KR102624718B1 - 변이형 rpoc 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자 - Google Patents

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Abstract

변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자를 개시한다. 변이형 rpoC 암호화 서열은 플라스미드의 카피수를 조절하는 변이형 RpoC를 암호화한다. 또한, 핵산 분자를 포함하는 재조합 미생물, 재조합 미생물에서 대상 벡터의 카피수를 조절하는 방법, 및 재조합 미생물의 사용에 의한 표적 생성물의 제조 방법을 개시한다.

Description

변이형 RPOC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자
본 발명은 변이형 rpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질 암호화 서열(또한 "변이형 rpoC 암호화 서열"이라 지칭된다)을 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로, 여기에서 변이형 rpoC 암호화 서열은 변이형 RpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질(또한 "변이형 RopC"라 지칭된다)을 암호화하고, 변이형 RpoC는 플라스미드의 카피수를 조절한다.
플라스미드는 생물공학에서 중요한 역할을 하며, 미생물로부터 표적 유전자를 도입, 변형 및 제거하고, 표적 유전자에 의해 암호화된 상응하는 단백질을 생성시키기 위한 수단을 제공한다. 플라스미드는 그것이 발생하는 미생물의 염색체로부터 물리적으로 분리되며 염색체와 독립적으로 복제하는, 박테리아(Bacteria), 알카에아(Archaea) 및 유카리오타(Eukaryota) 도메인의 다양한 범위의 미생물에서 자연적으로 발생하는 핵산 분자이다. 플라스미드는 전형적으로 이중 가닥 원형 DNA 분자이지만, 선형 DNA 분자 및/또는 RNA 분자일 수도 있다. 플라스미드는 약 1 kb 내지 2 Mb 이상의 크기 범위로 발생한다. 예를 들어, 최근의 리뷰 논문[Shintani et al., Frontiers in Microbiology 6:242 (2015)]에 따르면, GenBank 데이터베이스에서 발견되는 4602개 플라스미드 중에서 광범위한 크기 변화가 관찰되었으며, 이때 플라스미드의 크기 범위는 744 bp 내지 2.58 Mb이고 평균 크기가 80 kb이다. 또한,플라스미드는 세포당 카피의 범위로 발생한다. 예를 들어, 플라스미드는 일반적으로 낮은 카피, 예를 들어 세포당 1-20 카피, 중간 카피, 예를 들어 세포당 20-100 카피, 또는 높은 카피, 예를 들어 세포당 500-700 또는 그 이상의 카피를 특징으로 한다. 플라스미드는 표적 유전자를 포함하도록 변형될 수 있다.
생명공학에서 플라스미드를 사용하는 것과 관련된 도전은 생물공학적 응용이 일반적으로 미생물내 표적 유전자의 안정적인 혼입을 필요로 하고, 배양 동안 표적 유전자 및 이의 상응하는 단백질 생성물의 수율의 신중한 조절을 필요로 하지만, 이를 달성하기 위한 노력이 다른 것을 달성하는데 불리하게 작용할 수 있다는 것이다. 표적 유전자를 갖는 플라스미드를 포함하는 미생물을 배양하는 동안, 미생물의 세포가 성장하고 분열함에 따라 플라스미드가 안정하게 분리되도록 하는 것이 일반적으로 유리하며, 따라서 높은 비율의 미생물 세포가 배양 전체에 걸쳐 표적 유전자를 포함하게 된다. 또한, 표적 유전자를 구조적으로 안정하게 유지시키고, 일정한 뉴클레오티드 서열을 유지하여, 의도된 생성물만을 제조하는 것이 일반적으로 유리하다. 또한, 목적하는 결과를 달성하기에 충분히 높은 수준으로, 예를 들어 충분한 양 및 활성 형태로 상응하는 단백질 생성물의 생성을 달성하기에 충분히 높은 수준으로 표적 유전자를 발현시키는 것이 일반적으로 유리하다. 불행하게도, 플라스미드를 복제하고 플라스미드로부터 표적 유전자를 발현시키는 기술은, 특히 높은 수준에서, 세포에 대사 부담을 가한다. 이는 플라스미드가 세포로부터 상실되게 하고/하거나 돌연변이가 표적 유전자의 발현 수준 또는 일치성을 변화되게 할 수 있다. 이는 또한 상응하는 단백질 생성물의 응집 및 비활성을 유도할 수 있다. 따라서, 생물학적 기술분야에서 플라스미드를 사용하는 동안 안정한 혼입과 수율 조절의 균형을 맞추는 것은 일반적으로 시행착오를 포함하는 경험적 과정이다.
플라스미드 카피수는 안정한 혼입과 수율의 조절 모두에 관하여 중요한 고려사항이다. 플라스미드의 카피수는 일반적으로 3개의 인자, 즉 플라스미드의 복제 기원, 포함된 표적 유전자를 포함한 플라스미드의 크기, 및 배양 조건에 의해 결정된다. 복제 기원에 관하여, 플라스미드는 복제, 특히 복제 기원의 특징에 기초하여 불화합성(incompatibility) 그룹으로 분류될 수 있다. 특히, 플라스미드는 일반적으로 단일 복제 기원으로부터 복제하는 플라스미드의 영역에 상응하는 레플리콘(replicon)을 포함한다. 플라스미드는 또한 일반적으로 플라스미드의 복제 기원을 인식하고 복제를 개시시키는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하였다. 플라스미드의 단백질과 복제 기원간의 상호작용은 복제의 특이성, 및 레플리콘, 그에 따른 플라스미드의 카피수를 결정한다. 동일한 복제 기원을 갖는 플라스미드는, 플라스미드가 분리 안정성에 관하여 서로 불화합성임에 기초하여 동일한 불화합성 그룹내에서 분류된다. 상이한 복제 기원을 갖는 플라스미드는 플라스미드가 서로 화합성이라면 상이한 불화합성 그룹내에서 분류될 수 있다. 플라스미드의 크기와 관련하여, 크기를 증가시키는 것은 일반적으로 플라스미드의 복제 및 플라스미드로부터 표적 유전자의 발현과 관련된 대사 부담을 증가시키고, 따라서 플라스미드의 카피수를 감소시킨다. 배양 조건에 관하여, 상기는 또한 대사 부담에 영향을 미치며, 특정 조건에 따라 카피수의 증가 또는 감소를 초래할 수 있다.
3개의 인자 중에서, 복제 기원은 카피수에 대한 기준선을 수립하기 때문에,복제 기원은 일반적으로 특정 용도를 위해 플라스미드를 선택하는데 있어서 주된 고려 사항이다. 다른 2개 인자, 즉 플라스미드의 크기 및 배양 조건의 변화는 항상 선택사항인 것은 아니다. 플라스미드의 크기는 표적 유전자의 크기에 의해 결정되고/되거나 제한될 수 있다. 배양 조건도 또한 상응하는 생성물을 충분한 양 및 충분한 활성으로 수득하기 위한 요건에 의해 결정되고/되거나 제한될 수 있다. 이 또한 경험적 과정일 것이다.
돌연변이 RNA 폴리머라제의 사용은 플라스미드의 카피수를 변경하기 위한 잠재적인 접근법이다. RNA 폴리머라제는 전사에 하나의 역할을 한다. RNA 폴리머라제는 또한 염색체 및 플라스미드의 복제에도 하나의 역할을 한다. RNA 폴리머라제 서열은 다수의 세균에서 측정되었으며, 이는 RNA 폴리머라제 내의 보존된 영역을 식별하기 위한 기초를 제공한다. 예를 들어, 문헌[Lee et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57:56-65 (2013)]은 21개 균주로부터의 RNA 폴리머라제 β' 서브유닛의 C-말단 도메인의 정렬을 제공한다. 세균 RNA 폴리머라제의 구조가 또한 측정되었다. 예를 들어, 문헌[Mukhopadhyay et al., Cell 135:295-307 (2008)]은 RNA 폴리머라제가 ~ 150 옹스트롬 x ~ 100 옹스트롬 x ~ 100 옹스트롬의 치수 및 집게발을 연상시키는 모양을 갖는 구조를 드러냄을 보고한다. RNA 폴리머라제 β' 서브유닛은 "클램프(clamp)"라 칭하는 집게발, 및 활성 중심 틈새 부분을 구성한다.
RNA 폴리머라제 β' 서브유닛을 암호화하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 rpoC 유전자의 2 개의 돌연변이는 ColE1-유형 플라스미드의 카피수의 감소를 야기하는 것으로 보고되었다. 구체적으로, 문헌[Ederth et al, Molecular Genetics and Genomics 267:587-592(2002)]은 단일 아미노산 치환(G1161R) 및 41-아미노산 결실을 확인하였다. 둘 다 rpoC 유전자의 3'-말단 영역 부근에 위치한다. 2개의 돌연변이는 각각 ColE1 플라스미드의 카피수의 10배 및 20배 감소를 유발한다(추정상 각각 90% 및 95% 이상의 감소에 상응한다). Ederth 등은 DNA 폴리머라제 I에 대한 프리프라이머(preprimer) 및 상기 프리프라이머의 안티센스 억제제를 암호화하는 RNA II 및 RNA I에 대한 프로모터로부터의 변경된 발현이 감소를 야기할 수 있음을 제안한다.
rpoC 에서의 돌연변이는 또한 플라스미드 pBR322의 카피수의 증가를 야기하는 것으로 보고되었다. 구체적으로, 문헌[Petersen et al., Journal of Bacteriology 173:5200-5206(1991)]은 rpoC 유전자의 3'-말단 영역 부근에 또한 위치하는 단일 아미노산 치환(G1033D)을 확인하였으며, 이는 39℃의 반-허용 생육 온도에서 pBR322의 카피수를 증가시킨다. Petersen은 돌연변이가 또한 염색체 카피수의 증가를 유발한다는 것을 주목한다.
불행하게도, 플라스미드의 카피수를 변화시키는 추가의 돌연변이체를 얻기 위해 RNA 폴리머라제 β' 서브유닛을 예측가능하게 변형시키는 일반적인 접근법이 존재하지 않는다. 특정 돌연변이가 플라스미드의 카피수를 변경시킬 수 있는 지의 여부 및 변경 정도를 결정하는 것은 또한 경험적 과정일 것이다. 또한, 염색체 카피수의 상응하는 변화를 일으키지 않는 상기와 같은 돌연변이체를 획득하기 위해 RNA 폴리머라제 β' 서브유닛을 예측가능하게 변형시키는 어떠한 일반적인 접근법도 존재하지 않는다.
따라서, 이상적으로는 염색체 카피수의 상응하는 변화를 유발하지 않으면서 플라스미드의 카피수를 변화시키도록 변형된 RNA 폴리머라제 β' 서브유닛의 돌연변이체가 필요하다.
본원의 하나의 양태에 따라, 변이형 rpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질 암호화 서열(또한 "변이형 rpoC 암호화 서열"이라 칭한다)을 포함하는 핵산 분자를 개시한다. 변이형 rpoC 암호화 서열은 변이형 RpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질(또한 "변이형 RpoC"라 칭한다)을 암호화한다. 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함하며, 이때 R47C 치환의 넘버링은 에스케리키아 콜라이의 야생형 RpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질(또한 "야생형 RpoC"라 칭한다)에 기초하여 정의된다.
일부 예에서, 변이형 RpoC의 발현은 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 플라스미드의 카피수를 감소시킨다.
