KR20180093981A - 발효적 생산에 의해 l-메티오닌을 생산하는 방법 - Google Patents

발효적 생산에 의해 l-메티오닌을 생산하는 방법 Download PDF

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KR20180093981A
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Abstract

본 발명은 i) 메티오닌의 발효적 생산을 위해 최적화된 미생물을, 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 배양하여 L-메티오닌을 생산하는 단계; ii) 단계 i)에서 수득된 L-메티오닌을 회수하는 단계; iii) 단계 ii)에서 수득된 메티오닌 함유 분획에 알콜 용매 또는 아세토니트릴을 첨가하여 L-메티오닌을 침전시키는 단계; 및 iv) L-메티오닌을 회수하는 단계를 포함하는, L-메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

Description

발효적 생산에 의해 L-메티오닌을 생산하는 방법
본 발명은 고도의 순도의 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.
황-함유 화합물 예컨대 메티오닌, 시스테인, 호모시스테인 또는 S-메틸아데노실메티오닌은 세포 대사에 있어 중요하며, 식품 또는 사료 첨가제 및 제약으로서 사용되기 위해 산업적으로 생산된다. 특히, 동물에 의해 합성될 수 없는 필수 아미노산인 메티오닌은 많은 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 단백질 생합성에서의 그의 역할 이외에도, 메티오닌은 메틸교환, 및 셀레늄 및 아연의 생체이용률에 수반된다. 메티오닌은 또한 알레르기 및 류마티스성 열과 같은 장애에 대한 치료법으로서 직접적으로 사용된다. 그럼에도 불구하고, 생산되는 메티오닌의 대부분은 동물 사료에 첨가된다.
BSE 및 조류 독감의 결과로서 동물-유래 단백질의 사용이 감소되면서, 순수 메티오닌에 대한 수요가 증가한 바 있다. 통상적으로, D,L-메티오닌은 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 화학적으로 생산된다. 그러나, 라세미 혼합물 뿐만 아니라 순수 L-메티오닌도 기능 수행을 잘 하지 못한다 (Saunderson, C.L., 1985). 추가적으로, 순수 L-메티오닌이 라세미 메티오닌으로부터, 예를 들어 N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제 처리를 통해 생산될 수 있지만, 이는 생산 비용을 현저히 증가시킨다. 따라서, 환경에 대한 관심과 더불어 순수 L-메티오닌에 대한 수요가 증가함에 따라 메티오닌의 미생물에 의한 생산은 매력적인 프로젝트가 되었다.
그러나, 이들 방법의 구현을 위해서는 탄소판 상에서의 발효에 의해 메티오닌을 생산하는데 적합한 미생물이 이용가능해야 한다. 산업적으로 효과적인 해결책이, 특히 특허 출원 WO 2005/111202, WO 2007/017710, WO 2007/077041 및 WO 2009/043803에서 공개된 바 있다. 메티오닌을 생산하는 다른 미생물은 또한 출원 WO 2004/038013, WO 2006/001616, WO 2006/138689 및 WO 2007/012078에 기재되어 있다.
발효 브로쓰로부터 L-메티오닌을 회수하기 위한 다양한 방법이 제안되어 있다. 보통의 발효 조건 하에서의 메티오닌의 저용해도 때문에, 전세포 및 다른 발효 브로쓰 성분으로부터의 그의 분리는 L-메티오닌을 경제적으로 생산할 수 있기 위해 해결되어야 할 주요 문제이다.
WO 2005/007862에는 발효 브로쓰 또는 발효 상청액 중의 메티오닌의 용해도가 pH를 산성 또는 염기성 pH로 조정함으로써 및/또는 온도를 증가시킴으로써 증가되는 방법이 개시되어 있다. 이어서, 메티오닌은 선택적으로 결정화될 수 있다. 메티오닌 용해도는 동물 사료 부문에서의 사용을 위해 건조되고 과립화될 수 있는, 정제된 메티오닌 최종 생성물을 제조하도록 조작된다.
