KR101381048B1 - Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 - Google Patents

Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1) 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화되도록 변이된 재조합 미생물을 배양하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산하는 단계; 및, 2) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하에, 상기 단계 1)에서 생성된 OPS를 황화물과 반응시켜, 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 것을 특징으로 하는 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 및 OPS 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.

Description

Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 Ｏ-포스포세린으로부터 Ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법{A microorganism producing O-phosphoserine and the method of producing L-cysteine or derivatives thereof from O-phosphoserine using the same}
본 발명은 O-포스포세린을 중간 생산물로써 이용한 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 및 당해 O-포스포세린 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임A 생합성의 전구물질로 사용된다. 또한 시스테인 생합성은 L-세린, L-글리신, L-메치오닌 등 다른 아미노산의 생합성과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져있다. 산업적으로, L-시스테인 및 그 유도체는 제약분야(기관지질환치료), 화장품 분야 (헤어샴푸 및 퍼머웨이브로션의 성분) 및 식품분야(항산화제, 풍미증진제 및 반죽보조제)에 사용되고 있다.
지금까지 L-시스테인은 주로 사람의 머리카락이나, 동물의 깃털 등을 원료로 하여 화학적인 산-가수분해공정으로 생산되어왔다 (Biotechnology of the Amino Acids Production edited by Ko Aida, pp 217-223, 1986). 그러나 머리카락으로부터 추출하는 시스테인의 생성 수율은 7~8%로 매우 낮으며, 추출과정 중 사용하는 염산과 황산의 사용으로 환경오염 폐기물이 과량 생성된다. 또한 원재료로 머리카락을 이용함으로 소비자들에게 혐오감을 불러 일으킬 수 있다. 이러한 문제들로 인해 친환경적 L-시스테인 생산공정의 개발요구가 높아졌으며, 이에 따라, 미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법이 개발되었다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 우선, D,L-ATC에 미생물을 이용하여 생물학적으로 전환하는 방법이 알려져 있다(Ryu OH et al .,, Process Biochem., 32:201-209, 1997). 하지만 이 방법은 전구체인 D,L-ATC의 용해도가 낮아 산업화에 어려움이 있다. 2) 또 다른 방법은 대장균을 이용한 직접 발효법으로 L-시스테인을 생산하는 방법이 알려져 있다(유럽등록특허 EP0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). 이 방법은 미생물 내 L-시스테인이 과량 축적될 경우 세포내 독성을 나타낼 수 있어, 미생물을 이용하여 높은 농도의 L-시스테인을 생산하는데 한계가 있다. 미생물 및 식물의 L-시스테인 생합성 경로를 살펴보면, O-acetyl-serine(OAS)은 L-cysteine의 탄소골격의 중간 전구물질로서 작용한다(Kredich NM and Tomkins GM, J. Biol. Chem., 241: 4955-4965, 1966). O-acetyl-serine은 sulfur donor로 Hydrogen sulfide를 이용하여 O-acetyl-serine sulfhydrase(OASS)에 의해 시스테인으로 전환된다. 또한 sulfur donor로 SO4를 환원시켜 thiosulfate를 만들고 이를 이용하여 시스테인을 만들 수 있다(Nakamura T et al ., Bacteriol., 156: 656-662, 1983). 그리하여 OAS을 축적하는 미생물과 다양한 sulfur donor로부터 OASS을 이용하여 시스테인을 생산할수 있다(미국등록특허 US6579705). 이러한 OAS를 이용한 시스테인 생합성 경로의 경우 세린으로부터 OAS를 전환하는 활성을 가진 효소인 세린 아세틸트렌스퍼레이즈(CysE, serine acetyltrnasferase)와 OAS로부터 시스테인을 전환하는 활성을 가진 효소인 시스테인 신세이즈(CysK, cysteine synthase)를 이용하게 되는데 이들 효소 중 특히 세린 아세틸트렌스퍼레이즈 (CysE)는 최종 산물인 시스테인에 대해 강한 피드백을 가지고 있다고 알려져 있다(Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006).
