KR102147776B1

KR102147776B1 - L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 라이신의 생산 방법

Info

Publication number: KR102147776B1
Application number: KR1020190115821A
Authority: KR
Inventors: 유미; 이한진; 박준석; 박창병; 김일권
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2020-08-26

Abstract

본 발명은 ptsG 변이 유전자를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것이며, 상기 균주는 포도당 특이적 인산화전이계의 ptsG의 변이를 ptsG에 도입하거나 변이 ptsG를 부가적으로 염색체에 도입한 것이다. 이에 따라 본 발명은 L-라이신 생산능력이 향상되는 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법을 제공할 수 있다.

Description

L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 라이신의 생산 방법{A microorganism of Corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method for producing L-lysine using the same}

본 발명은 L-라이신 생산능력을 갖는 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.) 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 포도당 특이적 인산화전이계의 ptsG의 변이를 ptsG에 도입하거나 변이 ptsG를 부가적으로 염색체에 도입하여 L-라이신 생산능력이 향상된 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-라이신, L-글루탐산등의 L-아미노산의 발효 생산에 이용되고 있는 그람 양성 미생물이다. L-라이신은 동물사료, 식품 첨가, 의약품 등에 사용되고 있다. L-라이신을 생산하는데 이용하는 코리네박테리움 균주의 생산성을 증진시키기 위해 UV, 화학제등을 이용한 돌연변이법과 L-아미노산 생산성에 영향을 미치는 유전자를 과발현 또는 파쇄/감쇄하는 등의 유전자 재조합 기술이 이용되어 왔다.(Becker J 등, Synthetic Biology - Metabolic Engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, vol 162. Springer, Cham).

최근에는 적응 실험 진화법(Adaptive Lab Evolution)을 이용하여 특정 특성을 가지는 변이를 유도하여 원하는 환경에서 생육이 향상되거나 생산성을 증진 시키는 연구가 시도되어 왔다. 예로서, 셀로바이오스 또는 자일로스를 이용하진 못하는 코리네박테리움 속 균주에 이들 탄소원을 이용할 수 있는 유전자를 도입한 후 적응 실험 진화법을 이용하여 그 이용성을 현저히 개선하고 이들 탄소원을 효율적으로 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법(Jungseok Lee 등, Microb Cell Fact. 15:20(2016) 등이 보고되고 있다. 한편, 코리네박테리움 속 균주는 탄소원으로 자당(sucrose), 포도당(glucose), 과당(fructose)을 모두 사용할 수 있다. 그 중, 자당은 당인산기전이효소체계(phosphotransferase system, PTS)에 의해 인산화되어 세포안으로 들어오고, 인산화 자당은 바로 인산화 자당 분해효소(phsophosucrose hydrolase)에 의해 6-인산화 포도당과 과당으로 분해된다. 6-인산화 포도당은 바로 해당과정(glcolysis) 또는 오탄당인산화 경로로 들어가고, 과당은 세포 밖으로 나간 과당 특이적 PTS에 의해 다시 들어오면서 1-인산화 과당이 되어 해당과정으로 들어간다. 자당 또는 과당을 탄소원으로 하여 L-라이신을 발효할 경우 1-인산화 과당이 오탄당 인산화 경로보다는 해당계로 바로 유입되어 L-라이신에 필요한 환원력을 충분히 공급하지 못하기 때문에 포도당을 탄소원으로 할 경우에 비해 생산성이 떨어지는 원인이 된다. 이의 해결을 위해 공개특허공보 제10-2006-0125804호에 기술된대로 1.6-인산화 과당의 탈인산화를 통해 6-인산화 과당으로의 전환에 관여하는 1,6-인산화과당 탈인산화 효소(Fructose-1,6-bisphosphatase)를 과발현 하거나 등록특허공보 제10-0564805호에 기재된대로 외래의 과당 인산화 효소(fructokinase)를 과발현 시켜 과당의 6-인산화 과당의 생성을 촉진시키고 인산화포도당 이성화 효소(phophoglucose isomerase)에 의해 6-인산화 포도당으로 전환시켜 이를 통해 오탄당 인산화 경로로의 탄소 흐름을 증가시켜 라이신에 필요한 환원력 공급을 증가시키므로서 생산성을 향상 시키는 방법 등이 알려져 있다.

그러나, 코리네박테리움속 균주에서 과당이 다른 당 특이적 인산화전이계를 통해서도 적은 비율로 과당을 흡수할 수 있다는 보고(Patrick Kiefer 등, Appl Environ Microbiol. 70(1): 229-239(2004))는 있으나 이를 자당 또는 과당을 이용한 L-라이신 생산에는 이용하였다는 예는 공지되어 있지 않다.

이에 본 발명자들은 과당 특이적 인산화전이계를 불활성화한 코리네박테리움 균주에 과당을 탄소원으로 하는 최소 배지에서 과당 소모속도가 현저히 증가한 자연 돌연변이주를 개발하고자 하였다.

