganismo possuindo uma capacidade para produzir ácido L-glutâmico acumula ácido L-glutâmico, a concentração de ácido L-glutâmico no meio excede a concentração de saturação de ácido L-glutâmico, e assim ácido L- glutâmico naturalmente precipita no meio. A operação de tomar existentes cristais de ácido L-glutâmico no meio é significa uma operação para artificialmente proporcionar a existência de cristais de ácido L-glutâmico no meio. Exemplos de operação incluem a adição dos cristais, uma operação de dissolução de uma certa quantidade de ácido L-glutâmico no meio no início da cultura e diminuição de pH durante a cultura para forçar a precipitação de cristais etc. A quantidade de cristais tomada existente no meio é normalmente de 0,01 g/L a 10 g/L. Em adição, o período no qual os cristais são tomados existentes é preferivelmente um período no qual a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado no meio aumenta para uma concentração ao redor da concentração de saturação (por exemplo, quando o pH é 4,5 ou maior, 25 g/L ou maior). A quantidade de cristais de ácido L-glutâmico que existe no meio e a concentração de ácido L- glutâmico podem ser medidas por métodos bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica. Os cristais de ácido L-glutâmico são medidos após o meio ser deixado em repouso, e os cristais são coletados por decantação. A concentração de ácido L-glutâmico no meio é uma concentração de ácido L-glutâmico dissolvido. Quando os cristais precipitam no meio, a concentração de ácido L-glutâmico significa um valor de concentração de ácido L-glutâmico medido para uma solução transparente obtida pela separação de teor sólido do meio por centrifugação (ou filtração). A operação para tomas cristais de ácido L-glutâmico existentes no meio é preferivelmente a adição de cristais de ácido L- glutâmico.
Os cristais de ácido L-glutâmico incluem aqueles de forma-α e de forma-β (H. Takahashi, T. Takenishi, N. Nagashima, Bull. Chem. Soc.
Japan, 35, 923 (1962); J. D. Bemal, Z. Krist., 78, 363 (1931); S. Hirokawa, Acta Cryst., 8, 637 (1955)). Quando são obtidos cristais de forma-α, os cristais a serem adicionados são preferivelmente aqueles de forma-a.
Embora a quantidade preferida de cristais a ser adicionada varie dependendo das condições incluindo a forma cristalina dos cristais etc, ela é normalmente de 0,2 g/L ou maior para os cristais de forma-α. Se os cristais são adicionados na quantidade acima mencionada ou em uma quantidade maior, cristais de forma-α podem ser obtidos com boa reprodutibilidade. Cristais de forma-α podem ser manuseados mais facilmente comparados com os cristais de forma-β em vista de sua morfologia.
Como o meio usado na presente invenção, um meio nutriente normal contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais inorgânicos bem como nutrientes orgânicos em quantidade traço tais como aminoácidos e vitaminas conforme requeridos podem ser utilizados exceto se contiver ácido pantotênico, e o pH é ajustado para satisfazer as condições predeterminadas.
Quer um meio sintético quer um meio natural pode ser usado. Qualquer fonte de carbono e fonte e nitrogênio que pode ser utilizada por uma cepa a ser cultivada pode ser empregada no meio.
Sacarídeos tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido e melaço são usados como a fonte de carbono. Em adição, ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido cítrico podem ser utilizados cada um sozinho ou em combinação com outra fonte de carbono.
Amônia, sais de amônio tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, nitratos etc. são usados como a fonte de nitrogênio.
Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléicos, aqueles contendo estas substâncias tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedo e produtos de decomposição de proteína de feijão-soja são utilizados como os nutrientes orgânicos traço. Quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um aminoácido etc. para metabolização e crescimento é usada, o nutriente requerido tem que ser suplementado.
Fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês etc. são usados como os sais minerais.
Como o método de cultura, cultura de aeração a de 20°C a 42°C é normalmente realizada desde que o pH seja controlado para ser um valor predeterminado.
Após a completitude da cultura, o ácido L-glutâmico precipitado na cultura pode ser coletado por centrifugação, filtração ou semelhante. O ácido L-glutâmico dissolvido no meio também pode ser coletado por métodos conhecidos. Por exemplo, o ácido L-glutâmico pode ser isolado por concentração do caldo de cultura para cristalizá-lo ou isolado por cromatografia de troca iônica ou semelhante. Também é possível cristalizar o ácido L-glutâmico dissolvido no meio e então coletar o ácido L-glutâmico cristalizado juntamente com o ácido L-glutâmico precipitado durante a cultura.
