CN104411821B - 用于发酵生产甲硫氨酸的重组微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明与优化甲硫氨酸发酵生产的重组微生物相关，其中所述钴胺素非依赖的甲硫氨酸合成酶MetE的活性在所述微生物中减弱。所述发明还与通过发酵生产甲硫氨酸的方法相关。

Description

用于发酵生产甲硫氨酸的重组微生物
发明领域
本发明涉及用于生产甲硫氨酸的重组微生物和生产甲硫氨酸的方法，其通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养所述重组微生物。所述微生物以通过减弱钴胺素非依赖甲硫氨酸合酶的活性来增加甲硫氨酸/碳源得率(yield)的方式进行修饰。具体地，基因metE在所述重组微生物中缺失。
现有技术
含硫化合物，如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢至关重要且在工业上生产以用作食品或饲料添加剂以及药物。特别是甲硫氨酸，一种不能被动物合成的必需氨基酸，其在许多机体功能中起重要作用。除了在蛋白质生物合成中的作用外，甲硫氨酸参与转甲基作用以及硒和锌的生物使用率。甲硫氨酸还直接被用作病症像过敏和风湿热的治疗。尽管如此，生产的多数甲硫氨酸被添加到动物饲料中。
由于BSE和禽流感，对动物来源蛋白质的使用降低，纯化的甲硫氨酸需求有所增加。通常，D,L-甲硫氨酸由丙烯醛、甲硫醇和氰化氢化学生产。但是，外消旋混合物表现不及纯的L-甲硫氨酸(Saunderson,1985)。此外，虽然纯化的L-甲硫氨酸可以由外消旋甲硫氨酸生产，例如，通过N-乙酰-D,L-甲硫氨酸的酰基酶处理，但其显著增加生产成本。因此，对于纯的L-甲硫氨酸需求的增加伴随环保上的顾虑使得微生物生产甲硫氨酸具有吸引人的应用前景。
由微生物优化化学品的生产通常涉及过表达参与生物合成途径的蛋白质，减弱参与抑制生物合成途径的蛋白质或减弱参与不需要的副产物的生产的蛋白质。所有这些在微生物中用于L-甲硫氨酸生产的优化之前已被描述(见，例如，专利或专利申请US 7,790,424、US 7,611,873、WO 2002/010209、WO 2005/059093和WO 2006/008097)；然而，由微生物工业生产L-甲硫氨酸需要进一步改进。
在大肠杆菌(Escherichia coli)和其他微生物像谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，两种不同的酶催化甲硫氨酸从头生物合成的终止步骤(Foster等,1961；Gonzalez等,1992)。钴胺素依赖的甲硫氨酸合酶(MetH,EC 2.1.1.13)由metH基因编码且包含对于活性所需的辅基。钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶(MetE,EC2.1.1.14)由metE基因编码且没有已知的对于源自维生素的辅基的需求。
许多专利申请涉及MetH和MetE酶的过生产以增强甲硫氨酸生物合成的最后一步，举例来说：
-来自BASF的WO2007/012078和WO2007/135188描述了基因改造导致metH和/或metE基因的过表达。
-来自EVONIK的WO2009/144270描述了使用展示出升高的钴(I)胺素依赖的MetH再活化系统的量和/或活性的微生物生产甲硫氨酸的方法。
发明人令人惊讶而意外地发现减弱钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶(MetE)的量和/或活性的导致改进的甲硫氨酸生产。这是首次提出一种属于甲硫氨酸生物合成途径的酶的活性损失对甲硫氨酸生产有益。
发明概述
本发明与一种经优化用于甲硫氨酸生产的重组微生物相关，其中钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶MetE的活性减弱。优选地，编码MetE酶的基因metE缺失或突变。所述重组微生物也可以包含其它基因修饰如：
-至少一个下列基因的增加的表达：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、thrA、编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因(metA*)、thrA、或编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)和/或
-下列基因之一的减弱的表达：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL和yncA。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及微生物，其中：a)所述metE基因缺失，且b)基因metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc的表达增强；且c)基因metJ、pykA、pykF、purU和yncA的表达减弱。
本发明还与用于在发酵过程中的甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物的生产方法相关，其包括如下步骤：a)在包含含有葡萄糖的可发酵碳源和硫源的适当培养基中培养根据本发明的重组微生物及b)从所述培养基中回收甲硫氨酸或甲硫氨酸衍生物。
发明详述
在详细描述本发明前，应该理解的是本发明不受限于具体例示的方法且当然可以变化。还应该理解的是本申请所用的术语仅为描述本发明的特定实施方案的目的，而非意欲为限制性的，其仅受限于所附的权利要求书。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论见前文或见后文，在此通过提述以其整体并入。但是，本文提到的出版物的引用是为了描述和公开在出版物中报道的且可用于与本发明相关的方案、试剂和载体。本文的任何内容均不应理解为承认本发明无权先于凭借现有发明的这些公开。
此外，除非另外表明，本发明的实践采用本领域传统的微生物学和分子生物学技术。这些技术被本领域的技术人员公知，且在文献中被充分解释。见，例如，Prescott等(1999)以及Sambrook等(1989)(2001)。
必须注意的是，除非上下文另外清楚表明，如本文和所附权利要求中所用单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指称。因此，举例来说，提及“微生物”包括这种微生物的复数，且提及“内源基因”是对一个或多个内源基因的指称等。除非另外限定，所有本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。虽然与本文描述的那些相似或等同的任何材料和方法均能用于实施或测试本发明，优选的材料和方法如下所述。
在所附权利要求和本发明的连续描述中，除非上下文由于表达语言和必要的含义所需，词语“包含”、“含有”、“涉及”或“包括”或其时态的变化如“包含”、“含有”、“涉及”或“包括”的使用具有包含的意义，例如，为详明所述特征的存在但不排除其他特征在本发明多个实施方案中的存在或添加。
定义
术语“甲硫氨酸”指具有化学式HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3的必需含硫氨基酸且对于特定的L-异构体的CAS号为59-51-8或63-68-3。
“甲硫氨酸衍生物”指甲硫氨酸的分子类似物，其与甲硫氨酸具有相同的化学骨架但至少一个不同的化学基团。在本发明中，优选的甲硫氨酸衍生物是N-乙酰甲硫氨酸(NAM)，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和羟基甲硫氨酸。
本文所用的术语“微生物”指未经人工修饰的细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物选自：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)，或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。更优选地，微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种。
本文所用的术语“重组微生物”或“基因修饰的微生物”指自然界不存在的且基因方面不同于在自然界存在的与其等同的细菌、酵母或真菌。意思是，对其修饰是通过对遗传元件的引入或缺失或修饰进行的。也可以通过将定向诱变与在特定的选择压力下的进化组合而强制新的代谢途径的发展和进化来转化(见，例如，WO 2004/076659)。
如果将外源基因与允许其在宿主微生物中表达的所有元件引入微生物中，可修饰微生物来表达这些外源基因。用外源基因对微生物修饰或“转化”是本领域技术人员的日常工作。
可以对微生物修饰来调节内源基因的表达水平。
术语“内源基因”意思是所述基因存在于未经任何基因修饰的微生物(野生型菌株)中。可通过引入额外的异源序列或以其替代内源调节元件，或将基因的一个或多个增补拷贝引入染色体或质粒中来过表达内源基因。也可修饰内源基因来调节其表达和/或活性。举例而言，可向编码序列中引入突变来修饰基因产物或者引入额外的异源序列或以其替代内源调节元件。内源基因的调控可导致基因产物活性的上调和/或增强，或者内源基因产物活性的下调和/或降低。
