JP2014087259A - Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システイン等の化合物の製造法を提供する。
【解決手段】Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することによって、これらの化合物を製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｌ−システイン又はその関連物質の製造法に関し、詳しくはＬ−システイン又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いたＬ−システイン又はその関連物質の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。

従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。

Ｌ−システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。

また、Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献５）、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼＢ（特許文献６）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。

さらに、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている（非特許文献１）。また、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ遺伝子座、ｅｍｒ遺伝子座、ａｃｒ遺伝子座、ｃｍｒ遺伝子座、ｍｅｘ遺伝子、ｂｍｒ遺伝子、若しくはｑａｃＡ遺伝子（特許文献７）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ、若しくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献８）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。

また、Ｌ−システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ（特許文献９）が知られている。

さらに、セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡが知られており、エシェリヒア・コリのＬ−システイン生産に利用することが示唆されている（特許文献１０、１１）。

Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.11）は、Ｌ−アスパラギン酸を脱炭酸しβ−アラニンを生成する反応を触媒する酵素である。Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、一般的に、不活性な前駆体タンパク質として翻訳され、その後、特定の部位でプロセッシングされ活性なタンパク質となることが知られている。Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、Ｌ−システイン酸により競合阻害を受けることが知られているが（非特許文献２）、Ｌ−システインにより阻害を受けるかは知られていない。

Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼの触媒反応により生成したβ−アラニンは、パントテン酸生合成の中間産物として用いられ、パントテン酸はコエンザイムＡ（ＣｏＡ）に変換されて生体内で利用される。したがって、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、アセチルＣｏＡの生合成の鍵酵素となり得る（非特許文献３）。しかしながら、Ｌ−システインの生産において、アセチルＣｏＡの生合成が律速となり得るかは知られていない。

Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼをコードするｐａｎＤ遺伝子の発現を増強することにより、パントテン酸の生産量が増大することが知られている（非特許文献４）。また、パントテン酸を含有する培地を用いてＬ−グルタミン酸を製造する方法が知られている（特許文献１２）。

しかしながら、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼまたはパントテン酸と、Ｌ−システイン生産との関連は知られていない。

特開２００２−２３３３８４号公報 特開平１１−１５５５７１号公報 米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号 米国特許第６２１８１６８号 特開２００３−１６９６６８号公報 特開２００５−２４５３１１号公報 米国特許第５９７２６６３号 特開２００５−２８７３３３号公報 国際公開パンフレット第０１／２７３０７号 米国特許第５８５６１４８号 米国特許出願公開第２００５０００９１６２号 国際公開パンフレット第２００４／１１１２５８号

Dassler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000) Williamson JM. et al., J Biol Chem. 1979 Aug 25;254(16):8074-82. Kennedy J. et al., Anal Biochem. 2004 Apr 1;327(1):91-6. Dusch N. et al., Appl Environ Microbiol. 1999 Apr;65(4):1530-9.

本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼの活性が増大するように細菌を改変することによってＬ−システイン生産能を向上させることができることを見出した。本発明者は、さらに、Ｌ−システイン生産に用いる培地にパントテン酸を添加することによりＬ−システイン生産能を向上
させることができることを見出した。以上に基づき、本発明は完成された。

すなわち本発明は以下のとおり例示できる。
[１]
Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
[２]
ｐａｎＤ遺伝子の発現量を増大させることにより、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大した、前記細菌。
[３]
ｐａｎＤ遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｐａｎＤ遺伝子の発現量が増大した、前記細菌。
[４]
前記ｐａｎＤ遺伝子が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡである、前記細菌。
（Ａ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
[５]
前記ｐａｎＤ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌。
（ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
[６]
前記Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、下記（１）および（２）の特徴を有する、前記細菌。
（１）２４位のグリシンおよび２５位のセリンが保存されている。
（２）９位のリジン、１１位のヒスチジン、５７位のスレオニン、および５８位のチロシンが保存されている。
[７]
前記Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、さらに下記（３）の特徴を有する、前記細菌。
（３）１５位のバリン、１６位のスレオニン、２０位のロイシン、２２位のチロシン、２９位のアスパラギン酸、４２位のグルタミン酸、５１位のアスパラギン、５２位のグリシン、５４位のアルギニン、６０位のイソロイシン、７２位のアスパラギン、７３位のグリシン、７４位のアラニン、７５位のアラニン、７６位のアラニン、８３位のアスパラギン酸、および８６位のイソロイシンが保存されている。
[８]
さらに、下記の性質（１）〜（３）の１またはそれ以上を有する前記細菌。
（１）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
（２）Ｌ−システイン排出系が強化されている。
（３）３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。[９]
前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
[１０]
前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
[１１]
前記細菌がパントエア属細菌である、前記細菌。
[１２]
前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記細菌。
[１３]
前記細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
[１４]
前記培地がパントテン酸を含有する、前記方法。
[１５]
Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
[１６]
前記培地におけるパントテン酸の含有量が１ｍｇ／Ｌ以上である、前記方法。
[１７]
前記関連物質がＬ−シスチン、チアゾリジン誘導体、またはＬ−メチオニンである、前記方法。

本発明により、細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。

種々の細菌由来ＰａｎＤタンパク質のアラインメント結果を示す図。保存されているアミノ酸残基を枠で囲んである。 パントテン酸を種々の濃度で添加した際のＬ−システイン生産量を示す図。

＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼの活性が増大するように改変された、腸内細菌科に属する細菌である。

本発明において、Ｌ−システインとは、フリー体のＬ−システインもしくはその塩、又はそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。