Em uma modalidade na qual ácido L-glutâmico excedendo uma concentração de saturação precipita, a concentração de ácido L- glutâmico dissolvido no meio é mantida em um nível constante. Portanto, a influência do ácido L-glutâmico em uma concentração alta sobre os microorganismos pode ser reduzida. Conseqüentemente, também é tomada possível a procriação de um microorganismo possuindo capacidade de produção de ácido L-glutâmico adicionalmente melhorada. Em adição, visto que o ácido L-glutâmico é precipitado como cristais, a acidulação do caldo de cultura pelo acúmulo de ácido L-glutâmico é suprimida, e portanto a quantidade de álcali usada para manter o pH do caldo de cultura pode ser significativamente reduzida.
EXEMPLOS
Daqui em diante, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos seguintes exemplos. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 <1> Triagem de microorganismo possuindo resistência a ácido L- glutâmico em ambiente ácido A triagem de microorganismo possuindo resistência a ácido L- glutâmico em ambiente ácido foi realizada como segue. Um (1) g de cada uma de cerca de 500 amostras obtidas da natureza incluindo solo, frutas, corpos vegetais, água de rio etc. foi suspenso em 5 mL d água esterilizada, e 200 pL da suspensão foram aplicados sobre 20 mL de meio sólido ajustado para pH 4,0 com HC1. A composição do meio foi a seguinte: 3 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 0,2 g/L de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,5 g/L de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 0,2 g/L de cloreto de sódio, 0,1 g/L de cloreto de cálcio di-hidratado, 0,01 g/L de sulfato ferroso hepta- hidratado, 0,01 g/L de sulfato de manganês tetra-hidratado, 0,72 mg/L de sulfato de zinco di-hidratado, 0,64 mg/L de sulfato de cobre penta-hidratado, 0,72 mg/mL de cloreto de cobalto hexa-hidratado, 0,4 mg/L de ácido bórico, 1,2 mg/L de molibdato de sódio di-hidratado, 50 pg/L de biotina, 50 pg/L de pantotenato de cálcio, 50 pg/L de ácido fólico, 50 pg/L de inositol, 50 pg/L de niacina, 50 pg/L de ácido p-amino-benzóico, 50 pg/L de cloridrato de piridoxina, 50 pg/L de riboflavina, 50 pg/L de cloridrato de tiamina, 50 mg/L de ciclo-heximida e 20 g/L de ágar.
Os meios plaqueados com as amostras acima foram incubados a 28°C, 37°C ou 50°C por 2 dias a 4 dias e 378 cepas formadoras de colônias foram obtidas.
Subseqüentemente, cada uma das cepas obtidas como descrito acima foi inoculada em um tubo de ensaio de 16,5 cm de comprimento de 14 mm de diâmetro contendo 3 mL de meio líquido (ajustado para pH 4,0 com HC1) contendo uma concentração de saturação de ácido L-glutâmico e cultivado a 28°C, 37°C ou 50°C por 24 horas a 3 dias com agitação. Então, as cepas crescidas foram selecionadas. A composição do meio acima mencionado foi a seguinte: 40 g/L de glicose, 20 g/L de sulfato de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 2 g/L de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 0,5 g/L de cloreto de sódio, 0,25 g/L de cloreto de cálcio di- hidratado, 0,02 g/L de sulfato ferroso hepta-hidratado, 0,02 g/L de sulfato de manganês tetra-hidratado, 0,72 mg/L de sulfato de zinco di-hidratado, 0,64 mg/L de sulfato de cobre penta-hidratado, 0,72 mg/L de cloreto de cobalto hexa-hidratado, 0,4 mg/L de ácido bórico, 1.2 mg/L de molibdato de sódio di- hidratado e 2 g/L de extrato de levedo.