WO 2011/045377 및 WO2013/083934는 발효에 의해 수득되는 신규 액체 또는 결정질 메티오닌 조성물에 관한 것이다. 메티오닌 및 다른 성분 함량은 보다 용이한 정제를 가능하게 하여, 특히 액체 조성물의 건조 잔류물과 비교하여 보다 높은 함량의 메티오닌을 갖는 고체 생성물을 수득하도록 한다.
US2012/0178966에는 상청액에 함유된 탄소 및 질소와 동시의 메티오닌의 회수가 개시되어 있다. 메티오닌은 먼저 L-메티오닌의 전구체인, O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린의 합성에 이어서, L-메티오닌으로의 효소적 변환인 제2 단계를 포함하는 2-단계 공정에 의해 생산된다.
이들 방법이 많은 단계를 포함하며, 이들 방법이 고등급 순도의 L-메티오닌을 제공하지 않기 때문에, 본 출원인은 고등급 L-메티오닌을 생산하는 효과적인 방법을 밝혀낸 바 있다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 특정하게 예시된 방법으로 제한되지 않으며, 당연히 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정한 실시양태를 기재하려는 목적일 뿐이며, 제한하는 것으로는 의도되지 않고, 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 이해하여야 한다.
본원에 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 상기 공개물에 보고되어 있으며 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 기재하고 개시하려는 목적으로 인용된다.
게다가, 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 미생물학 및 분자 생물학 기술을 사용한다. 이러한 기술은 숙련된 작업자에게 널리 공지되어 있으며 문헌에 충분히 설명되어 있다.
하기 청구범위 및 이어지는 발명의 설명에서, 분명한 언어 또는 필요한 암시로 인해 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 단어 "포함하다", "함유하다", "수반하다" 또는 "포함시키다", 또는 "포함한다", "포함하는", "함유하는", "수반된", "포함시킨다", "포함한"과 같은 변형어는 포함적 의미로, 즉 언급된 특색의 존재를 명시하지만, 본 발명의 다양한 실시양태에서의 추가의 특색의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록 사용된다.
용어 "메티오닌" 및 "L-메티오닌"은 화학식 HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 및 CAS 번호 59-51-8 또는 특정한 L-이성질체의 경우에는 CAS 번호 63-68-3을 갖는 필수 황-함유 아미노산을 나타낸다.
"메티오닌의 유도체"는 동일한 화학적 백본을 제시하지만, 적어도 1개의 화학적 기가 메티오닌과 상이한, 메티오닌과 유사한 분자를 지칭한다. 본 발명에서, 바람직한 메티오닌 유도체는 N-아세틸 메티오닌 (NAM), S-아데노실 메티오닌 (SAM) 및 히드록시-메티오닌이다.
본원에 사용된 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 박테리아, 효모 또는 진균을 지칭한다. 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 보다 우선적으로, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종이다. 보다 더 우선적으로, 본 발명에 따라 사용되는 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종이다.
본원에 사용된 용어 "개선된 메티오닌 생산", "메티오닌 생산을 개선시키다" 및 그의 문법적 등가물은 증가된 메티오닌/탄소 공급원 수율 (퍼센트로 표현될 수 있는, 소모된 탄소 공급원의 그램/mol당 생산된 메티오닌의 그램/mol의 비) 및/또는 생산된 메티오닌의 개선된 순도를 지칭한다. 본 발명에서, 생산된 메티오닌의 순도는 용매에 의해 L-메티오닌을 침전시킴으로써 증가될 수 있다. 소모된 탄소 공급원 및 생산된 메티오닌의 양을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 생산된 메티오닌의 수율은 본 발명의 방법에서 보다 높다.
본 개시내용에 사용된 용어 "메티오닌의 발효적 생산을 위해 최적화된 미생물" 또는 "재조합 미생물"은 상응하는 야생형 미생물의 내인성 생산과 비교하여 개선된 메티오닌 생산을 제공하도록 진화되고/거나 유전자 변형된 미생물을 지칭한다. 메티오닌 생산을 위해 "최적화된" 이러한 미생물은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 특히 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041, WO2009/043803, WO2012/098042, WO2013/001055, WO2013/190343, WO2015/028674 및 WO2015/028675에 개시된 바 있다.