本発明において、Ｌ−システイン生産能とは、細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインもしくはその関連物質、又
はこれらの混合物を生産し培地中または菌体内に蓄積することができる細菌を意味する。Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、好ましくは、０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。

細菌が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換されることがある。また、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞内に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010号）。これらチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。

また、Ｌ−システインは、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、Ｌ−システイン生産能に加えて、これらＬ−システインを経由して生産される化合物を産生する能力を有する細菌を用いることによって、これらの化合物を製造することができる。

したがって、本発明において、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体、もしくは前記のようなＬ−システインを経由して生産される他の化合物、又はこれらの混合物を培地中又は菌体内に蓄積する能力も含まれるものとする。なお、本発明において、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体、及び前記のようなＬ−システインを経由して生産される他の化合物をまとめてＬ−システインの関連物質という。

Ｌ−システイン生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えＤＮＡ技術を利用して、Ｌ−システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。

本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−システインを生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、又はクレブシエラ属細菌を用いることが望ましい。

エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ
４７０７６）等が挙げられる。

これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ １２２８７株が挙げられる。また、具体的には、欧州特許出願公開９５２２２１号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。

パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。

パントエア・アナナティスとしては、具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＳＣ１７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０９１）が挙げられる。ＡＪ１３３５５株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。ＳＣ１７株は、ＡＪ１３３５５株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第６，５９６，５１７号）。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。また、パントエア・アナナティスＳＣ１７株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０９１が付与されている。尚、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。

なお、特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl
Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067）。よって、エンテロバクター属に属する細菌には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験等により、パントエア・アグロメランス又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスには、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・スチューアル
ティに再分類されているものがある。また、エルビニア属に属する細菌には、パントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属、パントエア属、及びエルビニア属等のいずれに属するものであってもよい。

以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法について述べる。

細菌にＬ−システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７−１００頁参照）。ここで、Ｌ−システイン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又はそれ以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−システイン生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又はそれ以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−システイン生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−システイン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法、及びＬ−システイン生産能を有する細菌について具体的に例示する。

Ｌ−システイン生産能の付与又は増強、及びＬ−システイン生産菌
細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、又はＬ−セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素の活性を増強することにより向上させることができる。そのような酵素としては、例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）や３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）が挙げられる。酵素活性の増強は、後述するように、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増強することや、目的の酵素の非活性を増強することにより達成できる。セリンアセチルトランスフェラーゼは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。

エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型ＳＡＴ（特開平11-155571）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型ＳＡＴ（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミ
ノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型ＳＡＴ（WO97/15673、米国特許第6218168号）、野生型ＳＡＴの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列において１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型ＳＡＴ（米国特許公開第20050112731(A1)）、９５位及び９６位のＶａｌ残基及びＡｓｐ残基が、各々Ａｒｇ残基及びＰｒｏ残基に置換された変異型ＳＡＴ（変異型遺伝子名cysE5、米国特許公開第20050112731(A1)）、及び、１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換された変異型ＳＡＴ（米国特許第6218168号、米国特許公開第20050112731(A1)）等が知られている。

ＳＡＴをコードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、ＳＡＴ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のＳＡＴアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。

また、セリンによるフィードバック阻害耐性の変異型ＰＧＤをコードする遺伝子としては、serA5遺伝子（米国特許第６,１８０,３７３号）が知られている。

また、細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン排出系を強化することによっても向上させることができる。Ｌ−システイン排出系は、Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することにより強化することができる。Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質としては、ｙｄｅＤ遺伝子にコードされるＹｄｅＤタンパク質、ｙｆｉＫ遺伝子にコードされるＹｆｉＫタンパク質、ｙｅａＳ遺伝子にコードされるＹｅａＳタンパク質が挙げられる。よって、ｙｄｅＤ遺伝子（Dassler et al., Mol. Microbiol.36. 1101-1112 (2000)）、ｙｆｉＫ遺伝子（特開２００４−４９２３７）、又はｙｅａＳ遺伝子（欧州特許出願公開第１０１６７１０号明細書）の発現を増強することにより、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。また、ＹｅａＳタンパク質の２８位のスレオニン残基、１３７位のフェニルアラニン残基、および／または１８８位のロイシン残基に変異を導入することによっても、Ｌ−システイン排出系が強化されＬ−システイン生産能を高めることができる（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。具体的には、ＹｅａＳタンパク質の２８位のスレオニン残基をアスパラギンに置換する変異、１３７位のフェニルアラニン残基をセリン、グルタミン、アラニン、ヒスチジン、システイン、及びグリシンのいずれかに置換する変異、および／または１８８位のロイシン残基をグルタミンに置換する変異が好ましい（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。

また、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質の中には、Ｌ−システインの排出に関与するものがある。よって、それらをコードする遺伝子の発現を増強することによりＬ−システイン排出系を強化することができる。例えば、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ遺伝子座、ｅｍｒ遺伝子座、ａｃｒ遺伝子座、ｃｍｒ遺伝子座、ｍｅｘ遺伝子、ｂｍｒ遺伝子、若しくはｑａｃＡ遺伝子（米国特許第５９７２６６３号）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ、若しくはｃｕｓＡ遺伝子（特開２００５−２８７３３３号公報）の発現を上昇させることにより、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。

また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を向上させることができる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群は、ｃｙｓＰＴＷＡＭ遺伝子クラスターによってコードされている（特開２００５−１３７３６９号公報、ＥＰ１５２８１０８号明細書）。