另一种调节其表达的方式是将基因的内源启动子(例如，野生型启动子)交换为更强或更弱的启动子来上调或下调内源基因的表达。这些启动子可为同源或异源。选择适当的启动子是本领域的技术人员的能力之内。
术语“外源基因”意思是通过本领域的技术人员所熟知的方式将基因引入微生物中，而此基因并非在所述微生物中天然存在。外源基因可以整合至宿主染色体中，或通过质粒和载体在染色体外表达。本领域公知在复制起点和细胞中的拷贝数方面不同的多种质粒。这些基因可为异源或同源。
术语“异源基因”意思是所述基因来源的微生物物种不同于表达它的受体微生物。其指不天然存在于微生物中的基因。
在本申请中，所有基因以其来自大肠杆菌的通用名提及。它们的核苷酸序列可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene或http://www.ebi.ac.uk/embl/得到。
使用Genbank中给出对于已知基因的参考文献，本领域的技术人员能够确定在其他生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。此日常工作使用通过与源自其他微生物的基因进行序列比对和设计简并探针以克隆另一生物体中的对应基因而确定的共有序列来有利地完成。这些分子生物学的日常方法是本领域技术人员熟知的，并例如在Sambrook等,(1989)和(2001)中申明(claim)。
本文所用的术语“改进的甲硫氨酸生产”、“改进甲硫氨酸生产”和本文所用的其语法上等同的表述指增加的甲硫氨酸/碳源得率(消耗的每克/摩碳源产生的克/摩甲硫氨酸的比例，其可以百分数表示)。用于确定消耗的碳源和生产的甲硫氨酸的量的方法对于本领域的那些技术人员是熟知的。与相应地未修饰的微生物相比，重组微生物的得率更高。
术语“经优化用于甲硫氨酸发酵生产的微生物”指与相应的野生型微生物的内源生产相比，经进化和/或基因修饰来提供改进的甲硫氨酸生产的微生物。这种对于甲硫氨酸生产“优化”的微生物是本领域熟知的，且已经在特定的专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中公开。
根据本发明术语“发酵生产”、“培养”或“发酵”用于表示细菌的生长。这种生长一般在发酵罐中用适应于所用微生物且包含至少一种简单碳源和(如果需要的话)共底物的适当培养基来实施。
“适当的培养基”表示培养基(例如，无菌液体培养基)，其包含对细胞的维持和/或生长必需或有益的营养物，如碳源或碳底物、氮源、例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾；痕量元素(例如，金属盐)，例如镁盐，钴盐和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸和维生素。
根据本发明，术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”指任何可以被本领域的技术人员使用以支持微生物的正常生长的碳的来源，包括单糖(如葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖和乳糖)，寡糖，双糖(如蔗糖、麦芽糖或纤维二糖)，糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素及其组合。特别优选的简单碳源为葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。所述碳源可源自可再生物料(feed-stock)。可再生物料定义为某些工业过程所需的原材料，其可在短暂延迟中且以足以允许其转化成预期产物的量再生。处理或未处理的植物生物量是令人感兴趣的可再生碳源。
根据本发明，术语“硫源”指硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基硫醚和其他甲基封端的硫化物或不同来源的组合。更优选地，培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或其混合物。
术语“氮源”对应于铵盐或氨气。氮源以铵或氨的形式供给。
术语“减弱”或“表达减弱”在上下文的意思是与未修饰的微生物相比基因或酶的表达被减少或抑制。酶的表达的减少或抑制是由编码所述酶的基因的表达减弱获得的。
基因的减弱可以通过本领域的技术人员所知的手段或方法实现。通常，基因表达的减弱可以通过以下实现：
-突变编码区或启动子区或，
-缺失基因表达所需的启动子区的全部或一部分或，
-通过同源重组缺失基因的编码区或，
-将外来元件插入编码区或启动子区或
-在弱启动子调控下表达所述基因。
本领域的技术人员已知多种展示不同强度以及能够用于弱的基因表达的启动子。
术语酶的“活性”与术语“功能”在本发明的上下文可互换使用，并表示酶催化的反应。本领域的技术人员知道如何测量所述酶的酶活性。具体地，对于蛋白质MetE活性的测量，参见实施例5。
术语酶的“减弱的活性”或“降低的活性”意思是通过氨基酸序列中的突变获得的蛋白质的比催化活性降低和/或通过核苷酸序列的突变或基因编码区的缺失获得的细胞中蛋白质浓度减少。
术语酶的“增强的活性”或“增加的活性”指所述酶的比催化活性增加，和/或细胞中酶的量/可用性增加，其例如通过过表达编码酶的基因获得。
术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”及其语法上等同的表述在文本中可互换使用并具有相似含义。这些术语意思是与未修饰的微生物相比基因或酶的表达增加。酶的表达增加通过增加编码所述酶的基因的表达获得。
为了增加基因的表达，本领域的技术人员知道不同的技术：
-增加基因在微生物中的拷贝数。所述基因在染色体或染色体外编码。当基因位于染色体上时，可通过本领域的专家已知的重组的方法(包括基因替代)将基因的几个拷贝引入染色体上。当基因位于染色体外时，其可被不同类型的质粒携带，所述质粒在复制起点和它们在细胞中的拷贝数方面不同。取决于所述质粒的性质，这些质粒在微生物中以1至5个拷贝，或约20个拷贝，或多至500个拷贝存在：严紧复制的低拷贝数质粒(pSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
-使用诱导基因的高水平表达的启动子。本领域的技术人员知道哪一种启动子最为便捷，例如启动子Ptrc、Ptac、Plac或λ启动子cI被广泛使用。这些启动子可通过特定化合物或通过特定外部条件像温度或光而为“诱导型”。这些启动子可为同源或异源。
-减弱对于基因特异性或非特异性的转录阻遏物的活性或表达
-使用稳定相应的信使RNA的元件(Carrier和Keasling,1998)或稳定蛋白质的元件(例如，GST标签，GE Healthcare)。
术语“编码”(encoding或coding)指多核苷酸通过转录和翻译的机制产生氨基酸序列的过程。编码酶的基因可为外源或内源。
术语“反馈敏感性”或“反馈抑制”指细胞机制调控，其中催化细胞中特定底物生产的一种或几种酶当所述底物已积累至一定水平时被抑制或较不活跃。因此术语“降低的反馈敏感性”或“降低的反馈抑制”意思是这种机制的活性与未修饰的微生物相比减少或被抑制。本领域的技术人员知道如何修饰酶来获得这种结果。所述修饰已描述于专利申请WO2005/111202或专利US 7,611,873中。
本发明涉及经优化用于发酵生产甲硫氨酸的重组微生物，其中所述钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶MetE的活性减弱。
本领域的技术人员知道减弱酶活性的多种手段和方法，如蛋白质突变、基因突变或基因表达的减弱。蛋白质突变可通过替代酶的催化位点中存在的特定氨基酸，或引入额外的氨基酸，或缺失某些氨基酸来实现。
在本发明的第一方面，编码钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶MetE的metE基因的表达减弱。大肠杆菌(E.coli)metE基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO20中。
基因减弱可通过向基因中引入外来DNA以使其失活或通过在弱启动子或诱导型启动子调控下表达基因来实现。本领域的技术人员知道展示不同表达强度和/或不同诱导参数的多种启动子以及如何通过修饰野生型启动子来修饰启动子以降低其表达强度，举例来说，在其共有序列、核糖体结合位点或起始密码子中…。因此，本领域的技术人员能够选择导致metE减弱表达的启动子。
在本发明的一个优选实施方案中，缺失至少一部分metE基因。优选地，此缺失部分代表编码序列的至少10％，更优选编码序列的至少20％、30％、40％，或50％。更优选地，缺失编码序列的至少80％。在本发明的一个具体实施方案中，将metE基因全部缺失。本领域的技术人员知道许多使基因部分缺失的技术如同源重组。