등록특허공보 제10-0564805호 공개특허공보 제10-2006-0125804호

Becker J 등, Synthetic Biology-Metabolic Engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, vol 162. Springer, Cham. Jungseok Lee 등, Microb Cell Fact. 15:20, 2016. Patrick Kiefer 등, Appl Environ Microbiol. 70(1): 229-239, 2004.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 L-라이신 생산능력이 향상된 ptsG 변이 유전자를 제공하고자 한다.

또한, 상기 ptsG 변이 유전자가 삽입된 균주를 제공하고자 한다.

또한, 상기 균주를 이용한 L-라이신의 제조 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 3의 서열을 갖는 L-라이신 생산능력이 향상된 ptsG 변이 유전자를 제공한다.

또한, 상기 ptsG 변이 유전자가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 제공한다.

또한, 상기 균주를 이용한 L-라이신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 균주는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 아쓰로박터 속(Arthrobacter sp.) 및 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.)의 미생물을 포함할 수 있다.

코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 일 수 있다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주는 ptsG 변이 유전자를 포함하는 균주이다.

상기 ptsG 변이 유전자는 서열번호 1의 야생형 ptsG 유전자의 429번째 아미노산인 페닐알라닌이 치환된 것이다.

상기 치환되는 아미노산은 제한되지 않지만 바람직하게는 시스테인으로 치환된 것(서열번호 3)일 수 있다.

상기 치환된 ptsG 변이 유전자에 의해 균주 내에서 당유입이 강화되어 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주보다 L-라이신 생산능력이 향상될 수 있다.

상기 변이 유전자를 균주에 삽입하기 위해 사용되는 "벡터" 또는 “플라스미드 벡터”는, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제조물을 뜻한다.

본 발명의 "재조합 벡터"는 코리네형 세균 뿐만 아니라, 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이 때, 상기 "적합한 숙주세포"는 벡터가 복제 가능한 것으로서, 복제가 개시되는 특정 핵산서열인 복제 원점을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 "재조합 벡터"는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 "선택 마커"는 벡터로 형질전환된 형질전환체(숙주세포)를 선별하기 위한 것으로서, 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환된 세포의 선별이 가능하다.

상기 ptsG 변이 유전자가 추가로 포함되면, L-라이신 생산능력이 더욱 향상될 수 있다. 따라서 상기 균주는 ptsG 변이 유전자를 1 copy 이상 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법을 제공한다;

(a) ptsG 변이 유전자가 1 copy이상 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 배양물에서 L-라이신을 회수하는 단계.

상기 배지의 배양 조건은, 적절한 배지에서 약 25℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 성장시킨다. 본 발명에서 적합한 성장 배지는 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 액체 배지, 사부로 덱스트로스(Sabouraud Dextrose, SD) 액체 배지 또는 효모 배지(Yeast Medium, YM) 액체 배지와 같이 일반적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다.

배양에 적합한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0이며, 여기서 pH 6.0 내지 pH 8.0이 초기 조건에 바람직하다. 배양 배지의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다.

상기 균주의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 상기 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fedbatch culture)이 포함되며, 바람직하게는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지, 배양물로부터 L-라이신을 분리해낼 수 있다. L-라이신 회수 방법의 예로서, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등의 방법이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 균주는 포도당 특이적 인산화전이계의 ptsG의 변이를 ptsG에 도입하거나 변이 ptsG를 부가적으로 염색체에 도입하여 L-라이신 생산능력이 향상되는 균주를 제공할 수 있다. 또한, 상기 균주를 이용한 L-라이신 생산방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 L-라이신을 생산하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1의 플라스미드 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 6의 플라스미드 벡터를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 벡터의 제작

균주에 과당을 직접 이용하기 위하여 프록토키나아제(fructokinase)를 도입하였다. 상기 실험에 이용한 프록토키나아제는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래이며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum)과 코돈 출현빈도(codon usage)를 맞춰서 합성을 진행하여 사용하였다. 프록토키나아제의 염기서열은 서열번호 5에 나타내었다.

재조합 벡터의 삽입을 위해 pfkB 유전자(Fructose-1-phosphate kinase)를 이용하였으며, 재조합 벡터의 삽입 위치는 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 상에서 pfkB 유전자 한 가운데를 중심으로 좌측암 500 bp 부분과 우측암 500 bp 부분과 프로모터1, 그리고 프록토키나아제 염기서열을 PCR로 증폭하여, 오버랩 PCR(overlap PCR) 방법으로 연결한 후 재조합 벡터인 pCGI(문헌[Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130] 참조)에 클로닝하여 플라스미드 벡터를 제조하였다. 상기 플라스미드 벡터를 pCGI(scrK)라고 명명하고, 도 2에 나타내었다. 프로모터1의 염기서열은 서열번호 6에 나타내었다, 상기 재조합 벡터를 제작하기 위하여 각각의 유전자 단편을 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다.