또한 일부 예에서, 변이형 RpoC는 (1) 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 29를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 30을 포함하는 C-말단 도메인을 포함한다. R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다.
또한 일부 예에서, 변이형 RpoC는 (1) 서열번호 31을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 32를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 33을 포함하는 C-말단 도메인을 포함한다. R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다.
또한 일부 예에서, 변이형 RpoC는 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
또한 일부 예에서, 변이형 RpoC는 서열번호 27을 포함한다.
본원의 또 다른 양태에 따라, 핵산 분자를 포함하는 벡터를 개시한다.
본원의 또 다른 양태에 따라, 핵산 분자를 포함하는 재조합 미생물을 개시한다.
본원의 또 다른 양태에 따라, 재조합 미생물에서 대상 벡터의 카피수를 조절하는 방법을 개시한다. 방법은 재조합 미생물을 대상 벡터의 복제에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 대상 벡터의 카피수를 조절함을 포함한다.
본원의 또 다른 양태에 따라, 재조합 미생물의 사용에 의한 표적 생성물의 제조 방법을 개시한다. 재조합 미생물은 표적 유전자 벡터를 포함한다. 표적 유전자 벡터는 표적 생성물을 제조하기 위한 표적 유전자를 포함한다. 방법은 (1) 재조합 미생물을, 재조합 미생물이 표적 유전자를 발현하는 조건하에 배양 배지에서 배양하여, 표적 생성물을 생성시키는 단계, 및 (2) 재조합 미생물 및/또는 배양 배지로부터 표적 생성물을 회수하는 단계를 포함한다.
본원의 또 다른 양태에 따라, 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 유전자 교체 벡터 및 유전자 교체 서열을 개시한다. 변이형 rpoC 암호화 서열은 서열번호 28을 포함하는 변이형 RpoC N-말단 도메인을 암호화한다. 유전자 교체 서열은 미생물의 염색체 중의 내인성 rpoC 암호화 서열을 변이형 rpoC 암호화 서열로 교체하기 위한 단백질을 암호화한다.
본원에 개시된 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자는 벡터, 예를 들어 플라스미드의 카피수를 조절하는데 유용하며, 따라서 벡터의 사용에 의해 표적 생성물의 상업적인 생산을 개선시키기에 유용하다.
도 1은 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) RpoC(Q8RQE8)(서열번호 34), 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) RpoC(BAH99075.1)(서열번호 35), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) RpoC(Q5F5R6)(서열번호 36), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) RpoC(Q5X865)(서열번호 37), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) RpoC(Q9HWC9)(서열번호 38), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) RpoC(Q9KV29)(서열번호 39), 에스케리키아 콜라이(P0A8T7)(서열번호 26), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피뮤리움(Typhimurium) RpoC(P0A2R4)(서열번호 40), 액티노마이세스 오돈토리티쿠스(Actinomyces odontolyticus) RpoC(EDN79927.1)(서열번호 41), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor) RpoC(Q8CJT1)(서열번호 42), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae) RpoC(Q6NJF6)(서열번호 43), 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) RpoC(A5U053)(서열번호 44), 로도코커스 에퀴(Rhodococcus equi) RpoC(CBH49656.1)(서열번호 45), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) RpoC(O84316)(서열번호 46), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum) RpoC(A7FZ76)(서열번호 47), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) RpoC(P37871)(서열번호 48), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) RpoC(Q97NQ8)(서열번호 49), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) RpoC(Q82Z41)(서열번호 50), 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) RpoC(Q03PV0)(서열번호 51)의 N-말단 도메인의, CLUSTAL O(1.2.4)에 의한 다중 서열 정렬을 도시한다.
도 2는 도 1에 도시된 바와 같은 RpoC 단백질(각각 서열번호 34-39, 26, 및 40-51)의 센트럴 도메인의, CLUSTAL O(1.2.4)에 의한 다중 서열 정렬을 도시한다.
도 3A-B는 도 1에 도시된 바와 같은 RpoC 단백질(각각 서열번호 34-39, 26, 및 40-51)의 C-말단 도메인의, CLUSTAL O(1.2.4)에 의한 다중 서열 정렬을 도시한다.
도 4는 E.coli의 RpoC 단백질(서열번호 26) 및 변이형 RpoC(서열번호 27)의 N-말단 도메인의 서열 정렬을 도시한다.
도 5는 E.coli의 RpoC 단백질(서열번호 26) 및 변이형 RpoC(서열번호 27)의 정렬된 N-말단 도메인의 차이를 도시하며, 이때 전체가 제공된 E.coli의 RpoC의 N-말단 도메인의 서열 및 제공된 변이형 RpoC의 서열이 차이를 보인다.
도 6A-B는 염색체상의 rpoC 서열을 대체하기 위한, pJSL47이라 칭하는 재조합 플라스미드의 구성 과정을 예시한다.
도 7A-B는 야생형 RepFIC 레플리콘을 포함하는, pJSL48이라 칭하는 재조합 플라스미드의 구성 과정을 예시한다.
도 8A-B는 변형된 RepFIC 레플리콘을 포함하는, pJSL49라 칭하는 재조합 플라스미드의 구성 과정을 예시한다.
변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자를 개시한다. 변이형 rpoC 암호화 서열은 변이형 RpoC를 암호화한다. 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함하며, 이때 R47C 치환의 넘버링은 에스케리키아 콜라이의 야생형 RpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질(또한 "야생형 RpoC"라 칭한다)에 기초하여 정의된다.
놀랍게도, 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자(여기에서 변이형 rpoC 암호화 서열은 변이형 RpoC를 암호화하고, 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함한다)를 사용하여 염색체 카피수의 상응하는 감소를 야기하지 않으면서 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 미생물에서 플라스미드의 카피수를 상당히 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 이는 다른 이유들 가운데에서도, 본원에 개시된 바와 같은 R47C 치환이 RpoC의 N-말단 도메인 서열에서 발생하는 반면, Ederth 등 및 Petersen 등에 의해 기재된 바와 같은 단일 치환을 포함하는 E.coli RpoC의 돌연변이체는 오직 rpoC 유전자의 3'-말단 영역 부근, 및 따라서 RpoC의 C-말단 도메인 서열에서만 돌연변이를 포함하였기 때문에 놀라운 것이다. 이는 또한 본원에 개시된 바와 같은 R47C 치환이 9 아미노산 잔기 N-말단 도메인 서열내에서 발생하는 반면(그 외에는 다양한 세균의 RpoC들 간에 엄격하게 보존된다), Ederth 등 및 Petersen 등에 의해 기재된 바와 같은 E.coli RpoC의 돌연변이체에서의 단일 치환은, 보존된 잔기에 의해 둘러싸이지 않고 따라서 보존된 서열내에 존재하지 않는 RpoC 서열내의 위치에서 발생하기 때문에 놀라운 것이다.
이론에 얽매이고하 하는 것은 아니지만, 다양한 세균으로부터의 야생형 RpoC는, 야생형 RpoC들간에 엄격하게 보존되는 서열번호 26의 잔기 40-48에 상응하는 N-말단 도메인 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 서열은 다양한 계통발생, 대사 및 환경을 나타내는 19개의 다양한 세균, 즉 써무스 써모필루스, 아세토박터 파스퇴리아누스, 네이세리아 고노로에아에, 레지오넬라 뉴모필라, 슈도모나스 아에루기노사, 비브리오 콜레라에, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움, 액티노마이세스 오돈토리티쿠스, 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 코리네박테리움 디프테리아에, 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 로도코커스 에퀴, 클라미디아 트라코마티스, 클로스트리디움 보툴리늄, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 엔테로코커스 파에칼리스, 및 락토바실러스 브레비스들간에 엄격하게 보존된다. 참조를 위해, 이들 서열은 Lee 등에 의해 제공된 바와 같은 21개 균주의 RpoC의 C-말단 도메인의 정렬로부터 입수할 수 있는 전장 RpoC 서열에 상응한다. 또한, 다양한 범위의 세균으로부터의 야생형 RpoC가 또한 서열번호 29에 상응하는 센트럴 도메인 서열(이는 또한 야생형 RpoC들간에 엄격하게 보존된다)을 포함하는 것으로 여겨진다. 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 서열은 또한 19개의 다양한 세균들간에 엄격하게 보존된다. 또한, 다양한 범위의 세균으로부터의 야생형 RpoC가 또한 서열번호 30에 상응하는 C-말단 도메인 서열(이는 또한 야생형 RpoC들간에 엄격하게 보존된다)을 포함하는 것으로 여겨진다. 도 3A-B에 도시된 바와 같이, 상기 서열은 또한 19개의 다양한 세균들간에 엄격하게 보존된다.
추가로, 각각 엄격하게 보존된 N-말단, 중심 및 C-말단 도메인 서열을 포함하여, 서열번호 26의 잔기 33-57에 상응하는 보다 긴 N-말단 도메인 서열, 서열번호 32에 상응하는 보다 긴 센트럴 도메인 서열, 및 서열번호 33에 상응하는 보다 긴 C-말단 도메인 서열은 19개의 다양한 세균의 RpoC들간에 일반적으로 보존되는 다수의 잔기를 포함하는 것으로 여겨진다. 도 1, 도 2 및 도 3A-B에 도시된 바와 같이, E.coli RpoC는 이들 보다 긴 서열을 포함한다. 또한, 다른 세균으로부터의 RpoC는 이들 보다 긴 서열에 고도로 유사한 서열을 포함한다.
다양한 세균으로부터의 야생형 RpoC는 엄격하게 보존된 N-말단, 중심 및 C-말단 도메인 서열을 포함하기 때문에, 이들 서열 또한 다른 세균의 야생형 RpoC들간에 엄격하게 보존되는 것으로 여겨진다. 맥락상, 표 1에 나타낸 바와 같이, E.coli의 RpoC의 짝짓기식 서열 정렬에 대한 결과는 다른 18개의 다양한 세균의 RpoC에 비해, 심지어 E.coli와 계통발생적으로, 대사적으로, 및 환경적으로 동떨어진 극호열성 써무스 써모필루스와 같은 세균의 RpoC에 대해서조차 비교적 고도의 서열 일치성 및 유사성을 나타낸다. 이는 RpoC가 전사 및 복제에서 하는 근본적인 역할과 일치한다.