また、細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システインの分解に寄与するシステインデ
スルフヒドラーゼの活性を低下させることにより向上させることができる。エシェリヒア・コリでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、ｍｅｔＣ遺伝子にコードされるシスタチオニン−β−リアーゼ（特開平１１−１５５５７１号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)）、ｔｎａＡ遺伝子にコードされるトリプトファナーゼ（特開２００３−１６９６６８、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）、ｃｙｓＭ遺伝子にコードされるＯ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特開２００５−２４５３１１）、及び、ｍａｌＹ遺伝子にコードされるＭａｌＹ（特開２００５−２４５３１１）が知られている。酵素活性の低下は、後述する手法により達成できる。

Ｌ−システイン生産菌は、下記の性質（１）〜（３）の１またはそれ以上を有するのが好ましい。
（１）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
（２）Ｌ−システイン排出系が強化されている。
（３）３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。

Ｌ−システイン生産菌としては、具体的には、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードする複数種のｃｙｓＥアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリ ＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号）、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ（特開平１１−１５５５７１号公報）、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７）などのエシェリヒア属に属する株、ｙｄｅＤ遺伝子、変異型ｃｙｓＥ遺伝子および変異型ｓｅｒＡ５遺伝子を保持するプラスミドｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ（特開２００５−１３７３６９（ＵＳ２００５０１２４０４９（Ａ１）、ＥＰ１５２８１０８（Ａ１）））を有するエシェリヒア・コリ等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳは、前記３遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はＰｏｍｐＡプロモーターにより制御される。

Ｌ−システインを出発物質として生合成されるγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、及びＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。

例えば、γ−グルタミルシステイン生産能は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性の増強及び／又はグルタチオン合成酵素活性の低下によって、増強することができる。また、グルタチオン生産能はγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及び／又はグルタチオン合成酵素活性の増強によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素を用いることでもγ−グルタミルシステインやグルタチオンの生産能を増強させることができる。グルタチオンの生産についてはＬｉらの総説（Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen.
Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242）に詳しく記載されている。

Ｌ−メチオニン生産能は、Ｌ−スレオニン要求性、ノルロイシン耐性を付与することによって、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、例えば、thrBC部分を欠失させることによってＬ−ホモセリン以降の生合成能を
失ったＬ−スレオニン要求株を取得することができる。ノルロイシン耐性株では、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化され、Ｌ−メチオニン生産能が付与又は増強される。E. coliにおいては、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼはmetK遺伝子にコードされている。また、Ｌ−メチオニン生産能は、メチオニンリプレッサーの欠損、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ−シンテース、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIなどのＬ−メチオニン生合成に関与する酵素の活性の増強によっても、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、メチオニンリプレッサーはmetJ遺伝子に、ホモセリントランスサクシニラーゼはmetA遺伝子に、シスタチオニンγ−シンテースはmetB遺伝子に、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIはmetL遺伝子にそれぞれコードされている。また、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを用いることでもＬ−メチオニンの生産能を付与又は増強することができる（特開2000-139471号、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471号、US20080311632）。よって、Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するためには、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強させることも有効である。

Ｌ−メチオニン生産菌としては、具体的には、AJ11539 (NRRL B-12399)、AJ11540 (NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有する218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)等のE. coli株が挙げられる。

また、Ｌ−メチオニン生産菌としては、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471号）を用いることもできる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたＬ−スレオニン要求株である。AJ13425は、平成１０年５月１４日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。

シスタチオニン、ホモシステインはＬ−メチオニン生合成経路の中間体であるため、これら物質の生産能を増強するためには、上記のＬ−メチオニンの生産能を増強させる方法を一部利用することが有効である。シスタチオニン生産能を増強させる具体的方法として、メチオニン要求性変異株を用いる方法（特願２００３−０１０６５４）や、発酵培地にシステイン（またはその生合成原料）及び／又はホモセリン（またはその生合成原料）を添加する方法（特開２００５−１６８４２２）が知られている。ホモシステインはシスタチオニンを前駆体とするため、ホモシステイン生産能を増強するためには、シスタチオニン生産能を増強させる上記方法も有効である。

また、Ｌ−メチオニンを出発物質として生合成されるＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン生産能は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を強化することや（ＥＰ０６４７７１２、ＥＰ１４５７５６９）、ｍｄｆＡ遺伝子にコードされる排出因子ＭｄｆＡを強化すること（ＵＳ７４１０７８９）で付与又は増強することができる。

以下、システインデスルフヒドラーゼ等の酵素活性を低下させる手法について記載する。本発明において、「酵素の活性が低下する」とは、目的の酵素活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。酵素活性は、例えば非改変株と比較して７５％以下、５０％以下、２５％以下、又は１０％以下に低下していることが好ましく、活性が完全に消失しているのが特に好ましい。なお、酵素によっては、活性を完全に消失させないのが好ましい場合もある。

酵素活性が低下するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやＳＤ配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、アンチセンスＲＮＡを発現させることによっても達成できる。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。酵素活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性等のマーカー遺伝子やＬ−システイン生産に有用な遺伝子が挙げられる。

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステ
ム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、紫外線照射、または、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。

酵素活性が低下したことは、同酵素活性を測定することにより確認できる。システインデスルフヒドラーゼ活性は、特開２００２−２３３３８４公報に記載された手法により測定することができる。

標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。

標的タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold
spring Harbor (USA), 2001））。

Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性の増大
本発明の細菌は、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変されている。本発明の細菌は、上述したようなＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変を行った後に、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強してもよい。

本発明において、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性とは、Ｌ−アスパラギン酸を脱炭酸しβ−アラニンを生成する反応を触媒する活性をいう。また、本発明において、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼという。Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大することで、β−アラニンを中間代謝産物して生合成されるパントテン酸の生産量が増大すると予想される。

「Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大する」とは、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１５０％以上、より好ましくは２００％以上、さらに好ましくは３００％以上に向上している。また、「Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大する」とは、もともとＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有する菌株においてＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を増大させることだけでなく、もともとＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が存在しない菌株にＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を付与することを含む。また、結果としてＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大する限り、細菌が本来有するＬ−アスパルテート−α−デカルボ
キシラーゼを弱化および／または欠損させた上で、好適なＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼを導入してもよい。

Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を増大させるような改変は、例えば、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現を増強させることによって達成される。

遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、染色体に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列や、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピート等が挙げられるが、これらに限定されない。また、染色体上に存在するＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。このような遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはインテグレーションベクターを用いて達成することが出来る。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されるように、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。トランスポゾンとしては、例えば、Ｍｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５が利用できる。染色体に遺伝子が導入されたことは、遺伝子の一部をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して目的遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、目的遺伝子のコピー数を増加させることができる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社より入手可）、ｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）、ｐＰＲＯＫ系ベクター（クロンテック社）、ｐＫＫ２３３‐２（クロンテック社製）、ｐＥＴ系ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０等が挙げられる。

また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモーター等を用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの
論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128
(1995)）等に記載されている。

また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のＳＤ配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（ＷＯ２００５／０１０１７５）により行うことができる。

また、遺伝子の発現の増強は、目的の遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、目的の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。レギュレーターとしては、例えばＬｙｓＲファミリーなどに属するものが挙げられ、データベースEcoCyc（http://ecocyc.org/）等を利用して見出すことができる。目的の遺伝子の転写量の増大や目的のタンパク質の量の増大を指標として、レギュレーターの改変を行えばよい。

上記のような遺伝子の発現を増強させる手法は、単独で用いてもよく、任意に組み合わせて用いてもよい。

また、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を増大させるような改変は、例えば、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼの非活性を増強することによっても達成できる。非活性が増強されたＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、例えば、種々の細菌を探索し取得することができる。また、在来のＬ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼに変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。非活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H.,Wilson, G.
A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。

目的の酵素活性が増大したことは、同酵素活性を測定することにより確認できる。Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性は、非特許文献４（Dusch N. et al., Appl Environ Microbiol. 1999 Apr;65(4):1530-9.）に記載された手法により測定することができる。

目的の遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。

目的のタンパク質の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。

なお、上記のような遺伝子の発現や酵素の非活性を増強する手法は、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼやそれをコードする遺伝子に限られず、ＳＡＴ等の任意の酵素やそれらをコードする遺伝子等についても同様に適用できる。

Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼは、通常、ｐａｎＤ遺伝子によりコードされる。ｐａｎＤ遺伝子がコードするタンパク質をＰａｎＤタンパク質ともいう。エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｐａｎＤ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、146314〜146694位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｐａｎＤ遺伝子は、ＥＣＫ０１３０、ＪＷ０１２７と同義である。また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のＰａｎＤタンパク質は、GenBank accession NP_414673(version NP_414673.1 GI:16128124、locus_tag="b0131")として登録されている。前記ＭＧ１６５５株のｐａｎＤ遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び８に示す。また、パントエア・アナナティスＳＣ１７株のｐａｎＤ遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９及び１０に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカム２２５６株のｐａｎＤ遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１及び１２に示す。バチラス・サブチリス１６８株のｐａｎＤ遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び１４に示す。

細菌が属する種又は菌株によって、ｐａｎＤ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を増大させるような改変を受けるｐａｎＤ遺伝子は、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号７、９、１１、または１３に示す塩基配列のバリアントであってもよい。ｐａｎＤ遺伝子のバリアントは、例えば配列番号７、９、１１、または１３の塩基配列を参考にして、ＢＬＡＳＴ等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、ｐａｎＤ遺伝子のバリアントは、同遺伝子のホモログ、例えば腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号７、９、１１、または１３の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅可能な遺伝子を含む。

また、上記以外の細菌のｐａｎＤ遺伝子ホモログの例として、以下の細菌のｐａｎＤ遺
伝子が挙げられる。カッコ内は、エシェリヒア・コリＫ１２株のＰａｎＤタンパク質（配列番号８）と、各細菌のｐａｎＤ遺伝子ホモログがコードするＰａｎＤタンパク質との、ＢＬＡＳＴによる同一性（％）を示す。これらの遺伝子の塩基配列及びそれらがコードするアミノ酸配列を、配列番号１５〜６０に示す。なお、ｐａｎＤ遺伝子は、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、これらホモログのバリアントであってもよい。
Arthrobacter aurescens ATCC BAA-1386（54）
Bacteroides fragilis ATCC 25285（44）
Bacteroides vulgatus ATCC 8482（48）
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869（43）
Chlorobium tepidum ATCC 49652（47）
Citrobacter koseri ATCC BAA-895（96）
Clavibacter michiganensis NCPPB 382（51）
Corynebacterium jeikeium NCTC 11915（48）
Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406（44）
Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894（90）
Flavobacterium johnsoniae ATCC 17061（45）
Flavobacterium psychrophilum ATCC 49511（44）
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH78578 ATCC 700721（89）
Methylophilus methylotrophus ATCC 53528（53）
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19851（50）
Parabacteroides distasonis ATCC 8503（48）
Porphyromonas gingivalis ATCC 53978（45）
Rhodococcus sp（49）
Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635（51）
Salinibacter ruber ATCC BAA-605（44）
Salmonella enterica subsp. arizonae serovar 62 ATCC BAA-731（96）
Streptomyces coelicolor ATCC 10147（51）
Thermobifida fusca ATCC 27730（49）

ｐａｎＤ遺伝子は、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、上記のようなＰａｎＤタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Va
l又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記のようなＰａｎＤタンパク質のアミノ酸配列全体、例えば配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０に示すアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。

