BR112016004367B1 - Microrganismo recombinante e método para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados - Google Patents

Abstract

MICROORGANISMO PARA PRODUÇÃO DE METIONINA COM ATIVIDADE DE METIONINA SINTASE E EFLUXO DE METIONINA AUMENTADOS. O presente pedido está relacionado a um microrganismo recombinante otimizado para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados, em que o referido microrganismo recombinante, a atividade de metionina sintase depende de cobalamina e o efluxo de metionina são aumentados. O pedido está também relacionado em um método para otimizar a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados, compreendo as etapas de: a. cultura de um microrganismo recombinante, em que no referido microrganismo, a atividade de metionina sintase depende de cobalamina e o efluxo de metionina sintase depende de cobalamina e o efluxo de metionina são aumentados, num meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono fermentável e uma fonte de enxofre, e b. recuperação de metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura.

Description

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção relaciona-se a um microrganismo recombinante útil na produção de L-metionina e/ou seus derivados e ao método para preparação de L- metionina. O microrganismo da invenção é modificado de uma maneira em que a produção de L-metionina é otimizada pelo aumento da atividade de metionina sintase dependente de cobalamina, assim como do efluxo de L-metionina. Em particular, os genes metH, fldA, fpr, ou seus genes homólogos, e os genes ygaZ e ygaH, ou seus homólogos, são sobre-expressos nesse microrganismo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Compostos contendo enxofre, como cisteína, homocisteína, metionina ou S-adenosilmetionina, são críticos no metabolismo celular. Em particular, a L-metionina, um aminoácido essencial, não sintetizável por animais, desempenha um papel importante em muitas funções do corpo. A maior parte da metionina produzida industrialmente é vastamente utilizada como aditivo alimentar ou de rações para animais.

[003] Com a diminuição do uso de proteínas de origem animal devida à BSE e gripe aviária, a demanda por metionina pura aumentou. Geralmente, D,L-metionina é produzida quimicamente a partir de acroleína, metil mercaptano e cianeto de hidrogênio. Contudo, a mistura racêmica não tem o mesmo nível de desempenho da L-metionina pura (Saunderson, 1985). Ademais, apesar da L-metionina pura poder ser produzida a partir da metionina racêmica, por exemplo, através do tratamento de N-acetil-D,L-metionina com acilase, isto aumenta drasticamente os custos de produção. Desse modo, a demanda crescente por L-metionina pura, acompanhada com preocupações ambientais, torna a produção microbiana de metionina uma perspectiva atraente.

[004] Outros aminoácidos importantes, como lisina, treonina, e triptofano, são produzidos por fermentação para uso em rações animais. Portanto, estes aminoácidos podem ser produzidos usando glucose e outros recursos renováveis como matéria prima. Até agora, a produção fermentativa de L- metionina ainda não obteve sucesso, mas o desenvolvimento da tecnologia encontra-se em andamento.

[005] Foram já descritas diferentes abordagens para a otimização da produção de L-metionina em microrganismos (ver, por exemplo, patentes ou pedidos de patente US7,790,424, US7,611,873, WO2002/10209, WO2005/059093 e WO2006/008097); no entanto, a produção industrial de L- metionina por microrganismos carece de mais desenvolvimento. Em Escherichia coli, a etapa terminal da biossíntese de novo de metionina é catalisada por duas enzimas distintas; a metionina sintase dependente de cobalamina (MetH, EC 2.1.1.13) que contém um grupo prostético necessário à sua atividade e a metionina sintase independente de cobalamina (MetE, EC 2.1.1.14) (Foster et al., 1961; Gonzalez et al., 1992). A metionina sintase dependente de cobalamina, MetH, é uma proteína de ~136 kDa que contém quatro domínios: um domínio contendo o cofator cobalamina (domínio Cob), um domínio de ligação ao substrato metil-THF (domínio CH3-THF), um domínio de ligação ao substrato homocisteína (domínio Hcy), e um domínio de ligação a S-Adenosil-Metionina (SAM) (domínio Adomet) (Matthews, 2001). A enzima é desativada por oxidação na presença de oxigênio (Banerjee et al., 1990). Para reativar a enzima, ocorre uma metilação redutora. A reação envolve um grupo metil proveniente de SAM ligado ao domínio AdoMet da enzima, e dois elétrons transferidos através de uma cadeia de transporte externa. Os dois elétrons são provenientes de NADPH e transferidos através de uma cadeia redox de potencial negativo composta por uma flavodoxina redutase contendo FAD, FldA e uma flavodoxina redutase contendo FMN, Fpr (Fujii & Huennekens, 1974; Wan & Jarrett, 2002) em Escherichia coli. Como revelado no pedido de patente WO2009/144270, foram identificados homólogos funcionais de FldA e Fpr em Corynebacterium glutamicum. São eles, respetivamente, FdxC, FdxD ou FdxA e FprA1, FprA2, FprA3 ou FldR1.

[006] O complexo proteico YgaZ e YgaH pertence à família de exportadores de aminoácidos de cadeia ramificada (LIV-E), família responsável pela exportação de L-valina. Da mesma forma, YgaZH está também envolvido na exportação de metionina, como demonstrado por Trotschel et al para BrnFE, a homóloga de YgaZH em Corynebacterium glutamicum (Trotschel et al., 2005).

[007] Foram apresentados diversos pedidos de patentes relacionados à otimização da atividade da metionina sintase por diferentes meios, de forma a produzir L- metionina:o WO2007/012078 e WO2007/135188 da BASF reivindicam, entre outras modificações, alteração genética conducente a sobre-expressão de, pelo menos, metH e/ou metE,o WO2009/144270 da Evonik revela um método de produção de metionina com um microrganismo que apresenta um aumento de quantidade e/ou atividade de um sistema de reativação de MetH dependente de cob(I)alamina,o WO2008/080900 da Evonik reivindica uma forma MetHFBR (Resistente a FeedBack) que será mais resistente a concentrações elevadas de L-metionina.

[008] Igualmente, um pequeno número de patentes revela a sobre-expressão de genes codificando o sistema de efluxo de metionina em diferentes microrganismos:o pedidos de patentes WO2002/097096 e WO2005/085463 (Degussa) descrevem redução de captação de L-metionina em Corynebacterium ou,o pedidos de patentes EP1239041 (Ajinomoto) e WO2008/082211 (CJ Corporation) revelam sobre-expressão de um exportador de aminoácidos de cadeia ramificada (YgaZH), responsável pela exportação de L-valina e L- metionina.

[009] Inventores descobriram inesperada e surpreendentemente que o aumento do efluxo de L-metionina, juntamente com o aumento da atividade de L-metionina sintase dependente de cobalamina num microrganismo recombinante sobre-produtor de L-metionina, aumentam a produção de metionina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010] A invenção refere-se a um microrganismo recombinante e método para otimização da produção de metionina e/ou seus derivados, no qual a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina e o efluxo de metionina são aumentados. No microrganismo recombinante, a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina é aumentada pela sobre-expressão de metH e, opcionalmente, dos genes fldA e fpr de E. coli ou seus genes homólogos de C. glutamicum, enquanto que o efluxo de metionina é aumentado pela sobre-expressão dos genes ygaZH de E. coli ou brnFE de C. glutamicum, ou seus genes homólogos.

[011] O microrganismo recombinante pode ainda apresentar outras modificações genéticas, como: o expressão aumentada de pelo menos um dos seguintes genes: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metA, alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade a feedback reduzida para S- adenosilmetionina e/ou metionina, thrA, ou um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição por feedback reduzida para treonina e/ou o expressão atenuada de um dos seguintes genes: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, udhA, dgsA, metE3 metN, metl, metQ ou yncA.

[012] Em uma modalidade particular, a presente invenção relaciona-se a um microrganismo recombinante em que: a) os genes metH, e, opcionalmente, os genes fldA e fpr de E. coli ou os seus genes homólogos de C. glutamicum são sobre-expressos, b) os genes ygaZ e ygaH de E. coli ou os genes brnF e brnE de C. glutamicum, os seus genes homólogos oriundos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii estão em sobre-expressão, e c) a expressão dos genes metA*, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG e pyc está aumentada; e d) a expressão dos genes metJ, pykA, pykF, purU, yncA, dgsA e metE está atenuada.

[013] O microrganismo recombinante é, preferencialmente, Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[014] Antes de passar à descrição detalhada da presente invenção, deve entender-se que ela não se limita aos métodos exemplificados em particular e pode, naturalmente, variar. Deve também ser entendido que a terminologia aqui usada serve unicamente o propósito de descrever modalidades particulares da invenção, que serão limitadas apenas pelas reivindicações anexadas, e não se destina a ser limitativa.

[015] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados, tanto supra como infra, são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

[016] Ademais, a prática da presente invenção aplica, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de microbiologia e biologia molecular dentro da especialidade. Estas técnicas são bem conhecidas do especialista no assunto e encontram-se explicadas em detalhe na literatura.

[017] Deve notar-se que, tal como usadas aqui ou nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um/uma" e "o/a", compreendem referência plural, exceto se o contexto ditar claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um microrganismo" compreende a pluralidade de tais microrganismos, e a referência a "um gene endógeno" relaciona-se a um ou mais genes endógenos, e assim por diante. Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado comumente entendido por um especialista no assunto a que esta invenção se relaciona. Apesar de poderem ser usados quaisquer materiais e métodos semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos para levar à prática ou testar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos.