프라이머			서열번호
pfkB 좌측상동암 단편 증폭 프라이머	정방향	5’ - gaggttgatgcgattcaat - 3’	8
pfkB 좌측상동암 단편 증폭 프라이머	역방향	5’ - gttgatcacaacagtttcca - 3’	9
pfkB 우측상동암 단편 증폭 프라이머	정방향	5’ - tggcgggtattttcatc - 3’	10
pfkB 우측상동암 단편 증폭 프라이머	역방향	5’ - gttcttgtaatcctccaaaa - 3’	11
프로모터1 증폭 프라이머	정방향	5’ - atgaacaacgtactgtgcat - 3’	12
프로모터1 증폭 프라이머	역방향	5’ - atcgccctcaacctca - 3’	13
프록토키나아제 증폭 프라이머	정방향	5’ - aagaacgtccgcacca - 3’	14
프록토키나아제 증폭 프라이머	역방향	5’ - ccttctgcgttgaccaa - 3’	15

표 1의 프라이머를 이용하여 아래의 조건 하에 PCR을 수행하였다. Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc.,일본)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오타이드 1pM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA 10ng을 템플레이트로 이용하여, pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(솔젠트 사) 1 유닛의 존재 하에 25 내지 30주기 수행하였다.

PCR은 (i) 변성(denaturation) 단계 : 94℃에서 30 초, (ii) 결합(annealing) 단계 : 58 ℃에서 30 초, 및 (iii) 확장(extension) 단계 : 72℃에서 1 내지 2분(1 kb당 2분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.

이와 같이 제조된 유전자단편을 self-assembly cloning을 이용하여, pCGI 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 제조하였다.

<실시예 2> 변이 균주의 제조

상기 실시예 1의 재조합 벡터를 대장균(E.coli) DH5a에 형질 전환시키고, 50㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 재조합에 사용하였다.

상기 방법에서 공통적으로 진행된 과정으로서, 해당 유전자들의 증폭은 코리네박테리움 글루타미쿰(C.glutamicum) ATCC 13032 genomic DNA로부터 PCR 방법으로 증폭하여 전략에 따라 self-assembled cloning 방법으로 pCGI 벡터에 삽입하여 E. coli DH5a에서 선별하였다. 염색체의 유전자 염기 치환(Chromosomal base substitution)은 각각 단편의 유전자를 개별 증폭하여 오버랩 PCR로 목적 DNA 단편을 제조하였다. 유전자 조작 시 PCR 증폭 효소로는 Ex Taq 중합효소(Takara), Pfu 중합효소(Solgent)를 이용하였고, 각종 제한효소 및 DNA modifying 효소는 NEB 제품을 사용하였으며, 공급된 버퍼 및 프로토콜에 따라 사용하였다.

상기 pCGI(scrK) 플라스미드 벡터를 이용하여 변이 균주를 제조하였다. 상기 플라스미드 벡터의 최종 농도가 1㎍/㎕ 이상 되도록 준비하여 코리네박테리움 글루타미쿰 K070 균주(기탁번호 : KTCC13032)에 전기천공법(문헌[Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347] 참조)을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때, 전기 천공한 균주를 카나마이신이 20㎍/㎕ 포함되는 LB-한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리한 후 게놈상의 유도한 위치에 적절히 삽입되었는지 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 분리된 균주를 다시 2차 재조합을 유도하기 위하여 스트렙토마이신(streptomycine)을 함유한 LB-한천 액체배지에 접종하고, 하룻밤 이상 배양하여 동일 농도의 스트렙토마이신(streptomycine)를 함유한 한천배지에 도말하여 콜로니를 분리하였다. 최종 분리한 콜로니 중에서 카나마이신에 대한 내성 여부를 확인한 후, 항생제 내성이 없는 균주들 중 프록토키나아제가 삽입되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다(문헌[Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73]참조).

<실시예 3> 적응진화를 통한 변이 유도

위 실험으로 선별된 균주를 적응진화(adaptive elvolution)를 유도하여 과당(fructose)의 사용이 증가된 균주를 선별하였다. 위 실험에는 CGXⅡ 최소배지를 사용하였으며, 당원으로는 과당을 이용하였다. 배지조성은 표 2에 나타내었다.

성분	농도	생산배지 첨가량
(NH₄)₂SO₄	2 %	20g/L
Urea	0.5 %	5g/L
KH₂PO₄	0.1 %	1g/L
K₂HPO₄	0.1 %	1g/L
MgSO₄ x 7H₂O	0.025 %	0.25g/L
MOPS	4.2 %	42g/L
CaCl₂	1 ppm	1mg/L
FeSO4 x 7H2O	1 ppm	1mg/L
MnSO4 x H2O	1 ppm	1mg/L
ZnSO4 x 7H2O	0.1 ppm	0.1mg/L
CuSO4	0.02 ppm	0.02mg/L
NiCl2 x 6H2O	0.002 ppm	0.002mg/L

포함되어 있는 20ml CGXⅡ 최소배지에 균주를 접종하여 30℃ 배양한 뒤, OD₆₁₀값(파장이 610nm인 분광광도계 사용)이 1.0이상이 될 때까지 배양하였다. 그리고 배양액을 새로운 최소배지에 1% 접종한 뒤, 같은 방법으로 연속배양을 진행하였다. 14번째 연속 배양액을 스트렙토마이신이 포함되어 있는 LB-한천 플레이트에서 single isolation을 하여 단일 콜로니를 선별하였다.