Assim, 78 cepas de microorganismos mostrando resistência ao ácido L-glutâmico em um ambiente ácido foram obtidas com sucesso. <2> Seleção de cepas mostrando velocidade de crescimento superior a partir de microorganismos possuindo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido Os vários microorganismos possuindo resistência ao ácido L- glutâmico em um ambiente ácido obtidos como descrito acima são cada um inoculados em um tubo de ensaio de 16,5 cm de comprimento e 14 mm de diâmetro contendo 3 mL de meio (ajustado para pH 4,0 com HC1) obtido pela adição de 20 g/L de ácido glutâmico e 2 g/L de glicose em meio M9 (Sambrook, I, Fritsh, E. F. e Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989), e a turvação do meio foi medida no decorrer do tempo para selecionar as cepas mostrando uma velocidade de crescimento favorável. Como um resultado, como uma cepa mostrando crescimento favorável, a cepa AJ13355 foi obtida do solo em Iwata-Shi, Shizuoka, Japão. Esta cepa foi determinada como Enterobacter agglomerans baseado em suas propriedades morfológicas descritas acima. Enterobacter agglomerans inclui aquelas reclassificadas em Pantoea agglomerans, Paníoea ananatis, Pantoea stewartii etc. baseando-se na análise de seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA ou semelhante, e a cepa AJ13355 é classificada em Paníoea ananatis dentre estas. <3> Aquisição de cepa com menor secreção de muco a partir de cepa AJ13355 de Pantoea ananatis Visto que a cepa AJ13355 de Pantoea ananatis secreta extracelularmente muco quando cultivada em um meio contendo um sacarídeo, a eficiência de operação não é favorável. Portanto, uma cepa com menor secreção de muco foi obtida pelo método de irradiação com ultravioleta (Miller, J. H. et al, "A Short Course in Bacterial Genetics;
Laboratory Manual", p. 150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.). A cepa AJ13355 de Pantoea ananatis foi irradiada com raio ultravioleta por 2 minutos em uma posição distante de 60 cm de uma lâmpada de ultravioleta de 60 W e cultivada em meio LB durante a noite para fixar a mutação. A cepa mutada foi diluída e inoculada em meio LB contendo 5 g/L de glicose e 20 g/L de ágar de modo que cerca de 100 colônias por placa emergissem e foi cultivada a 30°C durante a noite com inclinação da placa a cerca de 45 graus, e então 20 colônias não mostrando fluxo descendente de mudo foram selecionadas.
Como uma cepa que satisfez às condições de não reversão emergiu até mesmo após 5 tempos de subcultura em meio LB contendo 5 g/L de glicose e 20 g/L de ágar, e que mostrou crescimento equivalente ao da cepa parental em meio LB, o meio LB contendo 5 g/L de glicose e meio M9 (Sambrook, J., Fritsh, E. F. e Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) suplementado com 20 g/L de ácido L-glutâmico e 2 g/L de glicose e ajustado para pH 4,5 com HC1, foi selecionada a cepa SC 17 das cepas selecionadas acima. <4> Construção de bactéria produtora de ácido glutâmico a partir de cepa SCI7 de Pantoea ananatis (1) Preparação de uma cepa deficiente em aHDGH a partir da cepa SC 17 de Pantoea ananatis Uma cepa que foi deficiente em aKGDH e possuía sistema biossintético de ácido L-glutâmico intensificado foi preparada a partir da cepa SC 17 de Pantoea ananatis. (i) Clonagem de um gene aKGDH (daqui em diante, referido como "sucAB") de cepa AJ13355 de Pantoea ananatis 0 gene sucAB de cepa AJ13355 de Pantoea ananatis foi clonado por seleção de um fragmento de DNA complementando a propriedade de não-assimilação de ácido acético da cepa de Escherichia coli deficiente em gene de subunidade aKGDH-El (daqui em diante, referido como"sucA") do DNA cromossômico da cepa AJ13355 de Pantoea ananatis. O DNA cromossômico da cepa AJ13355 de Pantoea ananatis foi isolado por um método normalmente empregado para extra ir DNA cromossômico de Escherichia coli ("Text for Bioengineering Experiments", Editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp.97-98, Baifukan, 1992). O pTWV228 (resistente a ampicilina), que é um produto comercial de Takara Shuzo Co., Ltd., foi usado como um vetor. O DNA cromossômico da cepa AJ13355 digerido com EcoTllX e pTWV228 digerido com Pstl foram ligados usando T4 ligase e a mistura de ligação foi usada para transformar a cepa JRG465 de Escherichia coli deficiente em sucA (Herbert, J. et ai, Mol. Gen. Genetics., 105, 182 (1969)). Uma cepa crescendo em um meio mínimo de acetato foi selecionada das cepas transformantes obtidas acima, e um plasmídeo foi extraído da cepa obtida e chamado de pTWVEKlOl. A cepa JRG465 de Escherichia coli hospedando pTWVEKlOl recuperou a auxotrofia para ácido succínico ou L- lisina e L-metionina além da característica de propriedade de não assimilação de ácido acético. Isto sugere que pTWVEKlOl continha o gene sucA de Paníoea ananatis.