본 발명자들은 새로운 L-시스테인 생산 방법을 모색하던 중 특정 미생물에서는 O-포스포-L-세린(O-phospho-L-serine, 이하 OPS라 칭함)을 이용하여 L-시스테인을 합성하는 효소(O-phosphoserine sulfhydrylase(OPSS))가 존재한다는 사실을 알게 되었다(Mino K et al . FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al. J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD et al. J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). 특히, 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 OPSS는 C-말단의 5개 아미노산을 제거할 경우, 효소 활성 강화가(Agren D et al. FEBS letters, 583: 330-336, 2009) 보고되어 이러한 사실에 근거하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, OPS를 축적하도록 변이된 미생물을 배양하여 상기 OPS와 OPSS 효소를 반응시켜 시스테인을 생산하였는데, 이러한 방법은 한번도 시도된 바 없다.
본 발명의 목적은 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 OPS 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 명세서 내에서 사용된 용어 “시스테인 전환”은 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용에 의해 기질인 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)으로부터 생산물인 시스테인으로 전환되는 반응을 의미한다. 즉, OPS를 시스테인으로 전환하여 상기 시스테인을 수득하는 반응을 의미한다.
또한, 용어 “시스테인 전환율”은 OPS가 시스테인으로 전환된 비율을 의미한다. 최적의 반응 조건에서 OPS 1몰은 시스테인 1몰로 전환되며, 예를 들어 OPS 100몰로부터 전환반응을 거쳐 시스테인 100몰이 수득되었을 경우, 시스테인 전환율이 100%가 된다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은, 1) 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화되도록 변이된 재조합 미생물을 배양하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산하는 단계; 및 2) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하에, 상기 단계 1)에서 생성된 OPS를 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 1) 단계는 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화된 재조합 미생물을 배양하는 단계에 관한 것이다.
상기 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 가지는 단백질로, 본 발명의 SerB의 활성이 약화된 미생물은 OPS를 축적하는 것을 특징으로 한다. 상기 SerB는 이에 제한되지는 않으나, SerB의 활성을 나타내는 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. SerB의 활성을 나타내는 한, 상기 아미노산 서열과 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 SerB의 활성 약화는 변형되지 않은 균주에 비해, SerB의 활성이 감소된 것을 의미하고, 활성이 제거된 경우도 포함한다. 상기 SerB 활성을 약화시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예는, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자를 결손시키는 방법 및 상기 염색체 상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 기술된 방법은 다른 효소의 활성의 약화시에도 동일하게 적용할 수 있다.
본 발명에서 내재적 SerB의 활성이 제거된 재조합 미생물은, 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린을 추가로 포함하여야 한다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 함유하는 이스트추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10 g/L, 바람직하게는 0.5 내지 3 g/L 이다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5 g/L, 바람직하게는 0.1 내지 1 g/L 이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 SerB 유전자를 약화시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균을 글리신 또는 세린을 포함하는 배지에서 배양한 결과, OPS의 생산량이 야생형에 비해 증가하는 것을 확인하였다(표 2, 3, 6 및 7 참조).
본 발명의 재조합 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 강화될 수 있다. 상기 SerA는 3-포스포글리세레이트(3-phosphoglycerate)를 3-포스포하이드록시피루베이트(3-phosphohydroxypyruvate)로 전환하는 활성을 가지는 단백질이며, 상기 SerA는 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체가 사용될 수 있다. 상기 SerA는 이에 제한되지는 않으나, SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체의 활성을 나타내는 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 3 내지 7로 기재되는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체의 활성을 나타내는 한, 상기 아미노산 서열과 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 피드백이 해제된 변이체는 상기 SerA를 암호화하는 유전자에 삽입, 치환 등의 방법으로 변이를 도입하여 세린 혹은 글리신에 의한 피드백 저해로부터 그 활성을 유지하거나, 강화된 경우를 의미하며, 상기 피드백이 해제된 변이체는 이미 잘 알려져 있다 (Grant GA et al ., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al ., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001; Peters-Wendisch P et al ., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002; 유럽등록특허 EP0943687B). 본 발명의 구체적인 실시예에서 SerB 유전자를 약화시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균에 추가로 피드백이 해제된 SerA 유전자를 도입한 결과, OPS의 생산량이 야생형에 비해 증가하는 것을 확인하였다(표 4 및 9 참조).