[018] Nas reivindicações que se seguem e subsequente descrição da invenção, exceto quando o contexto dite o contrário por linguagem expressa ou implicação necessária, as palavras “compreender”, “conter”, “envolver” ou “incluir” ou variações como “compreende”, “compreendendo”, ”contendo”, “envolvido”, “inclui”, “incluindo” são usadas com sentido inclusivo, i.e., para especificar a presença do aspecto referido, não excluindo a presença ou acréscimo de outros aspectos em várias modalidades da invenção.

[019] Os termos “metionina” e “L-metionina ” designam o aminoácido essencial contendo enxofre com a fórmula química HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 e número CAS 59-51-8 ou 63-68-3 para o L-isómero específico.

[020] “Derivados de metionina ” refere-se a moléculas análogas a metionina que apresentam a mesma cadeia química principal, mas diferem da metionina em pelo menos um grupo químico. Nesta invenção, os derivados de metionina preferidos são N-acetil metionina (NAM), S-adenosil metionina (SAM) e hidroximetionina (ou um análogo de hidroximetionina ou MHA).

[021] O termo “microrganismo”, aqui usado, refere- se a uma bactéria, levedura ou fungo não modificado artificialmente. Preferencialmente, o microrganismo é selecionado de entre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma espécie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella, ou Corynebacterium. Dentro destes, na presente invenção, são preferidas as espécies Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

[022] A designação “microrganismo recombinante ” ou “microrganismo geneticamente modificado”, tal como aqui usada, refere-se a uma bactéria, levedura ou fungo que não se encontra na natureza e é geneticamente diferente do seu equivalente encontrado na natureza. Isto significa que ele é modificado por introdução, deleção ou modificação de elementos genéticos. Também pode ser transformado forçando o desenvolvimento e evolução de novas vias metabólicas, por combinação de mutagênese direcionada e evolução sob uma pressão seletiva específica (ver, por exemplo, WO2004/076659 ou WO2007/011939).

[023] Um microrganismo pode ser modificado de forma a expressar genes exógenos se esses genes forem introduzidos com todos os elementos necessários à sua expressão no microrganismo hospedeiro. A modificação ou “transformação” de microrganismos com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para o especialista no assunto.

[024] Um microrganismo pode ser modificado de forma a modular o nível de expressão de um gene endógeno.

[025] A designação “gene endógeno” significa que o gene estava presente no microrganismo antes de qualquer modificação genética. Genes endógenos podem ser sobre- expressos por introdução de sequências heterólogas, em acréscimo a, ou em substituição de elementos regulatórios endógenos ou, ainda, introduzindo uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou um plasmídeo. Genes endógenos também podem ser modificados para modular a sua expressão e/ou atividade. Por exemplo, podem ser introduzidas mutações na sequência codificadora para modificar o produto do gene, ou podem introduzir-se sequências heterólogas em acréscimo a, ou substituição de, elementos regulatórios endógenos. A modulação de um gene endógeno pode resultar na supra-regulação e/ou aumento da atividade do produto do gene, ou, em alternativa, infraregular e/ou diminuir a atividade do produto do gene endógeno.

[026] Outra forma de modular a sua expressão é trocar o promotor endógeno de um gene (e.g., promotor tipo selvagem) por outro, mais forte ou mais fraco, de forma a supra ou infra-regular a expressão do gene endógeno. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Está dentro da capacidade do especialista no assunto selecionar promotores adequados.

[027] Pelo contrário, "gene exógeno" significa que o gene foi introduzido no microrganismo, por meios bem conhecidos do especialista no assunto, sendo que ele não ocorre naturalmente no microrganismo. Genes exógenos podem ser integrados no cromossomo hospedeiro, ou ser expressos extra-cromossomicamente por plasmídeos ou vetores. São conhecidos nesta especialidade uma variedade de plasmídeos, que diferem quanto à sua origem de replicação e número de cópias na célula. Estes genes podem ser homólogos.

[028] No contexto da invenção, "gene homólogo" não se limita a designar genes com um antepassado genético comum teórico, mas inclui também genes que podendo ser geneticamente não relacionados, evoluíram, ainda assim, para codificar uma proteína que desempenha funções idênticas e/ou apresenta estrutura semelhante. Assim, no contexto da presente invenção, a designação "homólogo funcional" relaciona-se ao fato de uma determinada atividade enzimática poder não ser gerada apenas por uma proteína específica com determinada sequência de aminoácidos, mas também por proteínas com sequência semelhante de outros microrganismos aparentados, ou não.

[029] Utilizando as referências fornecidas pelo Genbank para genes conhecidos, os especialistas no assunto são capazes de determinar os genes equivalentes noutros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente realizado usando sequências de consenso, que podem ser determinadas procedendo ao alinhamento de sequências com genes derivados de outros microrganismos e criando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de rotina de biologia molecular, são bem conhecidos dos especialistas no assunto.

[030] As expressões "produção aumentada de metionina", "aumento de produção de metionina" e seus equivalentes gramaticais aqui usados, relacionam-se a um aumento do rendimento metionina/fonte de carbono (rácio de grama/mol de metionina produzida por grama/mol de fonte de carbono consumida, que pode ser expresso em percentagem) e/ou ao aumento do grau de pureza da metionina produzida. Na presente invenção, a pureza da metionina produzida pode ser aumentada diminuindo a produção de cetometilvalerato e/ou homolantionina. São do conhecimento dos especialistas no assunto métodos para determinação da quantidade de fonte de carbono consumida e de metionina produzida. O rendimento e/ou pureza da metionina produzida são maiores no microrganismo recombinante do que no microrganismo não modificado correspondente.

[031] A designação "microrganismo otimizado para a produção fermentativa de metionina" relaciona-se a microrganismos que evoluíram e/ou foram geneticamente modificados para apresentarem produção de metionina aumentada em comparação com a produção endógena nos microrganismos tipo selvagem correspondentes. Estes microrganismos "otimizados" para a produção de metionina são bem conhecidos na especialidade, e foram revelados em particular nos pedidos de patentes WO2005/111202, WO2007/077041, WO2009/043803 e WO2012/098042.

[032] De acordo com a invenção, "produção fermentativa", "cultura" ou "fermentação" são usados para indicar crescimento bacteriano. Este crescimento é geralmente levado a cabo em fermentadores com um meio de cultura apropriado, adaptado ao microrganismo utilizado e contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e co- substratos se necessário.

[033] Um "meio de cultura apropriado" designa um meio (e.g., um meio líquido, estéril) contendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou crescimento da célula, tais como fontes ou substratos de carbono; fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico, fosfato dipotássico; oligoelementos (e.g., sais metálicos), por exemplo sais de magnésio, cobalto e/ou manganês; assim como fatores de crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas.

[034] Na presente invenção, as designações "fonte de carbono" ou "substrato carbônico" referem-se a qualquer fonte de carbono que possa ser usada pelo especialista no assunto para sustentar o crescimento normal de um microrganismo, incluindo monossacarídeos (como glucose, galactose, xilose, frutose ou lactose), oligossacarídeos, dissacarídeos (como sacarose, celobiose ou maltose), melaço, amido ou seus derivados, hemiceluloses e combinações entre eles. A glucose é uma fonte especialmente preferida de carbono simples. Outra destas fontes preferida é a sacarose. A fonte de carbono pode ser derivada de matéria prima renovável. Matéria prima renovável é definida como matéria base necessária para determinados processos industriais, que pode regenerar-se num curto espaço de tempo e em quantidade suficiente para permitir a sua transformação no produto desejado. Biomassa vegetal, tratada ou não, é uma interessante fonte renovável de carbono.

[035] De acordo com esta invenção, "fonte de enxofre" refere-se a sulfato, tiossulfato, sulfito de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito, metil mercaptano, dimetilsulfito e outros sulfitos com grupos metil, ou uma combinação das diferentes fontes. Mais preferencialmente, a fonte de enxofre no meio de cultura será sulfato, ou tiossulfato, ou uma mistura dos dois.

[036] "Fonte de nitrogênio" corresponde a um sal de amônio ou um gás de amônio. A fonte de nitrogênio é fornecida sob a forma de amônio ou amoníaco.

[037] Neste contexto, as expressões "atenuação" ou "expressão atenuada" significam que a produção de um gene ou a produção de uma enzima estão diminuídas ou suprimidas quando comparadas com as do microrganismo não modificado, levando a uma diminuição da concentração intracelular de um ácido ribonucleico, uma proteína ou uma enzima, por comparação com o microrganismo não modificado. O especialista no assunto conhece diferentes meios e métodos para medir a concentração de ácido ribonucleico ou proteína na célula, incluindo, por exemplo, o uso de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) por transcrição reversa (RT-PCR) e Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qPCR) para determinar a concentração de ácido ribonucleico, e a utilização de um anticorpo específico para determinar a concentração de uma proteína específica.

[038] A diminuição ou supressão da produção de uma enzima é obtida através da atenuação da expressão do gene que a codifica.

[039] A atenuação de genes pode ser conseguida através de métodos conhecidos dos especialistas no assunto. Duma forma geral, a atenuação de genes pode ser obtida das seguintes formas: o mutando a região codificante ou a região promotora ou, o deletando a totalidade ou parte da região promotora necessária à expressão do gene ou, o deletando a totalidade ou parte da região codificadora do gene por recombinação homologa ou, o inserindo um elemento externo na região codificadora ou na região promotora ou, o expressando o gene sob o controle de um promotor fraco ou um promotor induzível.