在本发明的第二方面中，突变metE基因以编码展示减弱活性的修饰的蛋白质。在本发明的一个优选实施方案中，基因metE中的突变导致失活的截短MetE蛋白质的翻译。更优选地，突变是13碱基对(bp)部分的缺失：其核苷酸序列示于SEQ ID NO:20的大肠杆菌基因的第417至第429碱基，其导致移码突变。因此，蛋白质的翻译被缩短(通过移码引入终止密码子)且产生如SEQ ID NO 22所示的152个氨基酸的截短蛋白质而不是如SEQ ID NO 21所示的野生型序列中753个氨基酸。允许将终止密码子引入来自任何微生物物种的metE基因中的任何等同突变也是本发明的一部分。
甲硫氨酸生物合成途径的优化
根据本发明的重组微生物经修饰用于改进甲硫氨酸的生产。参与甲硫氨酸生产的基因是本领域熟知的，且包括参与甲硫氨酸特异性生物合成途径的基因以及参与前体提供途径的基因以及参与甲硫氨酸消耗途径的基因。
甲硫氨酸的高效生产需要甲硫氨酸特异性途径以及几个前体提供途径的优化。已经描述了甲硫氨酸生产菌株，特别是在专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中。这些申请作为参考并入本申请中。
在本发明的一个具体实施方案中，如下所述修饰重组微生物：至少一个下列基因的表达增加：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metH、metA、编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的thrA等位基因(MetA*)、thrA、或编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)。
·ptsG编码PTS酶IICBGlc，如专利申请EP11305829中所述。
·pyc编码丙酮酸羧化酶，如专利申请EP11305829中所述。在一个优选的实施方案中，pyc基因是异源的且选自来源于如下的pyc基因：埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或棒状杆菌属菌种(Corynebacterium species)。
·pntAB编码膜结合的转氢酶的亚基，如专利申请WO2012/055798所述，
·cysP编码周质硫酸盐结合蛋白，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·cysU编码硫酸盐ABC转运蛋白的组成部分，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·cysW编码膜结合的硫酸盐转运蛋白，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·cysA编码硫酸盐通透酶，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·cysM编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶，如WO2007/077041和WO2009/043803所述，
·cysI和cysJ分别编码亚硫酸盐还原酶的α和β亚基，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述。优选地，cysI和cysJ一起过表达，
·cysH编码腺嘌呤核苷酰硫酸还原酶，如WO2007/077041和WO2009/043803所述。
增加C1代谢也是改进甲硫氨酸生产的修饰。其涉及选自GcvTHP、Lpd、MetF或MetH的参与C1代谢的至少一种酶的活性增加。在本发明的一个优选实施方案中，通过增强如下至少一个的表达和/或活性来增加一碳代谢：
·gcvT、gcvH、gcvP和lpd，编码甘氨酸裂解复合物，如专利申请WO2007/077041中所述。甘氨酸裂解复合物(GCV)是催化甘氨酸氧化、得到二氧化碳、氨、亚甲基-THF和还原的吡啶核苷酸的多酶复合体。GCV复合体由四种蛋白质组分组成，称为P-蛋白质的甘氨酸脱氢酶(GcvP)、称为H-蛋白质的硫辛酰-GcvH-蛋白质(GcvH)、称为T-蛋白质的氨基甲基转移酶(GcvT)，以及称为L-蛋白质的二氢硫辛酰胺脱氢酶(GcvL或Lpd)。P-蛋白质催化磷酸吡哆醛依赖的CO2从甘氨酸的释放，剩下甲胺基。甲胺基被转移至H-蛋白质的硫辛酸基团，其在甘氨酸脱羧之前结合于P-蛋白质。T-蛋白质催化NH3从甲胺基团的释放并就剩余的C1单元转移至THF，形成亚甲基-THF。然后L-蛋白质氧化H-蛋白质的硫辛酸组分并将电子转移至NAD+，形成NADH；
·MetF编码亚甲基四氢叶酸还原酶，如专利申请WO 2007/077041中所述；
·MetH(B-12依赖的高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶)编码甲基转移酶。
至少一个下列参与丝氨酸生物合成的基因的过表达也降低副产物异亮氨酸的生产：
·serA编码磷酸甘油酸脱氢酶，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·serB编码磷酸丝氨酸磷酸酶，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·serC编码磷酸丝氨酸氨基转移酶，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述。
已显示下列基因的过表达改进甲硫氨酸的生产：
·cysE编码丝氨酸酰基转移酶；其过表达使得甲硫氨酸生产增加，如WO 2007/077041中所述；
·metA编码高丝氨酸琥珀酰转移酶。等位基因MetA*编码的酶具有对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸降低的反馈敏感性。优选地，使用专利申请WO 2005/111202中描述的等位基因MetA*；
·thrA编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；thrA*等位基因编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶，如WO 2005/111202中所述。
在本发明的一个具体实施方案中，基因可以在诱导型启动子的调控下。在本发明的一个优选实施方案中，这些基因中至少一个是在温度诱导型启动子的调控下。优选地，至少一个下列基因的表达：thrA、cysE、metA，直接或间接在诱导型启动子的调控下。更优选地，基因thrA、cysE和metA直接或间接地在诱导型启动子的调控下。在本发明的一个优选实施方案中，thrA基因的表达在诱导型启动子的直接调控下且cysE基因的表达在thrA基因的诱导型表达的极效应(polar effect)下。在本发明的另一优选实施方案中，thrA基因的表达在诱导型启动子的直接调控下且cysE和metA基因的表达是在thrA基因的诱导型表达的极效应下。
在最优选的实施方案中，温度诱导型启动子属于PR启动子家族。具有在诱导型启动子的调控下的基因的甲硫氨酸生产菌株在专利申请WO2011/073122中描述。
在本发明的另一具体实施方案中，微生物被进一步修饰，且至少一个下列基因的表达减弱：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL或yncA。
·基因metJ编码阻遏蛋白MetJ(Genbank 1790373)，如专利申请JP2000/157267中所表明的其负责下调甲硫氨酸调节子，
·基因pykA和pykF编码酶“丙酮酸激酶”。至少一个或两个丙酮酸激酶的表达减弱减少了磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的消耗。PEP的可用性增加可增加草酸乙酰(重要的天冬氨酸前体)的产生，而天冬氨酸又是甲硫氨酸的前体，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述。
·purU编码甲酰四氢叶酸脱甲酰酶，一种催化甲酰基-THF去甲酰酶反应的酶。去甲酰酶活性的减弱使高半胱氨酸甲基化所需的甲基-THF的产生增加。通过去甲酰化的C1代谢物损失导致不能转化为甲硫氨酸的高半胱氨酸的生产增加。然后高半胱苷酸可为酶胱硫醚γ合酶(MetB)的底物，所述酶可催化O-琥珀酰高丝氨酸和高半胱氨酸之间的反应导致高羊毛氨酸的产生，如WO2007/077041和WO2009/043803中所述，
·ybdL编码如专利申请PCT/FR2010/052937中所述的氨基转移酶，
·yncA编码N-酰基转移酶，如专利申请WO 2010/020681中所述。
在本发明的一个更优选的实施方案中，通过重组微生物从作为主要碳源的葡萄糖发酵生产甲硫氨酸，其中钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶MetE的活性减弱，其可通过所述微生物中上面讨论的修饰的组合来实现，例如：
·基因metJ的表达减弱且编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表达增强；
·基因metJ的表达减弱；编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表达增强；且编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表达增强；