또한, 상기 SerC는 상기 3-포스포하이드록시피루베이트를 O-포스포세린으로 전환하는 활성을 가지는 단백질로, 이에 제한되지는 않으나, SerC의 활성을 나타내는 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. SerC의 활성을 나타내는 한, 상기 아미노산 서열과 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 SerC는 상기 효소의 활성이 증가하도록 상기 효소를 암호화하는 유전자 내부에 돌연변이가 유발될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 SerB 유전자 약화 및 피드백이 해제된 SerA 유전자 도입된 대장균에 추가로 SerC 유전자를 도입한 결과, OPS의 생산량이 야생형에 비해 증가하는 것을 확인하였다(표 9 참조).
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 O-포스포세린의 세포 안으로의 유입 또는 분해 능력을 감소시킬 수 있다. 구체적으로, PhnC/PhnD/PhnE 알킬포스포네이트 ABC 트랜스포터(PhnCDE 오페론, 구체적으로 포스포네이트 전달의 ATP-결합요소(ATP-binding component of phosphonate transport, PhnC; EG 10713)-Pn 트랜스포터의 주변세포질 결합단백질 요소(periplasmic binding protein component of Pn transporter, PhnD; EG 10714)-알킬포스포네이트 ABC 수송체의 내재막 요소(integral membrane component of the alkylphosphonate ABC transporter, PhnE; EG 11283)임), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase; PhoA) 또는 에시드 포스파아제(acid phosphatase; AphA)의 활성이 약화될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 추가로 PhnCDE 오페론 결손 시 OPS 생산량이 증가하는 것을 확인하였고(표 10 참조), 추가로 PhoA 또는 AphA의 활성을 결실시킴으로써, 배지에 함유된 인산의 농도가 낮아지는 배양 시점에서 OPS 분해가 감소하는 것을 확인하였다(표 12 참조). 아울러, 피드백이 해제된 SerA 유전자 도입 또는 SerC 유전자 도입에 의해 OPS 생산량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다(표 14 내지 표 16 참조).
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 피리미딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제(nucleotide transhydrogenase, PntAB; EC 1.6.1.1)의 활성이 강화될 수 있다. 상기 PntAB는 기존 문헌(Sauer U P et al ., J Biol Chem. 20;279(8):6613-9. Epub 2003)에 명시되어 있는 바와 같이, NADPH 대사작용에 관여하여 세포 내 레독스발란스(redox balance)을 조절하게 된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 OPS 생산용 재조합 미생물에 PntAB를 추가로 강화하여, OPS 생성량 증가를 확인하였다(표 17 참조).
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 O-아세틸세린/시스테인 배출 퍼미아제(O-Acetylserine/Cysteine Efflux Permease, YfiK), 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질(homoserine/homoserine lactone efflux protein, RhtB; EG 11469) 또는 쓰레오닌/호모세린 배출 단백질(threonine/homoserine lactone efflux protein, RhtC; EG11468)의 활성이 강화될 수 있다. 상기 YfiK는 시스테인과 OAS를 세포 밖으로 원활하게 배출하기 위하여 발굴된 배출 인자(Franke I et al ., J. Bacteriology, 185: 1161-1166, 2003)로 알려져 있으며, RhtB는 쓰레오닌의 전구 물질인 호모세린/호모세린 락톤의 배출인자로 보고되어 있다. 또한 RhtC는 쓰레오닌 및 호모세린의 배출인자로 알려져 있다. 상기 YfiK, RhtC 및 RhtB을 OPS 축적균주에서 강화시켰을 때, 생육 및 OPS의 생성량이 증가함을 확인하였다(표 18 참조).
상기 활성 강화 방법에는 상기 효소를 암호화하는 유전자의 세포내 카피수 증가, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 효소의 활성이 강화되도록 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 포스포글리세레이트 뮤테이즈(phosphoglycerate mutase)의 활성이 약화될 수 있다. 상기 포스포글리세레이트는 이소자임(isozyme) 형태로 GpmI, GpmA, GpmB의 세 가지 형태를 가지며, 해당과정 중의 3-포스포글리세레이트를 2-포스포글리세레이트로 전환하는 기능을 한다. 상기의 효소들은 3-포스포글리세레이트를 기질로 이용하여 3-포스포하이드록시피루베이트를 합성하는 SerA와 동일한 기질을 이용함으로써 경쟁관계에 있다. 따라서 각각의 활성을 약화시킴으로써 OPS의 전구 물질인 3-포스포글리세레이트의 양을 증가시켜, 결과적으로 OPS의 생성량을 증가시키는 것을 확인하였다(표 19 참조).