Fig. 1 mostra um mapa de enzima de restrição de um fragmento de DNA derivado de Pantoea ananatis em pTWVEKlOl. Na seqüência de nucleotídeos da porção hachurada na Fig. 1, foram encontradas seqüências de nucleotídeos consideradas para serem duas ORFs de comprimento total e duas seqüências de nucleotídeos consideradas para serem seqüências parciais de ORFS. Seqüências de aminoácidos que são preditas em serem codificadas por estas ORFs ou pelas seqüências parciais são mostradas nas SEQ ID NOS: 2-5 em uma ordem começando do lado de 5'. Como um resultado de pesquisa de homologia destas, foi revelado que as porções cujas seqüências de nucleotídeos foram determinadas continham uma seqüência parcial de extremidade 3' do gene de proteína de ferro-enxoffe succinato desidrogenase (sdhB), sucA de comprimento total e um gene de subunidade aKGDH-E2 (gene sucB), e uma seqüência parcial de extremidade 5' do gene de subunidade β de succinil CoA sintetase (gene sucC). Os resultados de comparação das seqüências de aminoácidos deduzidas destas seqüências de nucleotídeos com aquelas derivadas de Escherichia coli (Eur. J. Biochim., 141, pp.351-359 (1984); Eur. J. Biochim., 141, pp.361-374 (1984);
Biochemistry, 24, pp.6245-6252 (1985)), mostraram que estas seqüências de aminoácidos mostraram entre si homologia muito alta. Em adição, foi verificado que um agrupamento de sdhB-sucA-sucB-sucC foi constituído no cromossomo de Pantoea ananatis como em Escherichia coli (Eur. J.
Biochim., 141, pp.351-359 (1984); Eur. J. Biochim., 141, pp.361-374 (1984);
Biochemistry, 24, pp.6245-6252 (1985)). (ii) Aquisição de uma cepa deficiente em aKGDH derivada da cepa SCI 7 de Pantoea ananatis A recombinação homóloga foi realizada usando o gene sucAB de Pantoea ananatis obtido como descrito acima para obter uma cepa deficiente em aKGDH a partir de Pantoea ananatis.
Após a digestão de pTWVEKlOl com Sphl para excisar um fragmento contendo sucA, o fragmento foi cegado em sua extremidade com fragmento Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd.) e ligado com pBR32 digerido com EcoRI e cegado em sua extremidade com fragmento Klenow, pelo uso de T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi digerido no sítio de reconhecimento Bglíll de enzima de restrição posicionado aproximadamente no centro de sucA pelo uso de enzima, cegado em sua extremidade com fragmento Klenow, e então ligado de novo pelo emprego de T4 DNA ligase. Foi considerado que o gene sucA se tomou não funcional porque uma mutação de deslocamento de matriz foi introduzida em sucA do plasmídeo recém-construído por intermédio do procedimento acima. O plasmídeo construído como descrito acima foi digerido com uma enzima de restrição ApaLl, e submetido à eletroforese em gel de agarose para recuperar um fragmento de DNA contendo sucA no qual a mutação de deslocamento de matriz fora introduzida e um gene de resistência à tetraciclina derivado de pBNR322. O fragmento de DNA foi ligado de novo pelo uso de T4 DNA ligase para construir um plasmídeo para a disrupção de um gene aKGDH. O plasmídeo para a disrupção de um gene aKGDH obtido como descrito acima foi usado para transformar a cepa SC 17 de Pantoea ananatis por eletroporação (Miller J. Η., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", p.279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992), e uma cepa na qual sucA no cromossomo foi substituído por um sucA mutante do plasmídeo por recombinação homóloga foi obtida pelo uso de resistência à tetraciclina como um marcador. A cepa obtida foi chamada de cepaSC17sucA.
Com o propósito de confirmar que a cepa SC17sucA era deficiente na atividade de aKGDH, a atividade enzimática foi medida pelo método de Reed et al. (Reer L. J. e Mukherjee B. B., Methods in Enzymology, 13, ρρ. 55-61 (1969)) pelo uso de células da cepa cultivada em meio LB para a fase de crescimento logarítmica. Como um resultado, uma atividade de aKGDH de 0,073 (AABS/min/mg proteína) foi detectada da cepa SC 17, enquanto que nenhuma atividade de aKGDH foi detectada da cepa SC17sucA, e assim foi confirmado que sucA foi eliminado como intencionado. (2) Intensificação do sistema de biossíntese de ácido L-glutâmico de cepa SC17sucA de Pantoea ananatis Subseqüentemente, o gene de citrato sintase, o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase e o gene de glutamato desidrogenase derivados de Escherichia coli foram introduzidos na cepa SC17sucA. (i) Preparação de plasmídeo possuindo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA derivado de Escherichia coli Os procedimentos para a preparação de um plasmídeo possuindo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA derivado de Escherichia coli serão explicados pela referência às Figuras 2 e 3.