[040] O especialista no assunto conhecerá uma variedade de promotores com diferentes forças e saberá qual utilizar para obter uma expressão genética fraca ou induzível.

[041] O termo “atividade” de uma enzima é usado de forma intercambiável com o termo “função” e designa, no contexto desta invenção, a reação que é catalisada pela enzima. O especialista no assunto saberá medir a atividade enzimática da enzima em questão.

[042] Os termos “atividade atenuada” ou “atividade reduzida” de uma enzima referem-se a uma redução da atividade catalítica específica da proteína obtida por mutação na sequência de aminoácidos e/ou concentrações diminuídas da proteína na célula obtidas por mutação da sequência nucleotídica ou por deleção da região codificante do gene.

[043] Os termos “atividade aumentada” ou “atividade melhorada” de uma enzima designam um aumento da atividade catalítica específica da enzima e/ou um aumento da quantidade/disponibilidade da enzima na célula, obtida, por exemplo, pela sobre-expressão do gene que a codifica.

[044] Os termos “expressão aumentada”, “expressão melhorada” ou “sobre-expressão” e seus equivalentes gramaticais, são usados de forma intercambiável no texto e têm significado idêntico. Estes termos significam que a expressão de um gene ou a produção de uma enzima está aumentada quando comparada com o microrganismo não modificado, levando a um aumento da concentração intracelular de um ácido ribonucleico, uma proteína ou uma enzima, quando comparada com o microrganismo não modificado. O especialista no assunto conhecerá diferentes meios e métodos para medição da concentração de ácido ribonucleico ou de proteína na célula, por exemplo, PCR por transcrição reversa (RT-PCR) e PCR em tempo real (qPCR) para determinar a concentração de ácido ribonucleico e o uso de anticorpos específicos para determinar a concentração de uma proteína específica.

[045] O aumento da produção de uma enzima é obtido aumentando a expressão do gene que a codifica.

[046] Para aumentar a expressão de um gene, o especialista no assunto conhecerá diferentes técnicas, como: o aumento do número de cópias do gene no microrganismo. O gene é codificado cromossômica ou extracromossicamente. Quando o gene está localizado no cromossomo, podem ser introduzidas várias cópias do gene no cromossomo através de métodos de recombinação, conhecidos do especialista no assunto (incluindo substituição de genes). Quando o gene está localizado extracromossicamente, ele poderá ser transportado por diversos tipos de plasmídeos, que diferem ao nível da sua origem de replicação e, assim, do seu número de cópias na célula. Estes plasmídeos estão presentes no microrganismo em número de 1 a 5 cópias, ou cerca de 20 cópias, ou até 500 cópias, dependendo do tipo de plasmídeo: plasmídeos de baixo número de cópias com replicação controlada (e.g. pSC101, RK2 para E. coli), plasmídeos de baixo número de cópias (e.g. pACYC, pRSF1010 para E. coli) ou plasmídeos de elevado número de cópias (e.g. pSK bluescript II para E. coli). o utilização de um promotor, levando a um nível elevado de expressão do gene. O especialista no assunto sabe quais os promotores mais convenientes, por exemplo, os promotores Ptrc, Ptac, Plac, ou o promotor lambda cI são amplamente utilizados. Estes promotores podem ser “indutíveis” por um composto particular ou condição externa específica, como luz ou temperatura. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. o atenuação da atividade ou expressão de um repressor de transcrição específico, ou não, para o gene. o uso de elementos estabilizadores do RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling, 1999) ou elementos estabilizadores da proteína (e.g., etiquetas GST, GE Healthcare).

[047] Os termos “codificando” ou “codificante” relacionam-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo, através dos mecanismos de transcrição e translação, produz uma sequência de aminoácidos. O(s) gene(s) que codificam a(s) enzima(s) podem ser exógenos ou endógenos.

[048] Os termos “sensibilidade de feed-back” ou “inibição de feed-back” referem-se a um mecanismo de controle celular no qual uma ou várias enzimas que catalisam a produção de uma dada substância na célula são inibidas ou sua atividade reduzida quando essa substância se acumulou até um certo nível. Assim, os termos “sensibilidade de feedback reduzida” ou “inibição de feed-back reduzida” significam que a atividade desse mecanismo se encontra diminuída ou suprimida quando comparada com a do microrganismo não modificado. O especialista no assunto sabe como modificar a enzima para obter este resultado. Tais modificações foram descritas no pedido de patente WO2005/111202 ou na patente US7,611,873.

[049] Em uma primeira modalidade da invenção, um microrganismo recombinante é otimizado para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados aumentando a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina e do efluxo de metionina no referido microrganismo. O microrganismo recombinante é escolhido de preferência entre Enterobacteriaceae ou Corynebacteriaceae. Mais preferencialmente, o microrganismo recombinante da invenção é escolhido entre Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

[050] Como descrito anteriormente, a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina é mediada pela enzima MetH. Esta enzima requer um sistema de reativação para que tenha uma atividade sustentada. Este sistema e codificado por dois genes, fldA e fpr em E. coli e por um gene escolhido respetivamente entre fdxC, fdxD ou fdxA e entre fprA1, fprA2, fprA3 ou fldR1 em C. glutamicum. Neste pedido, os termos “MetH e seu sistema de reativação” ou “metH, fldA, fpr” relacionam-se à metionina sintase dependente de cobalamina e seu sistema de reativação tanto em E. coli como em C. glutamicum ou aos genes que a codificam em E. coli e C. glutamicum. Assim, o aumento da atividade da metionina sintase dependente de cobalamina é realizado de preferência pela sobre-expressão do gene metH e também do seu sistema de reativação, codificado pelos genes fldA e fpr.

[051] Em uma modalidade da invenção, a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina é aumentada pela sobre-expressão (aumento da expressão) dos genes metH, fldA, fpr de E. coli ou seus homólogos de C. glutamicum. De preferência, esses genes são sobre-expressos sob a ação de um promotor diferente do seu promotor tipo selvagem.

[052] Mais preferencialmente, os genes metH, fldA ou fpr ou genes seus homólogos de C. glutamicum são sobre- expressos cromossomicamente, i.e., esses genes são sobre- expressos a partir do cromossomo. Uma ou várias cópias suplementares de cada gene são introduzidas no cromossomo do microrganismo. Elas são integradas em diferentes loci selecionados de uma lista divulgada no pedido de patente WO2011/073122, e cujas deleções não têm impacto na produção de metionina. A cópia de tipo selvagem da sequência codificante de cada gene é conservada, mas a sua região promotora pode ser substituída por um promotor artificial e/ou sítio de ligação ribossômico (RBS).

[053] Em uma modalidade específica da invenção: o o gene metH tipo selvagem é conservado com substituição do seu promotor natural e RBS, e são introduzidas duas cópias adicionais no cromossomo, e o os genes fldA e fpr tipo selvagem e suas regiões promotoras são conservados, e uma cópia adicional de cada gene é introduzida no cromossomo.

[054] Cópias adicionais dos genes introduzidos são expressas sob o controle do promotor artificial e RBS.

[055] Em microrganismos produtores de aminoácidos, a metionina é excretada por um transportador de efluxo específico. Particularmente, em E. coli, este transportador é designado YgaZH e é codificado pelos genes ygaZ e ygaH, enquanto que em C. glutamicum, é denominado BrnFE e codificado pelos genes brnF e brnE. Foram identificados homólogos funcionais deste sistema de efluxo de metionina em vários outros microrganismos. Na presente invenção, o microrganismo recombinante sobre-expressa genes ygaZH de E. coli ou genes brnFE de C. glutamicum. Alternativamente, o microrganismo recombinante da invenção pode sobre-expressar homólogos funcionais de YgaZH ou de transportadores BrnFE. As Tabelas 1 e 2 apresentam, respetivamente, proteínas homólogas de YgaZ e YgaH.

[056] Utilizando o número de acesso indicado nas tabelas para cada homólogo, o especialista no assunto poderá obter a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos que a codifica, por exemplo, nos bancos de dados do NCBI.

[057] A partir da sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica, é uma tarefa de rotina para o especialista no assunto obter genes codificando estes homólogos. Isto pode ser feito tanto por síntese artificial do gene que codifica a proteína de interesse a partir da sua sequência de aminoácidos, como através de amplificação por PCR da região codificante de interesse a partir do DNA genômico correspondente. No contexto desta invenção, estes genes são designados “genes homólogos de ygaZ ou ygaH”. As sequências destes genes homólogos de ygaZH podem ser ajustadas ao desvio de códons do microrganismo hospedeiro.

[058] Em uma modalidade específica da invenção, o microrganismo recombinante sobre-expressa os genes ygaZ e ygaH de E. coli que codificam as proteínas cujas sequências estão divulgadas respetivamente em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, ou brnF e brnE de C. glutamicum ou genes seus homólogos. De preferência, os genes homólogos de ygaZ e ygaH serão um par de genes oriundos do mesmo organismo, composto pelo gene homólogo de ygaZ e o gene homólogo de ygaH. No entanto, poderá usar-se um par irregular com um gene homólogo de ygaZ de um primeiro organismo e um gene homólogo de ygaH de um segundo organismo. De preferência, os genes ygaZH, brnFE ou seus genes homólogos são sobre-expressos.