본 발명에 따른 용어 "발효적 생산", "배양" 또는 "발효"는 미생물의 성장을 나타내는 것으로, 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 성장은 일반적으로 사용되는 미생물에 대해 적합화되며, 적어도 1종의 단순 탄소 공급원, 및 필요에 따라 황의 공급원 및 질소의 공급원과 같은 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지를 갖는 발효기에서 수행된다.
"적절한 배양 배지"는 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 또는 유익한 영양분 예컨대 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어 인산일칼륨 또는 인산이칼륨; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망가니즈 염; 뿐만 아니라 성장 인자 예컨대 아미노산 및 비타민을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 나타낸다.
본 발명에 따른 용어 "탄소 공급원" 또는 "탄소 기질" 또는 "탄소의 공급원"은 모노사카라이드 (예컨대 글루코스, 갈락토스, 크실로스, 프룩토스 또는 락토스), 올리고사카라이드, 디사카라이드 (예컨대 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스 및 그의 조합을 포함한, 미생물의 정상적인 성장을 지지하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있는 탄소의 임의의 공급원을 나타낸다. 특히 바람직한 단순 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 단순 탄소 공급원은 수크로스이다. 탄소 공급원은 재생가능한 공급-원료로부터 유래될 수 있다. 재생가능한 공급-원료는 짧은 지연 내에 및 충분한 양으로 재생되어 그의 목적 생성물로의 변환을 가능하게 할 수 있는, 특정 산업 공정을 위해 요구되는 원료로서 정의된다. 처리된 또는 처리되지 않은 식물 바이오매스가 흥미로운 재생가능한 탄소 공급원이다.
본 발명에 따른 용어 "황의 공급원"은 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸술피드 및 다른 메틸 캡핑된 술피드 또는 다양한 공급원의 조합을 지칭한다. 보다 우선적으로, 배양 배지 중의 황 공급원은 술페이트 또는 티오술페이트 또는 그의 혼합물이다.
용어 "질소의 공급원"은 암모늄 염 또는 암모니아 기체에 상응한다. 질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아의 형태로 공급된다.
배양 조건
본 발명은 하기 단계를 포함하는, L-메티오닌 및/또는 그의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다:
i) 메티오닌의 발효적 생산을 위해 최적화된 미생물을, 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 배양하여 L-메티오닌을 생산하는 단계;
ii) 단계 i)에서 수득된 L-메티오닌을 회수하는 단계;
iii) 단계 ii)에서 수득된 메티오닌 함유 분획에 알콜 용매 또는 아세토니트릴을 첨가하여 L-메티오닌을 침전시키는 단계; 및
iv) L-메티오닌을 회수하는 단계.
본 발명에 따른 단계 i)은 미생물을 배양하는 것을 포함한다.
특히, 미생물은 20℃ 내지 55℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 씨. 글루타미쿰의 경우에는 약 30℃ 및 이. 콜라이의 경우에는 약 37℃의 온도에서 발효된다.
이. 콜라이의 경우에, 배양 배지는 M9 배지 (Anderson, 1946), M63 배지 (Miller, 1992); 또는 섀퍼(Schaefer) 등 (1999)에 의해 한정된 바와 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성일 수 있다.
씨. 글루타미쿰의 경우에, 배양 배지는 BMCG 배지 (Liebl et al., 1989) 또는 리델(Riedel) 등 (2001)에 의해 기재된 바와 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법의 단계 i)에서의 미생물은 단독 미생물이다. 이는 L-메티오닌을 생산하는, 단지 1종의 미생물 균주가 사용됨을 의미한다. L-메티오닌 전구체를 생산하는 미생물은 본 발명의 방법에 따르면 사용되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 어떠한 단계에서도 L-메티오닌 전구체의 임의의 효소적 프로세싱을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 단계 ii)는 L-메티오닌을 회수하는 것을 포함한다.