Um plasmídeo possuindo o gene gdhA derivado de Escherichia coli, pBRGDH (JP 7-203980 A), foi digerido com Hindlll e Sphl, ambas as extremidades foram cegadas por tratamento com T4 DNA polimerase, e então o fragmento de DNA possuindo o gene gdhA foi purificado e recuperado. Separadamente, um plasmídeo possuindo o gene gltA e o gene ppc derivado de Escherichia coli, pMWCP (WO 97/08294), foi digerido com Xbal, e então ambas as extremidades foram cegadas pelo uso de T4 DNA polimerase. Isto foi misturado com o fragmento de DNA purificado acima possuindo o gene gdhA e ligado pelo emprego de T4 ligase para obter um plasmídeo pMWCPG, que correspondeu a pMWCP contendo adicionalmente o gene gdhA (Fig. 2).
Concorrentemente, o plasmídeo pVIC40 (JP. 8-047307 A) possuindo a origem de replicação do plasmídeo de amplo espectro de hospedeiro RSF1010 foi digerido com Notl, tratado com T4 DNA polimerase e digerido com Pstl. pBR322 foi digerido com EcoTIAl, tratado com T4 DNA polimerase e digerido com Pstl. Ambos os produtos foram misturados e ligados pelo uso de T4 ligase para obter um plasmídeo RSF-Tet possuindo a origem de replicação de RSF1010 e o gene de resistência à tetraciclina (Fig. 3)· Subseqüentemente, pMWCPG foi digerido com EcoPl e Pstl, e um fragmento de DNA possuindo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA foi purificado e recuperado. RSF-Tet foi similarmente digerido com EcoPl e Pstl, e um fragmento de DNA possuindo a origem de replicação de RSF1010 foi purificado e recuperado. Ambos os produtos foram misturados e ligados pelo uso de T4 ligase para obter um plasmídeo RSFCPG, que correspondeu a RSF-Tet contendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA (Fig. 4). Foi confirmado que o plasmídeo RSFCPG obtido expressou o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA baseado na suplementação da auxotrofia da cepa de Escherichia coli deficiente em gene gltA, em gene ppc e em gene gdhA e na medição de cada atividade enzimática. (ii) Preparação de plasmídeo possuindo o gene gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum Um plasmídeo possuindo o gene gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum foi construído como segue. PCR foi realizada pelo uso de DNAs iniciadores, possuindo as seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 6 e 7, que foram preparadas baseando-s na seqüência de nucleotídeos de gene gltA de Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, pp.1817-1828 (1994)), e DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como um modelo para obter um fragmento de gene gltA de cerca de 3 kb. Este fragmento foi inserido em um plasmídeo pHSG399 (obtido de Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Smal para obter um plasmídeo pHSGCB (Fig. 5). Subseqüentemente, pHSGCB foi digerido com Hindlll, e o fragmento de gene gltA excisado de cerca de 3 kb foi inserido em um plasmídeo pSTV29 (obtido de Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Hindlll para obter um plasmídeo pSTVCB (Fig. 5). Foi confirmado que o plasmídeo pSTVCB obtido expressou o gene gltA pela medição da atividade enzimática na cepa JA13355 de Pantoea ananatis.
(iii) Introdução de RSFCPG e pSTVCB em cepa SCI 7sucA A cepa SC17sucA de Pantoea ananatis foi transformada com RSFCPG por eletroporação para obter uma cepa transformante SC17sucA/RSFCPG mostrando resistência à tetraciclina. Em adição, a cepa SC17sucA/RSFCPG foi transformada com pSTVCB por eletroporação para obter uma cepa transformante SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB mostrando resistência ao cloranfenicol. <4> Aquisição de cepa com resistência melhorada ao ácido L-glutâmico em ambiente de pH baixo Uma cepa com resistência melhorada ao ácido L-glutâmico em uma concentração alta em um ambiente de pH baixo (daqui em diante, também referida como "cepa com concentração alta de ácido L-glutâmico em pH baixo") foi isolada da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB de Pantoea ananatis. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi cultivada durante a noite a 30°C em meio LGB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedo, 10 g/L de NaCl, 5 g/L e glicose), e as células lavadas com solução salina foram apropriadamente diluídas e plaqueadas sobre uma placa de meio M9-E (4 g/L de glicose, 17 g/L de Na2HP04.12H20, 3 g/L e KH2P04, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4C1,10 mM de MgS04,10 μΜ de CaCL2, 50 mg/L de L-lisina, 50 mg/L de L-metionina, 50 mg/L de ácido DL-amino-pimélico, 25 mg/L de tetraciclina, 25 mg/L de cloranfenicol, 30 g/L e ácido L-glutâmico, ajustado para pH 4,5 com amônia aquosa). Uma emergência de colônia após a cultura a 32°C por 2 dias foi obtida como uma cepa com concentração alta de resistência a Glu em pH baixo.