[059] Os genes homólogos de YgaZH são escolhidos de entre genes codificando os homólogos de YgaZ e YgaH divulgados, respetivamente, nas tabelas 1 e 2. Preferencialmente, os genes homólogos de ygaZH são escolhidos de entre genes codificando homólogos de YgaZH de espécies de Citrobacter, Shigella, Raoultella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus. Mais preferencialmente, os genes homólogos de ygaZH serão originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii. Mais preferivelmente, os genes homólogos de ygaZH procederão de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii ou Enterobacter sp..

[060] Assim, os genes homólogos de ygaZH são escolhidos preferivelmente entre genes codificando o par constituído por homólogo de YgaZ e homólogo de YgaH definido respetivamente por: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 de Citrobacter koseri, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 de Shigella flexneri, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 de Raoultella ornithinolytica, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 de Enterobacter sp. (R4-368), SEQ ID NO: 11 ou 12 e SEQ ID NO: 13 ou 14 de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 de Photorhabdus luminescens subsp. laumondii, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 de Citrobacter youngae, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 de Citrobacter freundii.

[061] Em uma modalidade preferida da invenção, estes genes ygaZH ou brnFE ou genes homólogos originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii são sobre-expressos sob o controle de um promotor indutível. O especialista no assunto conhece os referidos promotores indutíveis. Por exemplo, promotores como I PR ou I PL podem ser usados para a sobre-expressão dos genes ygaZH ou genes brnFE ou genes homólogos de ygaZH originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii no microrganismo recombinante da invenção.

[062] Outro objetivo da invenção é identificar genes homólogos de ygaZH e obter a sua sobre-expressão num microrganismo produtor de aminoácidos, isoladamente ou em combinação com outras modificações genéticas, como discutido abaixo.

Otimização da via de biossíntese de metionina

[063] O microrganismo recombinante, de acordo com a invenção, é modificado para aumentar a produção de metionina. Os genes envolvidos na produção de metionina são bem conhecidos na área e compreendem genes envolvidos na via de biossíntese específica de metionina, assim como genes envolvidos em vias fornecedoras de precursores e genes envolvidos em vias que consomem metionina.

[064] A produção eficiente de metionina requer a otimização da via específica de metionina e várias vias produtoras de precursores. Foram já descritas cepas produtoras de metionina, em particular nos pedidos de patente WO2005/111202, WO2007/077041 e WO2009/043803. Estes pedidos foram incorporados como referência no presente pedido.

[065] Salvo indicação em contrário, todos os genes mencionados abaixo com relação à otimização da via de biossíntese de metionina referem-se a genes de E. coli.

[066] Em uma modalidade específica da invenção, o microrganismo recombinante é modificado como descrito abaixo: a expressão de pelo menos um gene escolhido entre ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metA, alelo de metA* codificando para uma enzima com sensibilidade de feed-back a S-adenosilmetionina e/ou metionina reduzida, thrA, e alelo de thrA* codificando para uma enzima com inibição por feedback reduzida para treonina, se encontra aumentada. o ptsG codifica a enzima PTS IICBGlc, como descrito no pedido de patente WO2013/001055, o pyc codifica uma piruvato carboxilase, como descrito no pedido de patente WO2013/001055. Em uma modalidade preferida, o gene pyc é heterólogo e escolhido de entre genes pyc de Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Pseudomonas fluorescens ou espécies de Corynebacterium, o pntAB codificam subunidades de uma transidrogenase ligada à membrana, tal como descrito no pedido de patente WO2012/055798, o cysP codifica uma proteína periplasmática de ligação a sulfato, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysU codifica um componente de transportador de sulfato de tipo ABC, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysW codifica uma proteína transportadora de sulfato ligada à membrana, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysA codifica uma sulfato permease, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysM codifica uma O-acetilserina sulfidralase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysI e cysJ codificam respetivamente as subunidades alfa e beta duma sulfito redutase como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803. De preferência, cysI e cysJ são sobre-expressas em conjunto, o cysH codifica um adenililsulfato redutase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803.

[067] O aumento do metabolismo C1 constitui também uma modificação que leva à produção aumentada de metionina. Ele relaciona-se ao aumento de atividade de pelo menos uma enzima envolvida no metabolismo C1, escolhida entre GcvTHP, Lpd, MetF ou MetH. Em uma modalidade preferida da invenção, o metabolismo C1 é aumentado melhorando a expressão e/ou atividade de pelo menos um dos seguintes: o gcvT, gcvH, gcvP, e lpd, codificando o complexo de clivagem de glicina, como descrito no pedido de patente WO 2007/077041. O complexo de clivagem de glicina (GCV) é um complexo multienzimático que catalisa a oxidação de glicina, produzindo dióxido de carbono, amônia, metileno-THF e um nucleotídeo de piridina reduzido. O complexo GCV consiste em quatro componentes proteicos: a glicina desidrogenase, dita proteína P (GcvP), a lipoilproteína-GcvH, dita proteína H (GcvH), a aminometiltransferase, dita proteína T (GcvT), e a diidrolipoamida desidrogenase, dita proteína L (GcvL ou Lpd). A proteína P catalisa a libertação de CO2 dependente de piridoxal fosfato a partir de glicina, daí resultando uma fração de metilamina. Esta fração de metilamina é transferida para o grupo ácido lipóico da proteína H, que se encontra ligado à proteína P anteriormente à descarboxilação da glicina. A proteína T catalisa a libertação de NH3 a partir do grupo metilamina e transfere a restante unidade C1 para THF, formando metileno-THF. A proteína L oxida então o componente de ácido lipóico da proteína H e transfere os elétrons para NAD+, formando NADH; o MetF codificando uma metilenotetraidrofolato redutase, como descrito no pedido de patente WO2007/07704.

[068] A sobre-expressão de pelo menos um dos seguintes genes envolvidos na biossíntese de serina também reduz a produção do subproduto isoleucina: o serA que codifica uma fosfoglicerato desidrogenase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o serB que codifica uma fosfosserina fosfatase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o serC que codifica uma fosfosserina aminotransferase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803.

[069] Já foi demonstrado que a sobre-expressão dos seguintes genes aumenta a produção de metionina: o cysE codifica uma serina aciltransferase; a sua sobre- expressão permite um aumento na produção de metionina, como descrito em WO2007/077041; o metA codifica uma homosserina succiniltransferase. O alelo metA* codifica uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S-adenosilmetionina e/ou metionina. Preferencialmente, usa-se o alelo metA* descrito no pedido de patente WO2005/111202; o thrA codifica uma aspartocinase/homosserina desidrogenase; o alelo thrA* codifica uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina, como descrito em WO2005/111202.

[070] Em uma modalidade específica da invenção, pelo menos um dos genes referidos está sob o controle de um promotor indutível. Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos um destes genes está sob o controle de um promotor indutível por temperatura. De preferência, a expressão de pelo menos um dos seguintes genes: thrA, cysE, metA, está sob o controle de um promotor indutível, directa or indirectamente. Mais preferencialmente, os genes thrA, cysE e metA estão sob o controle de um promotor indutível, directa ou indirectamente. Em uma modalidade preferida da invenção, a expressão do gene thrA está sob controle direto de um promotor indutível e a expressão do gene cysE está sob efeito polar da expressão indutível do gene thrA. Em outra modalidade preferida da invenção, a expressão do gene thrA encontra-se sob controle direto de um promotor indutível e a expressão dos genes cysE e metA está sob efeito polar da expressão indutível do gene thrA.

[071] Em uma modalidade mais preferida, o promotor indutível por temperatura pertence à família de promotores PR. Uma cepa produtora de metionina com genes sob o controle de promotores indutíveis está descrita no pedido de patente WO2011/073122.

[072] Em outra modalidade específica da invenção, o microrganismo foi sujeito a mais modificações, e a expressão de pelo menos um dos seguintes genes está atenuada: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, metE, dgsA, metN, metI, metQ ou udhA. o O gene metJ codifica a proteína repressora MetJ (GenBank 1790373), responsável pela regulação para baixo do regulon de metionina, como sugerido no pedido de patente JP2000/157267, o Os genes pykA e pykF codificam as enzimas ‘piruvato cinase’. A atenuação da expressão de pelo menos uma ou ambas piruvato cinases diminui o consumo de fosfoenol piruvato (PEP). Disponibilidade aumentada de PEP pode aumentar a produção de oxaloacetato, um precursor importante de aspartato, que, por sua vez, é um precursor de metionina, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o purU codifica uma formiltetraidrofolato desformilase, uma enzima que catalisa a reação formil-THF desformilase. A atenuação da atividade da desformilase aumenta a produção de metil-THF que é necessária para a metilação de homocisteína. A perda de metabolitos C1 por desformilação leva a um aumento da produção de homocisteína que não pode ser transformada em metionina. A homocisteína pode então constituir substrato para a enzima cistationina gamma sintase (MetB), que pode catalisar a reação entre O-succinil homosserina e homocisteína, resultando na produção de homolantionina, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o ybdL codifica uma aminotransferase como descrito no pedido de patente WO2012/090021, o yncA codifica uma N-aciltransferase, como descrito no pedido de patente WO2010/020681, o metE codifica uma metionina sintase independente de cobalamina, como descrito no pedido de patente PCT/IB2012/001336, o dgsA, mais conhecido como Mlc, codifica um regulador de transcrição duplo que controla a expressão de genes codificando enzimas dos sistemas fosfotransferase (PTS) e fosfoenolpiruvato (PEP) como descrito no pedido de patente WO2013/001055, o metN, metI, metQ, codificam um sistema de captação de metionina, o udhA codifica nucleotídeo piridina transidrogenase solúvel, como descrito no pedido de patente WO2012/055798.