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 L-세린 디아미네이즈 I(L-serine dehydratase I, SdaA; EC 4.3.1.17) 또는 2-아미노-3-케토부티레이트 CoA 리가아제(2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase; Kbl)의 활성이 약화될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 미생물은 배지에 첨가하는 글리신 또는 세린의 농도를 낮게 유지하여도, OPS의 생성량이 유지, 또는 증가되는 것을 특징으로 한다 (표 20 참조).
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 전사조절인자(transcription factor; IclR)의 활성이 약화될 수 있다. 상기 IclR은 전사조절인자로, 구체적으로 글라이옥실레이트 바이패스 오페론(Glyoxylate bypass operon)인 aceBAK의 발현을 억제하는 조절인자이므로(L Gui et al., J. Bacteriol., Vol 178, No. 1, 321-324, 1996), 이의 활성을 결실시킴으로써 OPS 생산량이 증가되는 것을 확인하였다(표 21 참조).
또한, 본 발명의 재조합 미생물은 추가로 ① 아세틸- CoA 신테타아제(Acetyl-CoA synthetase, Acs), ② 아세트산 키나아제(acetic acid kinase, AckA)-포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase, Pta), ③ 말레이트 신타아제 G(malate synthase G, GlcB), ④ 말레이트 디하이드로게나아제(malate dehydrogenase, MaeB), ⑤ 글루타메이트 디하이드로게나아제(glutamate dehydrogenase, GdhA), ⑥ 글리옥실레이트 카보리가아제(glyoxylate carboligase, Glc), ⑦ 타르트로네이트 세미알데히드 리덕타아제 2(tartronate semialdehyde reductase 2, GlxR) 및 ⑧ 글리세레이트 카이네이즈 II(Glycerate kinase II, GlxK)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 강화될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 생성된 NADH를 소모하기 위하여 축적된 아세테이트를 효과적으로 재사용하고자, ① Acs(EC No.6.2.1.1; J Bacteriol. 1995 May;177(10):2878-86) 또는 피루베이트 옥시데이즈 모노머(pyruvate oxidase monomer, PoxB; EC 1.2.2.2) 또는 ② AckA 및 Pta(EC 2,3,1,8)를 본 발명의 재조합 미생물에 추가로 강화하여 OPS의 생성량 증가를 확인하였다(표 22 참조). 상기 ③ GlcB(EC No.2.3.3.9) 및 ④ MaeB(EC 1.1.137)는 각각 글리옥실레이트로부터 말레이트를 합성하고, 상기 말레이트를 피루베이트로 전환할 수 있는 역할을 함으로써, TCA 회로를 약화시켜 당 이용성을 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 결과적으로 O-포스포세린의 생성량 증가가 가능하였다(표 23 참조). 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 2-옥소글루타레이트와 NADPH로부터 SerC의 기질로 이용되는 글루타메이트를 생성하는 ⑤ GdhA; (EC 1.4.1.2)를 강화한 결과, OPS의 생성량이 더욱 증가하였다(표 17 참조). ⑥ Glc(EC 4.1.1.47), ⑦ GlxR(EC 1.1.1.60) 및 ⑧ GlxK(EC 2.7.1.31)는 글리옥실레이트를 3-포스포글리세레이트로 전환함으로써, 포스포글라이세레이트 디하이드로제네이즈의 기질의 양을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Kim HJ et al., J. Bacteriol., 186(11), 3453-3460, 2004; Eva Cusa et al., J. Bacteriol., 181(24), 7479-7484, 1999; Chnag YY et al., J. Biol. Chem. 268(6): 3911-3919, 1993). 본 발명의 재조합 미생물에 추가로 상기 Glc, 상기 GlxR 및 상기 GlxK들의 활성을 강화시킴으로써, 당소모 및 생육이 개선되는 것을 확인하였다(표 24 참조).