·基因metJ的表达减弱；编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因(MetA*)的表达增强；编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表达增强；且基因cysE的表达增强；
·基因metJ的表达减弱；编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因(metA*)的表达增强；编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因(thrA*)的表达增强；基因cysE的表达增强；且基因metF和/或metH的表达增强。
在本发明的一个具体方面中，重组微生物包含下列遗传修饰：
·基因metE缺失
·基因metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc的表达增强；且
·基因metJ、pykA、pykF、purU和yncA减弱。
在本发明的一个具体实施方案中，微生物来自细菌的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。
优选地，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
培养条件
本发明还涉及甲硫氨酸生产的方法，其包括如下步骤：
-在包含可发酵碳源和硫源的适当培养基中培养重组微生物，及
-从所述培养基中回收甲硫氨酸或其衍生物。
本领域的技术人员能限定用于根据本发明的微生物的培养条件。具体地，将细菌在20℃-55℃，优选25℃-40℃，且更具体地对于谷氨酸棒状杆菌约30℃以及对于大肠杆菌约37℃的温度发酵。
对于大肠杆菌，培养基可与M9培养基(Anderson,1946)、M63培养基(Miller,1992)；或如由Schaefer等,(1999)定义的培养基组成相同或相似。
对于谷氨酸棒状杆菌，培养基可与BMCG培养基(Liebl等,1989)或与如由Riedel等,(2001)描述的培养基组成相同或相似。
在本发明的一些实施方案中，培养对于一种或几种无机底物受到限制或饥饿。这指微生物的生长由提供的无机化学品的数量支配并仍允许其弱生长的条件。这种微生物生长的限制已在专利申请WO 2009/043372中描述。在本发明的一个优选实施方案中，培养受到磷酸盐限制。
“从培养基回收甲硫氨酸或其衍生物”的行为指明回收L-甲硫氨酸和/或其衍生物之一，特别是N-乙酰甲硫氨酸(NAM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以及所有可能有用的其他衍生物的行为。生产的化合物的回收和纯化的方法是本领域的技术人员熟知的(具体参见WO2005/007862、WO 2005/059155)。
可以使用本领域已知的多种方法确定在发酵培养基中产物的量，例如，高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)。例如在培养基中获得的甲硫氨酸的量在OPA/Fmoc衍生后通过HPLC使用L-甲硫氨酸(Fluka,Ref 64319)作为标准测量。NAM的量使用NAM(Sigma,Ref01310)作为标准用折射法HPLC确定。
实施例
在下列实施例中进一步限定本发明。应该理解的是这些实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出。由上文的公开和这些实施例，本领域的技术人员可在不改变本发明的必要手段的情况下对本发明进行多种改变以将其适应于多种用途和条件。
具体地，实施例显示修饰的大肠杆菌(E.coli)菌株，但这些修饰可在相同家族/科的其他微生物中容易地实施。
大肠杆菌属于肠杆菌科，其包括革兰氏阴性、杆状外形的、无芽孢形成且长度通常为1-5μm的成员。大多数成员具有用于运动的鞭毛，但几个属是非运动性的。该家族/科的许多成员是在人和其他动物肠中发现的肠道菌群的正常部分，而其他发现于水或土壤中，或是多种不同动物和植物上的寄生物。大肠杆菌是最重要的模式生物之一，但肠杆菌科的其他重要成员包括克雷伯氏菌属，特别是土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)，植生克雷伯杆菌(Klebsiella planticola)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，和沙门氏菌。
而且，几个专利申请指出用于甲硫氨酸生产的优化可在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中容易地应用而无需过度实验。
实施例1：方案
用于构建甲硫氨酸生产菌株的几种方案描述于下列实施例中。
方案1：通过同源重组的染色体修饰和重组体的选择(Datsenko,&Wanner,(2000))。
通过如Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组在特定的染色体基因座进行等位替代或基因插入。侧翼为Flp识别位点的卡那霉素(Km)抗性kan使用pKD4质粒作为模板通过PCR扩增。所得的PCR产物用于转化携带表达λRed(γ、β、外(exo))重组酶的质粒pKD46的受体大肠杆菌菌株中。然后选择抗抗生素转化体并用表3中所列的适当引物通过PCR分析验证修饰的基因座的染色体结构。
kan抗性基因可使用携带编码Flp重组酶的基因的质粒pCP20切除，如Datsenko&Wanner(2000)所述。将pCP20质粒至引入适当的菌株并将转化体于30℃涂布在补充氨苄青霉素的LB上。为表达flp基因并去除卡那霉素盒，在37℃培养转化体。分离后，使用表3中所列的寡核苷酸通过PCR验证抗生素敏感的克隆。
方案2：噬菌体P1的转导
通过P1转导将染色体的修饰转移至给定的大肠杆菌受体菌株中。方案包括2步：(i)由在包含抗性相关的染色体修饰的供体菌株上制备噬菌体裂解物和(ii)通过此噬菌体裂解物感染受体菌株。
噬菌体裂解物的制备
-将具有感兴趣的染色体修饰的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种于10ml的Km50μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM。
-在37℃震荡温育30分钟。
-加入在供体菌株MG1655上制备的100μl P1噬菌体裂解物(大至1x109噬菌体/ml)。
-在37℃震荡3小时直到细胞完全裂解。
-加入200μl氯仿，并涡旋
-在4500g离心10分钟来消除细胞碎片。
-转移上清至无菌的管中。
-将裂解物储存在4℃。
转导
-将在LB培养基中培养的大肠杆菌受体菌株的5ml过夜培养物在1500g离心10分钟。
-在2.5ml的10mM MgSO4、5mM CaCl2中悬浮细胞沉淀。
-用染色体上具有修饰的菌株MG1655的100μl P1噬菌体感染100μl细胞(检测管)且以100μl无P1噬菌体的细胞和100ul无细胞的P1噬菌体作为对照管。
-在30℃无震荡下温育30分钟。
-在每个管中加入100μl 1M柠檬酸钠，并涡旋。
-加入1ml LB。
-在37℃震荡温育1小时
-在7000rpm离心3分钟。
-在LB+Km 50μg/ml上铺板
-在37℃过夜培养。
表1：在以下实施例中引用或描述的菌株(编号和基因型)
表2：专利申请EP10306164中描述的菌株1的基因型的先前和目前的命名法之间的对应
表3：用于下列实施例的寡核苷酸
实施例2：菌株5的构建，MG1655metA*11Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km(pCL1920-PgapA-pycre-TT07)(pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)
1.菌株1
甲硫氨酸生产菌株1(表1中的基因型)已描述于专利申请EP10306164中，其作为参考并入本申请。
2.菌株2的构建
为增加细胞中亚甲基四氢叶酸汇集物(pool)，通过在染色体上在yjbI基因座加入gcvTHP操纵子的一个拷贝来过生产由该操纵子编码的甘氨酸切割复合物。gcvTHP的此额外拷贝使用人工诱导型trc启动子和优化的核糖体结合位点表达，给出ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km染色体整合。
为缺失yjbI基因并将其用Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07区替代，使用Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒而且还有额外的DNA，同时缺失大多数有关基因。为此，构建了下列质粒：pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km。
该pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km质粒来源于pUC18载体(Norrander等,1983)且携带与Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07区相关的卡那霉素抗性盒，二者克隆于yjbI的上游区和下游区之间。
为构建pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km，首先构建pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC质粒。此质粒携带由转录终止子(大肠杆菌的rrnB基因的T1，命名为TT02)分隔的yjbI的上游和下游区以及多克隆位点(由BstZ17I、HindIII、AvrII、ApaI和PacI限制位点组成，命名为SMC)。该最终区是使用下列寡核苷酸从基因组DNA PCR扩增的：
YjbIup-F(SEQ ID NO 1)
CGTAGGCGCCGGTACCgagtgcagatcggctggaaggcg
具有
-与yjbI区的(4247987-4248009)序列同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于SfoI和KpnI限制位点和额外碱基的区(大写)。
YjbIup-R(SEQ ID NO 2)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGcatttctgtagaattttacacttatagtatcattactgattgagacttca
具有
-与yjbI区的(4248931-4248980)序列同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于大肠杆菌的rrnB基因的转录终止子T1的区(大写粗体)(Orosz等,1991),
-用于多克隆位点的BstZ17I限制位点和部分HindIII限制位点的区(大写)。
YjbIdown-F(SEQ ID NO 3)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTTACCTAGGGCCCTTAATTAAataatgaataagggtgtttaagtaaaggaaaacatcaccgttcctggcat
具有
-与yjbI区的(4250286-4250335)序列同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于大肠杆菌的rrnB基因的转录终止子T1部分的区(大写粗体)(Orosz等,1991),
-用于完整的多克隆位点的区(大写)。
YjbIdown-R(SEQ ID NO 4)
CGTAGGCGCCGGTACCcagcataatcattcaccacacatccg
具有
-与yjbI区的(4251224-4251249)序列同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于SfoI和KpnI限制位点和额外碱基的区(大写)。
首先，“upYjbI”和“downYjbI”片段分别使用YjbIup-F/YjbIup-R和YjbIdown-F/YjbIdown-R寡核苷酸从MG1655基因组DNA PCR扩增。第二，“upYjbI-downYjbI”片段使用YjbIup-F/YjbIdown-R寡核苷酸从“upYjbI”和“downYjbI”PCR片段扩增(其拥有包含大肠杆菌的rrnB基因的转录终止子T1的部分和多克隆位点的部分重叠区)。“upYjbI-downYjbI”PCR片段使用限制酶SfoI切出并克隆入pUC18载体的平端EcoRI/HindIII位点，给出pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC质粒。
然后，使用下列寡核苷酸从pKD载体PCR扩增卡那霉素抗性盒：
Km-F(SEQ ID NO 5)
TCCCCCGGGGTATACcatatgaatatcctccttag
具有
-用于扩增卡那霉素抗性盒的区(小写)(Datsenko&Wanner,2000中的参考序列)
-用于SmaI和BstZ17I限制位点和额外碱基的区(大写)。
Km-R(SEQ ID NO 6)
GCCCAAGCTTtgtaggctggagctgcttcg
具有
-用于扩增卡那霉素抗性盒的区(小写)(Datsenko&Wanner,2000中的参考序列)
-用于HindIII限制型内切位点和额外碱基的区(大写)。
用限制酶BstZ17I和HindIII切出PCR片段并克隆入pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC质粒的BstZ17I/HindIII位点，给出pUC18-ΔyjbI::TT02-SMC::Km质粒。
最后，使用Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F/GcvTHP-TT07-R寡核苷酸(描述如下)从菌株1的基因组DNA PCR扩增Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07片段。用限制酶ApaI和PacI剪切PCR片段并克隆入pUC18-ΔyjbI::TT07-SMC::Km质粒的ApaI/PacI位点，给出pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km质粒。
重组质粒通过DNA测序验证。
Ptrc01/RBS01-GcvTHP-F(SEQ ID NO 7)
CGTAGGCCTGGGCCCgagctgttgacaattaatcatccg
具有
-与菌株1中位于gcvTHP操纵子上游的人工诱导型trc启动子的部分同源的区(小写)，
-用于StuI和ApaI限制位点和额外碱基的区(大写)
GcvTHP-TT07-R(SEQ ID NO 8)
CGAAGGCCTTTAATTAAGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGCGGCCGCttactggtattcgctaatcggtacg
具有
-与gcvP基因序列(3044190-3044214)同源的区(小写)(网站http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于T7te转录终止子的序列的区(大写粗体)，命名为TT07(Harrington等,2001)，
-用于PacI、StuI限制位点和额外碱基的区。
最后，通过用KpnI限制酶剪切pUC18-ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km质粒获得ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km片段然后根据方案1通过电穿孔将其引入MG1655metA*11pKD46菌株。然后选择卡那霉素抗性转化体，并用寡核苷酸yjbI-gcvTHP-F和yjbI-gcvTHP-R通过PCR分析验证ΔyjbI::TT02-Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km片段的插入。经验证和选择的菌株称为MG1655metA*11pKD46ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km。
yjbI-gcvTHP-F(SEQ ID NO 9)
cagaccacccaactggcgacc
与yjbI区序列(4247754-4247774)同源(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)
yjbI-gcvTHP-R(SEQ ID NO 10)
gccattggaatcgaccagcc
与yjbI区序列(4251489-4251508)同源(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)
根据方案2，之后将ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km染色体修饰转导入菌株1中。
选择卡那霉素抗性转导体并使用引物yjbI-gcvTHP-F和yjbI-gcvTHP-R通过PCR验证ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km染色体修饰的存在。
将所得的菌株MG1655metA*11Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAMPtrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km命名为菌株2。
3.菌株3的构建
为构建菌株3，根据方案1移除菌株2的与ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km染色体整合相关的抗性盒。
选择卡那霉素敏感克隆并使用引物yjbI-gcvTHP-F和yjbI-gcvTHP-R通过PCR验证卡那霉素盒的缺乏。