단계 ii)에서의 L-메티오닌을 회수하는 행위는 배양 배지로부터 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체, 특히 N-아세틸 메티오닌 (NAM) 및 S-아데노실 메티오닌 (SAM), 및 유용할 수 있는 모든 다른 유도체 중 1종을 회수하는 행위를 나타낸다. 생산된 화합물의 회수 및 정제 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (특히 WO2005/007862, WO2005/059155 참조). 바람직하게는, L-메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계 ii)는 발효 브로쓰에서의 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체의 농축 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 단계 ii)는 복수의 단계, 예를 들어 L-메티오닌의 농축 단계가 후속되거나 또는 후속되지 않으면서, 발효 배지의 정화 단계를 포함할 수 있다.
발효 배지의 정화 단계는 발효 배지를 정화하고, 상기 발효 배지로부터 불용성 및 가용성 유기 불순물을 제거하여 액체 조 메티오닌 함유 분획을 수득하는 것을 의미한다. 배지의 정화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 그러한 것으로 공지된 임의의 방법에 의해 수행되며, 이러한 방법은, 예를 들어, 응집, 경사분리, 막 기술 (마이크로여과, 한외여과, 투석여과, 나노-여과 및 역삼투) 및 원심분리로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가용성 유기 불순물의 제거는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 그러한 것으로 공지된 임의의 방법에 의해 수행되며, 이러한 방법은, 예를 들어, 한외여과, 열 처리, 활성탄 유형의 흡착제를 사용한 처리 및 효소적 가수분해로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 가용성 불순물의 제거는 조작된 매스가 침전 동안 바르게 거동하도록 보장할 수 있게 한다. 실제로, 이 단계가 없으면, 조작된 매스는 매우 미세한 결정을 생성하면서 상기 결정의 분리 및 세척을 불리하게 하는, 페이스트상 균질 외관을 갖는다. 그 결과, 결정의 순도가 감소된다.
가용성 불순물의 제거 후에, 예비적 사전-농축 단계를 갖거나 또는 갖지 않으면서 결정화 단계가 이어서 후속된다.
결정화 단계는 고체 형태의 조 메티오닌을 회수하기 위해 메티오닌을 결정화하는 것으로 이루어진다. 이러한 결정화 단계는 냉각에 의한 결정화, 증발-결정화에 의한 결정화 및 단열 결정화로 이루어진 군으로부터 선택된 기술에 의해 수행될 수 있다. 본 출원인 회사는 증발-결정화의 사용을 권장한다. 증발-결정화가 선택된다면, 본 출원인 회사는 과포화에 근접하기 위해 강하-막 증발기를 사용하는 진공 증발에 의한 조 메티오닌 용액의 사전-농축을 권장한다. 이와 같이 사전-농축된 용액은 예를 들어 드래프트 튜브 유형의 결정화기로 옮겨져, 그 안에서 추가로 농축 및 결정화된다.
35℃에서의 메티오닌 용해도는 대략 70 g/L이다. 용액이 35℃의 온도를 보장하면서 진공 하에 대략 250 g/L로 농축되면, 고체 메티오닌 회수 수율은 >70%이다. 이들 조건 및 가용성 불순물의 제거에 의해, 고체 메티오닌은 모액으로부터의 분리가 용이한 해면질 구체의 형태로 결정화된다.
본 발명에 따른 단계 iii)은 단계 ii)에서 수득된 메티오닌 함유 분획에 알콜 용매 또는 아세토니트릴을 첨가하여 L-메티오닌을 침전시키는 것을 포함한다. 이 단계는 L-메티오닌 또는 그의 유도체의 침전 단계이다. 단계 iii)에서 사용되는 알콜 용매는 에탄올, 이소프로판올 또는 그의 혼합물 중에서 선택된 것일 수 있다. 바람직하게는, 단계 iii)에서 사용되는 알콜 용매는 에탄올이다.
바람직하게는, 단계 iii)에서 용매 / (메티오닌 함유 분획 + 용매)의 비는 50 내지 80 중량%, 바람직하게는 65 내지 75%에 포함된다. 여기서 사용된 용매라는 용어는 알콜 용매 또는 아세토니트릴을 의미함을 유의한다.