본 발명의 재조합 미생물은 SerB의 활성이 약화되어 OPS를 생산할 수 있는 미생물을 의미하며, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를들면, 엔테로박테리아과 또는 코리네형 미생물, 구체적으로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 있다. 바람직하게 본 발명의 미생물은 에스케리키아 속에 속하는 미생물이거나 코리네형(coryneform)에 속하는 미생물이며, 보다 바람직하게는 에스케리키아 속에 속하는 미생물이다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, OPS 생산능을 가지도록 제작된 균주를 대장균 CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC로 명명하였고, 2010년 9월 28일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM 11103P로 기탁하였다. 본 발명에서 용어 CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC는 CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC와 혼용된다.
상기 균주를 1L 발효기에서 80시간 배양한 결과, 19.5 g/L의 O-포스포세린이 생산된 것을 확인하였다(실시예 35 참조).
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에 서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은　회분식, 연속식 및 유가식 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.
본 발명은 상기 배양 단계에서 생산된 OPS를 추가로 분리 및 정제할 수 있으며, 그 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 OPS를 수집할 수 있다.
또한, 본 발명은 2) 단계로, O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하에, 상기 단계 1)에서 생성된 OPS를 황화물과 반응시켜, 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 단계를 포함한다.
상기 황화물은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드 (sulfide, S2 -), 티올설페이트(thiosulfate, S2O3 2 -) 등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH기)으로 전환될 수 있는 모든 황화물이면 이용 가능하다. 바람직하게는 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH,H2S, (NH4)2S, NaSH 및 Na2S2O3를 이용할 수 있다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 혹은 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배가 바람직하며, 1 내지 2배가 더욱 바람직하다. 가장 경제적으로 최적인 전환반응은 OPS와 티올그룹을 제공하는 황화물이 1:1(일대일) 몰비로 제공된 경우다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Na2S을 황 소스로 사용하였다. Na2S는 전환 반응 시 투입되는 OPS 몰농도 대비 1~3배의 몰농도까지 첨가되었으며, 바람직하게는 전환 반응 시 투입되는 OPS 몰농도의 2배의 몰농도로 투입하여 효율적으로 OPS을 시스테인으로 전환하는 공법을 개발하였다(표 34 참조).
본 발명에서 용어, "O-포스포세린 설피드릴레이즈(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS(O-phosphoserine)에 티올그룹(thiol, group, SH기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropyrum pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis) (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al ., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005)에서 처음으로 밝혀졌다.
본 발명에서 용어, "OPSS 변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻하며, 바람직하게는 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가될 수 있는 변이체를 의미한다.
본 발명에서 OPSS 변이체는 효소 활성을 증가시키기 위해 상기 OPSS를 암호화하는 핵산 서열 중 일부 핵산을 결실, 치환 또는 부가함으로써 제작할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 마이코박테리움 스메그마틱스 유래의 OPSS의 C-말단으로부터 5개 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 결실시킴으로써 활성이 증진된 변이형 효소를 제조하였다.
또한, 본 발명에서 OPSS 변이체는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 대장균에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈최적화가 포함된 유전자 합성기술을 적용함으로써 제작할 수 있다. 또한, 본 발명에서 OPSS 변이체는 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원으로 스크리닝된 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 OPS를 기질로 하여 시스테인을 합성하는 다양한 미생물 유래의 OPSS를 기반으로, 아미노산 상동성 검색을 통해 선별하였다. 상기 OPSS는 당업계에서 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 획득한 세포 침전물을 통상적으로 이용하는 세포파쇄법으로 파쇄하여, 효소가 포함된 상등액을 획득한 후 정제과정을 거쳐 OPSS 변이체를 수득하였다(표 26 참조).
또한, OPSS 효소를 경제적으로 확보하기 위한 고효율 발현 시스템을 개발하였다. 당 업계에서는 통상적으로 상용되는 T7 프로모터를 이용하는 pET 시스템(novagen)은 잘 알려져 있다. 하지만, 본 발명에서는 상용되는 효소 발현 시스템을 사용하지 않고 자체적으로 효소 발현 시스템을 개발하고자 노력하여 CJ1 시스템(대한민국 등록특허 10-0620092 B1)을 사용하였다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 T7 프로모터를 사용하는 pET 시스템과 CJ1 프로모터를 사용하는 CJ1 시스템을 이용하여 동일 배양조건에서 OPSS 효소 발현량을 확인하였다. 그 결과, pET 시스템 대비 CJ1 시스템 조건에서 OPSS 효소 발현량이 증가하였다. 또한 pET 시스템을 이용하여 OPSS 효소를 획득할 시, 효소를 과발현하기 위해 저온(18℃)으로 장시간의 배양 단계를 필요로 하는 반면, pCL-Pcj1 시스템을 이용하는 경우 고온(37℃)에서 단시간 배양으로 경제적으로 OPSS 효소를 확보가 가능하였다. 바람직하게는, pCL-Pcj1 시스템을 이용하여 OPSS 효소를 효율적으로 확보하는 시스템을 사용하였다(실시예 46 참조).