다른 세균의 RpoC와 비교한 E.coli의 RpoC의 짝짓기식 서열 정렬 결과
세균 등록번호 길이 동일성 유사성 갭 점수 서열
써무스 써모필루스 sp|Q8RQE8.1|RPOC_THET8 1765 36.1% 48.3% 33.9% 2851.0 서열번호 34
아세토박터 파스퇴리아누스 BAH99075.1 1439 59.6% 74.6% 5.6% 4334.5 서열번호 35
네이세리아 고노로에아에 sp|Q5F5R6.1|RPOC_NEIG1 1412 66.1% 80.4% 1.8% 4851.0 서열번호 36
레지오넬라 뉴모필라 sp|Q5X865.1|RPOC_LEGPA 1413 71.8% 83.3% 1.3% 5223.0 서열번호 37
슈도모나스 아에루기노사 sp|Q9HWC9.1|RPOC_PSEAE 1408 75.4% 85.6% 0.7% 5477.0 서열번호 38
비브리아 콜레라에 sp|Q9KV29.1|RPOC_VIBCH 1407 82.4% 89.8% 0.4% 5941.0 서열번호 39
에스케리키아 콜라이 sp|P0A8T7.1|RPOC_ECOLI 1407 100.0% 100.0% 0.0% 7139.0 서열번호 26
살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 sp|P0A2R4.1|RPOC_SALTY 1407 98.6% 99.3% 0.0% 7057.0 서열번호 40
액티노마이세스 오돈토리티쿠스 EDN79927.1 1529 40.9% 54.7% 23.0% 2883.5 서열번호 41
스트렙토마이세스 코엘리콜라 sp|Q8CJT1.1|RPOC_STRCO 1539 42.6% 55.7% 24.2% 3048.0 서열번호 42
코리네박테리움 디프테리아에 sp|Q6NJF6.1|RPOC_CORDI 1566 40.9% 54.1% 24.8% 2933.0 서열번호 43
마이코박테리움 튜베르큘로시스 sp|A5U053.1|RPOC_MYCTA 1552 41.0% 55.0% 24.5% 2944.0 서열번호 44
로도코커스 에퀴 CBH49656.1 1542 41.6% 55.6% 23.2% 2986.5 서열번호 45
클라미디아 트라코마티스 sp|O84316.1|RPOC_CHLTR 1468 47.8% 65.6% 9.1% 3447.0 서열번호 46
클로스트리디움 보툴리늄 sp|A7FZ76.1|RPOC_CLOB1 1420 47.5% 62.7% 18.0% 3344.5 서열번호 47
바실러스 서브틸리스 sp|P37871.4|RPOC_BACSU 1451 45.7% 59.4% 20.4% 3248.5 서열번호 48
스트렙토코커스 뉴모니아에 sp|Q97NQ8.1|RPOC_STRPN 1460 44.5% 58.4% 19.7% 3111.0 서열번호 49
엔테로코커스 파에칼리스 sp|Q82Z41.1|RPOC_ENTFA 1454 44.8% 59.8% 19.5% 3199.0 서열번호 50
락토바실러스 브레비스 sp|Q03PV0.1|RPOC_LACBA 1449 44.4% 59.4% 19.0% 3174.5 서열번호 51
*짝짓기식 서열 정렬을 디폴트 설정(행렬: BLOSUM62; 끊김: 10; 끊김 확장: 0.5; 출력 포맷; 쌍; 말단 끊김 벌점: 거짓; 말단 끊김: 10; 말단 끊김 확장: 0.5)(웹사이트: ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)을 사용하여 EMBOSS 니들 짝짓기식 서열 정렬(PROTEIN) 도구로 수행하였다.
또한, 다양한 세균으로부터의 야생형 RpoC는 보다 긴 N-말단, 중심 및 C-말단 도메인 서열과 매우 유사한 서열을 포함하기 때문에, 다른 세균의 야생형 RpoC는 이들 서열과도 또한 매우 유사한 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 또한, 다양한 서열이 엄격하게 또는 일반적으로 보존되는 것에 기초하여, 상응하는 N-말단, 중심 및 C-말단 도메인 서열은 RpoC가 염색체 및 플라스미드의 전사 및 복제에서 하는 역할에 구조적으로 및/또는 기능적으로 중요한 기여를 하는 것으로 여겨진다.
또한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, RpoC에서 특히 N-말단 도메인은 플라스미드의 카피수 측정에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 변형 rpoC 암호화 서열은 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인을 포함하는데, 이는 47번 위치 아미노산에서 단일 치환, 즉 R(즉 아르기닌)에서 C(즉 시스테인)로의 치환(또한 "R47C"라 칭한다)에 의해 야생형 N-말단 도메인의 엄격하게 보존된 서열과 상이하며, 이때 넘버링은 E.coli의 야생형 RpoC에 기초하여 정의된다. 상기 R47C 치환을 포함하고 그 외에는 E.coli의 야생형 RpoC와 동일한 변이형 RpoC는 플라스미드 카피수의 감소, 예를 들어 25% 내지 75%의 감소를 나타낸다. N-말단 도메인 중 R47C 치환이 변이형 RpoC와 E.coli의 야생형 RpoC간의 유일한 차이이고, R47C 치환은 19개의 다양한 세균들간에 일반적으로 보존되는 다양한 잔기를 포함하는 보다 긴 N-말단 도메인 서열내에 위치하며, 19개의 다양한 세균으로부터의 야생형 RpoC들간에 서열번호 26의 잔기 40-48에 상응하는 엄격하게 보존된 N-말단 도메인 서열내에 다른 치환은 존재하지 않기 때문에, N-말단 도메인이 플라스미드 카피수의 측정에 중요한 것으로 보인다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 핵산 분자는 예를 들어 이중가닥 DNA 분자, 단일가닥 DNA 분자, 이중가닥 RNA 분자, 단일가닥 RNA 분자, 또는 DNA/RNA 하이브리드 분자를 포함하여 DNA 및/또는 RNA의 분자를 의미하며, 이때 핵산 분자의 구조는 핵산 분자가 DNA 서열, RNA 서열, 또는 이 둘 모두를 포함하는 지의 여부에 따라 변한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질은 RNA 폴리머라제의 RNA 폴리머라제 β' 서브유닛을 의미한다. 상기에 논의된 바와 같이, RNA 폴리머라제는 전사에서 하나의 역할을 한다. RNA 폴리머라제는 또한 염색체 및 플라스미드의 복제에서 하나의 역할을 한다. RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질은 공지된 RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질과 구조적 및/또는 기능적 유사성을 근거로, 예를 들어 Lee 등에 의해 도시된 바와 같은 서열 정렬 및/또는 Mukhopadhyay 등에 의해 논의된 바와 같은 구조적 특징을 근거로 식별될 수 있다. RNA 폴리머라제 활성을 예를 들어 문헌[Chamberlin et al., The Journal of Biological Chemistry 254(20):10061-10069 (1979)]에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 rpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질 암호화 서열은 RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질의 서열을 암호화하는 DNA 분자 가닥, 또는 DNA 분자 가닥의 부분을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 야생형 RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질은 자연 조건하에서 하나의 종에 개별적으로 존재하는 RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 N-말단 도메인은 단백질의 N-말단에 또는 그 부근에, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열의 처음 1/3내에 존재하는 단백질의 일부를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 센트럴 도메인은 단백질의 중심에 또는 그 부근에, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열의 중간 1/3내에 존재하는 단백질의 일부를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 C-말단 도메인은 단백질의 C-말단에 또는 그 부근에, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열의 마지막 1/3내에 존재하는 단백질의 일부를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 레플리콘은 단일의 복제 기원으로부터 복제하는 DNA 분자의 영역을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 벡터는 미생물에서, 자연적으로 또는 미생물내로의 도입에 의해 발생할 수 있는 핵산 분자, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 플라스미드는 미생물에서, 자연적으로 또는 미생물내로의 도입에 의해 발생할 수 있는, 즉 미생물의 염색체(들)와 물리적으로 분리되고 염색체(들)와 독립적으로 복제할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 플라스미드는 전형적으로 이중가닥 환상 DNA 분자이나, 또한 선형 DNA 분자 및/또는 RNA 분자일 수도 있다. 플라스미드는 약 1 kb 내지 2 Mb 이상의 크기 범위로 존재한다. 플라스미드는 또한 세포당 카피의 범위, 즉 낮은 카피수에서부터 높은 카피수까지 존재한다. 플라스미드를 표적 유전자를 포함하도록 변형시킬 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 플라스미드 카피수는 미생물 세포 내 플라스미드의 카피수를 의미한다. 플라스미드 카피수를, 다른 접근법 중에서도, 예를 들어 실시간 PCR을 사용하여 미생물의 염색체상에서 단일 카피로 존재하는 유전자에 비해, 플라스미드상에 단일 카피로 존재하는 유전자의 카피수를 비교함으로써 미생물 중의 플라스미드에 대해 측정할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 플라스미드 카피수의 조절인자는 미생물에서 플라스미드의 카피수의 변화를 야기하는, 예를 들어 인자가 미생물 중에 존재하는 경우 대 인자가 미생물 중에 존재하지 않는 경우에 증가 또는 감소를 야기하는 RNA 분자 또는 단백질과 같은 인자를 의미한다. 플라스미드 카피수를 조절함으로써, 플라스미드를 안정하게 발현시키고, 이에 의해 상기 플라스미드를 포함하는 미생물의 안정한 생육을 가능하게 할 수 있다.
나타낸 바와 같이, 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자를 개시한다. 핵산 분자는 예를 들어 이중가닥 DNA 분자, 예를 들어, 변이형 rpoC 암호화 서열이 도입된 염색체 DNA, 또는 변이형 rpoC 암호화 서열이 클로닝된 플라스미드일 수 있다.
또한 나타낸 바와 같이, 변이형 rpoC 암호화 서열은 변이형 RpoC를 암호화한다. 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함함을 기본으로 하는 변이체이며, 이때 R47C 치환의 넘버링은 E.coli의 야생형 RpoC에 기초하여 정의된다. 변이형 RpoC는 RpoC이며, 따라서 염색체의 전사, 복제, 및 플라스미드의 복제에 역할을 한다. 19개의 다양한 세균의 야생형 RpoC가, 예를 들어 보존되지 않은 아미노산 위치에서 서로에 대해 변하는 것처럼, 변이형 RpoC도 또한 변이형 rpoC 암호화 서열의 소스에 따라 변할 수 있다. 따라서, 예를 들어 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함할 수 있으며 그 외에는 E.coli의 야생형 RpoC에 적어도 90% 일치할 수 있다. 또한 예를 들어, 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함할 수 있으며 그 외에는 다른 18개의 상이한 세균, 즉 써무스 써모필루스, 아세토박터 파스퇴리아누스, 네이세리아 고노로에아에, 레지오넬라 뉴모필라, 슈도모나스 아에루기노사, 비브리오 콜레라에, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움, 액티노마이세스 오돈토리티쿠스, 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 코리네박테리움 디프테리아에, 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 로도코커스 에퀴, 클라미디아 트라코마티스, 클로스트리디움 보툴리늄, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 엔테로코커스 파에칼리스, 및 락토바실러스 브레비스 중 어느 하나의 야생형 RpoC에 적어도 90% 일치할 수 있다. 또한 예를 들어, 변이형 RpoC는 R47C 치환 및 E.coli 또는 다른 18개의 다양한 세균의 야생형 RpoC 중 하나 이상의 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 변이형 RpoC는 (1) 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 29를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 30을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 이들 예에서, 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함하는, 서열번호 28에 상응하는 N-말단 도메인을 포함한다. 변이형 RpoC는 또한, RpoC가 염색체 및 플라스미드의 전사 및 복제에서 하는 역할과 일치하는, 서열번호 29에 상응하는 엄격하게 보존된 센트럴 도메인 서열 및 서열번호 30에 상응하는 엄격하게 보존된 C-말단 도메인 서열을 포함한다.
일부 예에서, 변이형 RpoC는 (1) 서열번호 31를 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 32을 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 33을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 이들 예에서, 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함하는, 서열번호 31에 상응하는 N-말단 도메인을 포함한다. 변이형 RpoC는 또한, RpoC가 염색체 및 플라스미드의 전사 및 복제에서 하는 역할과 일치하는, 서열번호 32에 상응하는 엄격하게 보존된 보다 긴 센트럴 도메인 서열 및 서열번호 33에 상응하는 엄격하게 보존된 보다 긴 C-말단 도메인 서열을 포함한다.