命名得到的菌株MG1655metA*11Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAMPtrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07为菌株3。
4.菌株4的构建
将专利申请PCT/FR2010/052937(其作为参考并入本申请)中所述的质粒pCL1920-PgapA-pycre-TT07引入菌株2，给出下列菌株MG1655metA*11Ptrc01*2/RBS08*1-metHPtrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metFPtrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km(pCL1920-PgapA-pycre-TT07)，命名为菌株4。
5.菌株5的构建
为增加丝氨酸途径的通量，serC和serA基因借助人工启动子和优化的核糖体结合位点并使用细菌人工染色体pCC1BAC(Epicentre)过表达。为此，构建了下列质粒pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca。
为构建pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca，PCR扩增了“TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2”和“Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca”区。
对于“TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2”区，首先使用寡核苷酸Ptrc30/RBS01-F和Ptrc30/RBS01-serC-R(下文描述)在不加基质的情况下通过短PCR合成携带转录终止子(rrnB的T1，注释为TT02)、人工启动子(Ptrc30)、优化的核糖结合位点(RBS01)和SerC基因的起始的大引物。第二，使用大肠杆菌MG1655基因组DNA作为基质以及合成的大引物和serC-TT07*2-R寡核苷酸通过PCR扩增“TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2”片段(下文描述)。
Ptrc30/RBS01-F(SEQ ID NO 11)
tcggcgccttaattaaCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTtacgtaGAGCTGTTGACGATTAATCATCCGGCTCGTATACTGTGTGGAATAAGGAGGTATATT
具有
-用于大肠杆菌的rrnB基因的转录终止子T1(Orosz等,1991)的区(大写粗体)，
-与人工诱导型trc启动子同源的区(大写下划线)，
-与优化的核糖体结合位点同源的区(大写斜体),
-用于NarI、PacI限制位点和额外碱基的区(小写)。
Ptrc30/RBS01-serC-R(SEQ ID NO 12)
ccagaactaaaattgaagatttgagccatAATATACCTCCTTATTCCACACAGTATACGAGC
具有
-与人工诱导型trc启动子同源的区(大写下划线)，
-与优化的核糖体结合位点同源的区(大写斜体)，
-与serC基因序列(956876-956904)同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)
serC-TT07*2-R(SEQ ID NO 13)
CCCAAGCTTGCATGCGCTAGCGAGCTCGAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGttaaccgtgacggcgttcg
具有
-用于在第29位具有一个碱基缺失的T7te转录终止子序列(Harrington等,2001)的区(大写粗体)(命名为TT07*2)，
-与serC基因序列(957946-957964)同源的区(小写)(参考网站http:// www.ecogene.org/的序列)，
-用于HindIII、SphI、SacI和NheI限制位点以及额外碱基的区(大写)。
以相同的方式，使用大肠杆菌MG1655基因组DNA作为基质以及Ptrc30/RBS01-serA-F和serA-TTadcca-R寡核苷酸(下文描述)通过PCR扩增“Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca”片段。
Ptrc30/RBS01-serA-F(SEQ ID NO 14)
TACGTAGCTAGCGAGCTGTTGACGATTAATCATCCGGCTCGTATACTGTGTGGAATAAGGAGGTATATTatggcaaaggtatcgctggagaaag
具有
-与人工诱导型trc启动子同源的区(大写下划线)
-与优化的核糖体结合位点同源的区(大写斜体)，
-与serA基因序列(3056408-3056432)同源的区(小写)(参考网站http:// www.ecogene.org/的序列)，
-用于NheI限制位点和额外碱基的区(大写)。
serA-TTadcca-R(SEQ ID NO 15)
CCCAAGCTTGCATGCCCTAGGTAAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAttagtacagcagacgggcgcg
-用于TTadc转录终止子序列(来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的adc基因的转录终止子，与pSLO1巨大质粒的179847至179807同源)的区(大写粗体)，
-与serA基因序列(3055200-3055220)同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于AvrII、SphI、HindIII限制位点和额外碱基的区(大写)。
分别使用限制酶NarI/NheI和NheI/SphI剪切PCR片段“TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2”和“Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca”，并将两者都克隆入pCC1BAC质粒的NarI/SphI位点，给出pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca质粒。
重组质粒通过DNA测序验证。
最终，将质粒pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca引入菌株4，给出下列菌株MG1655metA*11Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km(pCL1920-PgapA-pycre-TT07)(pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)，命名为菌株5。
6.菌株5中metE突变的确定
通过测量菌株5甲硫氨酸合酶活性(METE)，我们鉴定了metE基因由于给出截短的MetE蛋白质的某些突变而没有功能性。
所述突变是metE基因的13bp(基因的第417至第429碱基)缺失导致的移码突变。因此，蛋白质的翻译被缩短(通过移码引入终止密码子)并且产生152个氨基酸而不是753个氨基酸的截短蛋白质。
此为野生型MetE蛋白质的序列(SEQ ID NO 21)：
MTILNHTLGFPRVGLRRELKKAQESYWAGNSTREELLAVGRELRARHWDQQKQAGIDLLPVGDFAWYDHVLTTSLLLGNVPARHQNKDGSVDIDTLFRIGRGRAPTGEPAAAAEMTKWFNTNYHYMVPEFVKGQQFKLTWTQLLDEVDEALALGHKVKPVLLGPVTWLWLGKVKGEQFDRLSLLNDILPVYQQVLAELAKRGIEWVQIDEPALVLELPQAWLDAYKPAYDALQGQVKLLLTTYFEGVTPNLDTITALPVQGLHVDLVHGKDDVAELHKRLPSDWLLSAGLINGRNVWRADLTEKYAQIKDIVGKRDLWVASSCSLLHSPIDLSVETRLDAEVKSWFAFALQKCHELALLRDALNSGDTAALAEWSAPIQARRHSTRVHNPAVEKRLAAITAQDSQRANVYEVRAEAQRARFKLPAWPTTTIGSFPQTTEIRTLRLDFKKGNLDANNYRTGIAEHIKQAIVEQERLGLDVLVHGEAERNDMVEYFGEHLDGFVFTQNGWVQSYGSRCVKPPIVIGDISRPAPITVEWAKYAQSLTDKPVKGMLTGPVTILCWSFPREDVSRETIAKQIALALRDEVADLEAAGIGIIQIDEPALREGLPLRRSDWDAYLQWGVEAFRINAAVAKDDTQIHTHMCYCEFNDIMDSIAALDADVITIETSRSDMELLESFEEFDYPNEIGPGVYDIHSPNVPSVEWIEALLKKAAKRIPAERLWVNPDCGLKTRGWPETRAALANMVQAAQNLRRG*