[073] Em uma modalidade mais preferida da invenção, a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados por um microrganismo recombinante, em que a importação de metionina está atenuada e o efluxo de metionina aumentado, a partir de glucose como fonte principal de carbono, pode ser conseguida através de uma combinação das modificações no referido microrganismo discutidas acima, por exemplo: o a expressão do gene metJ está atenuada e a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; o a expressão do gene metJ está atenuada; a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; e a expressão de um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina (thrA*) está aumentada; o a expressão do gene metJ está atenuada; a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; a expressão de um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina (thrA*) está aumentada; e a expressão do gene cysE está aumentada; o a expressão do gene metJ está atenuada; a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; a expressão de um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina (thrA*) está aumentada; a expressão do gene cysE está aumentada; e a expressão dos genes metF está aumentada.

[074] Em uma modalidade particular da invenção, o microrganismo recombinante compreende as seguintes modificações genéticas: o os genes metH, e fldA e fpr de E. coli ou seus genes homólogos de C. glutamicum estão sobre-expressos, o os genes ygaZ e ygaH de E. coli ou os genes brnF e brnE de C. glutamicum ou seus genes homólogos oriundos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii estão sobre-expressos, o a expressão dos genes metA*, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG e pyc está aumentada, e o a expressão dos genes metJ, pykA, pykF, purU, metE, dgsA e yncA está atenuada.

[075] Em uma modalidade particular da invenção, o microrganismo a ser modificado provém das famílias bacterianas Enterobacteriaceae ou Corynebacteriaceae.

[076] Preferencialmente, o microrganismo a ser modificado é Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

Condições de cultura

[077] Em uma segunda modalidade da invenção, é otimizado um método para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados. Ele compreende os seguintes passos: o cultura de um microrganismo recombinante em que a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina e o efluxo de metionina estão aumentados, respetivamente, pela sobre-expressão dos genes metH, e opcionalmente dos genes fldA e fpr de E. coli ou seus homólogos de C. glutamicum e dos genes ygaZH de E. coli ou dos genes brnFE de C. Glutamicum, ou seus genes homólogos, num meio de cultura apropriado que contenha uma fonte fermentável de carbono e uma fonte de enxofre, e, o recuperação de metionina e/ou seus deriados a partir do meio de cultura.

[078] Os especialistas no assunto são capazes de definir as condições de cultivo para os microrganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias fermentam a uma temperature entre 20°C e 55°C, de preferência entre 25°C e 40°C, e, mais especificamente, a aproximadamente 30°C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.

[079] Para E. coli, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio M9 (Anderson, 1946), um meio M63 (Miller, 1992); ou um meio como definido por Schaefer et al., (1999).

[080] Pa ra C. glutamicum, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio BMCG (Liebl et al., 1989) ou a um meio como descrito por Riedel et al., (2001).

[081] No método da invenção, os genes homólogos de ygaZH que estão sobre-expressos no microrganismo recombinante são escolhidos, de preferência, de entre o grupo de genes homólogos de espécies de Citrobacter, Shigella, Raoultella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus, e, mais preferencialmente, originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[082] Em uma modalidade específica do método, o microrganismo recombinante compreende as seguintes modificações genéticas: o sobre-expressão dos genes metH, e fldA e fpr de E. coli, ou seus genes homólogos de C. glutamicum e o sobre-expressão dos genes ygaZH de E. coli, ou brnFE de C. glutamicum ou seus genes homólogos.

[083] Nesta modalidade específica do método, os referidos genes homólogos de ygaZH são escolhidos, de preferência, de entre o grupo consistindo em genes homólogos de espécies de Citrobacter, Shigella, Raoultella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus, e, mais preferencialmente de entre os grupos de genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[084] No método da invenção, os genes homólogos de ygaZH que estão sobre-expressos no microrganismo recombinante são originários, de preferência, de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii ou Enterobacter sp..

[085] Em uma modalidade da invenção, o crescimento do microrganismo recombinante é sujeito a uma limitação ou deficiência em um ou mais substratos inorgânicos, em particular, fosfato e/ou potássio, no meio de cultura. Ela relaciona-se à condição sob a qual o crescimento dos microrganismos é determinado pela quantidade de um químico inorgânico fornecido que ainda permite um crescimento fraco. Tal limitação no crescimento do microrganismo foi descrita no pedido de patente WO2009/043372. Em uma modalidade preferida da invenção, a cultura é submetida a limitação em fosfato.

[086] A ação de “recuperação de metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura” designa a ação de recuperar L-metionina e/ou um dos seus derivados, em particular, N-acetil metionina (NAM) e S-adenosil metionina (SAM) e todos os outros derivados que possam ser úteis, como hidroximetionina (ou um análogo de hidroximetionina ou MHA). Os métodos para a recuperação e purificação dos compostos produzidos são do conhecimento do especialista no assunto (ver, em particular, WO2005/007862, WO2005/059155). De preferência, o passo de recuperação de metionina e/ou seus derivados compreende um passo de concentração de metionina e/ou seus derivados no caldo de fermentação.

[087] A quantidade de produto no meio de fermentação pode ser determinada usando diversos métodos conhecidos na especialidade, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia gasosa (GC). Por exemplo, a quantidade de metionina obtida no meio é medida por HPLC após derivatização com OPA/Fmoc usando L-metionina (Fluka, Ref 64319) como padrão. A quantidade de NAM é determinada por HPLC refratométrico usando NAM (Sigma, Ref 01310) como padrão.

EXEMPLOS

[088] Os experimentos seguintes demonstram como a sobre-expressão de genes codificando o sistema de excreção de L-metionina, juntamente com a sobre-expressão de genes codificando a sintase de metionina dependente de B12 e seu sistema de reativação em microrganismos tais como E. coli e C. glutamicum aumentam a produção de metionina.

[089] Nos exemplos que se seguem, são usados métodos bem conhecidos na especialidade para construir cepas de E. coli e C. glutamicum contendo vetores de replicação e/ou diversas inserções, deleções e substituições cromossômicas usando recombinação homóloga como descrito por Datsenko & Wanner, (2000) para E.coli e na patente WO2007012078 para C. glutamicum.

[090] Do mesmo modo, o uso de plasmídeos ou vetores para expressar ou sobre-expressar um ou vários genes em microrganismos recombinantes é bem conhecido do especialista no assunto.

[091] São exemplos de vetores de expressão apropriados para E.coli: pTrc, pACYC184n pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236 etc...

[092] Exemplos de vetores vai-vem apropriados para C. glutamicum e E.coli são e. g. pClik5aMCS (WO2005059093), ou podem encontrar-se em Eikmanns et al., (1991).

[093] Podem encontrar-se exemplos de vetores apropriados para a manipulação de Corynebacteria no manual de Corynebacteria editado por Eggeling e Bott em 2005.

PROTOCOLOS

[094] Foram usados vários protocolos para construção de cepas produtoras de metionina descritas nos exemplos seguintes.

[095] Protocolo 1 (Modificações cromossômicas por recombinação homóloga, seleção de recombinantes e excisão de cassette antibiótica) e Protocolo 2 (Transdução do fago P1), usados nesta invenção, foram descritos integralmente no pedido de patente WO2013/001055.

[096] Protocolo 3: Construção de plasmídeos recombinantes

[097] A tecnologia de DNA recombinante encontra-se bem descrita e é conhecida do especialista no assunto.

[098] De forma breve, os fragmentos de DNA são amplificados por PCR usando oligonucleotídeos (que o especialista no assunto saberá desenhar) e DNA genômico MG1655 como matriz. Os fragmentos de DNA e plasmídeo seleccionado são digeridos com enzimas de restrição compatíveis, ligados e depois transformados em células competentes. Os transformantes são analisados e os plasmídeos recombinantes de interesse verificados por sequenciação de DNA.

[099] EXEMPLO 1: Sobre-produção de metionina sintase dependente de cobalamina ou sobre-produção de um sistema de secreção de L-metionina em uma cepa de E.coli recombinante sobre-produtora de L-metionina - Cepa 1 e Construção de cepas 2, 3, 4, 5 e 6

Cepa 1 - Cepa de referência

[0100] A cepa produtora de metionina 17 descrita no pedido de patente WO2013/001055 (que se encontra incorporada neste pedido como referência) foi renomeada cepa 1 no presente pedido. Relembrando, esta cepa sobre-expressa metH devido a um promotor artificial e sítio de ligação com ribossomo integrado à frente do gene metH no seu locus endógeno (para mais detalhes ver pedido de patente WO2007/077041). Esta cepa também contém a mutação no gene metE revelada no pedido de patente WO2013/190343.

Construção da cepa 5 - Sobre-produção de metionina sintase dependente de cobalamina, sobre-expressão de metH, fldA e fpr

[0101] O gene de E.coli que codifica metionina sintase dependente de cobalamina, metH e genes fldA e fpr codificando o sistema de reativação de MetH, estão todos em sobre-expressão no fundo genético da cepa 1.