また、ｐａｎＤ遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。

なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ等の酵素、およびＹｄｅＤタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子にも同様に適用される。

各細菌由来ＰａｎＤタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。これまでに報告されているように、ＰａｎＤタンパク質には共通して保存されている領域が存在する（Armando Albert et al., (1998) Nature structural biology volume 5 number 4:289-293）。したがって、ＰａｎＤタンパク質においては、それらの保存領域が保存されているのが好ましい。

具体的には、ＰａｎＤタンパク質において、２４位のグリシンおよび２５位のセリンが保存されているのが好ましい。ＰａｎＤタンパク質はαサブユニットとβサブユニットに
分割されるが、２４位のグリシンおよび２５位のセリンはその分割場所である。これらのアミノ酸残基は、前記アラインメント（図１）において、どの種のＰａｎＤタンパク質においても共通して保存されていた。

また、９位のリジン、１１位のヒスチジン、５７位のスレオニン、および５８位のチロシンが保存されているのが好ましい。これらのアミノ酸残基は立体構造からポケットと推測され、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性に寄与すると考えられる。これらのアミノ酸残基は、前記アラインメント（図１）において、どの種のＰａｎＤタンパク質においても共通して保存されていた。

また、１５位のバリン、１６位のスレオニン、２０位のロイシン、２２位のチロシン、２９位のアスパラギン酸、４２位のグルタミン酸、５１位のアスパラギン、５２位のグリシン、５４位のアルギニン、６０位のイソロイシン、７２位のアスパラギン、７３位のグリシン、７４位のアラニン、７５位のアラニン、７６位のアラニン、８３位のアスパラギン酸、および８６位のイソロイシンから選択される１またはそれ以上の残基が保存されているのが好ましく、これら全ての残基が保存されているのがより好ましい。これらのアミノ酸残基は、前記アラインメント（図１）において、ほぼ共通して保存されていた。

なお、上記各アミノ酸残基は、配列番号８における各位置に相当するアミノ酸残基を意味する。すなわち、上記各アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「２５位のセリン残基」とは、配列番号８における２５位に相当するセリン残基を意味し、２５位よりもＮ末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、Ｎ末端から２４番目（開始コドンによってコードされるメチニオン残基を含む）のセリン残基が「２５位のセリン残基」であるものとする。また、２５位よりもＮ末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、Ｎ末端から２６番目のセリン残基が「２５位のセリン残基」であるものとする。また、例えば、ＰａｎＤタンパク質において「２５位のセリン残基が保存されている」とは、当該ＰａｎＤタンパク質において配列番号８における２５位に相当するアミノ酸残基がセリンであることを意味する。その他のアミノ酸残基についても同様である。

＜２＞本発明のＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。Ｌ−システインの関連物質としては、先述したＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当するヘミチオケタール、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン等が挙げられる。

使用する培地としては、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

硫黄源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化物等の無機硫黄化合物が挙げられる。

有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養は好気的条件下で３０〜９０時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。

培養物からのＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物の採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が挙げられる。

また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスレイトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。

また、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するようＬ−システイン生産菌を改変することに代えて、パントテン酸を培地に添加することによってもＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を製造することができる。すなわち、本発明の方法のさらなる態様（以下、本発明の第２の方法ともいう）は、Ｌ−システイン生産能を有する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法、である。

なお、本発明の第２の方法に用いるＬ−システイン生産能を有する細菌は、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するよう改変されていてもよく、そうでなくともよい。すなわち、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するようＬ−システイン生産菌を改変することと、パントテン酸を培地に添加することとを組み合わせてもよい。

培地におけるパントテン酸の含有量は、１ｍｇ／Ｌ以上であるのが好ましく、２ｍｇ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５ｍｇ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１０ｍｇ／Ｌ以上であるのが特に好ましい。パントテン酸の含有量の上限は特に制限されないが、例えば、１０ｇ／Ｌ以下であってもよく、１ｇ／Ｌ以下であってもよい。パントテン酸は、フリー体であってもよく、パントテン酸塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。パントテン酸塩としては、特に制限されず、カルシウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。

パントテン酸は、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、本発明の方法が、Ｌ−システイン生産菌を増殖させる段階と、Ｌ−システインを生産蓄積させる段階を含む場合、少なくともＬ−システインを生産蓄積させる段階においてパントテン酸を培地に含有させればよく、Ｌ−システイン生産菌を増殖させる段階においては、パントテン酸を培地に含有させてもよく、含有させなくてもよい。また、Ｌ−システインを生産蓄積させる段階においても
、パントテン酸は、その全期間において培地に含有されていてもよく、その一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、パントテン酸の含有量は、Ｌ−システインを生産蓄積させる段階の全期間において前記の範囲である必要はなく、同段階の初期に含有量が前記の範囲となるようにパントテン酸を培地に含有させ、培養時間の経過に伴いパントテン酸含有量が減少してもよい。また、パントテン酸を連続的あるいは間欠的に追加添加してもよい。

本発明の第２の方法においては、パントテン酸を含有する培地を用いる限り、上述した本発明の細菌を用いる方法と同様の培地成分および同様の培養条件を用いることができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例において、システインはＬ−システインを意味する。