<실시예 4> NGS(Next Generation Sequencing)를 통한 돌연변이 확인

실시예 3에서 선별된 변이주 2종의 돌연변이주를 차세대 염기서열 분석(NGS; Next Generation Sequencing)을 통해 돌연변이의 원인을 확인하였다. 그 결과 변이균주 1에서 ptsG의 429번째 아미노산인 F(페닐알라닌)가 C(시스테인)로 치환되었음이 확인되었다.

	변이 전 균주	변이 균주 1
ptsG 변이 여부	-	F429C

<실시예 5> ptsG에 돌연변이 도입 및 변이 균주의 L-라이신 생성량 확인

상기 실시예 4의 결과를 바탕으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 에 당유입 경로의 ptsG에 돌연변이를 도입하여 L-라이신 생산능력을 향상시키고자 하였다.

ptsG 유전자의 429번째 아미노산이 페닐알라닌(TTC)에서 시스테인(TGC)으로 point mutation된 변이 균주의 플라스크에서 향상된 L-라이신 생성량은 하기 표 4에 나타내었다.

균주	OD610	L-라이신(g/L)	단위 균체당 L-라이신(g/gDCW)
변이 전 균주	28.7	64.2	7.4
변이 균주 1	27.9	65.0	7.7

<실시예 6> ptsG 변이 유전자의 추가 삽입을 위한 재조합 벡터의 제작

F429C 변이가 포함되어 있는 ptsG 유전자의 copy를 추가하기 위해 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터의 삽입위치로는 Hypothetical protein인 NCgl1742를 이용하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 상에서 NCgl1742 유전자 한 가운데를 중심으로 좌측암 900 bp 부분과 우측암 900 bp 부분과 프로모터2, 그리고 F429C 변이가 포함되어 있는 ptsG 유전자 염기서열을 PCR로 증폭하여, 오버랩 PCR(overlap PCR) 방법으로 연결한 후 재조합 벡터인 pCGI(문헌[Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130] 참조)에 클로닝하여 플라스미드 벡터를 제작하였다. 상기 플라스미드 벡터를 pCGI(ptsG)라고 명명하고, 도 3에 나타내었다. 프로모터2의 염기서열은 서열번호 7에 나타내었다. 상기 플라스미드 벡터를 제작하기 위하여 각각의 유전자 단편을 하기 표 5의 프라이머를 사용하였다.

프라이머			서열번호
NCgl1742 좌측상동암 단편 증폭 프라이머	정방향	atgagtacatcgaaaacagagaaaa	16
NCgl1742 좌측상동암 단편 증폭 프라이머	역방향	aaacgtattcgcctgaagca	17
NCgl1742 우측상동암 단편 증폭 프라이머	정방향	tttattaatgaagaacctgttgtgtt	18
NCgl1742 우측상동암 단편 증폭 프라이머	역방향	tcatttttcaatctcttcttttagg	19
프로모터2 증폭 프라이머	정방향	tggccgttaccctgcg	20
프로모터2 증폭 프라이머	역방향	tgtatgtcctcctggacttcg	21
ptsG(F429C) 증폭 프라이머	정방향	atggcgtccaaactgacg	22
ptsG(F429C) 증폭 프라이머	역방향	ttactcgttcttgccgttga	23

상기 표 5의 프라이머를 이용하여 아래의 조건 하에 PCR을 수행하였다.

Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc.,일본)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오타이드 1 pM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA 10 ng을 템플레이트로 이용하여, pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(솔젠트 사) 1 유닛의 존재 하에 25 내지 30주기 수행하였다.

PCR은 (i) 변성(denaturation) 단계 : 94℃에서 30초, (ii) 결합(annealing) 단계 : 58℃에서 30초, 및 (iii) 확장(extension) 단계 : 72℃에서 1 내지 2분(1 kb당 2분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.

이와 같이 제조된 유전자단편을 self-assembly cloning을 이용하여, pCGI 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터를 대장균(E.coli) DH5a에 형질 전환시키고, 50㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 재조합에 사용하였다.

<실시예 7> ptsG 변이 유전자가 추가적으로 도입된 변이 균주의 제조

상기 pCGI(ptsG 벡터를 이용하여 변이 균주를 제조하였다. 상기 벡터의 최종 농도가 1㎍/㎕ 이상 되도록 준비하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(기탁번호: KTCC13032)에 전기천공법(문헌[Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347] 참조)을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때, 전기 천공한 균주를 카나마이신이 20㎍/㎕ 포함되는 LB-한천 플레이트에 도말하여 콜로니를 분리한 후 게놈상의 유도한 위치에 적절히 삽입되었는지 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 분리된 균주를 다시 2차 재조합을 유도하기 위하여 스트렙토마이신(streptomycine)을 함유한 LB-한천 액체배지에 접종하고, 하룻밤 이상 배양하여 동일 농도의 스트렙토마이신(streptomycin)를 함유한 한천배지에 도말하여 콜로니를 분리하였다. 최종 분리한 콜로니 중에서 카나마이신에 대한 내성 여부를 확인한 후, 항생제 내성이 없는 균주들 중 프록토키나아제가 삽입되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다(문헌[Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73]참조).