[0102] Antes de usar a cepa 1, a cassette antibótica foi removida de ΔdgsA, modificação feita usando a Flp recombinase como descrito por Datsenko & Wanner, 2000 (de acordo com o Protocolo 1). Os transformantes sensíveis a canamicina foram selecionados e a ausência de cassette antibiótica no locus ΔdgsA foi verificada por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada cepa 2.

[0103] Para obter sobre-expressão de metH, este gene, ligado operacionalmente ao mesmo promotor e sítio de ligação com ribossomo, como descrito no pedido de patente WO2007/077041, foi integrado no cromossomo em dois loci diferentes, ybeM e ypjC (seleccionados de uma lista divulgada no pedido de patente WO2011/073122 e cuja deleção não tem impacto na produção de metionina).

[0104] Para obter forte sobre-expressão de metH, foi usada a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner, 2000 (de acordo com o Protocolo 1). Para ambas integrações cromossômicas, amplificou-se por PCR, pela técnica de PCR de sobreposição (oligonucleotídeos em sobreposição) um fragmento compreendendo o gene metH ligado ao seu promotor artificial e um marcador de resistência, ambos ladeados por sequências de DNA homólogas ao locus de integração alvo ybeM ou ypjC. As sequências para recombinação em ybeM e ypjC são referidas como SEQ ID N° 21 e 22, e SEQ ID N° 23 e 24 (listadas na tabela 3), respetivamente. Os produtos de PCR “ΔybeM::metH::Km” e “ΔypjC::metH::Cm” obtidos, foram então introduzidos separadamente, por electroporação, na cepa MG1655 metA*11 (pKD46). Os transformantes resistentes a antibióticos foram selecionados e a inserção do gene metH com a cassette de resistência no locus alvo foi verificada por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. As cepas retidas foram designadas MG1655 metA*11 ΔybeM::metH::Km e MG1655 metA*11 ΔypjC::metH::Cm. Por último, as integrações cromossômicas ΔybeM::metH::Km e ΔypjC::metH::Cm foram transferidas por transdução por fago P1 sucessivamente (de acordo com o Protocolo 2) de MG1655 metA*11 ΔybeM::metH::Km e MG1655 metA*11 ΔypjC::metH para a cepa 2. Os transdutantes resistentes a cloranfenicol ou canamicina foram selecionados e foi verificada a presença das integrações cromossômicas ΔybeM::metH::Km e ΔypjC::metH::Cm por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada cepa 3.

[0105] As cassettes antibóticas foram removidas de integrações cromossômicas feitas nos loci ybeM e ypjC loci da cepa 3 usando a recombinase Flp como descrito por Datsenko & Wanner, 2000 (de acordo como o Protocolo 1). Os transformantes sensíveis a canamicina e cloranfenicol foram selecionados e verificou-se a ausência de cassette antibiótica em ambos loci por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada cepa 4.

[0106] P ara obter sobre-expressão de fldA e fpr, estes genes foram ligados operacionalmente a promotores artificiais e a um sítio de ligação com ribossomo artificial e integrados no cromossomo no locus ytfA (mesmo critério de seleção que para os loci ybeM e ypjC, ver acima). Os promotores artificiais foram construídos com SEQ ID N° 25 para fldA e como descrito para a sobre-expressão do operon cysPUWAM no pedido de patente WO2009/043803 para fpr. Os sítios de ligação com ribossomo artificiais são os mesmos descritos para a sobre-expressão do gene ptsG na cepa 17, publicado no pedido de patente WO2013/001055.

[0107] Pa ra adicionar cópias de sobre-expressão de fldA and fpr no cromossomo, usou-se a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner, 2000 (de acordo com o Protocolo 1). Amplificou-se por PCR, pela técnica de PCR de sobreposição (oligonucleotídeos em sobreposição) um fragmento contendo os genes fldA e fpr, com seus respetivos promotores, e um marcador de resistência, ambos ladeados por sequência de DNA homóloga ao locus de integração ytfA. As sequências para recombinação no locus ytfA estão referenciadas como SEQ ID N° 26 e 27 (listadas na tabela 3). O produto de PCR “ΔytfA::fldA-fpr::Km” obtido, foi então introduzido por electroporação na cepa MG1655 metA*11 (pKD46). Os transformantes resistentes a antibióticos foram selecionados e a inserção dos genes fldA- fpr com a cassette de resistência no locus ytfA foi verificada por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada MG1655 metA*11 ΔytfA::fldA-fpr::Km. Finalmente, a integração cromossômica ΔytfA::fldA-fpr::Km foi transferida por transdução por fago P1 (de acordo com o Protocolo 2) a partir de MG1655 metA*11 ΔytfA::fldA-fpr::Km para a cepa 4. Foram selecionados transdutantes resistentes a canamicina e verificou-se a presença da integração cromossômica ΔytfA::fldA-fpr::Km por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida designou-se cepa 5.

Construção da cepa 6 - Sobre-produção de um sistema de secreção de L-metionina, sobre-expressão de ygaZH

[0108] Os genes ygaZH de E.coli que codificam o exportador de metionina estão em sobre-expressão na cepa 1. Eles foram clonados no plasmídeo de número de cópias moderado número pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990) usando o promotor natural de ygaZ. Este plasmídeo foi denominado pME1247. Finalmente, o plasmídeo pME1247 foi transformado para a cepa 1, originando a cepa 6.

EXEMPLO 2: Sobre-produção da metionina sintase dependente de cobalamina e sobre-produção de um sistema de secreção de L- metionina em uma cepa de E.coli sobre-produtora de L- metionina - Construção da cepa 7

[0109] Os genes ygaZH de E.coli que codificam o exportador de metionina, estão em sobre-expressão na cepa 5. O plasmídeo pME1247 foi transformado para a cepa 5, originando a cepa 7.

EXEMPLO 3: Sobre-produção da metionina sintase dependente de cobalamina ou seu sistema de reativação ou sobre-produção de um sistema de secreção de L-metionina em uma cepa recombinante de C. glutamicum sobre-produtora de L-metionina - Construção de cepas A a F

[0110] A cepa ATCC 13032 hom* ask* metH de C. glutamicum (designada cepa A adiante) está descrita na patente WO2007/012078.

[0111] Nessa cepa A, hom* e ask* correspondem, respetivamente, a alelos resistentes a feedback de homosserina desidrogenase codificando a proteína Hsdh S393F e de aspartato cinase codificando a proteína Ask T311I, também chamada LysC T311I.

[0112] Esta cepa A é subsequentemente mutada com N- Metil-N'-nitroguanidina como descrito na patente WO2007/012078. São isolados os clones que apresentem um título de metionina que seja pelo menos o dobro do da cepa A. Um desses clones, usado em mais experimentos, é denominado cepa B. Esta cepa B é um produtor de L-metionina de C. glutamicum.

[0113] Depois, a cepa B de C. glutamicum é modificada como descrito nas patentes WO2007/012078 e WO2004/050694 para obter a cepa C compreendendo hsk* metY metA metF DmcbR. O alelo mutado hsk* codificando a homosserina cinase Hsk T190A é sobre-expresso, assim como metY codificando a O- acetil homosserina sulfidrilase, metA codificando a homosserina acetil-transferase, metF codificando a homocisteína metilase e o gene mcbR está deletado.

[0114] Para aumentar a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina na cepa C produtora de L- metionina de C. glutamicum, metHcg (gene metH de C. glutamicum) é sobre-expresso juntamente com o gene fprA1 codificando uma ferredoxina redutase funcionando como proteína de reoxidação MetH. Estas modificações são feitas de acordo com o descrito na patente WO2009/144270. A cepa resultante é chamada cepa D.

[0115] Outra forma de aumentar a atividade da metionina sintase dependente de cobalamina na cepa C produtora de L-metionina em C. glutamicum, é obter a sobre- expressão de metHEc (gene metH de E. coli) juntamente com os genes fldA e fpr de E. coli, que codificam as flavodoxinas envolvidas na reativação da enzima MetH. Isto é conseguido de acordo com o descrito na patente WO2009/144270. A cepa resultante é chamada cepa E.

[0116] Para aumentar o sistema de excreção de L- metionina específico de C. glutamicum na cepa C, o operon brnFE é sobre-expresso a partir do vetor de expressão vai- vem pEC-XT99A (EP1085094) de E. coli-C. glutamicum. O plasmídeo foi construído em E. coli a partir de fragmentos gerados por PCR usando DNA ATCC 13032 de C. glutamicum como molde. O plasmídeo foi construído como descrito por Trotschel et al., (2005) em pEC-XT99A, e o plasmídeo resultante pCB1 é subsequentemente transformado na cepa C originando a cepa F.

EXEMPLO 4: Combinação de sobre-produção de metionina sintase dependente de cobalamina com a sobre-produção de um sistema de secreção de L-metionina em uma cepa de C. glutamicum sobre-produtora de L-metionina - Construção das cepas G e H

[0117] P ara combinar a sobre-produção de MetHCG,FprA1 ou MetHEC, FldA, Fpr em C. glutamicum com a sobre- produção do sistema de excreção de L-metionina específico BrnFE, o plasmídeo pCB1, descrito acima, é introduzido por eletroporação nas cepas D e E, originando, respetivamente, as cepas G e H.

[0118] A cepa G compreende apenas genes de C. Glutamicum, enquanto a cepa H contém metionina sintase dependente de cobalamina e seu sistema de reativação de E. coli.

[0119] O exportador é BrnFE em todos os casos.