＜実施例＞
（1）C.glutamicum 2256株、E.coli MG1655株、P.ananatis SC17株、B.subtilis 168株由来panD遺伝子を搭載したプラスミドの構築
Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を増強するため、各種panD遺伝子を搭載したpanD遺伝子の発現用プラスミドを以下の手順で構築した。
C.glutamicum 2256株（ATCC13869）のゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーpanD(Cg)-FW（CCAAGCTTATGGCATTCCAATAGTCAGG：配列番号１）およびpanD(Cg)-RV（CGAAGCTTGGGAAAAAGACGGCTCTACC：配列番号２）を用いたＰＣＲにより、panD遺伝子の上流約300bpから下流約200bpまでを含む約９００ｂｐのpanD(Cg)遺伝子断片を増幅した。上記プライマーは、5'末端に制限酵素HindIIIのサイトを有するようデザインされている。PCRは、Pyrobestポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いてプロトコールに記載の標準的な組成で行い、反応条件は94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分を30サイクルとした。得られた断片をHindIIIで処理し、pSTV29（Takara社）のHindIIIサイトに挿入してサブクローニングを行い、シークエンスが正しいことを確認した。そこから再度HindIIIにて切り出した断片を、同酵素で消化したpMW218（Takara社）にベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入し、C.glutamicum 2256株のpanD遺伝子がクローニングされたプラスミドpMW218-panD(Cg)（カナマイシン耐性マーカー）を取得した。

同様に、E.coli MG1655株（ATCC47076）のゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーpanD(Ec)-FW（ATGATTCGCACGATGCTGCAGG：配列番号３）およびpanD(Ec)-RV（TCAAGCAACCTGTACCGGAATCG：配列番号４）を用いたＰＣＲにより、panD(Ec)遺伝子断片を取得した。PCRは、上記と同一の条件で行った。pMW218をSmaI消化した後、得られた断片をベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入し、E.coli MG1655株のpanD遺伝子がクローニングされたプラスミドpMW218-panD(Ec)（カナマイシン耐性マーカー）を取得した。クローニングされたpanD遺伝子は、ベクター上のlacプロモーターのリードスルーにて発現する。

同様に、P.ananatis SC17株（FERM BP-11091）のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーpanD(Pa)-FW（GTAAAGGCTGCAGGTCGTATTTTTGGCTGT：配列番号５）およびpanD(Pa)-RW（GTTCTATATCGCGGTCTACTTCCTGATTCA：配列番号６）を用いたＰＣＲにより、panD(Pa)遺伝子断片を取得した。PCRは、Pyrobestポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いてプロトコールに記載の標準的な組成で行い、反応条件は94℃-1分の後、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分を30サイクルとした。pSTV29をsmaI消化した後、得られた断片をベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入し、P.ananatis SC17株のpanD遺伝子がクローニングされたプラスミドpSTV29-panD(Pa)（クロラムフェニコール耐性マーカー）を取得した。クローニングされたpanD遺伝子は、ベクター上のlacプロモーターのリードスルーにて発現する。

プラスミドpCR-panD（Bs）は、B.subtilis 168株（ATCC23857）のpanD遺伝子を含む領域が搭載されたプラスミドである。pCR-panD（Bs）は、pMW218ベクター（Nippon Gene社）のBamHIサイトにB.subtilis 168株のゲノムの2350947bp〜2353681bpの領域（ゲノムデータベースSubtiListによる；http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/）が両端のSau3AIで挿入された構造を有する。PCR等の定法によりB.subtilis 168株のpanD遺伝子およびその周辺領域を容易に取得でき、本実験の目的に合致するpCR-panD（Bs）と同様の構造のプラスミドを構築できる。

（2）P.ananatisシステイン生産菌SC17intE511-2の構築
各種panD遺伝子の発現強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、P.ananatis SC17株の染色体に阻害解除型SATをコードする遺伝子を挿入し、システイン生産能を有するSC17intE511-2株を以下の手順で構築した。

プラスミドpMIV-CysE5（特開2009-232844）には、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が解除された変異型SATであるCysE5（US20050112731(A1)）をコードする遺伝子（cysE5）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むCysE5カセットが搭載されている。プラスミドpACYC184からEco88I-XbaIで切り出したテトラサイクリン耐性遺伝子を平滑末端化し、同じく平滑末端化した前記pMIV-CysE5のPvuIサイトに挿入し、pMT-CysE5を構築した。得られたpMT-CysE5を利用し、ヘルパーとしてpMH10を用いる定法に従ったmini-Muファージシステム（EP1149911(A)）により、CysE5カセットをP.ananatis野生株であるSC17株の染色体に導入した。形質転換体の選択は、クロラムフェニコール耐性をマーカーとして行った。CysE5カセットが染色体に導入された形質転換体を約50個ピックアップし、システインの生産培養を行ったところ、大部分のクローンが0.2〜0.3 g/Lのシステインを生産した。その中で、１クローンがシステインを約0.7 g/L生産し、このクローンをSC17intE511と名づけた。SC17intE511のゲノムDNAを抽出し、得られたゲノムDNAをエレクトロポレーションにてSC17に導入し、CysE5カセットが染色体に導入された株を改めて作製した。形質転換体の選択は、クロラムフェニコール耐性をマーカーとして行った。約20個の形質転換体をピックアップし、システインの生産培養を行ったところ、ほぼすべてのクローンが0.2〜0.3 g/Lのシステインを生産した。このうちいくつかのクローンのSAT活性を定法（US20050112731(A)）により測定し、親株であるSC17intE511と同程度のSAT活性を有するクローンを選択してSC17intE511-2と名づけた。

（3）P.ananatisシステイン生産菌における各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加のシステイン生産への効果
各種panD遺伝子の発現強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、P.ananatisシステイン生産菌SC17intE511-2を上記のように構築されたプラスミドpMW218-panD(Cg)、pSTV28-panD（Pa）、pCR-panD（Bs）で形質転換した。P.ananatisの形質転換は定法に従ってエレクトロポレーションにより行い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質（25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン）を含むLB寒天培地（5g/L イーストエクストラクト、10g/L トリプトン、10g/L
塩化ナトリウム、15g/L アガー）にて行った。また対照株として、それぞれ空ベクターを形質転換したものも取得した。

以上のようにして得られたSC17intE511-2/ pMW218-panD(Cg)株、SC17intE511-2/ pMW218株、SC17intE511-2/ pSTV28-panD（Pa）株、SC17intE511-2/ pSTV29株、SC17intE511-2/
pCR-panD（Bs）株、SC17intE511-2/ pCR株を用いてシステイン生産培養を行い、生産されるシステインの量を比較した。また、SC17intE511-2/ pSTV29株を用い、パントテン酸カルシウムを20mg/L添加してシステイン生産培養を行い、パントテン酸添加がシステイン生産に及ぼす効果を調べた。培養には、下記組成のシステイン生産培地にプラスミドの抗
生物質耐性マーカーに対応した抗生物質（25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン）を添加して用いた。
＜システイン生産培地組成＞
硫酸アンモニウム 15 g/L
リン酸二水素カリウム 1.5 g/L
硫酸マグネシウム七水和物 1 g/L
チアミン塩酸塩 0.1 mg/L
硫酸第一鉄七水和物 1.7 mg/L
モリブデン酸ナトリウム二水和物 0.15 mg/L
塩化コバルト六水和物 0.7 mg/L
塩化マンガン四水和物 1.6 mg/L
硫酸亜鉛七水和物 0.3 mg/L
硫酸銅五水和物 0.25 mg/L
トリプトン 0.6 g/L
イーストエクストラクト 0.3 g/L
塩化ナトリウム 0.6 g/L
炭酸カルシウム 20 g/L
L-ヒスチジン塩酸塩一水和物 135 mg/L
チオ硫酸ナトリウム 4 g/L
ピリドキシン塩酸塩 2 mg/L
グルコース 60 g/L

システイン生産培養は以下の手順で行った。システイン生産菌各株をクロラムフェニコールまたはカナマイシンを含有するLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った。10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に入れた2mlのシステイン生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。32℃にて振とう培養を行い、グルコースが完全に消費された時点で培養を終了（約13〜16時間）し、培地中に生産されたシステイン量を定量した。培養は、各株とも４連で行った。システインの定量はGaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33）に記載の方法で行った。システイン生産量の平均値と標準偏差を表１に示す。表１に示したとおり、各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加はいずれもシステイン生産量を増加させることが明らかとなった。

（4）阻害解除型SAT遺伝子搭載プラスミドpACYC-E１の構築
システイン生産菌を構築するために用いる、阻害解除型SATをコードする遺伝子を搭載
するプラスミドpACYC-E１を以下の手順で構築した。

プラスミドpACYC-DE1には、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードするcysEX遺伝子（US5972663A）、並びに、システインおよびアセチルセリンの排出因子をコードするydeD遺伝子が搭載されており、これを導入することでシステインを著量生産するシステイン生産菌を作製できる。pACYC-DE1は、EP1528108B1に記載されているpACYC-DESの構築方法と概ね同じ方法により構築することができる。pACYC-DESとの違いは、pACYC-DE1では、serA5遺伝子が搭載されておらず、cysEX遺伝子とydeD遺伝子の2遺伝子のみがpACYC184ベクターに搭載されている点である。pACYC-DE1において、cysEX遺伝子とydeD遺伝子はいずれもompAプロモーターに連結されている。このpACYC-DE1をMnuIで切断してセルフライゲーションさせ、ydeDの内側約330bpを欠損させた。こうして構築した、cysEX遺伝子を搭載し、ydeD遺伝子の機能が消失したプラスミドをpACYC-E1とし、以下の実験に使用した。

（5）E.coliシステイン生産菌における各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加のシステイン生産への効果
panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加の効果がP.ananatis以外の細菌においても得られるかどうか、E.coliシステイン生産菌を用いて検討した。

E.coliシステイン生産菌としては、E.coli MG1655株に前記pACYC-E1（テトラサイクリン耐性マーカー）をエレクトロポレーション法により導入して得られた形質転換体MG1655/ pACYC-E1を用いた。

このE.coliシステイン生産菌MG1655/ pACYC-E1を、pMW218-panD(Cg)、pMW218-panD（Ec）で形質転換した。E.coliの形質転換は定法に従ってエレクトロポレーションにより行い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質（25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン）を含むLB寒天培地にて行った。また対照株として、空ベクターpMW218を形質転換した株も取得した。

以上のようにして得られた、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-panD(Cg)株、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-panD(Ec)株、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-218株を用いてシステイン生産培養を行い、生産されるシステインの量を比較した。また、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-218株を用い、パントテン酸カルシウムを10mg/L添加してシステイン生産培養を行い、パントテン酸添加がシステイン生産に及ぼす効果を調べた。用いたシステイン生産培地の組成は、グルコース濃度を40g/Lとしたこと以外は上記の通りである。上記と同様の方法で、グルコースが完全に消費されるまで19〜22時間培養し、培地中に生産されたシステイン量を定量した。培養は、各株とも４連で行った。システイン生産量の平均値と標準偏差を表２に示す。表２に示したとおり、E.coliにおいても、各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加はいずれもシステイン生産量を増加させることが明らかとなった。

（6）パントテン酸添加濃度の検討
パントテン酸を添加することによりシステイン生産が増加することが今回明らかとなったため、次に、効果が得られるために必要なパントテン酸濃度の検討を行った。

P.ananatis SC17intE511-2/ pSTV29株を、10mg〜100mg/Lの濃度域でパントテン酸カルシウムを添加したシステイン生産培地にて培養し、システイン生産量を測定した。用いたシステイン生産培地の組成は上記の通りであり、グルコース濃度は60g/Lとした。各濃度とも４連で、約16〜20時間培養を行った。システイン生産量の平均値と標準偏差を図２に示す。パントテン酸カルシウムを1mg/L以上添加した場合に、パントテン酸濃度依存的にシステイン生産量が増加することが明らかとなった。

（7）各種panD遺伝子の発現強化株によるシステイン生産
各種PanDタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、例えば配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に示す塩基配列のうち先頭20 bpをフォワード（Fw）プライマーに、末端20 bpの相補配列をリバース（Rv）プライマーに設定し、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分を30サイクルからなるＰＣＲにより各種PanD断片を増幅する。得られた断片を適当なプロモーター制御下に配置する、例えばpSTV28（TaKaRa社）のSmaIサイトへ導入してlacプロモーター制御下に配置することで、PanD遺伝子の発現ベクターを作製する。得られたPanD遺伝子の発現ベクターをシステイン生産菌、例えばP.ananatis SC17intE511-2へエレクトロポレーション法にて導入し、上記の方法にてシステイン生産培養を行うことで、効率的にシステインを生産できる。

配列表の説明
配列番号１：C. glutamicum 2256のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号２：C. glutamicum 2256のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号３：E. coli MG1655のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号４：E. coli MG1655のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：P. ananatis SC17のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号６：P. ananatis SC17のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号７：E. coli MG1655のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号８：E. coli MG1655のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：P. ananatis SC17のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号１０：P. ananatis SC17のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：C. glutamicum 2256のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号１２：C. glutamicum 2256のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：B. subtilis 168のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号１４：B. subtilis 168のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：Arthrobacter aurescensのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Arthrobacter aurescensのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：Bacteroides fragilisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号１８：Bacteroides fragilisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：Bacteroides vulgatusのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Bacteroides vulgatusのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：Brevibacterium lactofermentumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Brevibacterium lactofermentumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Chlorobium tepidumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号２４：Chlorobium tepidumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：Citrobacter koseriのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号２６：Citrobacter koseriのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：Clavibacter michiganensisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号２８：Clavibacter michiganensisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：Corynebacterium jeikeiumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号３０：Corynebacterium jeikeiumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：Cytophaga hutchinsoniiのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号３２：Cytophaga hutchinsoniiのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３：Enterobacter sakazakiiのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号３４：Enterobacter sakazakiiのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３５：Flavobacterium johnsoniaeのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号３６：Flavobacterium johnsoniaeのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７：Flavobacterium psychrophilumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号３８：Flavobacterium psychrophilumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３９：Klebsiella pneumoniaeのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号４０：Klebsiella pneumoniaeのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１：Methylophilus methylotrophusのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号４２：Methylophilus methylotrophusのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：Mycobacterium aviumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号４４：Mycobacterium aviumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：Parabacteroides distasonisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号４６：Parabacteroides distasonisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７：Porphyromonas gingivalisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号４８：Porphyromonas gingivalisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４９：Rhodococcus属細菌のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号５０：Rhodococcus属細菌のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５１：Saccharopolyspora erythraeaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号５２：Saccharopolyspora erythraeaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５３：Salinibacter ruberのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号５４：Salinibacter ruberのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５５：Salmonella entericaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号５６：Salmonella entericaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５７：Streptomyces coelicolorのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号５８：Streptomyces coelicolorのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５９：Thermobifida fuscaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号６０：Thermobifida fuscaのPanDタンパク質のアミノ酸配列

Claims (17)

1. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
2. ｐａｎＤ遺伝子の発現量を増大させることにより、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性が増大した、請求項１に記載の細菌。
3. ｐａｎＤ遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｐａｎＤ遺伝子の発現量が増大した、請求項２に記載の細菌。
4. 前記ｐａｎＤ遺伝子が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項２または３に記載の細菌。
   （Ａ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
   （Ｂ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
5. 前記ｐａｎＤ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の細菌。
   （ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に示す塩基配列を含むＤＮＡ。
   （ｂ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、または５９に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 前記Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、下記（１）および（２）の特徴を有する、請求項４または５に記載の細菌。
   （１）２４位のグリシンおよび２５位のセリンが保存されている。
   （２）９位のリジン、１１位のヒスチジン、５７位のスレオニン、および５８位のチロシンが保存されている。
7. 前記Ｌ−アスパルテート−α−デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、さらに下記（３）の特徴を有する、請求項６に記載の細菌。
   （３）１５位のバリン、１６位のスレオニン、２０位のロイシン、２２位のチロシン、２９位のアスパラギン酸、４２位のグルタミン酸、５１位のアスパラギン、５２位のグリシン、５４位のアルギニン、６０位のイソロイシン、７２位のアスパラギン、７３位のグリシン、７４位のアラニン、７５位のアラニン、７６位のアラニン、８３位のアスパラギン酸、および８６位のイソロイシンが保存されている。
8. さらに、下記の性質（１）〜（３）の１またはそれ以上を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の細菌。
   （１）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
   （２）Ｌ−システイン排出系が強化されている。
   （３）３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
9. 前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細菌。
10. 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項９に記載の細菌。
11. 前記細菌がパントエア属細菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細菌。
12. 前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項１１記載の細菌。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
14. 前記培地がパントテン酸を含有する、請求項１３に記載の方法。
15. Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
16. 前記培地におけるパントテン酸の含有量が１ｍｇ／Ｌ以上である、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記関連物質がＬ−シスチン、チアゾリジン誘導体、またはＬ−メチオニンである、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。