일부 예에서, 변이형 RpoC는 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 참조를 위해서, 서열번호 27은, R47C 치환을 포함하며 그 외에는 E.coli의 야생형 RpoC와 일치하는 변이형 RpoC에 상응한다. 또한 참조를 위해서, 변이형 RpoC의 아미노산 서열과 서열번호 27간의 서열 일치성 백분율을 짝짓기식 서열 정렬을 수행하여 측정할 수 있다. 이를 디폴트 설정(행렬: BLOSUM62; 끊김: 10; 끊김 확장: 0.5; 출력 포맷; 쌍; 말단 끊김 벌점: 거짓; 말단 끊김: 10; 말단 끊김 확장: 0.5)(웹사이트: ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)을 사용하여 EMBOSS 니들 짝짓기식 서열 정렬(PROTEIN) 도구로 수행할 수 있다. 이를 또한 유사한 다른 짝짓기식 서열 정렬 도구로 수행할 수 있다.
변이형 RpoC의 아미노산 서열은, 예를 들어 우세하게 또는 전적으로 E.coli의 야생형 RpoC와 다른 18개의 다양한 세균의 RpoC간에 보존되지 않은 아미노산 잔기의 치환을 근거로 서열번호 27과와 상이할 수 있다. 표 1을 참조하여, 다른 18개의 다양한 세균의 RpoC와 비교된 E.coli의 RpoC의 작짓기식 서열 정렬의 결과는 비교적 높은 정도의 서열 일치성 및 유사성을 가리키지만, 상기 결과는 또한 다양한 세균 중 17개의 RpoC가 E.coli의 야생형 RpoC와 비교하여 36.1% 내지 82.4% 범위, 및 따라서 충분히 90% 아래인 서열 일치성을 가짐을 가리킨다. 유사한 단백질들간에 보존되지 않는 아미노산 잔기의 치환은 일반적으로 더 잘 허용되는 듯하다, 예를 들어 보존되는 아미노산 잔기의 치환과 비교하여 구조 및/또는 기능을 붕괴시키지 않는 듯하다. 표 1의 결과는 RpoC가 보존되지 않는 다수의 아미노산 잔기를 포함하고 따라서 치환을 잘 받아들일 수 있음을 가리킨다.
변이형 RpoC의 아미노산 서열은 또한, 예를 들어 일부 또는 다수의 보존적 치환을 포함함을 근거로 서열번호 27과 상이할 수 있는데, 이는 서열번호 27에 비해, 또 다른 구조적으로 유사한 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 교체를 의미한다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 그룹내의 치환을 포함한다: (1) 글리신 및 알라닌, (2) 발린, 이소류신, 및 류신, (3) 아스파트산 및 글루탐산, (4) 아스파라진 및 글루타민, (5) 세린 및 쓰레오닌, (6) 리신 및 아르기닌, 및 (7) 페닐알라닌 및 티로신. 보존적 치환은 일반적으로 보존적이지 않은 치환과 비교하여 더 잘 허용되는 듯 하다.
따라서, 이들 예에서 변이형 RpoC는 R47C 치환을 포함한다. 변이형 RpoC는 또한 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어 변이형 RpoC는 서열번호 27에 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 변이형 RpoC는 서열번호 27을 포함한다. 일부 예에서, 변이형 RpoC는 서열번호 27로 이루어진다.
일부 예에서, 변이형 RpoC의 발현은 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 플라스미드의 카피수를 감소시킨다. 참조를 위해, 서열번호 26은 E.coli의 야생형 RpoC에 상응한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 변이형 RpoC는 RpoC이며, 따라서 염색체의 전사, 복제, 및 플라스미드의 복제에 역할을 한다. 또한 나타낸 바와 같이, R47C 치환을 포함하고 그 외에는 E.coli의 야생형 RpoC와 일치하는 변이형 RpoC는 예를 들어 약 25% 내지 75%의 플라스미드 카피수의 감소를 나타낸다. 일부 예에서, 변이형 RpoC의 발현은 플라스미드의 카피수를 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 10% 내지 80%까지, 예를 들어 25% 내지 75%, 30% 내지 70%, 35% 내지 65%, 40% 내지 60%, 45% 내지 55%, 10% 내지 40%, 20% 내지 50%, 30% 내지 60%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 80%까지 감소시킨다.
핵산 분자를 포함하는 벡터를 또한 개시한다. 핵산 분자는 상술한 바와 같을 수 있다. 일부 예에서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체 중 하나 이상에 상응할 수 있다.
핵산 분자를 포함하는 재조합 미생물을 또한 개시한다. 핵산 분자는 상술한 바와 같을 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, (1) 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 29를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 30을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 일부 예에서, 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, (1) 서열번호 31을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 32를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 33을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 일부 예에서 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, 서열번호 27을 포함한다.
일부 예에서, 재조합 미생물에서 변이형 RpoC의 발현은 플라스미드의 카피수를, 대조용 미생물에서 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 감소시킨다. 대조용 미생물은 예를 들어 재조합 미생물과 동일한 속, 종, 및/또는 균주로부터 유래될 수 있으며, 유사하거나 동일한 플라스미드를 포함할 수 있고, 따라서 재조합 미생물의 변이형 rpoC 암호화 서열과 대조용 미생물의 상응하는 rpoC 서열간의 차이에 대한 것 외에는 계통발생적으로 유사하고, 밀접하게 관련되고, 및/또는 유전학적으로 일치할 수 있다. 상기에 논의된 바와 유사하게, 감소는 10% 내지 80%까지, 예를 들어 25% 내지 75%, 30% 내지 70%, 35% 내지 65%, 40% 내지 60%, 45% 내지 55%, 10% 내지 40%, 20% 내지 50%, 30% 내지 60%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 80%까지 일 수 있다.
핵산 분자를 포함하는 재조합 미생물을, 예를 들어 벡터 중에 클로닝된 완전한 변이형 rpoC 암호화 서열을, 예를 들어 형질전환, 접합, 또는 형질도입에 의해 전구체 미생물내에 도입시켜 재조합 미생물을 수득하고, 이어서 재조합 미생물 중에 완전한 변이형 rpoC 암호화 서열을, 예를 들어 벡터의 선택에 의해 유지시킴으로써 수득할 수 있다. 이를 분자 생물학의 표준 기법에 의해 수행할 수 있다. 참조를 위해서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 또는 인공 염색체 중 하나 이상에 상응할 수 있다. 따라서, 일부 예에서 재조합 미생물을, 형질전환, 접합 또는 형질도입 중 하나 이상에 의해 전구체 미생물내에 핵산 서열을 포함하는 변이형 rpoC 암호화 서열 벡터, 예를 들어 플라스미드를 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
핵산 분자를 포함하는 재조합 미생물을, 예를 들어 벡터 중에 클로닝된 변이형 rpoC 암호화 서열의 일부를 도입시키고, 상기 부분을 사용하여, 예를 들어 sacB 벡터를 사용함으로써 상동성 재조합에 의한 유전자 교체에 의해, 내인성 염색체 야생형 rpoC 암호화 서열의 상응하는 부분을 교체시킴으로써 또한 수득할 수 있다. 이를 또한 분자 생물학의 표준 기법에 의해 수행할 수 있다. 따라서, 일부 예에서 재조합 미생물은 염색체를 포함하며, 변이형 rpoC 암호화 서열은 변이형 rpoC 암호화 서열에 의한 내인성 rpoC 암호화 서열의 교체에 기초하여 앰색체 중에 존재한다.
재조합 미생물을 다양한 세균의 세균으로부터 제조할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 19개의 다양한 세균들간에 엄격하게 또는 일반적으로 보존되는 다양한 N-말단, 중심 및 C-말단 도메인 서열에 기초하여, 상응하는 서열은 RpoC가 다양한 세균들간에 염색체 및 플라스미드의 전사 및 복제에서 하는 역할에 구조적으로 및/또는 기능적으로 중요한 기여를 하는 것으로 여겨진다. 또한, RpoC에서 특히 N-말단 도메인은 플라스미드의 카피수 측정에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 예에서, 재조합 미생물을 써무스 속, 예를 들어 써무스 써모필루스, 아세토박터 속, 예를 들어 아세토박터 파스퇴리아누스, 네이세리아 속, 예를 들어 네이세리아 고노로에아에, 레지오넬라 속, 예를 들어 레지오넬라 뉴모필라, 슈도모나스 속, 예를 들어 슈도모나스 아에루기노사, 비브리오 속, 예를 들어 비브리오 콜레라에, 에스케리키아 속, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 속, 예를 들어 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움, 액티노마이세스 속, 예를 들어 액티노마이세스 오돈토리티쿠스, 스트렙토마이세스 속, 예를 들어 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 코리네박테리움 속, 예를 들어 코리네박테리움 디프테리아에, 마이코박테리움 속, 예를 들어 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 로도코커스 속, 예를 들어 로도코커스 에퀴, 클라미디아 속, 예를 들어 클라미디아 트라코마티스, 클로스트리디움 속, 예를 들어 클로스트리디움 보툴리늄, 바실러스 속, 예를 들어 바실러스 서브틸리스, 스트렙토코커스 속, 예를 들어 스트렙토코커스 뉴모니아에, 엔테로코커스 속, 예를 들어 엔테로코커스 파에칼리스, 및 락토바실러스 속, 예를 들어 락토바실러스 브레비스의 세균 중 하나 이상으로부터 제조할 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, R47C 치환을 포함하고 그 외에는 E.coli의 야생형 RpoC와 일치하는 변이형 RpoC는 예를 들어 약 25% 내지 75%의 플라스미드 카피수의 감소를 나타낸다. 하기에 논의되는 바와 같이, 이는 다양한 E.coli 균주에서 성취되었다. 상응하게, 변이형 rpoC 암호화 가닥을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드 카피수를 특별히 에스케리키아 속의 세균, 특히 에스케리키아 콜라이 종의 세균에서 조절할 수 있다. 따라서, 일부 예에서 재조합 미생물을 에스케리키아 속의 세균 또는 에스케리키아 콜라이 종의 세균 중 하나 이상으로부터 제조할 수 있다.
재조합 미생물에서 대상 벡터의 카피수를 조절하는 방법을 또한 개시한다. 재조합 미생물에서 대상 벡터의 카피수를 조절하기 위한 변이형 rpoC 암호화 서열의 용도를 또한 개시한다. 재조합 미생물은 상술한 바와 같을 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, (1) 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 29를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 30을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 일부 예에서, 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, (1) 서열번호 31을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 32를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 33을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 일부 예에서 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, 서열번호 27을 포함한다. 일부 예에서 재조합 미생물을 에스케리키아 속의 세균 또는 에스케리키아 콜라이 종의 세균 중 하나 이상으로부터 제조할 수 있다. 일부 예에서, 재조합 미생물에서 변이형 RpoC의 발현은 플라스미드의 카피수를 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 예를 들어 10% 내지 80%까지, 예를 들어 25% 내지 75%, 30% 내지 70%, 35% 내지 65%, 40% 내지 60%, 45% 내지 55%, 10% 내지 40%, 20% 내지 50%, 30% 내지 60%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 80% 까지 감소시킨다.
방법은 재조합 미생물을 대상 벡터의 복제에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하여, 대상 벡터의 카피수를 조절함을 포함한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 또는 인공 염색체 중 하나 이상에 상응할 수 있다. 또한 논의된 바와 같이, RpoC는 플라스미드의 복제에 한 역할을 한다. 따라서, 일부 예에서 대상 벡터는 플라스미드를 포함한다.
배양을 예를 들어 배양 튜브, 플라스크, 및/또는 생물반응기(이들에 대한 세부사항은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다)에서 표준 미생물학 기법에 의해 수행할 수 있다. 배양을 적합한 배양 배지, 예를 들어 영양분 풍부 배지 또는 최소 배지(이들에 대한 세부사항은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다)에서 수행할 수 있다. 배양을 적합한 배양 온도에서, 예를 들어 25-38℃, 28-37℃, 또는 37℃에서 또는 약 상기 온도(이에 대한 세부사항은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다)에서 수행할 수 있다. 재조합 미생물이 배양 중 생육하고 분열함에 따라, 벡터가 복제될 것이다. 따라서, 예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터 제조된 재조합 미생물에 관하여, 상기 재조합 미생물을 생물반응기에서 배치식으로 또는 연속적으로 발효 기법에 의해 배양할 수 있다. 배양을 최소 배지, 예를 들어 다른 것들 중에서도, 한정된 양의 염, 예를 들어 M9 최소염 배지, 및 하나 이상의 탄소원, 예를 들어 글루코스, 슈크로스, 또는 리그노셀룰로스 물질을 포함하는 배지에서 수행할 수 있다. 배양을 약 37℃에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 조건은 에스케리키아 콜라이의 생육 및 분열을 지지하며, 따라서 벡터의 복제를 지지할 것이다. 에스케리키아 콜라이뿐만 아니라 다른 미생물로부터 제조된 재조합 미생물의 배양에 적합한 다른 조건은 공지되어 있으며 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다.
재조합 미생물의 사용에 의한 표적 생성물의 제조 방법을 또한 개시한다. 표적 생성물의 제조를 위한 재조합 미생물의 용도를 또한 개시한다. 다시, 재조합 미생물은 상술한 바와 같을 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, (1) 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 29를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 30을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 일부 예에서, 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, (1) 서열번호 31을 포함하는 N-말단 도메인, (2) 서열번호 32를 포함하는 센트럴 도메인, 및 (3) 서열번호 33을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하며, 여기에서 R47C 치환은 N-말단 도메인 내에 존재한다. 일부 예에서 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서 변이형 RpoC는 상기에 논의된 바와 같이, 서열번호 27을 포함한다. 일부 예에서 재조합 미생물을 에스케리키아 속의 세균 또는 에스케리키아 콜라이 종의 세균 중 하나 이상으로부터 제조할 수 있다. 일부 예에서, 재조합 미생물에서 변이형 RpoC의 발현은 플라스미드의 카피수를 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 예를 들어 10% 내지 80%까지, 예를 들어 25% 내지 75%, 30% 내지 70%, 35% 내지 65%, 40% 내지 60%, 45% 내지 55%, 10% 내지 40%, 20% 내지 50%, 30% 내지 60%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 80% 까지 감소시킨다.
상기 방법에 따라, 재조합 미생물은 표적 유전자 벡터를 포함하고, 표적 유전자 벡터는 표적 생성물의 제조를 위한 표적 유전자를 포함한다. 벡터는 예를 들어 유기체, 예를 들어 다른 유기체 중에서도 박테리아, 알카에아, 또는 유카리오타 도메인의 미생물, 동물, 및/또는 식물로부터의 표적 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드일 수 있다. 특히 박테리아 도메인의 미생물에 관하여, 표적 유전자는 예를 들어 다른 것들 중에서도, 에스케리키아 속의 세균, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 코리네박테리움 속의 세균, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰, 또는 바실러스 속의 세균, 예를 들어 바실러스 서브틸리스로부터 유래할 수 있다. 다른 유기체 중에서도 박테리아, 알카에아, 및 유카리오타 도메인의 미생물뿐만 아니라, 동물 및 식물을 포함한 다양한 유기체의 유전자의 재조합 발현을 허용하는 다수의 유전 공학 기법이 개발되었다. 상기와 같은 기법을 적용하여, 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명한 바와 같이, 본 개시내용에 따라 재조합 미생물에서 다양한 유기체로부터의 표적 유전자를 클로닝하고 발현시킬 수 있다.
일부 예에서, 표적 생성물은 (i) 표적 RNA, (ii) 표적 단백질, (iii) 표적 생물물질, (iv) 표적 중합체, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (v) 표적 감미제, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (vi) 표적 오일, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (vii) 표적 지방, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (viii) 표적 폴리사카라이드, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (ix) 표적 아미노산, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (x) 표적 뉴클레오티드, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, (xi) 표적 백신, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 또는 (xii) 표적 약학 생성물, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소 중 하나 이상을 포함한다. 따라서, 일부 예에서 표적 유전자는 표적 RNA를 암호화하고, 표적 생성물은 표적 RNA에 상응한다. 또한 일부 예에서, 표적 유전자는 표적 단백질을 암호화하고, 표적 생성물은 표적 단백질에 상응한다. 또한 일부 예에서 표적 유전자는 표적 RNA 및/또는 표적 단백질을 암호화하고, 표적 RNA 및/또는 표적 단백질은 차례로 표적 생물물질, 표적 중합체, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 감미제, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 오일, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 지방, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 폴리사카라이드, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 아미노산, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 뉴클레오티드, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 표적 백신, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 또는 표적 약학 생성물, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소의 생성에 한 역할을 한다. 예를 들어 표적 중합체, 표적 감미제, 표적 오일, 표적 지방, 표적 폴리사카라이드, 표적 아미노산, 및/또는 표적 뉴클레오티드에 관하여, 표적 유전자는 상기 표적 중합체, 표적 감미제, 표적 오일, 표적 지방, 표적 폴리사카라이드, 표적 아미노산, 및/또는 표적 뉴클레오티드를 생산하는 효소에 상응하는 표적 단백질을 직접적으로 또는 전구체를 통해 암호화할 수 있다. 또한 예를 들어, 백신에 관하여, 표적 유전자는 병원성 미생물에 대한 백신의 성분으로서 사용될 수 있는 항원 또는 항원 단편, 예를 들어 단백질 서브유닛, 수용체, 또는 병원성 미생물의 다른 단백질, 또는 그의 단편에 상응하는 표적 단백질을 암호화할 수 있다. 또한 예를 들어, 표적 약학 생성물에 관하여, 표적 유전자는 약학 생성물의 성분으로서 사용될 수 있는 표적 단백질, 예를 들어 항체, 수용체 또는 호르몬을 암호화할 수 있다.
일부 예에서, 벡터는 다수의 표적 유전자, 예를 들어 특정 유기체로부터의 다수의 표적 유전자, 및/또는 다수의 유기체 각각으로부터의 하나 이상의 표적 유전자를 포함한다. 또한 일부 예에서, 표적 유전자는 다수의 표적 생성물을 제조하기 위한 것이다.
일부 예에서, 표적 유전자 벡터, 예를 들어 플라스미드는 3 내지 120 kb의 크기를 갖는다. 재조합 벡터는 종종 3 내지 120 kb의 크기로 발생하는데, 그 이유는 이것이 표적 유전자가 클로닝된 벡터에 전형적인 크기이기 때문이다.
방법은 또한 (1) 재조합 미생물을 상기 재조합 미생물이 표적 유전자를 발현하는 조건하에 배양 배지에서 배양하여, 표적 생성물을 생성시키는 단계를 포함한다. 다시, 배양을 예를 들어 배양 튜브, 플라스크, 및/또는 생물반응기에서, 적합한 배양 배지, 예를 들어 영양분 풍부 배지 또는 최소 배지에서, 적합한 배양 온도에서, 예를 들어 25-38℃, 28-37℃, 또는 37℃에서 또는 약 상기 온도에서 표준 미생물학 기법에 의해 수행할 수 있으며, 이에 대한 세부사항은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다.
방법은 또한 (2) 표적 생성물을 재조합 미생물 및/또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함한다. 표적 생성물의 회수에 적합한 접근법은 다른 접근법들 중에서도, 표적 생성물의 세부사항에 기초하여, 예를 들어 표적 생성물, 예를 들어 RNA, 단백질, 중합체 등의 유형, 표적 생성물의 구체적인 세부사항, 예를 들어 화학 구조, 분자량, 친화성 태그 등 및 목적하는 순도, 예를 들어 높고 낮은 순도에 따라, 표적 단백질에 상응하는 표적 생성물에 대한 표준 단백질 정제 기법 또는 표적 중합체에 상응하는 표적 생성물에 대한 표준 중합체 추출 및 침전 기법(세부사항은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다)을 전개할 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA에 상응하는 표적 생성물에 관하여, 재조합 미생물의 배양에 이어서, 표적 RNA를, 당해 분야에 공지된 다른 방법들 중에서도, 문헌[Stead et al., Nucleic Acids Research 40(20), e156:1-9 (2012)]에 기재된 바와 같은 RNAsnap(TM) 방법의 사용에 의해, 또는 상업적으로 입수할 수 있는 방법, 예를 들어 TRIzol(R) Max(TM) 세균 RNA 단리 키트(ThermoFisher Scientific), RNeasy(R) 보호 세균 단리 키트(Qiagen), 또는 RiboPure(TM) 세균 RNA 단리(ThermoFisher Scientific)에 의해 재조합 미생물로부터 회수할 수 있다. 표적 단백질에 상응하는 표적 생성물의 경우, 표적 단백질을 당해 분야에 주지된 과정에 따라, 추출, 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및/또는 침전에 의한 농축에 의해 재조합 미생물로부터 회수할 수 있다. 표적 중합체에 상응하는 표적 생성물의 경우, 표적 중합체를, 또한 당해 분야에 주지된 과정에 따라, 화학 구조 및 분자량에 기초하여 선택된 세척을 위한 조성물 및 농축을 위한 침전물과 함께 추출, 세척 및 농축에 의해 회수할 수 있다. 표적 감미제, 표적 오일, 표적 지방, 표적 폴리사카라이드, 표적 아미노산, 또는 표적 뉴클레오티드에 상응하는 표적 생성물의 경우, 상기 표적 생성물이 재조합 미생물내에 축적되는 경우, 유사한 접근법을 또한 사용할 수 있는 반면, 상기 표적 생성물이 세포외에 축적되는 경우, 표적 생성물을, 예를 들어 다시 당해 분야에 주지된 과정에 따라, 배양 배지로부터의 침전에 의해 회수할 수 있다. 표적 백신 또는 표적 약학 생성물에 상응하는 표적 생성물의 경우, 표적 생성물을 다시 당해 분야에 주지된 과정에 따라, 다른 접근법들 중에서도, 예를 들어 표적 단백질에 대해 상술한 바와 같이, 예를 들어 항원 또는 항원 단편에 상응하는 표적 백신의 경우 이온-교환 크로마토그래피에 기초하여, 또는 단클론 항체에 상응하는 약학 생성물의 경우 친화성 크로마토그래피에 기초하여 회수할 수 있다.
일부 예에서 재조합 미생물을 상기에서 논의된 바와 같이, 표적 유전자 벡터를 형질전환, 접합, 또는 형질도입 중 하나 이상에 의해 재조합 미생물내에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
표적 생성물을 보다 상세히 고려하면, 일부 예에서, 표적 생성물은 (i) 표적 중합체, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소, 또는 (ii) 표적 생물중합체, 그의 전구체, 및/또는 그의 생성을 위한 효소 중 하나 이상을 포함한다. 생물중합체를 포함하여, 중합체의 생물학적 생성은, 특히 복잡한 화학 구조를 갖는 단량체를 기본으로 하는 중합체 및/또는 2개 이상의 단량체를 포함하는 공중합체의 경우, 재조합 미생물에서 다수의 표적 유전자의 조화된 도입 및 발현에 대한 필요성을 근거로, 도전일 수 있다. 유사한 고려사항을 또한 상기에 논의된 바와 같은 다른 표적 생성물, 특히 표적 감미제, 표적 지방, 표적 폴리사카라이드, 표적 아미노산, 표적 뉴클레오티드, 표적 백신, 및 표적 약학 생성물에 관하여 적용한다.
방법은, 예를 들어 표적 중합체, 표적 생물중합체, 표적 감미제, 표적 지방, 표적 폴리사카라이드, 표적 아미노산, 표적 뉴클레오티드, 표적 백신, 또는 표적 약학 생성물의 생성을 위해, 재조합 미생물 중의 벡터의 안정한 혼입과 표적 유전자의 생성물의 수율 조절과의 균형을 위해, 다수의 표적 유전자를 포함하는 벡터에 적합한 카피수를 신속하게 측정하는데 유용할 수 있다. 벡터의 세트를 제조할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 표적 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 그의 기준선 카피수에 관하여 변할 수 있다. 벡터를 야생형 rpoC 암호화 서열을 포함하는(따라서 야생형 RpoC를 발현한다) 제1 세균 균주, 예를 들어 E.coli 균주내에 도입시켜, 벡터를 포함하고 야생형 RpoC를 발현하는 제1 E.coli 균주 세트를 수득할 수 있다. 벡터를 또한 R47C 치환을 포함하는 변이형 RpoC를 암호화하는 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는(따라서 변이형 RpoC를 발현한다) 상응하는 제2 재조합 세균 균주(제2 균주는 그 외에는 제1 균주와 동일하다), 예를 들어 재조합 E.coli 균주에 도입시켜, 벡터를 포함하고 변이형 RpoC를 발현하는 상응하는 제2 E.coli 균주 세트를 수득할 수 있다. 방법을, 제1 및 제2 균주 세트를 이들 균주가 하나 이상의 표적 유전자를 발현하는 조건하에 배양 배지에서 배양하여, 표적 생성물을 생성시키고 표적 생성물을 회수함으로써 수행할 수 있다. 카피수를 배양 중 각각의 벡터에 대해 측정할 수 있다. 표적 생성물의 수율 또는 다른 관련된 특징을 회수 중에 측정할 수 있다. 상기 접근법은 제1 균주 세트에 대해 성취될 수 있는 카피수의 하한을 실질적으로 감소시킬 수 있으며, 이는 표적 유전자의 발현이 유해한 경우에, 예를 들어 세포에서 일정 수준을 초과하여 발현시 세포에 독성인 표적 RNA 및/또는 표적 단백질을 암호화하는 표적 유전자의 경우에, 상기 균주의 세포의 생육성을 유지하는데 유리할 수 있다. 상기 접근법은 또한 표적 생성물의 수율에 대한 벡터 카피수의 영향을 시험함에 관하여 샘플 크기를 유효하게 배가할 수 있다. 상기 접근법을, 특히 3 내지 120 kb 크기의 플라스미드를 포함하고/하거나 다수의 표적 유전자를 포함하는 플라스미드에 상응하는 벡터에 사용할 수 있다.
변이형 rpoC 암호화 서열 및 유전자 교체 서열을 포함하는 유전자 교체 벡터를 또한 개시한다. 변이형 rpoC 암호화 서열은 서열번호 28을 포함하는 변이형 RpoC N-말단 도메인을 암호화한다. 이 경우에 변이형 rpoC 암호화 서열은 전장 변이형 rpoC 암호화 서열일 필요가 없으며, 바람직하게는 단지 유전자 교체 벡터가 도입되는 미생물의 염색체에서 내인성 rpoC 암호화 서열과 상동성 재조합을 수행하기에 충분한 변이형 rpoC 암호화 서열만을 포함한다. 변이형 rpoC 암호화 서열은 예를 들어 0.2 내지 5 kb, 0.5 내지 3 kb, 0.7 내지 2.5 kb, 0.8 내지 2 kb, 0.9 내지 1.5 kb, 또는 약 1 kb의 전장 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함할 수 있다.
유전자 교체 서열은 변이형 rpoC 암호화 서열에 의한, 미생물 염색체 중의 내인성 rpoC 암호화 서열의 교체를 위한 단백질을 암호화한다. 일부 예에서 유전자 교체 서열은 sacB 유전자를 포함하고 단백질은 SacB를 포함한다. 예시적인 sacB 벡터는 문헌[Link et al., Journal of Bacteriology 179:6228-6237 (1997)], 및 하기의 웹사이트: arep.med.harvard.edu/labgc/pko3.html에 기재된 바와 같이 pKO3 및 pKOV를 포함한다.
유전자 교체 벡터를, 변이형 rpoC 암호화 서열, 예를 들어 0.2 내지 5 kb, 0.5 내지 3 kb, 0.7 내지 2.5 kb, 0.8 내지 2 kb, 0.9 내지 1.5 kb, 또는 약 1 kb의 전장 변이형 rpoC 암호화 서열을 전구체 벡터내에 클로닝함으로써 제조할 수 있다. 전구체 벡터는 변이형 rpoC 암호화 서열에 의한, 미생물 염색체 중의 내인성 rpoC 암호화 서열의 교체를 위한 유전자 교체 서열, 예를 들어 단백질, 예를 들어 SacB를 암호화하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
유전자 교체 벡터를 사용하여, 표준 분자 생물학 기법에 의해 서열번호 28을 포함하는 변이형 rpoC 암호화 서열로 미생물 염색체 중의 내인성 rpoC 암호화 서열을 교체시킬 수 있다. 유전자 교체를 위한 sacB 벡터의 용도는 또한 문헌[Link et al.] 및 웹사이트: arep.med.harvard.edu/labgc/pko3.html에 기재되어 있다.
발명의 방식
실시예
실시예 1: 염색체상의 rpoC 서열을 교체하기 위한 플라스미드의 구성
(1) rpoC 단편 및 sacB 벡터의 제조
변형된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)을 갖는 부분적인 변이형 rpoC 서열을 함유하는 2개의 0.5 kb DNA 단편을 증폭시키기 위해서, 에스케리키아 콜라이 균주 LS5218(Coli Genetic Stock Center(CGSC)(균주 6966)로부터 수득되었다)의 게놈 DNA(gDNA)를 QIAGEN 게노믹-팁 시스템을 사용하여 추출하고, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라제(Agilent에 의해 제조)와 함께 주형으로서 gDNA를 사용하여 수행하였다. 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 상응하는 변형된 RpoC 단백질은 서열번호 27이다. 변형된 RpoC 단백질 서열은 rpoC 뉴클레오티드 서열이 ATG 대신에 대안의 개시 코돈 GTG를 포함하는 것으로 간주된다. GTG는 일반적으로 발린을 암호화하지만, 대안의 개시 코돈으로서 GTG는 메티오닌을 암호화한다. PCR을 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 하기와 같이 수행하였다: 30주기의 95℃에서 30초간의 변성, 56℃에서 30초간의 어닐링, 및 72℃에서 30초간의 연장. 또 다른 PCR을 72℃에서 30초간 연장을 위해 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 혼합물을 QIAGEN 정제 키트로 정제하고 이어서 용출시켜 2개의 상이한 0.5 kb DNA 단편을 수득하였다.
sacB 유전자 및 R6K 기원을 함유하는 유전자 교체 벡터(도 6A-B)를 제조하기 위해서, pSKH130을 제한 효소 EcoRV로 절단하였다. PCR 혼합물 및 EcoRV 절단의 반응 혼합물을 QIAGEN 정제 키트로 정제하고 이어서 용출시켜 첫 번째 0.5 kb DNA 단편, 두 번째 0.5 kb DNA 단편, 및 4.7 kb 벡터 DNA 단편(또한 "sacB 벡터 컷"으로서 지칭된다)을 수득하였다.
(2) rpoC 서열을 교체하기 위한 플라스미드의 구성
실시예: 1-(1)에 기재된 첫 번째 0.5 kb DNA 단편, 두 번째 0.5 kb DNA 단편, 및 sacB 벡터 컷을 pJSL47의 구성에 사용하였다. pJSL47 플라스미드를 NEBuilder HiFi DNA 조립 마스터 믹스(NEB에 의해 제조) 및 BW25113(Coli Genetic Stock Center(CGSC)의 균주 7636이다)을 사용하여 구성하였다.
(3) 재조합 E.coli CC06-9642의 제조
에스케리키아 콜라이 LS5218(서열번호 7)의 염색체상의 rpoC를 변이형 rpoC 서열(서열번호 1)로 치환시키기 위해서, pJSL47 플라스미드를 E.coli 균주 LS5218 내로 일렉트로포레이션에 의해 도입시킨 다음 50 ㎎/L의 카나마이신을 함유하는 루리아 베르타니(LB) 아가 플레이트상에서 생육된 단일 콜로니를 선택하였다. 선택된 콜로니의 염색체내로의 pJSL47의 삽입을 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다. 선택된 균주를, sacB 유전자 및 R6K 기원을 "팝 아웃(pop out)"시키기 위해서, NaCl은 없지만 10% 슈크로스를 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 생육시켰다. 형질전환체를, PCR 및 서열 확인에 의해 LS5218 rpoC(서열번호 7)의 변이형 rpoC 서열(서열번호 1)에 의한 교체에 대해 확인하였다. 정확한 유전자형을 갖는 생성 균주를 E.coli CC06-9642로서 표시하였다.
실시예 2: 플라스미드 카피수의 측정
야생형 균주 LS5218, 및 균주 CC06-9642는 모두 F-유사 플라스미드(67,502 bp)를 함유한다. CC06-9642를 생성시킨 후에, F-유사 플라스미드의 존재를 PCR 방법에 의해 확인하였다. 사용된 프라이머는 예를 들어 서열번호 10 및 11의 것이었다. CC06-9642가 생성되었을 때, CC06-9637이 또한 생성되었다. 이들간의 차이는 CC06-9642가 F-유사 플라스미드를 함유하지만, CC06-9637은 이를 함유하지 않는다는 것이다. CC06-9637의 RpoC는 또한 변이형 rpoC이다.
상기 두 균주의 플라스미드 카피수를, PCR 도중 형성된 이중가닥 DNA를 결합시킴으로써 PCR 생성물을 검출하는 SYBR (R) Green I 염료를 사용하는 실시간 PCR(또한 "qPCR"이라 지칭된다)을 사용하여 측정하였다. 프로토콜은 Applied Biosystems 7500 Fast 실시간 PCR 시스템상에서 "단일-용기"로 세포 용해 및 PCR 반응을 수행하기 위해 Fast SYBR (R) Green Cells-to-Ct(TM) 키트를 사용하였다.
세포 용해물을 제조하기 위해서, LB 브로쓰 중의 각각의 균주의 밤새 배양물을 저온(4℃) 1xPBS로 희석한 다음 용해 용액, 정지 용액(Fast SYBR (R) Green Cells-to-Ct(TM) 키트, Cat. # 4402956) 및 RNase A(Life Technologies, Cat. # 12091-021, 20 ㎎/㎖)를 첨가하였다. qPCR 반응 혼합물을, 4 ㎕의 세포 용해물을 16 ㎕의 PCR 칵테일에 가함으로써 제조하였으며, 그의 조성을 표 2에 나타낸다.
PCR 칵테일 조성물
성분 부피
Fast SYBR (R) Green PCR 마스터 믹스 10 ㎕
순방향 프라이머(50μM 스톡) 0.12 ㎕
역방향 프라이머(50μM 스톡) 0.12 ㎕
무-뉴클레아제 수 5.76 ㎕
20 ㎕ qPCR 반응 혼합물을 위한 PCR 칵테일의 최종 부피 16 ㎕
LS5218 및 CC06-9642 세포 샘플 중의 F-유사 플라스미드의 카피수를, β-갈락토시다제를 암호화하는 단일 카피 염색체 lacZ 유전자의 경우에 대한, 플라스미드상의 마커 DNA 서열, 구체적으로 RepFIA 및 RepFIC의 상대적인 풍부성으로부터 추정하였다. RepFIA에 사용된 프라이머는 서열번호 24 및 서열번호 25이었다. RepFIC에 사용된 프라이머는 서열번호 10 및 서열번호 11이었다. lacZ에 대해 사용된 프라이머는 서열번호 12 및 서열번호 13이었다.
실시간 PCR 반응을 하기와 같은 7500 Fast 실시간 PCR 디폴트 프로그램: 1 주기의 95℃에서 20초간의 효소 활성화, 40주기의 95℃에서 3초간의 변성, 60℃에서 30초간의 어닐링 및 연장, 및 해리 곡선을 사용하여 수행하였다.
플라스미드 카피수를 2DCt를 계산함으로써 측정하였으며, 여기에서 DCt는 lacZ 유전자 Ct 값으로부터 RepFIC Ct 값을 공제함으로써 계산되었다(DCt = Ct_lacZ - Ct_repFIC).
qPCR을 사용하는 카피수 측정 결과
균주 lacZ에 대한 RepFIA 상대적인 풍부성 lacZ에 대한 RepFIC 상대적인 풍부성
LS5218 9.2 11.5
CC06-9642 6.2 4.3
표 3에 나타낸 바와 같이, CC06-9642의 F-유사 플라스미드의 카피수는 대조용 LS5218의 경우보다 더 낮았다. 따라서, 변이형 rpoC 서열은 F-유사 플라스미드의 카피수의 감소를 생성시킴이 확인되었다. 플라스미드 카피수가 과도한 경우, 대사 부담이 미생물의 세포에 가해질 수 있다. 상기 결과는 변이형 rpoC가 플라스미드 카피수의 조절의 함수를 가질 수 있음을 가리키며, 따라서 상기 결과로부터 균주가 안정하게 생육될 수 있고 플라스미드가 안정하게 발현될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: RepFIC 레플리콘의 변형된 DNA 서열을 함유하는 플라스미드의 구성
(1) RepFIC 단편 및 카나마이신-내성 유전자 단편의 제조
RepFIC 레플리콘(서열번호 14)을 함유하는 5.2 kb DNA 단편을 증폭시키기 위해서, E.coli LS5218의 게놈 DNA(gDNA)를 QIAGEN 게노믹-팁 시스템을 사용하여 추출하고, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라제(Agilent에 의해 제조)와 함께 주형으로서 gDNA를 사용하여 수행하였다. PCR을 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머를 사용하여 하기와 같이 수행하였다: 30주기의 95℃에서 30초간의 변성, 56℃에서 30초간의 어닐링, 및 72℃에서 5분간의 연장.
카나마이신 내성 유전자를 함유하는 1.4 kb DNA 단편을 증폭시키기 위해서, PCR을 PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라제와 함께 주형으로서 플라스미드 pKD4를 사용하여 수행하였다. PCR을 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 사용하여 하기와 같이 수행하였다: 30주기의 94℃에서 30초간의 변성, 56℃에서 30초간의 어닐링, 및 72℃에서 1분 30초간의 연장.
PCR 반응을 완료하고 이어서 혼합한 후에, 1.3 ㎖의 DpnI 및 5.7 ㎖의 10X 완충제 Tango(Thermo Fisher Scientific으로부터)(Cat No. ER1701)를 각각의 50 ㎕의 PCR 혼합물에 가하고, 이어서 이를 37℃에서 1시간 동안 배양하여 주형 DNA를 제거하였다. 혼합물을 QIAGEN 정제 키트로 정제하고 이어서 용출시켜 5.2 kb DNA 단편(또한 "RepFIC 단편"이라 지칭됨) 및 1.4 kb DNA 단편(또한 "KanR 단편"이라 지칭됨)을 수득하였다.
(2) 변형된 서열을 함유하는 RepFIC 단편의 제조
E.coli LS5218의 RepFIC 레플리콘에 비해 단일의 뉴클레오티드 치환을 포함하고 플라스미드 카피수의 증가를 생성시키는 변형된 RepFIC 레플리콘(서열번호 19)을 수득하였다. 변형된 RepFIC 레플리콘(서열번호 19)을 함유하는 5.2 kb DNA 단편을 증폭시키기 위해서, PCR을 PfuUltra II 융합 HS DNA 폴리머라제와 함께 주형으로서 E.coli LS5218의 gDNA를 사용하여 수행하였다. PCR을 서열번호 15 및 서열번호 20의 프라이머를 사용하여 하기와 같이 수행하였다: 30주기의 95℃에서 30초간의 변성, 56℃에서 30초간의 어닐링, 및 72℃에서 3분간의 연장. 또 다른 PCR을 72℃에서 2분 30초간의 연장을 위해 서열번호 21 및 서열번호 16의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
PCR 반응의 완료 후에, 1.3 ㎖의 DpnI 및 5.7 ㎖의 10X 완충제 Tango(Thermo Fisher Scientific으로부터)(Cat No. ER1701)를 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물에 가하고, 이어서 이를 37℃에서 1시간 동안 배양하여 주형 DNA를 제거하였다. 혼합물을 QIAGEN 정제 키트로 정제하고 이어서 용출시켜 2.8 kb DNA 단편 및 2.4 kb DNA 단편을 수득하였다.
(3) RepFIC 레플리콘의 야생형 또는 변형된 서열을 함유하는 플라스미드의 구성
실시예: 3-(1)에 기재된 RepFIC 단편 및 KanR 단편을 pJSL48이라 칭하는 플라스미드의 구성에 사용하였다. pJSL48 플라스미드를, 도 7A-B에 도시된 바와 같이 NEBuilder HiFi DNA 조립 마스터 믹스(NEB에 의해 제조)를 사용하여 구성하였다.
실시예: 3-(2)에 기재된 2.8 kb 및 2.4 kb DNA 단편 및 실시예: 3-(1)에 기재된 KanR 단편을 pJSL49라 칭하는 또 다른 플라스미드의 구성에 사용하였다. 3개 단편의 깁슨 조립을 도 8A-B에 도시된 바와 같이 NEBuilder HiFi DNA 조립 마스터 믹스로 수행하였다.
실시예 4: 플라스미드 카피수의 측정
플라스미드 카피수를 측정하기 위해서, 플라스미드 pJSL48 및 pJSL49를 E.coli LS5218에 도입시켜, E.coli 균주 CC06-9665 및 CC06-9666을 생성시켰다. 플라스미드 pJSL48 및 pJSL49를 또한 CC06-9642에 도입시켜, 각각 E.coli 균주 CC06-9638 및 CC06-9639를 생성시켰다.
E.coli 균주 CC06-9665, 9666, 9638 및 9639 중의 플라스미드의 카피수를 실시예 2에 기재된 바와 같이, 실시간 PCR 방법을 사용하여 측정하였다.
세포 샘플 중 플라스미드의 카피수를 β-갈락토시다제를 암호화하는 단일 카피 염색체 lacZ의 경우에 비해, 플라스미드상의 마커 DNA 서열, RepFIC 레플리콘의 상대적인 풍부성으로부터 평가하였다. RepFIC에 사용된 프라이머는 서열번호 10 및 서열번호 11이었다. lacZ에 사용된 프라이머는 서열번호 12 및 서열번호 13이었다. 카나마이신-내성 유전자에 사용된 프라이머는 서열번호 22 및 서열번호 23이었다.
qPCR 카피수 측정 결과
균주 lacZ에 대한 KanR 상대적인 풍부성 lacZ에 대한 repFIC 상대적인 풍부성
CC06-9665 5.4 8.8
CC06-9666 51.7 71.0
CC06-9638 4.0 4.8
CC06-9639 18.4 19.6
표 4에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pJSL49내에 도입된 변형된 RepFIC 서열을 함유하는 균주인 균주 CC06-9666 및 9639의 플라스미드 카피수는 균주 CC06-9665 및 9638의 경우보다 더 높았다. 균주 CC06-9665의 플라스미드 카피수는 CC06-9638의 경우보다 더 높았고, 균주 CC06-9666의 플라스미드 카피수는 CC06-9639의 경우보다 더 높았다. 따라서, 교체된 rpoC 서열은 RepFIC 레플리콘, 즉 E.coli LS5218의 RepFIC 레플리콘 또는 변형된 RepFIC가 사용된 것과 독립적으로 플라스미드 카피수의 감소를 생성시킴이 확인되었다.
본원에 개시된 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자는 벡터, 예를 들어 플라스미드의 카피수를 조절하는데 유용하며, 따라서 벡터의 사용에 의한 표적 생성물의 상업적인 생산을 개선시키는데 유용하다.
생물학적 기탁에 관한 정보
R47C 치환을 포함하는 변이형 RpoC를 암호화하는 변이형 rpoC 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하도록 형질전환된 E.coli 균주를 상술한 바와 같이 제조하였으며, 에스케리키아 콜라이 CC06-9637로서 표시하였고, 2018년 6월 15일자로, 부다페스트 조약에 따라 국제 공인 기탁 기관인 한국 미생물 배양 센터에 수납번호 KCCM12276P로 기탁하였다. 상기 균주는 부다페스트 조약에 따라 국제 공인 기탁 기관에 의해 기탁된다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12276P 20180615
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Nucleic Acid Molecules Comprising a Variant RpoC Coding Sequence <130> IKPA201775-KR <150> US 62/715,530 <151> 2018-08-07 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct modified rpoC <400> 1 gtgaaagatt tattaaagtt tctgaaagcg cagactaaaa ccgaagagtt tgatgcgatc 60 aaaattgctc tggcttcgcc agacatgatc cgttcatggt ctttcggtga agttaaaaag 120 ccggaaacca tcaactactg tacgttcaaa ccagaacgtg acggcctttt ctgcgcccgt 180 atctttgggc cggtaaaaga ttacgagtgc ctgtgcggta agtacaagcg cctgaaacac 240 cgtggcgtca tctgtgagaa gtgcggcgtt gaagtgaccc agactaaagt acgccgtgag 300 cgtatgggcc acatcgaact ggcttccccg actgcgcaca tctggttcct gaaatcgctg 360 ccgtcccgta tcggtctgct gctcgatatg ccgctgcgcg atatcgaacg cgtactgtac 420 tttgaatcct atgtggttat cgaaggcggt atgaccaacc tggaacgtca gcagatcctg 480 actgaagagc agtatctgga cgcgctggaa gagttcggtg acgaattcga cgcgaagatg 540 ggggcggaag caatccaggc tctgctgaag agcatggatc tggagcaaga gtgcgaacag 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305 310 315 320 Leu Lys Gly Lys Gln Gly Arg Phe Arg Gln Asn Leu Leu Gly Lys Arg 325 330 335 Val Asp Tyr Ser Gly Arg Ser Val Ile Asp Val Gly Pro Ser Leu Lys 340 345 350 Phe Asn Gln Met Gly Leu Pro Val Pro Met Ala Leu Glu Leu Phe Arg 355 360 365 Pro Phe Ile Met Lys Glu Leu Val Ala Arg Gly Leu Ala Ser Asn Ile 370 375 380 Lys Asn Ala Lys Arg Gln Ile Asp Arg Glu Asp Asp Asp Val Phe Asn 385 390 395 400 Val Leu Glu Asp Val Ile Lys Glu His Pro Val Leu Leu Asn Arg Ala 405 410 415 Pro Thr Leu His Arg Leu Gly Ile Gln Ala Phe Glu Pro Val Leu Val 420 425 430 Ser Gly Lys Ala Met Arg Leu His Pro Leu Ala Cys Glu Ala Tyr Asn 435 440 445 Ala Asp Phe Asp Gly Asp Gln Met Ala Ile His Val Pro Leu Ser Asp 450 455 460 Glu Ala Gln Ala Glu Ala Arg Leu Leu Met Leu Ala Ala His His Ile 465 470 475 480 Leu Ala Pro Ala Ser Gly Lys Pro Val Val Ala Pro Ser Gln Asp Met 485 490 495 Val Ile Gly Asn Tyr Tyr Leu Thr Met Glu Glu Ala Asn Arg Glu Gly 500 505 510 Glu Gly Met Ile Phe Thr Asp Leu Asp Glu Ala Thr Leu Ala Tyr Arg 515 520 525 Asn Gly Ile Val His Trp His Thr Arg Val Gly Val Gln Val Thr Ser 530 535 540 Met Pro Asp Lys Pro Phe Thr Asp Glu Gln Arg Ser Lys Ile Met Val 545 550 555 560 Thr Thr Val Gly Lys Leu Ile Phe Asn Asn Ile Leu Pro Lys Ser Phe 565 570 575 Pro Tyr Leu Asn Glu Pro Thr Ser Thr Asn Leu Asn Gly Tyr Val Pro 580 585 590 Asp Lys Tyr Phe Leu Glu Pro Gly Glu Asp Ile His Asp Tyr Leu Gln 595 600 605 Asn Ala Glu Ile Ile Pro Pro Phe Lys Lys Gly Phe Leu Ser Asp Ile 610 615 620 Ile Ala Ala Val Tyr Gln Gln Tyr Lys Val Thr Ala Thr Ser Glu Leu 625 630 635 640 Leu Asp Arg Ile Lys Asp Leu Gly Tyr Asn Glu Ser Thr Lys Ser Gly 645 650 655 Leu Thr Val Gly Met Val Asp Val Thr Asp Leu Lys Glu Lys Pro Glu 660 665 670 Ile Ile Ala Ala Ala His Lys Gln Val Ser Thr Val Thr Lys Gln Phe 675 680 685 Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp His Glu Arg Tyr Glu Arg Val Ile Gly 690 695 700 Ile Trp Asn Asp Ala Lys Asp Glu Ile Gln Asn Ala Leu Ile His Ser 705 710 715 720 Phe Asp Gln Gln Asn Pro Ile Phe Met Met Ser Asp Ser Gly Ala Arg 725 730 735 Gly Asn Ile Ser Asn Phe Thr Gln Leu Ala Gly Met Arg Gly Leu Met 740 745 750 Ala Ala Pro Ser Gly Asp Ile Met Glu Leu Pro Ile Thr Ser Asn Phe 755 760 765 Arg Glu Gly Leu Thr Val Met Glu Met Phe Ile Ser Thr His Gly Ala 770 775 780 Arg Lys Gly Met Thr Asp Thr Ala Leu Lys Thr Ala Asn Ser Gly Tyr 785 790 795 800 Leu Thr Arg Arg Leu Val Asp Val Ala Gln Asp Val Ile Ile Arg Glu 805 810 815 Lys Asp Cys Gly Thr Asp Arg Gly Leu Lys Ile Arg Ala Ile Thr Asp 820 825 830 Gly Asn Glu Met Ile Glu Pro Leu Tyr Asp Arg Ile Leu Gly Arg Tyr 835 840 845 Thr Gln Lys Thr Val Tyr Asp Pro Gln Thr Gly Asp Val Ile Val Pro 850 855 860 Lys Asn Gln Met Ile Val Glu Asp Thr Ala Gln Gln Ile Val Asp Ala 865 870 875 880 Gly Val Glu Glu Val Thr Ile Arg Ser Ala Phe Thr Cys Asn Thr Glu 885 890 895 His Gly Val Cys Glu His Cys Tyr Gly Arg Asn Met Ala Thr Gly Asp 900 905 910 Glu Val Glu Val Gly Glu Ala Val Gly Thr Val Ala Ala Gln Ser Ile 915 920 925 Gly Glu Pro Gly Thr Gln Leu Thr Met Arg Asn Phe His Thr Gly Gly 930 935 940 Val Ala Gly Asn Glu Asp Ile Thr Gln Gly Leu Pro Arg Val Gln Glu 945 950 955 960 Leu Phe Glu Ser Arg Asn Pro Lys Gly Lys Ala Glu Ile Thr Glu Val 965 970 975 Thr Gly Thr Val Glu Ser Ile Glu Glu Asn Pro Ala Glu Arg Thr Lys 980 985 990 Glu Ile Thr Ile Lys Gly Glu Ala Asp Thr Arg Ser Tyr Thr Leu Pro 995 1000 1005 Ile Thr Ala Arg Met Arg Val Ser Glu Gly Asp Phe Ile His Arg Gly 1010 1015 1020 Gly Ala Leu Asn Tyr Gly Ser Val Asp Pro Lys Glu Leu Leu Arg Val 1025 1030 1035 1040 Arg Asp Val Leu Ser Thr Glu Thr Tyr Ile Leu Gly Glu Val Gln Arg 1045 1050 1055 Val Tyr Arg Met Gln Gly Val Ala Ile Ser Asp Lys His Val Glu Ile 1060 1065 1070 Met Val Arg Gln Met Leu Arg Lys Val Arg Ile Met Asp Pro Gly Asp 1075 1080 1085 Thr Asp Val Leu Pro Gly Thr Leu Met Asp Ile Gln Asp Phe Arg Arg 1090 1095 1100 Ala Asn Tyr Gln Thr Leu Ile Asp Gly Gly Ile Ala Ala Thr Ala Arg 1105 1110 1115 1120 Pro Val Ile Leu Gly Ile Thr Lys Ala Ala Leu Glu Thr Asn Ser Phe 1125 1130 1135 Leu Ser Ala Ala Ser Phe Gln Glu Thr Thr Arg Val Leu Thr Asp Ala 1140 1145 1150 Ala Ile Arg Gly Lys Asn Asp Pro Leu Val Gly Leu Lys Glu Asn Val 1155 1160 1165 Ile Ile Gly Lys Ile Ile Pro Ala Gly Thr Gly Met Pro Asp Tyr Arg 1170 1175 1180 Gln Ile Lys Pro Lys Glu Val Gly Gly Thr Ser Thr Glu Gly Val Tyr 1185 1190 1195 1200 Ser Ile Ser Asp Leu Glu Lys Gln Met Gln Glu Asp Ser Gln Ala 1205 1210 1215

Claims (15)

  1. 변이형 rpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질 암호화 서열(변이형 rpoC 암호화 서열)을 포함하는 핵산 분자로,
    상기 변이형 rpoC 암호화 서열이 변이형 RpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질(변이형 RpoC)을 암호화하고;
    상기 변이형 RpoC가 서열번호 27에 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, R47C 치환을 포함하며, 이때 상기 R47C 치환의 넘버링은 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 야생형 RpoC RNA-폴리머라제 β' 서브유닛 단백질(야생형 RpoC)에 기초하여 정의되는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    변이형 RpoC의 발현이 서열번호 26을 포함하는 야생형 RpoC의 발현에 비해 플라스미드의 카피수를 감소시키는, 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    변이형 RpoC가
    (1) 서열번호 28을 포함하는 N-말단 도메인;
    (2) 서열번호 29를 포함하는 센트럴 도메인; 및
    (3) 서열번호 30을 포함하는 C-말단 도메인
    을 포함하고, R47C 치환이 N-말단 도메인 내에 존재하는, 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    변이형 RpoC가
    (1) 서열번호 31을 포함하는 N-말단 도메인;
    (2) 서열번호 32를 포함하는 센트럴 도메인; 및
    (3) 서열번호 33을 포함하는 C-말단 도메인
    을 포함하고, R47C 치환이 N-말단 도메인 내에 존재하는, 핵산 분자.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    변이형 RpoC가 서열번호 27을 포함하는, 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  8. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 미생물.
  9. 제8항에 있어서,
    핵산 서열을 포함하는 rpoC 암호화 서열 벡터를 형질전환, 접합, 또는 형질도입 중 하나 이상에 의해 전구체 미생물 내에 도입시킴으로써 제조되거나; 또는
    염색체를 포함하고, 변이형 rpoC 암호화 서열이 상기 변이형 rpoC 암호화 서열에 의한 내인성 rpoC 암호화 서열의 교체에 기초하여 상기 염색체 내에 존재하는
    재조합 미생물.
  10. 제8항에 있어서,
    에스케리키아 속의 세균 또는 에스케리키아 콜라이 종의 세균 중 하나 이상으로부터 제조된 재조합 미생물.
  11. 제8항의 재조합 미생물에서 대상 벡터의 카피수를 조절하는 방법으로, 상기 재조합 미생물을 상기 대상 벡터의 복제에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 대상 벡터의 카피수를 조절하는 방법.
  12. 제8항의 재조합 미생물의 사용에 의해 표적 생성물을 제조하는 방법으로, 상기 재조합 미생물이 표적 유전자 벡터를 포함하고, 상기 표적 유전자 벡터가 표적 생성물의 제조를 위한 표적 유전자를 포함하고,
    (1) 상기 재조합 미생물을, 상기 재조합 미생물이 상기 표적 유전자를 발현하는 조건하에 배양 배지에서 배양하여, 상기 표적 생성물을 생성시키는 단계; 및
    (2) 상기 재조합 미생물 및/또는 상기 배양 배지로부터 상기 표적 생성물을 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    표적 생성물이 (i) 표적 RNA, (ii) 표적 단백질, (iii) 표적 생물물질, (iv) 표적 중합체, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (v) 표적 감미제, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (vi) 표적 오일, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (vii) 표적 지방, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (viii) 표적 폴리사카라이드, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (ix) 표적 아미노산, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (x) 표적 뉴클레오티드, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, (xi) 표적 백신, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, 또는 (xii) 표적 약학 생성물, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    표적 생성물이 (i) 표적 중합체, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소, 또는 (ii) 표적 생물중합체, 그의 전구체, 또는 그의 생성을 위한 효소 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  15. 변이형 rpoC 암호화 서열 및 유전자 교체 서열을 포함하는 유전자 교체 벡터로,
    상기 변이형 rpoC 암호화 서열이 서열번호 28을 포함하는 변이형 RpoC N-말단 도메인을 암호화하고;
    상기 유전자 교체 서열이 미생물의 염색체 중의 내인성 rpoC 암호화 서열을 상기 변이형 rpoC 암호화 서열로 교체하기 위한 것인
    유전자 교체 벡터.
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