바람직하게는, 단계 iii) 후의 상청액 중의 L-메티오닌의 잔류 용해도는 실온에서 5 내지 6 g.L-1, 보다 바람직하게는 5.2 내지 5.9 g.L-1이다.
본 발명의 일부 예시적 실시양태에서, 단계 iii)의 작업 온도는 2℃ 내지 50℃, 바람직하게는 10℃ 내지 40℃, 보다 더 바람직하게는 18℃ 내지 40℃에 포함된다.
침전된 메티오닌의 회수는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수단 예컨대 경사분리 또는 원심분리, 바람직하게는 경사분리에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 단계 iv)는 L-메티오닌을 회수하는 것이다. 단계 iv)는 이전 단계 ii)와 상이할 수 있으며, 단계 ii)에서 사용되는 것들과 상이한 방법을 사용할 수 있다.
이 단계 iv)는 생성된 고체 조 메티오닌의 분리, 그의 세척 및 그의 건조를 포함할 수 있다. 고체 조 메티오닌은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 그러한 것으로 공지된 임의의 방법에 의해 회수되며, 이러한 방법은, 예를 들어, 원심분리, 흡인 여과 및 수직 여과 (드럼, 필터 프레스 등에서의 여과)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 후자의 경우에, 조 메티오닌은 40 μm 여과포 상에 보유되고, 모액은 통과한다. 이어서, 조 메티오닌 케이크는 1 내지 10BV의 물, 바람직하게는 탈염수로 세척된다. 이어서, 고체 조 메티오닌은 건조되고, 임의로 입자를 분급하기 위해 밀링된다.
발효 배지 또는 다양한 하류 공정 플럭스 예컨대 상청액, 투과물 또는 결정화의 모액 중의 생성물의 양은 관련 기술분야에 공지된 다수의 방법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 기체 크로마토그래피 (GC)를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어 배지에서 수득된 메티오닌의 양은 표준물로서 L-메티오닌 (Fluka, Ref 64319)을 사용하여, OPA/FMOC 유도체화 후에 HPLC에 의해 측정된다.
바람직하게는, 단계 iv) 후의 L-메티오닌의 농도는 적어도 180 g.L-1, 바람직하게는 적어도 200 g.L-1이며, 특히 180 내지 300 g.L-1, 보다 바람직하게는 220 내지 300 g.L-1에 포함된다.
도 1은 사용된 에탄올의 부피의 함수로 침전 수율을 나타낸다 (백색 정사각형: 이론적 수율 및 흑색 정사각형: 실험 결과).
도 2는 모액 재순환 하의 메티오닌 침전의 예시적인 공정을 나타낸다.
도 3은 에탄올성 모액 재순환 횟수의 함수로 메티오닌 회수의 이론적 수율을 나타낸다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 한정된다. 이들 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 단지 예시로서 제공됨을 이해하여야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 상기 개시내용 및 이들 실시예로부터 본 발명의 본질적 의미를 변형시키지 않으면서, 본 발명이 다양한 용도 및 조건에 대해 적합화되도록 그의 다양한 변화를 이룰 수 있다.
특히, 실시예는 변형된 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이) 균주를 제시하지만, 이들 변형은 동일한 과의 다른 미생물에서도 용이하게 수행될 수 있다.
에스케리키아 콜라이는 엔테로박테리아세아에 과에 속하며, 그람-음성이고, 막대-형상이며, 포자를 형성하지 않는, 전형적으로 길이가 1-5 ㎛인 구성원이다. 대부분의 구성원은 운동성을 위해 사용되는 편모를 갖지만, 몇몇 속은 비-운동성이다. 이 과의 많은 구성원은 인간 및 다른 동물의 장에서 발견되는 장 균총의 정상적인 부분인 반면, 다른 구성원들은 물 또는 토양에서 발견되거나, 또는 다양한 상이한 동물 및 식물 상의 기생충이다. 이. 콜라이가 가장 중요한 모델 유기체 중 하나이지만, 엔테로박테리아세아에 과의 다른 중요한 구성원은 클레브시엘라, 특히 클레브시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena), 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) 또는 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 및 살모넬라를 포함한다.