此为截短的MetE*蛋白质的序列(SEQ ID NO 22):
MTILNHTLGFPRVGLRRELKKAQESYWAGNSTREELLAVGRELRARHWDQQKQAGIDLLPVGDFAWYDHVLTTSLLLGNVPARHQNKDGSVDIDTLFRIGRGRAPTGEPAAAAEMTKWFNTNYHYMVPEFVKGQQFKLTWTKWTRRWRWATR*
实施例3：菌株7的构建，MG1655metA*11metE::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metHPtrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metFPtrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07(pCL1920-PgapA-pycre-TT07)(pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)
1.菌株6的构建
为研究有功能的MetE蛋白质的复原是否可改进菌株5的甲硫氨酸生产，我们使用Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重组策略用野生型替代截短的metE基因。
为此，使用寡核苷酸metE-Km-F和metE-Km-R(下文描述)PCR扩增侧翼为与metE区同源的片断的卡那霉素盒“metE::Km”片段。将“metE::Km”片段引入具有metE基因功能形式的菌株MG1655metA*11pKD46中。
metE-Km-F(SEQ ID NO 16)
agaaacccgcgcggcactggcgaacatggtgcaggcggcgcagaacttgcgtcgggggtaaaatccaaaccgggtggtaataccacccggtcttttctcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与metE区序列(4013277-4013376)同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于卡那霉素抗性盒扩增的区(大写)(Datsenko&Wanner,2000中的参考序列)。
metE-Km-R(SEQ ID NO 17)
gcagaagatggctggcagcgtatgctggaatggtttaagcagtatggtgggaagaagtcgctgtaaGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGACATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与metE区序列(4013377-4013442)同源的区(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用于T7te转录终止子序列的区(大写粗体)(Harrington等,2001)，
-用于卡那霉素抗性盒扩增的区(大写)(Datsenko&Wanner,2000中的参考序列)。
选择卡那霉素抗性重组体并使用寡核苷酸metE-F和metE-R(下文描述)通过PCR验证metE基因下游Km盒的存在。经验证和选择的菌株称为MG1655metA*11pKD46metE::Km。
metE-F(SEQ ID NO 18)
cgtttgggactggatgtgctgg
与metE区序列(4012495-4012516)同源(小写)(参考网站http:// www.ecogene.org/的序列)，
metE-R(SEQ ID NO 19)
gcgtggtacggcaaactgac
与metE区序列(4013672-4013691)同源(小写)(网站http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
然后根据方案2，将metE::Km染色体修饰转导至菌株3中。
选择卡那霉素抗性重组体并使用寡核苷酸metE-F和metE-R(上文描述)通过PCR验证metE基因下游Km盒的存在。通过DNA测序验证具有野生型序列的metE基因的存在。
将所得的菌株MG1655metA*11metE::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAM Ptrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07命名为菌株6。
2.菌株7的构建
将质粒pCL1920-PgapA-pycre-TT07(描述于专利申请PCT/FR2010/052937中)和质粒pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca(上文描述)引入菌株6，给出菌株MG1655metA*11metE::Km Ptrc01*2/RBS08*1-metH Ptrc01-cysPUWAMPtrc01-cysJIH Ptrc01/RBS01-gcvTHP Ptrc01/ARN01/RBS01-metF Ptrc94-serBΔmetJΔpykFΔpykAΔpurUΔyncAΔmalS::RN/PRM-CI857-TTadcca-PR01/RBS01*4-thrA*1-cysEΔpgaABCD::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::RN/PR01/RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::RN/serA-serCΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07(pCL1920-PgapA-pycre-TT07)(pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)，命名为菌株7。
对菌株6钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶(MS,MetE)的活性的测量证实了Met蛋白质是有功能的。
实施例4：在生物反应器中通过发酵生产L-甲硫氨酸
随后在0.5L发酵罐(GX,GPC)的生产条件下使用补料分批策略测试生产大量甲硫氨酸的菌株。
简要地，使用具有2.5g.L-1葡萄糖的10mL LB培养基中生长的24小时培养物接种基础培养基中的24小时预培养(B1a)。这些温育在含有40mL基础培养基(B1a)的500mL带挡板的烧瓶中在摇床(200RPM)中进行。第一次预培养在30℃的温度实现，第二次在34℃的温度实现。
第三个预培养步骤在生物反应器(Sixfors)中实施，其填充了用5mL浓缩的预培养物接种至生物量浓度为1.2g.L-1的200mL基础培养基(B1b)。预培养温度恒定维持在34℃且使用10％NH4OH溶液将pH自动调整至6.8的值。使用空气供给和/或搅拌将溶解氧浓度连续调整至空气分压饱和度(partial air pressure saturation)的30％的值。在来自批式培养基的葡萄糖耗尽后，以0.7mL.h-1的初始流量开始补料分批培养，并以0.13h-1的生长率指数增长24小时以获得约20g.L-1的细胞终浓度。
表4：预培养批式矿物质培养基组成(B1a和B1b)
表5：预培养补料分批矿物质培养基组成(F1)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.H2O 0.0104
CuCl2.2H2O 0.0012
MnCl2.4H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
柠檬酸Fe(III)H2O 0.0424
EDTA 0.0067
MgSO4 5.00
(NH4)2SO4 8.30
Na2SO4 8.90
(NH4)2S2O3 24.80
硫胺素 0.01
葡萄糖 500.00
维生素B12 0.01
NH4OH 28％ 调整pH至6.8
表6：培养批次矿物质培养基组成(B2)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0130
CuCl2.2H2O 0.0015
MnCl2.4H2O 0.0150
CoCl2.6H2O 0.0025
H3BO3 0.0030
Na2MoO4.2H2O 0.0025
柠檬酸Fe(III)H2O 0.1064
EDTA 0.0084
MgSO4.7H2O 1.00
CaCl2.2H2O 0.08
柠檬酸 1.70
KH2PO4 2.97
K2HPO4.3H2O 1.65
(NH4)2HPO4 0.72
(NH4)2S2O3 3.74
硫胺素 0.01
维生素B12 0.01
生物素 0.10
葡萄糖 10.00
NH4OH 28％ 调整pH至6.8