<실험예> 변이 균주의 L-라이신 생성량 평가

본 발명에 따른 변이 균주의 L-라이신 생산능력의 향상에 효과가 있는지 확인하고자 L-라이신 생성량을 평가하였다.

ptsG 유전자의 429번째 아미노산이 페닐알라닌(TTC)에서 시스테인(TGC)으로 point mutation된 유전자를 1 copy 추가하여 만든 변이 균주 2의 플라스크에서 향상된 L-라이신 생성을 확인하였다.

균주	OD610	L-라이신(g/L)	단위 균체당 L-라이신(g/gDCW)
변이 전 균주	39.4	63.5	5.3
변이균주 1	37.3	63.9	5.7
변이균주 2	24.8	64.4	8.6

그 결과, 변이 균주 1은 변이 전 균주보다 L-라이신(g/L) 생성량은 약 1%, 단위 균체당 L-라이신(g/gDCW) 생성량은 7.5%이상, 변이 균주 2는 변이 전 균주보다 L-라이신(g/L) 생성량은 약 1.4%, 단위 균체당 L-라이신(g/gDCW) 생성량은 60%이상 증가한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 변이 균주는 변이 전 균주보다 L-라이신 생산량이 증가됨을 알 수 있다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> A microorganism of Corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method for producing L-lysine using the same <130> 19-11267 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 683 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of wild-ptsG <400> 1 Met Ala Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Asp Asn Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu 20 25 30 Arg Phe Gln Val Lys Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp 35 40 45 Ser Asp Pro Ser Val Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met 50 55 60 Gln Val Val Met Gly Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asp Gly Met Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser 85 90 95 Ser Ser Lys Lys Glu Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile 100 105 110 Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp 130 135 140 Thr Phe Gly Leu Gln Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp 145 150 155 160 Thr Tyr Val Phe Leu His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu 165 170 175 Pro Ile Met Val Gly Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu 180 185 190 Trp Ile Gly Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu 195 200 205 Ala Leu Gly Ser Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met 210 215 220 Val Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala 225 230 235 240 Ile Gly Leu Tyr Trp Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu 245 250 255 Ala Val Gln Met Val Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile 260 265 270 Pro Ala Thr Ala Phe Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn 275 280 285 Gly Ile Ser Asn Leu Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile 290 295 300 Leu Ser Ile Val Ile Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly 305 310 315 320 Leu His Trp Pro Leu Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu 325 330 335 Gly Tyr Asp Phe Ile Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys 340 345 350 Phe Gly Leu Val Thr Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn 355 360 365 Lys Ala Met Arg Gln Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu 370 375 380 Gly Gly Ile Ser Glu Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys 385 390 395 400 Lys Thr Tyr Phe Arg Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Gly Gly Ile Val 405 410 415 Met Gly Ile Phe Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Phe Val Phe Thr Ser Leu 420 425 430 Leu Thr Ile Pro Ala Met Asp Pro Trp Leu Gly Tyr Thr Ile Gly Ile 435 440 445 Ala Val Ala Phe Phe Val Ser Met Phe Leu Val Leu Ala Leu Asp Tyr 450 455 460 Arg Ser Asn Glu Glu Arg Asp Glu Ala Arg Ala Lys Val Ala Ala Asp 465 470 475 480 Lys Gln Ala Glu Glu Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asn Ala Thr Pro Ala 485 490 495 Ala Pro Val Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 500 505 510 Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Val Ala Ala Lys Pro Lys Leu Ala Ala 515 520 525 Gly Glu Val Val Asp Ile Val Ser Pro Leu Glu Gly Lys Ala Ile Pro 530 535 540 Leu Ser Glu Val Pro Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro 545 550 555 560 Gly Ile Ala Ile Gln Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp 565 570 575 Ala Thr Val Ile Leu Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg 580 585 590 Leu Asp Ser Gly Val Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val 595 600 605 Gln Leu Gly Gly Glu Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln 610 615 620 Val Lys Ala Gly Asp Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg 625 630 635 640 Ser Lys Asp Leu Pro Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala 645 650 655 Lys Phe Gly Glu Ile Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser 660 665 670 Thr Thr Val Ile Lys Val Asn Gly Lys Asn Glu 675 