더욱이, 여러 특허 출원에서 메티오닌 생산을 위한 최적화가 과도한 실험 없이도 이. 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 용이하게 적용될 수 있음을 지적한다.
실시예 1: 발효 공정에 의한 메티오닌 생산
단계 i) : 미생물의 배양
L-메티오닌을 생산하는 박테리아의 배양 및 발효는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라, 특히 특허 출원 WO2013/190343의 실시예 4에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있었다.
특히, 배양 조건 및 배지 조성은, 여기서는 65 g.L-1의 메티오닌 농도를 수득할 때까지 37℃에서 계속되는 발효 시간 (배양 시간이 30 내지 35시간임)을 제외하면 동일하였다.
단계 ii) L-메티오닌의 회수
¤ 불용성 유기 불순물 (바이오매스)의 제거는 제1 단계에서, 80℃에서 100 nm의 세공 직경을 갖는 막 상에서의 접선 여과에 의해 수행하였다 (3.5 mm의 채널 직경을 갖는 세라믹 유형의 막). 1 bar의 막차압과 함께 온도를 우선적으로 40℃에서 유지하고, 20%의 탈염수를 사용하여 투석여과하였다. 이들 조건 하에, 평균 유량은 30 L/h/m2였고, 수득된 투과물은 투명하고 맑았다. 바이오매스 및 불용성 입자가 제거된 투과물은 가용성 유기 불순물, 특히 가용성 당 및 단백질을 여전히 함유하였는데, 이들은 다음 단계 전에 제거가 권장된다.
¤ 이 제2 단계의 목적은 발효액에 함유된 가용성 유기 불순물 (가용성 당 예컨대 폴리사카라이드 및 거대분자)을 제거하는 것이었다. 이는 이들 불순물이 L-메티오닌 결정화 단계 동안에, 조작된 매스의 거동 (균질, 엉긴 외관, 매우 미세한 결정) 및 고체 상의 회수에 부정적으로 영향을 미치기 때문이다.
이러한 제거는 5 kDa의 컷오프 역치를 갖는 세라믹 막 상에서의 한외여과에 의해 수행할 수 있었다. 40℃에서, 여과 유량은 평균적으로 25 L/h/m2였고, 거대분자의 대략 70%가 보유물에 보유되었다.
탈염 용액을 위건드(Wiegand)® 강하-막 진공 증발기 상에서 50℃에서의 물의 증발에 의해 사전-농축시켰다. 농축 계수는 L-메티오닌의 초기 농도에 따라 약 2 내지 5였다. 이 경우에는 50℃에서 과-포화 (80 g/L)에 근접하기 위해 3에 해당되었다. 이어서, 사전-농축된 용액을 강제-순환 증발결정화기로 옮기고, 대략 35℃에서 진공 하에 (50 mbar) 그 안에서 추가로 농축 및 결정화시켰다. 이러한 증발결정화기에 적용되는 농축 계수는 240 g/L를 달성하기 위해 대략 3이었다.
단계 iii) 용매를 사용한 침전
다양한 용매를 70% (중량 기준으로 용매/(메티오닌 함유 분획 + 용매))의 동일한 비로, 단계 ii)에서 나온 발효 농축 상청액에 대해 검정하였다. 메티오닌의 보다 낮은 잔류 용해도를 달성하도록 하는 용매는 에탄올 및 이소프로판올이었다 (표 1).
표 1: 사용된 용매 및 작업 온도의 함수로의 L-메티오닌의 잔류 용해도.
Figure pct00001
*결정되지 않음
용매로서 다양한 백분율의 에탄올을 단계 ii)에서 나온 발효 상청액에 대해 검정하였다. 용매로서 다양한 백분율의 에탄올을 사용한 L-메티오닌의 이론적 회수 수율은 결과와 일치하였다. 도 1은 실험 결과 및 이론적 결과를 제시한다.