Para a cepa obtida, o nível de crescimento em meio líquido M9-E foi medido e a capacidade de produção de ácido L-glutâmico foi testada em um tubo de ensaio largo de volume de 50 mL contendo 5 mL de meio de teste de ácido L-glutâmico (40 g/L de glicose, 20 g/L de sulfato de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 2 g/L de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 0,5 g/L de cloreto de sódio, 0,25 g/L de cloreto de cálcio di- hidratado, 0,02 g/L e sulfato ferroso hepta-hidratado, 0,02 g/L e sulfato de manganês tetra-hidratado, 0,72 mg/1 de sulfato de zinco di-hidratado, 0,64 mg/L de sulfato de cobre penta-hidratado, 0,72 mg/L de cloreto de cobalto hexa-hidratado, 0,4 mg/L de ácido bórico, 1,2 mg/L de molibdato de sódio di- hidratado, 2 g/L de extrato de levedo, 200 mg/L de cloridrato de L-lisina, 200 mg/L de ácido DL-a,s-diamino-pimélico, 25 mg/L de cloridrato de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol). Uma cepa que exibiu o melhor nível de crescimento e a mesma capacidade de produção de ácido L-glutâmico como aquela de sua cepa parental, a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, foi chamada de Pantoea ananatis AJ13601. A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, National Institute of Advandec Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 18 de agosto de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM P-17516. Foi então convertida ao depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 6 de julho de 2000 e recebeu um número de acesso de FERM BP-7207.
Exemplo 1 Pantoea ananatis AJ13601 foi em um meio contendo pantotenato de cálcio (12 mg/L) e em um meio não contendo pantotenato de cálcio para investigar a produtividade de ácido L-glutâmico.
Especificamente, a cultura foi realizada como segue. Células de cepa AJ13601 de Pantoea ananatis cultivadas a 30°C por 14 horas em meio de ágar LBG (10 g/L de triptona, 5 g/L e extrato de levedo, 10 g/L e NaCl, 15 g/L de ágar) contendo 25 mg/L de cloridrato de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol foram raspadas de uma placa e inoculadas em 300 mL de meio de cultura de semente possuindo a seguinte composição e contida em um fermentador de frasco de volume de 1 L, e a cultura de semente foi realizada sob condições de 34°C e pH 6,0. [Composição do meio de cultura de semente] Sacarose 50 g/L
MgS04.7H20 0,4 g/L
KH2P04 2,0 g/L
Extrato de levedo 4,0 g/L
FeS04.7H20 0,01 g/L
MnS04.5H20 0,01 g/L
Cloridrato de L-lisina 0,4 g/L
DL-Metionina 0,4 g/L
Ácido ε-diamino-pimélico 0,4 g/L
Cloridrato de tetraciclina 25 mg/L
Cloranfenicol 25 mg/L O pH foi ajustado para 6,0 pela adição de gás amônia durante a cultura. A cultura de semente foi acabada pela observação de depleção do sacarídeo no meio como um índice, e o meio de cultura de semente correspondendo ao volume de 20% do meio de cultura principal foi inoculado em 300 mL de meio de cultura principal contido em um fermentador de frasco de volume de 1 L para realizar a cultura principal sob as condições de 34°C e pH 4,5. A composição do meio de cultura principal é mostrada abaixo. [Composição de meio de cultura principal] Glicose 50 g/L
(NH4)2S04 5,0 g/L
MgS04.7H20 0,4 g/L
KH2P04 6,0 g/L
NaCl 1,5 g/L
FeS04.7H20 0,01 g/L
MnS04.5H20 0,01 g/L
Cloridrato de L-lisina 0,8 g/L
DL-Metionina 0,6 g/L
Ácido α,ε-diamino-pimélico 0,6 g/L
Cloridrato de tetraciclina 25 mg/L
Cloranfenicol 25 mg/L
Cloreto de cálcio di-hidratado 0,75 g/L
Pantotenato de cálcio 12 mg/L (adicionado apenas na cultura com adição de ácido pantotênico) O pH foi ajustado para 4,5 pela adição de gás amônia durante a cultura. Após o sacarídeo ter sido consumido e esgotado no meio, uma solução aquosa de glicose a 700 g/L foi continuamente adicionada (5 mL/h).