680 <210> 2 <211> 2052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-ptsG <400> 2 atggcgtcca aactgacgac gacatcgcaa catattctgg aaaaccttgg tggaccagac 60 aatattactt cgatgactca ctgtgcgact cgccttcgct tccaagtgaa ggatcaatcc 120 attgttgatc aacaagaaat tgactccgac ccatcagttc ttggcgtagt accccaagga 180 tccaccggta tgcaggtggt gatgggtgga tctgttgcaa actattacca agaaatcctc 240 aaacttgatg gaatgaagca cttcgccgac ggtgaagcta cagagagttc atccaagaag 300 gaatacggcg gagtccgtgg caagtactcg tggattgact acgccttcga gttcttgtct 360 gatactttcc gaccaatcct gtgggccctg cttggtgcct cactgattat taccttgttg 420 gttcttgcgg atactttcgg tttgcaagac ttccgcgctc caatggatga gcagcctgat 480 acttatgtat tcctgcactc catgtggcgc tcggtcttct acttcctgcc aattatggtt 540 ggtgccaccg cagctcgaaa gctcggcgca aacgagtgga ttggtgcagc tattccagcc 600 gcacttctta ctccagaatt cttggcactg ggttctgccg gcgataccgt cacagtcttt 660 ggcctgccaa tggttctgaa tgactactcc ggacaggtat tcccaccgct gattgcagca 720 attggtctgt actgggtgga aaagggactg aagaagatca tccctgaagc agtccaaatg 780 gtgttcgtcc cattcttctc cctgctgatt atgatcccag cgaccgcatt cctgcttgga 840 cctttcggca tcggtgttgg taacggaatt tccaacctgc ttgaagcgat taacaacttc 900 agcccattta ttctttccat cgttatccca ttgctctacc cattcttggt tccacttgga 960 ttgcactggc cactaaacgc catcatgatc cagaacatca acaccctggg ttacgacttc 1020 attcagggac caatgggtgc ctggaacttc gcctgcttcg gcctggtcac cggcgtgttc 1080 ttgctctcca ttaaggaacg aaacaaggcc atgcgtcagg tttccctggg tggcatgttg 1140 gctggtttgc tcggcggcat ttccgagcct tccctctacg gtgttctgct ccgattcaag 1200 aagacctact tccgcctcct gccgggttgt ttggcaggcg gtatcgtgat gggcatcttc 1260 gacatcaagg cgtacgcttt cgtgttcacc tccttgctta ccatcccagc aatggaccca 1320 tggttgggct acaccattgg tatcgcagtt gcattcttcg tttccatgtt ccttgttctc 1380 gcactggact accgttccaa cgaagagcgc gatgaggcac gtgcaaaggt tgctgctgac 1440 aagcaggcag aagaagatct gaaggcagaa gctaatgcaa ctcctgcagc tccagtagct 1500 gctgcaggtg cgggagccgg tgcaggtgca ggagccgctg ctggcgctgc aaccgccgtg 1560 gcagctaagc cgaagctggc cgctggggaa gtagtggaca ttgtttcccc actcgaaggc 1620 aaggcaattc cactttctga agtacctgac ccaatctttg cagcaggcaa gcttggacca 1680 ggcattgcaa tccaaccaac tggaaacacc gttgttgctc cagcagacgc tactgtcatc 1740 cttgtccaga aatctggaca cgcagtggca ttgcgcttag atagcggagt tgaaatcctt 1800 gtccacgttg gattggacac cgtgcaattg ggcggcgaag gcttcaccgt tcacgttgag 1860 cgcaggcagc aagtcaaggc gggggatcca ctgatcactt ttgacgctga cttcattcga 1920 tccaaggatc tacctttgat caccccagtt gtggtgtcta acgccgcgaa attcggtgaa 1980 attgaaggta ttcctgcaga tcaggcaaat tcttccacga ctgtgatcaa ggtcaacggc 2040 aagaacgagt aa 2052 <210> 3 <211> 683 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of substituted-ptsG <400> 3 Met Ala Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Asp Asn Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu 20 25 30 Arg Phe Gln Val Lys Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp 35 40 45 Ser Asp Pro Ser Val Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met 50 55 60 Gln Val Val Met Gly Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asp Gly Met Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser 85 90 95 Ser Ser Lys Lys Glu Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile 100 105 110 Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp 130 135 140 Thr Phe Gly Leu Gln Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp 145 150 155 160 Thr Tyr Val Phe Leu His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu 165 170 175 Pro Ile Met Val Gly Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu 180 185 190 Trp Ile Gly Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu 195 200 205 Ala Leu Gly Ser Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met 210 215 220 Val Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala 225 230 235 240 Ile Gly Leu Tyr Trp Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu 245 250 255 Ala Val Gln Met Val Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile 260 265 270 Pro Ala Thr Ala Phe Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn 275 280 285 Gly Ile Ser Asn Leu Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile 290 295 300 Leu Ser Ile Val Ile Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly 305 310 315 320 Leu His Trp Pro Leu Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu 325 330 335 Gly Tyr Asp Phe Ile Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys 340 345 350 Phe Gly Leu Val Thr Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn 355 360 365 Lys Ala Met Arg