단계 ii)에서 나온 발효 상청액을 대략 250 g.L-1으로 농축시키고, 에탄올을 0%, 30% 및 70%의 상이한 비율 (중량 기준으로 용매/(메티오닌 함유 분획 + 용매)의 비에 상응함)로 첨가하였다. 이론적 회수 수율을 에탄올 함량의 함수로 결정하였다. 도 1은 실험 데이터가 이론적 값과 일치함을 입증한다 (37℃에서의 L-메트의 용해도는 대략 70 g.L-1임).
단계 iv) L-메티오닌의 회수
단계 iii) 후에 형성된 결정을 코퀘네트(Choquenet)® 필터 프레스 상에서 분리하고, 케이크 부피당 1 부피의 탈염수로 세척함으로써 회수하였다. 결정을 45℃의 유동층 (에어로매틱(Aeromatic)® 유형) 상에서 건조시켰다. 이들 조건 하에, L-메티오닌 회수 수율은 >85%/건조의 순도로 >80%였다.
실시예 2: 에탄올로 실현된 1회의 침전 단계에 의한 L-메티오닌의 증가된 회수.
실시예 1의 프로토콜에 따라, 상기 기재된 구현예로부터 유래되며 L-메티오닌을 함유하는 발효 브로쓰를 정제하였다. 발효 동안 형성된 바이오매스를 완전히 분리하였다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 발효 브로쓰로부터 제거하였다. 37℃에서의 상청액 중의 메티오닌 농도는 거의 65 g.L-1이었다. 단계 ii) 후에 용액을 80℃의 온도를 보장하면서 진공 하에 (300 mbar) 대략 200 g.L-1으로 농축시켰다 (회전증발기를 사용함).
실온으로 냉각시킨 후에, 에탄올 (70% W/W)을 첨가하여 메티오닌의 침전을 완료하였다. 결정을 여과에 의해 회수하였다. 필터 케이크를 70% (100 mL)의 에탄올로 세척한 다음, 동결건조에 의해 건조시켰다.
에탄올을 사용한 1회의 침전 단계는 결정화 수율이 67.5%에서 87%로 증가하도록 하였다 (표 2).
표 2: 1회의 에탄올 (70%) 침전 단계를 갖지 않거나 또는 갖는 경우의 침전 수율.
Figure pct00002
실시예 3: 에탄올로 실현된 수회의 침전 단계에 의한 L-메티오닌의 증가된 회수.
에탄올을 실시예 2에 기재된 바와 같이 사용할 수 있으며, 증류 단계로부터 수득된 1차 모액을 순환식으로 사용할 수 있었다 (도 2). 에탄올은 침전 단계를 위해 재순환되었다. 모액의 일부분은 재순환되어 수율을 증가시켰다. 60%의 모액이 재순환된다면, 메티오닌 수율은 95%로 증가될 수 있었다 (도 3).
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Claims (8)

  1. 하기 단계를 포함하는, L-메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산 방법:
    i) 메티오닌의 발효적 생산을 위해 최적화된 미생물을, 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 배양하여 L-메티오닌을 생산하는 단계;
    ii) 단계 i)에서 수득된 L-메티오닌을 회수하는 단계;
    iii) 단계 ii)에서 수득된 메티오닌 함유 분획에 알콜 용매 또는 아세토니트릴을 첨가하여 L-메티오닌을 침전시키는 단계; 및
    iv) L-메티오닌을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 단계 i)에서의 미생물이 단독 미생물인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L-메티오닌 전구체의 임의의 효소적 프로세싱을 포함하지 않는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)가 L-메티오닌의 결정화 단계가 후속되거나 또는 후속되지 않으면서, 발효 배지의 정화 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)에서 사용되는 알콜 용매가 에탄올, 이소프로판올 또는 그의 혼합물 중에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)에서 사용되는 알콜 용매가 에탄올인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)에서 용매 / (메티오닌 함유 분획 + 용매)의 비가 50 내지 80 중량%, 바람직하게는 65 내지 75%에 포함되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)에서 단계 iii) 후의 상청액 중의 L-메티오닌의 잔류 용해도가 실온에서 5 내지 6 g.L-1인 방법.
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