EXEMPLO 5: Produção de L-metionina por fermentaçao em biorreator com cepas de E.coli

[0120] As cepas descritas nos exemplos anteriores foram testadas sob condições de produção em reatores 2.5 L (Pierre Guerin) usando uma estratégia de batelada alimentada.

[0121] Resumidamente, foi usada uma cultura de 24 horas cultivada em 10 mL de meio LB com 2.5 g.L-1 de glucose para inocular uma pré-cultura de 24 horas em meio mínimo (B1a). Estas incubações foram feitas em frascos com defletores de 500 mL contendo 50 mL de meio mínimo (B1a) num agitador rotativo (200 RPM). A primeira pré-cultura foi realizada a uma temperatura de 30°C, a segunda a uma temperatura de 34°C.

[0122] Um terceiro passo de pré-cultura foi levado a cabo em biorreatores (Sixfors) preenchidos com 200 mL de meio mínimo (B1b) inoculado para uma concentração de biomassa de 1.2 g.L-1 com 5 mL de pré-cultura concentrada. A temperatura da pré-cultura foi mantida constante a 34°C e o pH automaticamente ajustado para um valor de 6.8 usando uma solução de NH4OH a 10%. A concentração de oxigênio dissolvido foi continuamente ajustada para um valor de 30% da saturação de pressão de ar parcial com fornecimento de ar e/ou agitação. Após esgotamento da glucose no meio de batelada, iniciou-se batelada alimentada com um quociente de vazão inicial de 0.7 mL.h-1, antes de aumentar exponencialmente por 26 horas com uma taxa de crescimento de 0.13 h-1 a fim de obter uma concentração celular final de aproximadamente 20 g.L-1.

[0123] Subsequentemente, fermentadores de 2.5 L (Pierre Guerin) foram preenchidos com 600 ou 620 mL de meio mínimo (B2) e foram inoculados para uma concentração de biomassa de 3,2 g.L-1 com um volume de pré-cultura variando entre 80 e 100 mL.

[0124] O crescimento celular é controlado por fosfato, sendo por isso que a concentração final de fosfato no meio de batelada B2 foi ajustado para um valor compreendido entre 0 e 20 mM, adicionando diferentes concentrações de KH2PO4, K2HPO4 e (NH4)2HPO4. Do mesmo modo, a concentração final de fosfato do meio F2 foi ajustada para um valor compreendido entre 5 e 30 mM, adicionando diferentes concentrações de KH2PO4, K2HPO4 e (NH4)2HPO4. A concentração de tiossulfato no meio de batelada alimentada pode ser ajustada de forma a prevenir a deficiência deste composto durante o cultivo.

[0125] A temperatura de cultivo foi mantida constante a 37 °C e o pH mantido no valor de trabalho (6.8) por adição automática de soluções de NH4OH (10% e 28%). A taxa de agitação inicial foi fixada em 200 RPM durante a fase de batelada e foi aumentada até 1000 RPM durante a fase de batelada alimentada. A taxa inicial de circulação de ar foi fixada em 40 NL.h-1 durante a fase de batelada e aumentada para 100 NL.h-1 no início da fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e 40%, preferencialmente 30% de saturação, por aumento da agitação.

[0126] Foi adicionado IPTG aos meios de batelada e batelada alimentada quando necessário, em concentração final de 20 μM. Quando necessário, foram adicionados antibióticos em concentração de 50 mg.L-1 para espectinomicina, 30 mg.L-1 para cloranfenicol, 50 mg.mL-1 para canamicina e 100 mg.L-1 para ampicilina.

[0127] Quando a massa celular atingiu uma concentração próxima a 5 g.L-1, iniciou-se a batelada alimentada com um quociente de vazão inicial de 5 mL.h-1. A solução de alimentação foi injetada de acordo com uma função sigmóide com um quociente de vazão crescente que atingiu 24 mL.h-1 após 25 horas. As condições precisas de alimentação foram calculadas através da equação:

na qual Q(t) é o quociente de vazão de alimentação em mL.h- 1 com p1 = 1.80, p2 = 22.4, p3 = 0.27, p4 = 6.50. Este quociente de vazão foi aumentado de 10 a 50%, de preferência entre 20 e 30% durante todo o cultivo.

[0128] Após 25 horas de batelada alimentada, a bomba de alimentação de solução foi parada e o cultivo foi finalizado após esgotamento da glucose.

[0129] Os aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC após derivatização com OPA/Fmoc e outros metabolitos relevantes foram analisados usando HPLC com detecção refratométrica (ácidos orgânicos e glucose) e GC-MS após sililação.

[0130] Foi testado o impacto da combinação da sobre- expressão de metH, fldA, fpr e sobre-expressão de ygaZH em E. coli. Os resultados são apresentados na Tabela 8.

Tabela 8: Rendimentos máximos e finais de metionina e concentrações de homolantionina produzida em culturas de batelada alimentada por diferentes cepas.

[0131] O desempenho das cepas de interesse, cepas 5, 6 e 7 é comparado com a cepa de referência 1, tendo sido cultivadas nas mesmas condições. O símbolo ~ indica que não há diferença entre cepas, o símbolo + indica um aumento entre 1 e 5%, o símbolo ++ indica um aumento entre 5 e 10% e o símbolo +++ indica um aumento superior a 10%. Ver abaixo a definição de rendimento de metionina/glucose.

[0132] Estes resultados mostram que, em E. coli, a sobre-expressão unicamente de genes ygaZH não traz benefício na produção de metionina (cepa 6). A sobre-expressão do sistema metionina sintase dependente de cobalamina em E. coli (cepa 5) leva a uma produção de metionina aumentada. Surpreendentemente, observamos que a combinação da sobre- expressão dos genes ygaZH e do sistema metionina sintase dependente de cobalamina tem um efeito sinêrgico na produção de metionina, levando a um aumento inesperado da produção de metionina. Além disso, esta combinação também tem um impacto favorável na produção de homolantionina, levando a obtenção de metionina com melhor pureza.

Determinação do rendimento de metionina/glucose (Ymet)

[0133] O volume do reator foi calculado adicionando ao volume inicial a quantidade de soluções adicionadas para regulação de pH e alimentação da cultura e subtraindo o volume utilizado para amostragem e perdido por evaporação.

[0134] O volume de batelada alimentada foi seguido continuamente por pesagem do estoque de alimentação. A quantidade de glucose injetada foi então calculada com base no peso injetado, densidade da solução e concentração de glucose determinada pelo método de Brix ([Glucose]). O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma:

Em que Metionina0 e Metioninat são, respetivamente, as concentrações de metionina inicial e final e V0 e Vt os volumes inicial e no momento t.

[0135] A glucose consumida foi calculada da seguinte forma:

Glucose Injetadat = volume alimentadot * [Glucose] Glucose Consumidat = [Glucose]o * Vo + Glucose Injetada - [Glucose]residual * Vt Em que [Glucose]0, [Glucose], [Glucose]residual são, respetivamente, as concentrações de glucose inicial, injetada e residual.

Ensaio de atividade de metionina sintase dependente de cobalamina

[0136] O ensaio de atividade de metionina sintase dependente de cobalamina é uma adaptação do ensaio descrito por Drummond et al., em 1995.

[0137] A atividade da metionina sintase dependente de cobalamina foi analisada medindo a concentração do produto tetraidrofolato (H4folato) com espetrofotômetro num comprimento de onda de 350 nm e a uma temperatura constante de 37°C.

[0138] A mistura de reação foi realizada em 80 mM fosfato de potássio pH7.2, 20 mM DTT, 15 μM S- adenosilmetionina (SAM), 0.6 mM ácido (6R,S)-5-Metil- 5,6,7,8-tetraidrofólico, 40μM hidroxocobalamina, 0.1mM cloreto de zinco e 8μg de extrato bruto num volume final de 800μl. A mistura de reação foi incubada antes por 10 min a 37°C para iniciar a reação por adição do substrato homocisteína com concentração final de 0.8 mM. Após 5 min a 37°C, adicionou-se 200 μl de solução de derivatização acídica (4M HCl em ácido fórmico a 60%) para pôr fim ao turnover levando o volume a 1ml, e os tubos são aquecidos a 80°C por 10 min. Este passo é necessário para estabilizar o produto enzimático da reação, o tetraidrofolato, que não é estável em ácido. O calor leva à formação de meteniltetraidrofolato, que absorve luz nos 350 nm, enquanto o substrato residual 5- metiltetraidrofolato não contribui para a absorvância a 350 nm. O ensaio em branco continha todos os componentes na mistura de reação, exceto o substrato homocisteína.

Quantificação dos níveis de proteínas FldA e Fpr

[0139] Para quantificar as duas proteínas, foram produzidos anticorpos contra a flavodoxina-1 (fldA) e a flavodoxina redutase (fpr) (Anticorpos de coelho, Eurogentec) que foram usados em experimentos “Western blot”. A deteção “Western blot” foi realizada usando AP cabra anti-coelho. Os níveis proteicos de FldA e Fpr nos “blots” foram quantificados com um sistema de imagem disponível comercialmente (Epson Expression 1680 professional) e comparados nas diferentes cepas descritas nesta patente.

EXEMPLO 6: Produção fermentativa de L-metionina com cepas de C. glutamicum

[0140] São cultivadas cepas num frasco nas mesmas condições descritas no pedido de patente WO2009/144270.

Tabela 9: Títulos de metionina produzida por cepas D, E, F, G e H de C. glutamicum comparados com a cepa de referência C.