表7：培养补料分批培养基组成(F2)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0104
CuCl2.2H2O 0.0012
MnCl2.4H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
柠檬酸Fe(III)H2O 0.0524
EDTA 0.0067
MgSO4 5.00
(NH4)2S2O3 55.50
硫胺素 0.01
维生素B12 0.01
生物素 0.10
葡萄糖 500.00
随后，用220mL基础培养基(B2)填充GX0.5L发酵罐(GPC)，并以20至30mL的预培养体积接种至2.1g.L-1生物量浓度。
培养温度恒定维持在37℃且通过自动加入NH4OH溶液(NH4OH 10％)将pH维持至工作值(6.8)。初始搅拌率在批式期过程中设置为200RPM并在补料分批期过程中增加至1000RPM。初始空气流量在批式期过程中设置为0.3L.min-1并在补料分批期开始时增加至0.7L.min-1。通过增加搅拌将溶解氧浓度维持在20-40％，优选30％饱和度的值。
当细胞团达到接近5g.L-1的浓度时，补料分批以1.9mL.h-1的初始流量开始。补料溶液以具有在26小时后达到8.8mL.h-1的渐增流量的S形概貌(sigmoid profile)注入。精确的补料条件由方程计算：
其中Q(t)是以mL.h-1表示的补料流量，对于600mL的批式体积，p1＝0.66、p2＝8.21、p3＝0.27、p4＝6.50。
在26小时的补料分批后，停止补料溶液泵并在葡萄糖完全耗尽后完成培养。
细胞外的氨基酸在OPA/Fmoc衍生后通过HPLC定量并使用具有折射检测的HPLC以及GC-MS在硅烷化后分析其他相关代谢物。
表8：不同菌株在补料分批培养中产生的以％每克葡萄糖的甲硫氨酸g表示的最终甲硫氨酸得率(Ymet最终)。对于甲硫氨酸/葡萄糖得率的定义参见下文。每个菌株评估一次。
菌株 Ymet最终
菌株5 0.225
菌株7 0.186
由以上表8中可以看出，甲硫苷酸生产的得率在metE基因突变后显著增加。包含突变的metE基因的菌株5与含有具有功能的MetE蛋白质的菌株7相比具有4点更高的得率。
发酵罐的体积通过将反应器的初始体积加上为调节pH和补料培养所加入的溶液的量并减去用于采样以及蒸发损失的体积来计算。
补料分批的体积通过称量补料持续追踪。注入的葡萄糖的量基于注入的重量、溶液的密度(density)以及通过Brix方法确定的葡萄糖浓度([葡萄糖])来计算。甲硫氨酸得率表示如下：
每个菌株在培养过程中获得的最终得率在此展示。
甲硫氨酸0和甲硫氨酸t分别为初始和最终甲硫氨酸的浓度，且V0和Vt分别为初始和最终的体积。
消耗的葡萄糖计算如下：
注入的葡萄糖t＝补料体积t*[葡萄糖]
消耗的葡萄糖t＝[葡萄糖]0*V0+注入的葡萄糖-[葡萄糖]残余*Vt，[葡萄糖]0、[葡萄糖]、[葡萄糖]残余分别为初始、补料和残余葡萄糖浓度。
实施例5：钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶(MetE)活性的测量
对于钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶(MS,MetE)活性的体外测定，如上面实施例3中所述在基础培养基中分别培养携带野生型或突变的metE基因的大肠杆菌菌株7和5并在log期的结束时通过离心收获。将沉淀(pellet)重悬于含有蛋白酶抑制剂与EDTA的混合物的冷的20mM磷酸钾缓冲液pH7.2中。然后，用Precellys系统(Bertin Technologies；在6500rpm,2x10s)通过珠磨破碎细胞，然后在4℃以12000g离心30分钟。将上清脱盐并用于酶分析。使用Bradford测定法试剂(Bradford,1976)确定蛋白质浓度。
为确定MS活性，将40μg粗细胞提取物在37℃与1mM D,L-高半胱氨酸和100mM磷酸钾缓冲液pH7.2中的0.25mM甲基-四氢蝶酰-三谷氨酸、5mM MgSO4温育15分钟。通过钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶生产的甲硫氨酸在用叔丁基二甲基硅三氟乙酰胺(TBDMSTFA)衍生后通过GC-MS定量。包括天门冬氨酸和正亮氨酸(norleucine)作为内部标准。
钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶活性的结果在下面的表9中展示。
表9：携带野生型或突变酶的大肠杆菌菌株的钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶活性(以mUI/mg蛋白质表示)。每个菌株评估一次。
菌株 MS(mUI/mg蛋白质)
菌株5 0
菌株7 12.7
由表9中可见，菌株5(ΔmetE)完全失去了其MS活性而菌株7则保持了显著的活性。该活性的丧失与甲硫氨酸生产的显著改进相关。
实施例6：METE基因的缺失对L-甲硫氨酸生产的作用
为评估metE基因的完全缺失对L-甲硫氨酸生产的作用，我们缺失了菌株5中突变的metE基因。我们使用如先前描述的同源重组并使用Datsenko&Wanner(2000)提供的策略在该菌种中引入了metE基因的完全缺失。
用卡那霉素盒替代突变的metE基因后，选择卡那霉素抗性重组体并通过DNA测序验证。
它们中之一如实施例4所述培养并通过HPLC定量生产的L-甲硫氨酸。
与具有有功能MetE蛋白质的菌株7相比，具有完全缺失的metE的菌株生产更多甲硫氨酸：metE的缺失导致甲硫氨酸得率增加大于15％。
参考文献
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Claims (16)

1.一种经优化用于发酵生产甲硫氨酸的重组微生物，其中该重组微生物与野生型微生物相比，钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶MetE的活性在所述重组微生物中被抑制且metH基因在所述重组微生物中过表达。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述钴胺素非依赖的甲硫氨酸合酶MetE由metE基因编码，所述metE基因的至少一部分缺失。
3.权利要求2的重组微生物，其中所述metE基因的缺失是对应SEQ ID NO:20的第417至第429位的碱基的缺失。
4.权利要求1至3中任一项的重组微生物，其中至少一个下列基因的表达增加：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、thrA、编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因，即metA*，或编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因，即thrA*。
5.权利要求4的重组微生物，其中至少一个基因在诱导型启动子的调控下。
6.权利要求5的重组微生物，其中至少一个基因在受温度诱导的启动子的调控下。
7.权利要求1至6中任一项的重组微生物，其中至少一个下列基因表达减弱：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL或yncA。
8.权利要求1至6中任一项的重组微生物，其中：
基因metE的表达减弱，和
编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA等位基因，即metA*的表达增强。
9.权利要求8的重组微生物，其中：
编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA等位基因，即thrA*的表达增强；和
基因cysE的表达增强。
10.权利要求9的重组微生物，其中：
基因metF的表达增强。
11.权利要求1至6中任一项的重组微生物，其中：
a.所述metE基因缺失
b.基因metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc的表达增强；和
c.基因metJ、pykA、pykF、purU和yncA表达减弱。
12.权利要求1至11中任一项的重组微生物，其中所述微生物来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)细菌。
13.权利要求12的重组微生物，其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。
14.一种用于发酵生产甲硫氨酸的方法，其包括如下步骤：
a.在包含可发酵碳源和硫源的适当培养基中培养根据权利要求1至13中任一项的重组微生物，及
b.从所述培养基中回收甲硫氨酸。
15.权利要求14的方法，其中所述重组微生物在所述培养基中的生长对于一种或几种无机底物受到限制或缺陷。
16.权利要求15的方法，其中所述培养基中的所述无机底物是磷和/或钾。
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