Quando a concentração de ácido L-glutâmico no caldo de cultura ultrapassou 40 g/L, 1,0 g/L de cristais de ácido L-glutâmico foi adicionado no meio como cristais semente para promover a precipitação de ácido L-glutâmico no caldo de cultura.
Após a realização da cultura principal por 50 horas, uma quantidade comercializada de cristais de ácido L-glutâmico foi precipitada no fermentador de frasco. Então, gás amônia foi adicionado para elevar o pH para 6,0 e deste modo dissolver todos os cristais de ácido L-glutâmico no fermentador de frasco. Então, a quantidade de ácido L-glutâmico produzido foi medida. A concentração de ácido L-glutâmico foi medida usando o analisador de eletrodo de enzima automático As210 produzido por Asahi Chemical Industry.
Como um resultado, foi verificado que o rendimento de fermentação em ácido L-glutâmico foi significativamente melhorado pela adição de ácido pantotênico como mostrado na Tabela 1. [Tabela 1] Tabela 1 A causa da melhoria do rendimento de ácido L-glutâmico proporcionada pela adição de pantotenato de cálcio foi investigada. Como um resultado, a redução de acetoína, de 2,3-butanodiol e a produção de C02 foram confirmadas (Tabela 2). As concentrações de acetoína e de 2,3- butanodiol foram medidas pelo uso de uma aparelhagem de cromatografia a gás GC1700 produzida por Shimadzu com as seguintes condições. [Coluna usada] DB-210 123-0233 produzida por J & W Scientifíc, comprimento da coluna: 30 m, diâmetro da coluna: 0,32 mm, espessura de filme: 5 pm. [Condições de medição] Temperatura da câmara de vaporização: 250°C Gás de arraste: He Pressão: 85,6 kPa Vazão total: 97,2 mL/min Vazão da coluna: 0,93 mL/min Velocidade linear: 25,0 cm/s Vazão de purga: 3,0 mL/min Razão de divisão: 100 Temperatura da coluna: 70°C Gás de reposição: He Vazão de reposição: 30,0 mL/min Vazão de H2:47 mL/min Vazão de ar: 400 mL/min A quantidade de C02 descarregada foi medida pelo uso de medidor de dióxido de carbono oxigênio descarregado Modelo EX-1562 produzido por ABLE. As quantidades produzidas de acetoína e de 2,3- butanodiol bem como a quantidade produzida de C02 calculada destes valores são mostradas na Tabela 2 (todos os valores são representados em termos de quantidade de carbono). Os valores medidos de C02 descarregado do meio de cultura foram 26,5% sem adição de ácido pantotênico e 27,6% com adição de ácido pantotênico.
Quando pantotenato de cálcio foi adicionado no meio, as quantidades de acetoína, de 2,3-butanodiol e de C02 gerado em associação com a produção secundária das substâncias acima (dois moles de C02 são gerados por cada 1 mol de acetoína e de 2,3-butanodiol) foram reduzidas em cerca de 14,3% em termos do balanço de carbono comparado com o caso onde pantotenato de cálcio não foi adicionado. Devido ao fato de este valor ser substancialmente equivalente à diferença de rendimentos de fermentação em ácido L-glutâmico obtidos com e sem a adição de pantotenato de cálcio, i.e., cerca de 13,1%, é considerado que ao efeito de melhoria de rendimento proporcionado pela adição de pantotenato de cálcio foi principalmente causado pela redução da produção secundária de acetoína e 2,3-butanodiol. [Tabela 2] Tabela 2 Dos resultados acima, o mecanismo de melhoria do rendimento de fermentação em ácido L-glutâmico proporcionado pela adição de ácido pantotênico foi estimado como segue. Isto é, é considerado que rendimento de fermentação em ácido L-glutâmico foi melhorado porque a insuficiência de coenzima A (CoA) pôde ser compensada pela adição de ácido pantotênico. Ácido pantotênico está contido na estrutura de CoA na forma de panteteína, e assim ele é um dos constituintes de CoA. CoA é usada como uma coenzima no processo de conversão de ácido pirúvico em acetil-CoA na rota metabólica. Por outro lado, acetoína e 2,3-butanodiol são gerados a partir de ácido pirúvico, e C02 é descarregado em associação com a produção de acetoína. Quando ácido pantotênico não foi adicionado no meio usado para a cultura de bactéria produtora de ácido L-glutâmico, acetoína e 2,3-butanodiol acumularam no meio. Portanto, é considerado que CoA era originalmente insuficiente na bactéria, e acetil-CoA suficiente não foi produzida na bactéria, que resultou na produção secundária de acetoína e 2,3-butanodiol.
Por outro lado, quando quantidade suficiente de CoA foi fornecida pela adição de ácido pantotênico, a reação causada pelo complexo de piruvato desidrogenase (ácido pirúvico -» acetil-CoA) foi promovida, cuja reação havia servido como um fator limitante de velocidade devido à insuficiência de CoA, e assim o afluente de carbono para o ciclo TCA foi promovido. Assim, é considerado que a produção de ácido L-glutâmico foi promovida via ácido a-ceto-glutárico (aKG) como um resultado. Em adição, quando a produção de acetoína e de 2,3-butanodiol diminuiu, C02 gerado em associação com a produção destas substâncias a partir de ácido pirúvico também diminuiu (2 moles de C02 para 1 mol de cada acetoína e 2,3- butanodiol). Portanto, é considerado que esta redução também contribuiu para a melhoria do rendimento de ácido L-glutâmico (Fig. 6).
Baseando-se no mecanismo acima, é considerado que a adição de uma substância tal como ácido D-panto [sic], β-alanina ou D-panteteína no lugar de ou em adição à adição de ácido pantotênico deve proporcionar efeito de melhoria de rendimento comparável ou mais favorável.
Exemplo 2 A concentração de pantotenato de cálcio a ser adicionado no meio foi mudada de 0 mg/L para 196 mg/L para examinar o efeito da concentração de pantotenato de cálcio sobre o rendimento de fermentação em ácido L-glutâmico. A cultura foi realizada na maneira igual àquela no Exemplo 1 exceto que a concentração de pantotenato de cálcio foi modificada para 0,1,2,4, 8,12, 24,48,96 ou 192 mg/L. Os resultados são mostrados na Fig. 7. Como confirmado destes resultados, o rendimento de fermentação em ácido L-glutâmico foi melhorado positivamente dependendo da concentração de pantotenato de cálcio. Até mesmo quando 1 mg/L de pantotenato de cálcio foi adicionado, o rendimento foi melhorado em cerca de 5% comparado com ausência de adição (0 mg/L). Devido ao fato de que o efeito de melhoria de rendimento dependendo da concentração de adição pôde ser obtido até ter sido alcançada a concentração de pantotenato de cálcio adicionado de 12 mg/L, é considerado que o efeito de melhoria de rendimento pode ser obtido até mesmo com uma concentração menor do que 1 mg/L.
Exemplo 3 A cultura principal foi realizada com adição de pantotenato de sódio no lugar de pantotenato de cálcio. As condições de cultura foram iguais àquelas usadas no Exemplo 1. Pantotenato de sódio foi adicionado em uma concentração de 12,15 mg/L de modo que a concentração molar de ácido pantotênico fosse equivalente àquela obtida com a adição de 12 mg/L de pantotenato de cálcio. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Como mostrado pelos resultados, rendimentos de fermentação em ácido L-glutâmico equivalentes foram obtidos com pantotenato de cálcio e com pantotenato de sódio. Assim, ficou claro que o fator de melhoria de rendimento deve ser o próprio ácido pantotênico, não o contra-íon de ácido pantotênico. [Tabela 3] Tabela 3 Aplicabilidade industrial De acordo com a presente invenção, ácido L-glutâmico pode ser produzido mais eficientemente comparado com técnicas convencionais pelo uso de uma bactéria tal como uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea.

Claims (2)

1. Método para produzir ácido L-glutâmico por fermentação, caracterizado pelo fato de compreender cultivar um microorganismo pertencente ao gênero Pantoea que pode metabolizar uma fonte de carbono em um pH específico cm um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono e possui uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em um meio líquido possuindo o citado pH em uma quantidade excedendo a quantidade correspondendo à citada concentração de saturação de ácido L-glutâmico em um meio cujo pH é controlado para ser de 3 a 5, de maneira que ácido L-glutâmico é precipitado e que contém ácido pantotênico para causar o acúmulo de ácido L-glutâmico no meio enquanto se precipita o ácido L-glutâmico, em que o ácido pantotênico no meio é um sal de ácido pantotênico, e o sal está contido em uma concentração de 1 mg/L ou maior.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Pantoea ananatis.
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