[0141] O símbolo ~ indica que não há diferença entre cepas, o símbolo + indica um aumento entre 1 e 3%, o símbolo ++ indica um aumento superior a 3%.

[0142] Tal como em E. coli, em C. glutamicum, a combinação da sobre-expressão dos genes brnFE e do sistema metionina sintase dependente de cobalamina (de E. coli - cepa H e de C. glutamicum - cepa G) tem um efeito sinêrgico na produção de metionina, levando a um aumento inesperado na produção de metionina.

EXEMPLO 7: Sobre-produção de metionina sintase dependente de cobalamina e sobre-produção de sistemas homólogos de secreção de L-metionina em uma cepa de E.coli sobre-produtora de L-metionina - Construção das cepas 8 a 17

[0143] Os genes homólogos de ygaZH de espécies de Citrobacter, Raoultella, Shigella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus foram sobre-expressos no fundo genético da cepa 5.

[0144] Antes de usar a cepa 5, a cassette antibiótica da integração cromossômica feita no locus ytfA foi removida usando a recombinase Flp como descrito por Datsenko & Wanner, 2000 (de acordo com o Protocolo 1). Os transformantes sensíveis a canamicina foram selecionados e a ausência da cassette antibiótica no locus ytfA foi verificada por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa resultante foi denominada cepa 8.

Construção da cepa 9 - Sobre-produção do sistema de secreção endógeno de L-metionina, sobre-expressão de ygaZH de E. coli

[0145] P ara comparar o efeito da sobre-expressão de ygaZH de E. coli e sobre-expressão de homólogos de ygaZH no mesmo fundo genético, o plasmídeo pME1247 contendo ygaZH de E. coli foi transformado na cepa 8, originando a cepa 9.

Construção das cepas 10 a 17 - Sobre-produção de sistemas homólogos de secreção de L-metionina, sobre-expressão de ygaZH de gêneros e espécies listadas na tabela 10

[0146] P ara obter a sobre-expressão dos genes homólogos de ygaZH listados na tabela 10, cada par de genes foi clonado no plasmídeo de número de cópias moderado pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990) usando um promotor natural e um sítio de ligação com ribossomo natural do gene ygaZ de E. Coli, como anteriormente descrito para os genes ygaZH de E. Coli. Como especificado na tabela 11, os genes homólogos de ygaZH foram amplificados a partir de DNA genômico da cepa correspondente ou sintetizados quimicamente, otimizando, ou não, o uso de codon para E. coli (como proposto por GeneArt® Gene Synthesis service com GeneOptimizer® software - Lifetechnologies). Os fragmentos de DNA amplificados compreendendo os genes homólogos de ygaZH são listados em SEQ ID, indicado na tabela 11. Os plasmídeos resultantes foram nomeados como indicado na tabela 11. Finalmente, cada plasmídeo foi transformado na cepa 8, originando as cepas 10 a 17, como mencionado na tabela 11.

EXEMPLO 8: Produção fermentativa de L-metionina em frascos de experimento

[0147] Produtores recombinantes de L-metionina sobre-produzindo metionina sintase dependente de cobalamina MetH, assim como diferentes sistemas de secreção de L- metionina de vários microrganismos (homólogos de YgaZH em E.coli) foram avaliados em frascos Erlenmeyer pequenos.

[0148] Cepas de produção foram avaliadas em frascos Erlenmeyer pequenos. Foi cultivada uma pré-cultura de 5.5 mL a 30°C por 21 horas em um meio misto (10% meio LB (Sigma 25%) com 2.5 g.L-1 glucose e 90% meio mínimo PC1). Ela foi usada para inocular uma cultura de 50 mL para um OD600 de 0.2 em meio PC1. Foi adicionada espectinomicina em concentração de 50 mg.L-1 e gentamicina a 10 mg.L-1 quando necessário. A temperatura das culturas foi 37°C. Quando a cultura atingiu um OD600 de 5 a 7, quantificaram-se os aminoácidos extracelulares por HPLC após derivatização com OPA/Fmoc e analisaram-se outros metabolitos relevantes usando HPLC com deteção refratométrica (ácidos orgânicos e glucose) e GC-MS após sililação.

Tabela 13: Rendimento de metionina (Ymet) em g metionina / % g de glucose produzida em frascos de cultura por cepas de interesse com sobre-expressão dos genes homólogos de ygaZH, assim como genes metH, fldA e fpr. Ver abaixo para a definição precisa de rendimento metionina/glucose. “n” indica o número de repetições.

[0149] Como pode ser visto na tabela 13, a sobre- expressão de genes homólogos de ygaZH de vários microrganismos no produtor de L-metionina com sobre- expressão dos genes metH, fldA, fpr, leva a desempenhos equivalentes ou superiores às obtidas com a cepa 9, que tem sobre-expressão de ygaZH de E.coli. Os sistemas homólogos de secreção de L-metionina de microrganismos que não E. coli podem substituir as proteínas endógenas das bactérias.

[0150] As proteínas homólogas de YgaZH de Citrobacter Koseri (cepa 10, Ymet=19,6g/g), Citrobacter youngae (cepa 16, Ymet=19,6g/g), Citrobacter freundii (cepa 17, Ymet=19,6g/g) e Enterobacter sp. (cepa 13, Ymet=19,4g/g) mostraram os melhores rendimentos de produçao de L-metionina em comparação com a cepa 9 (Ymet=18.7g/g).

[0151] O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma:

REFERÊNCIAS - Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128. - Banerjee R.V., Harder S.R., Ragsdale S.W., Matthews R.G., 1990, Biochemistry, 29:1129-1135 - Carrier T., Keasling J.D., 1999, Biotechnology Progress, 15:58-64 - Datsenko K.A., Wanner B.L., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A, 97:6640-6645 - Drummond J.T., Jarrett J., González J.C., Huang S., Matthews R.G., 1995, Analytical Biochemistry, 228(2):323-329. - Eikmanns B.J., Kleinertz E., Liebl W., Sahm H., 1991, Gene, 102:93-98 - Foster M.A., Jones K.M., Woods D.D., 1961, Biochemical Journal, 80:519-531 - Fujii K. and Huennekens F.M., 1974, Journal of Biological Chemistry, 249 (21):6745-6753 - Gonzalez J.C., Banerjee R.V., Huang S., Summer J.S., Matthews R.G., 1992, Biochemistry, 31:6045-6056 - Lerner C.G. and Inouye M., 1990, Nucleic Acids Research, 18(15):4631 - Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210. - Matthews R.G., 2001, Accounts of Chemical Research, 34:681-689 - Miller, 1992; “A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - Riedel et al., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583. - Saunderson C.L., 1985, British Journal of Nutrition, 54:621-633 - Schaefer et al. 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96. - Trotschel C., Deutenberg D., Bathe B., Burkovski A., Kramer R., 2005, Journal of Bacteriology. 187(11):3786- 3794 - Wan J.T. and Jarrett J.T., 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 406:116-126

Claims (10)

1. Microrganismo recombinante geneticamente modificado para apresentar uma melhora na produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados em comparação com a produção endógena do microrganismo do tipo selvagem correspondente caracterizado por no referido microrganismo recombinante, a expressão de metH a partir de E. coli, e a expressão dos genes fldA e fpr a partir de E. coli serem aumentadas e os genes ygaZH a partir de E. coli ou seus genes homólogos serem sobre-expressos, em que o referido microrganismo recombinante é Escherichia coli e em que a expressão aumentada e a sobre-expressão, respectivamente, são alcançadas por: - aumento no número de cópias do gene no microrganismo, - uso de um promotor levando a um aumento do nível da expressão do gene, - atenuação da atividade ou da expressão de um repressor de transcricional, específico ou não especifico do gene ou - uso de elementos estabilizando o RNA mensageiro correspondentes ou elementos estabilizando a proteína.

2. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos genes metH, fldA e fpr serem sobre-expressos cromossomicamente.

3. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os referidos genes homólogos de ygaZH serem escolhidos entre o grupo que consiste em genes homólogos de espécies de Citrobacter, espécies de Shigella, espécies de Raoultella, espécies de Enterobacter, espécies de Yersinia e espécies de Photorhabdus.

4. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os genes homólogos de ygaZH se originarem de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

5. Microrganismo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por o referido ygaZH ou genes homólogos serem expressos sob o controle do promotor induzível.

6. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por a expressão de pelo menos um dos seguintes genes ser também aumentada: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metA, alelo de metA* codificando para uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina, thrA ou um alelo de thrA* codificando para uma enzima com a inibição de feed-back reduzida para treonina.

7. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por pelo menos um dos referidos genes estar sob o controle de um promotor indutível.

8. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por a expressão de pelo menos um dos seguintes genes ser também atenuada: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, metE, dgsA, metN, metI, metQ ou udhA.

9. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por: a. Os referidos genes metH e fldA e fpr serem sobre-expressos, b. Os referidos genes ygaZ e ygaH ou os genes brnF e brnE ou seus genes homólogos originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii serem sobre-expressos, c. a expressão dos genes metA*, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG e pyc ser aumentada; e d. a expressão dos genes metJ, pykA, pykF, purU, dgsA, metE e yncA ser atenuada.

10. Método para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados caracterizado por compreender as etapas de: a. cultivar um microrganismo recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono fermentável e uma fonte de enxofre, e b. recuperar metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura.