KR102654301B1 - NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 - Google Patents

NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법{NADH:quinone oxidoreductase expression-modulated recombinant microorganism and method for producing O-phosphoserine, cysteine and its derivatives using the same}
본 출원은 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임 A 생합성의 전구 물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC(D,L-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid)를 생물학적으로 전환하는 방법, 2) 대장균을 이용한 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법(유럽 등록특허 EP0885962B; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006), 3) 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")을 발효 생산한 후, O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 "OPSS")의 촉매 작용 하에 황화물과 반응시켜 L-시스테인으로 전환시키는 방법(US 2012-0190081 A1)이 공지되어 있다.
이 때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서는 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 존재하였다.
본 출원의 목적은 NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화되고, O-포스포세린 생산능을 가진, 에스케리키아 속 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 a) NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는, NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된, O-포스포세린을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")"은 세린의 인산(phosphoric acid) 에스테르로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, O-포스포세린 설프하이드릴라아제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(US 2012-0190081 A1).
본 출원의 용어 "NADH:quinone 산화환원효소 (NADH:quinone oxidoreductase, 이하, "Nuo")"는 미생물의 전자전달계에서 NADH를 산화하여 세포내막의 quinone을 환원시키는 효소이다. 상기 효소 단백질은 NADH 탈수소화효소-1 (NADH dehydrogenase-1: NDH-1) 으로도 명명될 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 그 예로 nuoABCEFGHIJKLMN 유전자 클러스터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 nuoABCEFGHIJKLMN 유전자 클러스터는 nuo 오페론을 구성하며, 상기 오페론 앞쪽의 프로모터와 리보좀 결합부위의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현이 조절될 수 있다. 본 출원에서 'nuoABCEFGHIJKLMN 유전자'는 'NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자' 및 'nuoABCEFGHIJKLMN 유전자', 'nuo 오페론', 'nuo 유전자'와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 "오페론" 은 하나의 발현 조절 서열, 구체적으로는 하나의 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자군을 포함하는 DNA의 기능적 단위를 의미한다. 오페론에 의해 전사된 mRNA는 단일 mRNA 분자가 1개 이상의 단백질을 코딩하는 폴리시스트로닉(polycistronic) mRNA이거나, 단일 mRNA 분자가 1개의 단백질을 코딩하는 모노시스트로닉(monocistronic) mRNA일 수 있다.
Nuo는 13개의 아단위(subunit) 단백질의 복합체로 (NuoA, NuoB, NuoC, NuoE, NuoF, NuoG, NuoH, NuoI, NuoJ, NuoK, NuoL, NuoM, NuoN), 각 아단위 단백질의 번역은 두 종류의 오페론인 nuoABCEFGHIJKL 과 nuoMN을 주형으로 한다. 상기 nuo 오페론의 구조는 EcoCyc(www.biocyc.org)에서 확인할 수 있다(수납번호: EG12082). 상기 nuo 오페론은 구조 유전자(Structure Gene) 및 발현조절영역(regulatory region)을 포함하는 것으로 알려져 있다. 상기 nuo 오페론의 "발현조절영역"은 nuo 오페론을 구성하는 구조 유전자의 업스트림에 존재하여 구조 유전자의 발현을 조절할 수 있는 부위를 의미한다. nuo 오페론의 발현조절영역은 구조 유전자를 제외한 프로모터 (nuoA 프로모터 및/또는 nuoM 프로모터)와 오퍼레이터를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 nuo 오페론은 서열번호 26 내지 서열번호 38로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 nuo 오페론은 서열번호 26 내지 38 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지며 이에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 구조유전자 서열; 및 상기 구조유전자 서열의 발현을 조절하는 발현조절영역을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 26 내지 38의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 nuo 오페론은 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 염기 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 nuo 오페론에 상응하는 기능을 나타내는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기 서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 용어 "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법을 모두 포괄한다.(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)
본 출원의 미생물은 OPS를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 보다 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 에스케리키아 속 미생물의 경우, L-세린의 생합성 경로의 효소인 SerA, SerC 및 SerB를 통해, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(ll):7 139-44.).
본 출원의 "O-포스포세린을 생산하는 미생물"이란, 자연적으로 O-포스포세린의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 O-포스포세린의 생산능이 없는 모균주에 O-포스포세린의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 Nuo 활성이 강화된, O-포스포세린을 생산하는 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 O-포스포세린을 생산하는 미생물은 본 출원에서 개시된 방법으로 Nuo 활성이 강화되어, O-포스포세린을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 본 출원에서 상기 "O-포스포세린을 생산하는 미생물"은 "O-포스포세린 생산 미생물", "O-포스포세린 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 O-포스포세린을 생산하는 미생물은 상기 Nuo의 활성이 강화되어, 목적하는 O-포스포세린 생산능이 증가된, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 단백질의 "활성 강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 모균주는 에스케리키아 콜라이 ATCC27325 일 수 있다. 다른 예로, 상기 모균주는 OPS 생산능이 증가되도록 하는 변형을 포함하는 균주일 수 있고, 예를 들어 CA07-0012 (KCCM 11212P; US2012-0190081A) 또는 CA07-4821일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 활성 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 Nuo일 수 있으나, nuo 오페론에 의해 코딩되어, NADH를 소모 또는 NADH를 소모하여 Proton motive force를 형성하는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 Nuo 활성의 강화는, Nuo 단백질 복합체를 구성하는 아단위 단백질 중 1 이상의 활성이 강화되는 것을 포함한다.
구체적으로, 본 출원의 단백질 활성 강화는,
1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가;
2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열의 변형;
3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열의 변형;
4) 단백질 활성이 강화되도록 아미노산 서열을 변형;
5) 단백질 활성이 강화되도록 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 활성이 강화되도록 변형된 단백질을 코딩하도록 상기 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 변형);
6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 pCL, pSK, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 변형하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체하거나 이를 삽입함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 뒤에 강력한 이종 프로모터를 삽입한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터 및 rmf 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 내재적 활성에 비해 강력한 프로모터로 치환하는 것은 모두 포함한다.
상기 3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열 변형은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환 된 세포를 선별할 수 있다.
상기 6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 단백질의 활성 강화는 상기 1) 내지 2) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는, nuo 오페론의 발현 증가일 수 있다. 전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 이를 코딩하는 유전자의 업스트림에 활성이 강화된 유전자 발현 조절 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림은 nuoA 유전자의 업스트림일 수 있다. 일 구현예로, NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 Nuo 단백질 복합체를 코딩하는 nuo 오페론에 존재하는 하나의 발현 조절 서열을 변형함으로써 오페론에 존재하는 1 이상의 구조 유전자, 예를 들어 2 이상, 3 이상, 또는 전체 구조 유전자 서열의 발현이 강화되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 발현 조절 서열의 변형은 nuo 오페론의 내재적 프로모터와 nuoA 유전자 사이에 활성이 강화된 유전자 발현 조절 서열이 추가로 삽입되는 것일 수 있고, 예를 들어 상기 유전자 발현 조절 서열은 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 단백질의 활성 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 Nuo의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 미생물은 추가적으로 OPS의 생산능 및/또는 세포 밖으로의 배출 능력을 강화하거나; OPS의 분해능 및/또는 유입 능력을 강화하는 변형을 포함하는 것일 수 있다.
OPS의 생산능 및/또는 세포 밖으로의 배출 능력을 강화하거나; OPS의 분해능 및/또는 유입 능력을 강화하는 변형의 예시로, 포스포세린 포스포타아제(SerB)의 활성 약화; 포스포세린 배출단백질(YhhS) 활성 강화; 또는 이들 변형의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화" 는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원의 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원의 SerB는 서열번호 2으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 2으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원의 SerB는 SerB의 활성을 나타내는 한, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB는 서열번호 2으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 3을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 SerB 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, SerB 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 YhhS는 OPS를 배출하는 활성을 지니므로, 상기 YhhS 활성이 강화되도록 변이된 미생물은 OPS를 배출하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원의 YhhS는 서열번호 4으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원의 YhhS는 YhhS의 활성을 나타내는 한, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 YhhS는 서열번호 4으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 본 출원의 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 YhhS 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, YhhS 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, OPS의 생산능 및/또는 세포 밖으로의 배출 능력을 강화하거나; OPS의 분해능 및/또는 유입 능력을 강화하는 변형을 포함하는 미생물은 CA07-0012 (KCCM 11212P; US2012-0190081A) 또는 CA07-4821 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 한국등록특허 제1381048호 또는 미국공개공보 제2012-0190081호 등에 개시된 내용이 본 출원의 참고자료로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, OPS의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물의 배양은, 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10g/L, 구체적으로 0.5 내지 3g/L일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트 추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5g/L, 구체적으로 0.1 내지 1g/L 일 수 있다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 함유염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화학물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리클리콜에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 구체적으로 30℃ 내지 35℃일 수 있다. 배양물의 배양기간은 원하는 유용물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로 10 내지 100 시간일 수 있다. 그러나 이들 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 본 출원의 방법에서 상기 배양하는 단계 이전, 배지를 준비하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 배양에 따른 배지 또는 미생물로부터 OPS를 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
본 출원의 OPS를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 OPS를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 OPS를 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 OPS는 정제된 형태 또는 OPS를 함유한 미생물 발효액일 수 있다. 또한, 상기 배양 단계의 전후, 상기 회수 단계의 전후에 당해 분야에서 공지된 적합한 방법을 추가하여, OPS의 회수를 효율적으로 수행할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 a) NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하여 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a)단계에서 생산된 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
구체적으로는 Nuo의 활성이 강화된 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하여 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계 및 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 단계에서 생산된 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법일 수 있다. 상기 NADH:quinone 산화환원효소 활성 강화 및 O-포스포세린을 생산하는 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 출원에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기 (-NH 2)의 질소 원자 또는 티올 기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 방법에 따라 시스테인을 생산하기만 한다면, 시스테인 유도체로의 전환은 당업계에 널리 알려진 방법으로 용이하게 다양한 시스테인 유도체로의 전환이 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 예로 시스테인을 아세틸레이션에이젼트(acetylation agent)와 반응시켜 NAC(N-acetylcysteine)를 합성하거나, 시스테인을 염기성 조건에서 할로아세틱에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로서 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS에 티올그룹(thiol, group, SH 기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropymm pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 메그마틱스(Mycobacterium megmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al. J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005) 에서 처음으로 밝혀진 것일 수 있다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체 단백질도 포함하며, US 2012-0190081 A1 및 US 9127324 B2호에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 변이체 단백질도 모두 포함할 수 있다.
상기 황화물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S203 2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH 기)으로 전환될 수 있는 황화물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH, H2S, (NH4)2S, NaSH 및 Na2S203를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된, OPS를 생산하는 미생물은 OPS를 고효율로 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1 : Nuo 발현조절영역이 변이된 균주의 OPS 생산능 평가
선행연구 결과, OPS 생산 호스트 균주에서 유전자 nuoA, rmf, idi의 평균 전사량은 각각 8986, 32205, 631 임을 알 수 있었으며 배양구간 별 구체적인 수치는 표 1에 나타난 바와 같다.
Gene
name		 Early Exponential Mid Exponential Late Exponential Stationary Average
idi 914 740 637 234 631
nuoA 6969 7517 8535 12922 8986
rmf 30725 28192 28109 41792 32205
rmf 전사량의 평균값은 nuoA에 비해 3.6배 수준임을 나타내고 있으며, idi 전사량의 평균값은 nuoA에 비해 0.07배 수준임을 확인할 수 있었다. 이는 nuoA의 프로모터에 대비 rmf 유전자의 프로모터는 강한 프로모터이며, idi 유전자의 프로모터는 약한 프로모터임을 나타낸다.
따라서 OPS 생산 미생물 내 nuo 오페론(서열번호 1)에 활성이 다른 rmf 프로모터와 idi 프로모터를 삽입함으로써 NADH:quinone 산화환원효소의 발현을 조절하였을 때 미생물의 OPS 생산능을 비교하고자 하였다.
1-1 : Nuo 발현조절영역을 강화시키기 위한 플라스미드 제작
E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 14 및 15의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 nuo 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였고, 서열번호 18 및 19의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 상기 프로모터의 다운스트림(Downstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 또한 E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 16 및 17의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 rmf 유전자의 프로모터 부위를 수득하였다.
상기의 단편들을 획득하기 위해서 중합효소 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용한 PCR을 실시하였고, PCR은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
상기의 과정으로 획득된 nuo 프로모터의 업스트림 단편과 다운스트림 단편, 및 rmf 프로모터 단편은 EcoRV 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSKH130(서열번호 39, 미국 공개특허 제2020-0048619호)와 함께 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pSKH130_Prmf-nuoA 로 명명하였다.
1-2 : Nuo 발현조절영역을 약화시키기 위한 플라스미드 제작
E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 14 및 20의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 nuo 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하고, 서열번호 23 및 19의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 상기 프로모터의 다운스트림(Downstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 또한 E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 idi 유전자의 프로모터 부위를 수득하였다.
실시예 1-1과 동일한 PCR 조건으로 PCR을 진행하여 상기 단편을 획득하였고 상기 단편을 이용하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 클로닝을 진행함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였다. 이를 pSKH130_Pidi-nuoA 로 명명하였다.
실시예 1-1과 실시예 1-2에서 사용한 프라이머 서열을 표 2에 나타내었다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
14 UP F1 CTGCAGGAATTCGATCAACCACCAGAGATTCACGT
15 UP R1 GCTTCCTGACTCCAGTGCTTACTCATCAAAAGTAG
16 Prmf F TTTGATGAGTAAGCACTGGAGTCAGGAAGCCGCTT
17 Prmf R TGTTGACATACTCATGCCTCGTTTCCCTCATACTG
18 Down F1 TGAGGGAAACGAGGCATGAGTATGTCAACATCCAC
19 Down R1 ACGGTGAGAACGACCGTTACATCACGCTAGTCGAC
20 UP R2 TCATTTTTCTTCAGCTGCTTACTCATCAAAAGTAG
21 Pidi F TTTGATGAGTAAGCAGCTGAAGAAAAATGAGCATG
22 Pidi R TGTTGACATACTCATAATTTCTCACATGTAATTCTGATC
23 Down F2 TACATGTGAGAAATTATGAGTATGTCAACATCCAC
1-3 : Nuo 발현조절영역 변이 균주 제작
실시예 1-1에서 제작한 pSKH130_Prmf-nuoA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 을 이용하여 OPS 생산능을 갖는 CA07-0012 (KCCM 11212P, 미국 공개특허 제2012-0190081호)에 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 nuo 유전자의 야생 프로모터 염기서열 말단에 rmf 유전자의 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4826를 얻었다.
구체적으로, pSKH130 벡터가 PI 단백질(pir 유전자)에 의존성을 가지는 R6K 리플리콘(replicon), SacB(Levansucrase) 유전자 및 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하고 있으므로, 1차 교차에서 R6K 및 카나마이신을 이용하여 원하는 균주를 확보한 후, 수크로스(sucrose)가 있는 배지에서 항생제를 제거하여 균주를 제작하였다.
상기 CA07-4826는 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 rmf 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다.
같은 방식으로, 상기 실시예 1-2에서 제작한 pSKH130_Pidi-nuoA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)을 이용하여 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 nuo 유전자의 야생 프로모터 염기서열 말단에 idi 유전자의 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4827를 얻었다. 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 상기 균주 CA07-4827에 idi 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
24 NuoP Conf F GAGAGCTACCATAATCCGTG
25 NuoP Conf R CATCTCAACGTAACAGCAGG
1-4 : 역가배지를 이용한 nuo 오페론 강화 및 약화 균주의 OPS 생산능 비교
상기 실시예 1-3에서 제작한 2종 균주 CA07-4826, CA07-4827와 대조군 CA07-0012의 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하에서 OPS로 기재) 생산능을 평가하기 위해서 하기 배지(표 4)를 이용하여 평가를 진행하였다.
배지성분 조제량
포도당 40g
KH2PO4(KP1) 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4.7H2O 1g
MnSO4.4H2O 5mg
FeSO4.7H2O 10mg
L-글리신 1.5g/L
효모액기스 2.5g/L
CaCO3 30g/L
pH 6.8
구체적으로, 배양은 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 3의 25mL 역가배지에 접종한 다음, 이를 33℃ 온도에서 200rpm으로 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 그 결과 생산된 OPS 농도를 표 5에 나타내었다.
균주 이름 OPS(g/L)
CA07-0012 1.95
CA07-4826 2.20
CA07-4827 0.40
rmf 프로모터에 의해 nuo 오페론이 강화된 CA07-4826은 모균주에 비해 약 12.8% 향상된 OPS 생산능을 보였으며, idi 프로모터에 의해 nuo 오페론이 약화된 CA07-4827는 모균주에 비해 약 79.5% 감소한 OPS 생산능을 보였다.
실시예 2 : OPS 생산능이 증가한 균주 내 nuo 오페론 강화에 따른 OPS 생산능 평가
OPS 배출능이 강화된 균주에서 Nuo 오페론을 강화하였을 때 추가로 OPS 생산능이 증가하는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여 OPS 배출능을 지닌 단백질 YhhS(서열번호 4, 미국 등록특허 10323262 B2)이 강화된 균주에서 nuo 오페론을 추가로 강화시켰을 때 OPS 생산능을 평가하였다.
2-1 : OPS 생산 균주 내 YhhS 강화를 위한 플라스미드 제작
E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용하여 yhhS 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였고 서열번호 8 및 9의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용하여 yhhS 유전자의 야생형 프로모터 다운스트림(Downstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 또한 pCL_Ptrc-gfp(US 2017-0247727 A1)를 주형으로 서열번호 8 과 서열번호 9 프라이머 쌍을 이용하여 trc 프로모터(Ptrc)를 수득하였다. 상기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 6과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
6 yhhS UP F CTGCAGGAATTCGATGAAGGTAACCACTTTTTCCG
7 yhhS UP R GAGTTGCAGCAAGCGGAGGATCACCACATTTTTAC
8 Ptrc F AATGTGGTGATCCTCCGCTTGCTGCAACTCTCTCA
9 Ptrc R TACGGGTTCGGGCATGATAGCTCTCCTGTGTGAAA
10 yhhS Down F CACAGGAGAGCTATCATGCCCGAACCCGTAGCCGA
11 yhhS Down R GTCGACTAGCGTGATAGCGGTTTGCCTTTACTGGC
상기의 단편들을 획득하기 위해서 중합효소 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
상기의 과정으로 획득된 yhhS 프로모터의 업스트림 단편과 다운스트림 단편, 및 trc 프로모터 단편은 EcoRV 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSKH130와 함께 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pSKH130_Ptrc-yhhS 로 명명하였다.
2-2 : YhhS 강화 균주 제작
상기 실시예 2-1에서 제작한 pSKH130_Ptrc-yhhS를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 을 이용하여 CA07-0012에 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 yhhS 유전자의 야생형 프로모터 염기서열 말단에 trc 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4821를 얻었다. 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 쌍 (표 7) 을 이용하여 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 상기 균주 CA07-4821에 trc 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
12 yhhSP Conf F AGTTGAGCAAAAACGCCAGT
13 yhhSP Conf R GCCATACCGTACAGCCAGAC
2-3 : 역가배지를 이용한 YhhS 강화 균주의 OPS 생산능 평가
상기 실시예 2-2에서 제작한 균주 CA07-4821 과 그 모균주인 CA07-0012의 OPS 생산능을 평가하기 위해서 배지(표 4)를 이용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 평가를 진행하였다.
그 결과, CA07-4821의 경우 CA07-0012 대비 약 26.7% 향상된 OPS 생산능을 갖는 것을 확인하였으며, 이를 표 8 에 나타내었다.
균주 이름 OPS(g/L)
CA07-0012 1.95
CA07-4821 2.47
2-4 : YhhS 및 nuo 오페론이 강화된 균주 제작
실시예 1-1에서 제작한 pSKH130_Prmf-nuoA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 을 이용하여 상기 실시예 2-3에서 제작한 CA07-4821에 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 nuo 유전자의 야생 프로모터 염기서열 말단에 rmf 유전자의 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4828을 얻었다.
상기 균주 CA07-4828는 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 rmf 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다.
2-5 : 역가배지를 이용한 YhhS 및 nuo 오페론이 강화된 균주의 OPS 생산능 평가
상기 CA07-4828의 OPS 생산능을 평가하기 위해서 CA07-4821을 대조군으로 실시예 1-4와 동일한 방법으로 평가를 진행하였고 그 결과를 표 9에 나타내었다.
균주 이름 OPS(g/L)
CA07-4821 2.47
CA07-4828 2.53
YhhS 및 nuo 오페론이 동시 강화된 CA07-4828의 경우 YhhS만이 강화된 CA07-4821 대비 약 2.4% 향상된 OPS 생산능을 보였으며, 이로써 OPS 생산능이 강화된 균주에서도 nuo 오페론 강화가 OPS 생산능을 추가로 증가시키는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> NADH:quinone oxidoreductase expression-modulated recombinant microorganism and method for producing O-phosphoserine, cysteine and its derivatives using the same <130> KPA201455-KR <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuo operon <220> <221> misc_feature <222> (1)..(630) <223> nuoA promoter <220> <221> misc_feature <222> (631)..(633) <223> nuoA start codon <220> <221> misc_feature <222> (1090)..(1092) <223> nuoB start codon <220> <221> misc_feature <222> (1846)..(1848) <223> nuoC start codon <220> <221> misc_feature <222> (3651)..(3653) <223> nuoE start codon <220> <221> misc_feature <222> (4148)..(4150) <223> nuoF start codon <220> <221> misc_feature <222> (5532)..(5534) <223> nuoG start codon <220> <221> misc_feature <222> (8261)..(8263) <223> nuoH start codon <220> <221> misc_feature <222> (9253)..(9255) <223> nuoI start codon <220> <221> misc_feature <222> (9807)..(9809) <223> nuoJ 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Ala Asn Ala Asn His 50 55 60 Leu Ala Ser Leu Phe Leu Gly Ile Glu Leu Ile Ser Leu Pro Leu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Val Gly Tyr Ala Phe Arg Gln Lys Arg Ser Leu Glu Ala Ser 85 90 95 Ile Lys Tyr Thr Ile Leu Ser Ala Ala Ala Ser Ser Phe Leu Leu Phe 100 105 110 Gly Met Ala Leu Val Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Leu Ser Phe Val Ala 115 120 125 Leu Gly Lys Asn Leu Gly Asp Gly Met Leu Asn Glu Pro Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Gly Phe Gly Leu Met Ile Val Gly Leu Gly Phe Lys Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Pro Phe His Leu Trp Thr Pro Asp Val Tyr Gln Gly Ala Pro Ala 165 170 175 Pro Val Ser Thr Phe Leu Ala Thr Ala Ser Lys Ile Ala Ile Phe Gly 180 185 190 Val Val Met Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Pro Val Gly Asp Ser Glu Ala 195 200 205 Ile Arg Val Val Leu Ala Ile Ile Ala Phe Ala Ser Ile Ile Phe Gly 210 215 220 Asn Leu Met Ala Leu Ser Gln Thr Asn Ile Lys Arg Leu Leu Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Ser Ile Ser His Leu Gly Tyr Leu Leu Val Ala Leu Ile Ala Leu 245 250 255 Gln Thr Gly Glu Met Ser Met Glu Ala Val Gly Val Tyr Leu Ala Gly 260 265 270 Tyr Leu Phe Ser Ser Leu Gly Ala Phe Gly Val Val Ser Leu Met Ser 275 280 285 Ser Pro Tyr Arg Gly Pro Asp Ala Asp Ser Leu Phe Ser Tyr Arg Gly 290 295 300 Leu Phe Trp His Arg Pro Ile Leu Ala Ala Val Met Thr Val Met Met 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ala Gly Ile Pro Met Thr Leu Gly Phe Ile Gly Lys Phe 325 330 335 Tyr Val Leu Ala Val Gly Val Gln Ala His Leu Trp Trp Leu Val Gly 340 345 350 Ala Val Val Val Gly Ser Ala Ile Gly Leu Tyr Tyr Tyr Leu Arg Val 355 360 365 Ala Val Ser Leu Tyr Leu His Ala Pro Glu Gln Pro Gly Arg Asp Ala 370 375 380 Pro Ser Asn Trp Gln Tyr Ser Ala Gly Gly Ile Val Val Leu Ile Ser 385 390 395 400 Ala Leu Leu Val Leu Val Leu Gly Val Trp Pro Gln Pro Leu Ile Ser 405 410 415 Ile Val Arg Leu Ala Met Pro Leu Met 420 425 <210> 39 <211> 4695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSKH130 <400> 39 tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 60 gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 120 gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 180 agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 240 cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 300 gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 360 ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 420 caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 480 aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg 540 gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 600 ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 660 atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 720 tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 780 ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg 840 gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt gaaggatcag atcacgcatc 900 ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt caaaatcacc aactggtcca 960 cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt ctggctggat gatggggcga 1020 ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg cagacctcag cgctcaaaga 1080 tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca tccggcagtt caacagatcg 1140 ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt gatgtcattc tggtgaagaa 1200 gctcgaccgt cttggccgcg acaccgccga catgatccaa ctgataaaag agtttgatgc 1260 tcagggtgta gcggttcggt ttattgacga cgggatcagt accgacggtg atatggggca 1320 aatggtggtc accgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattggagct ccaccgcggt 1380 ggcggccgct ctagacttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 1440 cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgctagagga tcgatccttt 1500 ttaacccatc acatatacct gccgttcact attatttagt gaaatgagat attatgatat 1560 tttctgaatt gtgattaaaa aggcaacttt atgcccatgc aacagaaact ataaaaaata 1620 cagagaatga aaagaaacag atagattttt tagttcttta ggcccgtagt ctgcaaatcc 1680 ttttatgatt ttctatcaaa caaaagagga aaatagacca gttgcaatcc aaacgagagt 1740 ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgataaa gcaggcaaga 1800 cctaaaatgt gtaaagggca aagtgtatac tttggcgtca ccccttacat attttaggtc 1860 tttttttatt gtgcgtaact aacttgccat cttcaaacag gagggctgga agaagcagac 1920 cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag tttgcaaaac 1980 aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg 2040 cgaaagaaac gaaccaaaag ccatataagg aaacatacgg catttcccat attacacgcc 2100 atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtt cctgaattcg 2160 attcgtccac aattaaaaat atctcttctg caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc 2220 cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat 2280 tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta catgttctat caaaaagtcg 2340 gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat 2400 tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat 2460 ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct acactgattt ctccggtaaa cattacggca 2520 aacaaacact gacaactgca caagttaacg tatcagcatc agacagctct ttgaacatca 2580 acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac 2640 agcagttcat cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc 2700 actacgtaga agataaaggc cacaaatact tagtatttga agcaaacact ggaactgaag 2760 atggctacca aggcgaagaa tctttattta acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat 2820 tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag 2880 caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga 2940 aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa 3000 tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca 3060 ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa ttctttaact ggcccataca 3120 agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct 3180 ttacttactc acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct 3240 atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac gtttgcgcca agcttcctgc 3300 tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag catccttgaa caaggacaat 3360 taacagttaa caaataaaaa cgcaaaagaa aatgccgatg ggtaccgagc gaaatgaccg 3420 accaagcgac gcccaacctg ccatcggatc ccccgggctg caggaattcg atatcacgct 3480 agtcgaccta gctagcatat ggggagatct actagtaaag catgccaatt ggtattctat 3540 agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt 3600 ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg tagcatctgg cttactgaag cagaccctat 3660 catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg 3720 gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 3780 catggctaat tcccatgtca gccgttaagt gttcctgtgt cactcaaaat tgctttgaga 3840 ggctctaagg gcttctcagt gcgttacatc cctggcttgt tgtccacaac cgttaaacct 3900 taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt tttttcttat aaaacttaaa accttagagg 3960 ctatttaagt tgctgattta tattaatttt attgttcaaa catgagagct tagtacgtga 4020 aacatgagag cttagtacgt tagccatgag agcttagtac gttagccatg agggtttagt 4080 tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag 4140 cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatcttca gatcctctac gccggacgca 4200 tcgtggccgg atcttgcggc cgcaaaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 4260 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca ccaataactg 4320 ccttaaaaaa actagcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 4380 gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 4440 ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 4500 tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 4560 cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 4620 acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 4680 cgggaaacgt cttgc 4695

Claims (11)

  1. NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화되고, O-포스포세린 생산능을 가진, 에스케리키아 속 재조합 미생물로, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 nuo 오페론의 발현 증가인, 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림에 내재적 활성에 비해 활성이 강한 유전자 발현 조절 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림에 내재적 활성에 비해 활성이 강한 프로모터를 포함하는 것인, 미생물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림은 nuoA 유전자의 업스트림인, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(SerB)의 활성이 약화된 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 O-포스포세린 배출 단백질(YhhS) 의 활성이 강화된 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 방법은 상기 배양에 따른 배지 또는 미생물에서 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  10. a) NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된 O-포스포세린 생산 에스케리키아 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법으로,
    상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 nuo 오페론의 발현 증가이고, 상기 시스테인의 유도체는 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymethylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH, (R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, 및 S-(4-Tolyl)-L-cysteine 중 선택되는 것인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
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