Gln Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu 370 375 380 Gly Gly Ile Ser Glu Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys 385 390 395 400 Lys Thr Tyr Phe Arg Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Gly Gly Ile Val 405 410 415 Met Gly Ile Phe Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Phe Val Cys Thr Ser Leu 420 425 430 Leu Thr Ile Pro Ala Met Asp Pro Trp Leu Gly Tyr Thr Ile Gly Ile 435 440 445 Ala Val Ala Phe Phe Val Ser Met Phe Leu Val Leu Ala Leu Asp Tyr 450 455 460 Arg Ser Asn Glu Glu Arg Asp Glu Ala Arg Ala Lys Val Ala Ala Asp 465 470 475 480 Lys Gln Ala Glu Glu Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asn Ala Thr Pro Ala 485 490 495 Ala Pro Val Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 500 505 510 Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Val Ala Ala Lys Pro Lys Leu Ala Ala 515 520 525 Gly Glu Val Val Asp Ile Val Ser Pro Leu Glu Gly Lys Ala Ile Pro 530 535 540 Leu Ser Glu Val Pro Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro 545 550 555 560 Gly Ile Ala Ile Gln Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp 565 570 575 Ala Thr Val Ile Leu Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg 580 585 590 Leu Asp Ser Gly Val Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val 595 600 605 Gln Leu Gly Gly Glu Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln 610 615 620 Val Lys Ala Gly Asp Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg 625 630 635 640 Ser Lys Asp Leu Pro Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala 645 650 655 Lys Phe Gly Glu Ile Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser 660 665 670 Thr Thr Val Ile Lys Val Asn Gly Lys Asn Glu 675 680 <210> 4 <211> 2052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of substituted-ptsG <400> 4 atggcgtcca aactgacgac gacatcgcaa catattctgg aaaaccttgg tggaccagac 60 aatattactt cgatgactca ctgtgcgact cgccttcgct tccaagtgaa ggatcaatcc 120 attgttgatc aacaagaaat tgactccgac ccatcagttc ttggcgtagt accccaagga 180 tccaccggta tgcaggtggt gatgggtgga tctgttgcaa actattacca agaaatcctc 240 aaacttgatg gaatgaagca cttcgccgac ggtgaagcta cagagagttc atccaagaag 300 gaatacggcg gagtccgtgg caagtactcg tggattgact acgccttcga gttcttgtct 360 gatactttcc gaccaatcct gtgggccctg cttggtgcct cactgattat taccttgttg 420 gttcttgcgg atactttcgg tttgcaagac ttccgcgctc caatggatga gcagcctgat 480 acttatgtat tcctgcactc catgtggcgc tcggtcttct acttcctgcc aattatggtt 540 ggtgccaccg cagctcgaaa gctcggcgca aacgagtgga ttggtgcagc tattccagcc 600 gcacttctta ctccagaatt cttggcactg ggttctgccg gcgataccgt cacagtcttt 660 ggcctgccaa tggttctgaa tgactactcc ggacaggtat tcccaccgct gattgcagca 720 attggtctgt actgggtgga aaagggactg aagaagatca tccctgaagc agtccaaatg 780 gtgttcgtcc cattcttctc cctgctgatt atgatcccag cgaccgcatt cctgcttgga 840 cctttcggca tcggtgttgg taacggaatt tccaacctgc ttgaagcgat taacaacttc 900 agcccattta ttctttccat cgttatccca ttgctctacc cattcttggt tccacttgga 960 ttgcactggc cactaaacgc catcatgatc cagaacatca acaccctggg ttacgacttc 1020 attcagggac caatgggtgc ctggaacttc gcctgcttcg gcctggtcac cggcgtgttc 1080 ttgctctcca ttaaggaacg aaacaaggcc atgcgtcagg tttccctggg tggcatgttg 1140 gctggtttgc tcggcggcat ttccgagcct tccctctacg gtgttctgct ccgattcaag 1200 aagacctact tccgcctcct gccgggttgt ttggcaggcg gtatcgtgat gggcatcttc 1260 gacatcaagg cgtacgcttt cgtgtgcacc tccttgctta ccatcccagc aatggaccca 1320 tggttgggct acaccattgg tatcgcagtt gcattcttcg tttccatgtt ccttgttctc 1380 gcactggact accgttccaa cgaagagcgc gatgaggcac gtgcaaaggt tgctgctgac 1440 aagcaggcag aagaagatct gaaggcagaa gctaatgcaa ctcctgcagc tccagtagct 1500 gctgcaggtg cgggagccgg tgcaggtgca ggagccgctg ctggcgctgc aaccgccgtg 1560 gcagctaagc cgaagctggc cgctggggaa gtagtggaca ttgtttcccc actcgaaggc 1620 aaggcaattc cactttctga agtacctgac ccaatctttg cagcaggcaa gcttggacca 1680 ggcattgcaa tccaaccaac tggaaacacc gttgttgctc cagcagacgc tactgtcatc 1740 cttgtccaga aatctggaca cgcagtggca ttgcgcttag atagcggagt tgaaatcctt 1800 gtccacgttg gattggacac cgtgcaattg ggcggcgaag gcttcaccgt tcacgttgag 1860 cgcaggcagc aagtcaaggc gggggatcca ctgatcactt ttgacgctga cttcattcga 1920 tccaaggatc tacctttgat caccccagtt gtggtgtcta acgccgcgaa attcggtgaa 1980 attgaaggta ttcctgcaga tcaggcaaat tcttccacga ctgtgatcaa ggtcaacggc 2040 aagaacgagt aa 2052 <210> 5 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of fructokinase <400> 5 atgaacaacg tactgtgcat tggcgaactg ctcatcgatt tcatctgctc ggacatcgat 60 accaccctga gcaagggcga aaacttcaag aagaaggcag gcggcgctcc agccaacgtc 120 acggccgcca tctccaagct gggaggcagc gcatcctttc tgggcaaggt tggcaacgac 180 cctttcggcc acttcctgaa agagacactg gatgaagtca aggttgacac ctccatgctc 240 atcatggaca ataacagctc cactacgctg gctttcgtca gcctgcaggc aaacggcgag 300 cgcgatttcg ttttcaaccg tggcgctgac ggcctcctgc gctatgacga aattaatctg 360 gataaggtgt actccaacaa gatcatccac tttggctcgg ctaccgcact gctgggcggc 420 gagatgaccg acacctacct gaagatcatg gaggaagcca agaagcgggg catcatcatt 480 tcctttgacc cgaactaccg cgataacctg tgggaaaacc gcactgaaga attcatcgct 540 atctcgcgta agtgtatcga gctggcggat ttcgtcaagc tgtccgatga ggagctgaaa 600 atcatctccg gcgaaaagaa catcaagaac ggggtgaagc tgctggcgtc caacaacaag 660 gtgattgcag tcaccctggg caaggagggg actatgatct ccaacggcga ggaagtggag 720 atcatcgaaa gtatcaagat caaatccatc gattccaccg gcgctggcga tgcgtttgtg 780 ggcgcgttct tgtacaagct ctccgaggcc ctcgaggcac gcgacatcct gtccgacttc 840 aacaagatca aggaaaacgt gcgatttgcg aacaaagttg gtgccatcgt atgcaccaag 900 ctcggcgcaa tctcctccct cccatccttg agtgaggttg agggcgat 948 <210> 6 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of promoter 1 <400> 6 tggcgggtat tttcatccaa acccaaccgc gcatcattcc aatgctgatc caccccatcc 60 ggataaacca ccatgaacgg caacggatca aaagtcctgt tggtgaagct gcgccccaca 120 gatcctgact gctgggagcc atgaaaatag atcagcgcat ccgtggtgga accaaaaggc 180 tcaacaatac gaaacgttcg ctttcggtcc tgatgaaaga gatgtccctg aatcatcatc 240 taagtatgca tctcggtata atcgaccagg acagtgccac cacaattttg gaggattaca 300 agaac 305 <210> 7 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of promoter 2 <400> 7 tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60 ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120 aggctgctta tcacagtgaa agtaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180 gaagtccagg aggacataca 200 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for left homologous arm fragmentation amplification of pfkB <400> 8 gaggttgatg cgattcaat 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for left homologous arm fragmentation amplification of pfkB <400> 9 gttgatcaca acagtttcca 20 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for right homologous arm fragmentation amplification of pfkB <400> 10 tggcgggtat tttcatc 17 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for right homologous arm fragmentation amplification of pfkB <400> 11 gttcttgtaa tcctccaaaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for promoter 1 amplification <400> 12 atgaacaacg tactgtgcat 20 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for promoter 1 amplification <400> 13 atcgccctca acctca 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fructokinase amplification <400> 14 aagaacgtcc gcacca 16 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fructokinase amplification <400> 15 ccttctgcgt tgaccaa 17 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for left homologous arm fragmentation amplification of NCgl1742 <400> 16 atgagtacat cgaaaacaga gaaaa 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for left homologous arm fragmentation amplification of NCgl1742 <400> 17 aaacgtattc gcctgaagca 20 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for right homologous arm fragmentation amplification of NCgl1742 <400> 18 tttattaatg aagaacctgt tgtgtt 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for right homologous arm fragmentation amplification of NCgl1742 <400> 19 tcatttttca atctcttctt ttagg 25 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for promoter 2 amplification <400> 20 tggccgttac cctgcg 16 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for promoter 2 amplification <400> 21 tgtatgtcct cctggacttc g 21 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ptsG(F429C) amplification <400> 22 atggcgtcca aactgacg 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ptsG(F429C) amplification <400> 23 ttactcgttc ttgccgttga 20

Claims

서열번호 1의 야생형 ptsG 유전자의 429번째 아미노산인 페닐알라닌이 시스테인으로 치환된 ptsG 변이 유전자.
삭제
제1항에 있어서, 상기 변이 유전자는 서열번호 3의 서열을 갖는 ptsG 변이 유전자.
제1항의 변이 유전자가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주.
제4항에 있어서, 상기 균주는 제1항 또는 제3항 중 어느 한 항의 ptsG 변이 유전자를 1 copy 이상 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주.
다음의 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법;
(a) 제4항의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 배양물에서 L-라이신을 회수하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법;
(a) 제5항의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 배양물에서 L-라이신을 회수하는 단계.