아울러, 상기 효소의 활성을 강화하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예는, 이로 제한되는 것은 아니지만, OPSS를 코딩하는 염기서열의 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 유전자 변이 도입 방법 등이 있다.
본 발명의 OPSS의 최적의 효소 전환이 가능하도록 하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예는, 이로 제한되는 것은 아니지만, OPSS 효소의 특성을 파악하는 방법, 바람직하게는 OPSS 효소 최적의 활성 온도, pH, 기질에 대한 저해 유무 및 농도 그리고 OPSS 효소 자체의 열 안정성 파악 등이 있으며, 효소 전환 반응의 최적 조건을 파악하는 방법, 특히 효소 전환 반응시 사용되는 최적의 OPSS 효소 농도 및 사용되는 기질들의 최적 발란스 농도, OPS 기질 외에 효소 전환 반응시 사용되는 황화물에 대한 선호도, 전환 반응 시 사용되는 버퍼 선호도와 이로 인해 발생되는 이온영향성 그리고 보조효소 들의 존재 유무 및 최적 농도 파악 등이 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 명기된 방법에 의해 확보된 OPSS 효소의 특성들을 파악하고 이 결과들로부터 OPS를 기질로 하여 시스테인을 합성하는 전환 반응 시, 시스테인 전환율이 증가하며 효소의 안정성이 높은 경제적인 효소 전환 공법을 개발하였다. 상기의 효소 전환 반응 온도 37℃에서 80℃까지 가능하며, 구체적으로 고세균(Archea)에 속하는 Ape-OPSS(서열번호 12) 효소의 경우, 37℃ 비해 60℃ 온도에서 효소 활성이 증가했으며 효소 자체의 열 안정성도 뛰어나 최적 효소 반응 온도는 60℃였다. 반면 Msm-T(서열번호 10)의 경우, 37℃ 온도에서 최적의 활성을 보였으며, 60℃ 열처리에 민감성을 나타냈다. 또한, 효소 전환 반응 pH 6.0~10.0 범위까지 OPSS 효소의 활성을 보였으며 특히 Ape-OPSS은 pH7.4에서 최적의 활성을 보였고, Msm-T의 경우 바람직하게는 pH8.0~9.0 에서 최적 활성을 보이며 Ape-OPSS 대비 좀 더 넓은 범위의 pH에서 안정성을 나타냈다(표 28, 31 및 도 2 및 3 참조).
효소 전환 반응시 사용되는 보조인자(cofactor)로 0.001 내지 2 mM의 PLP(pyridoxal-5'-phosphate) 또는 0.001 내지 100 mM의 DTT 를 추가로 첨가할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 대조군 대비 25 mM DTT 또는 0.2 mM PLP가 첨가된 실험군에서의 시스테인 전환율이 2.3배 증가함을 확인하였다. 상기와 같은 DTT 또는 PLP 처리가 단계 2)의 반응효율을 높이는데 긍정적이었으며, 특히 보조인자의 첨가에 따른 생산비용의 상승하는 범위 중 합리적인 생산비를 책정할 수 있는 범위로 한정하였다(표 30 참조).
또한, 사용되는 OPS의 종류 및 농도에 따라 OPSS의 반응조건이 달라질 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 정제된 OPS(시중 구매), 본 발명의 단계 1)의 방법으로 제조된 발효액으로부터 정제된 OPS 또는 OPS를 포함하는 발효액을 대상으로 최적전환율을 나타내는 조건을 수행한 결과, OPSS의 종류, 농도 및 온도에 따라 OPS 종류 및 농도별 시스테인 전환율이 달라질 수 있음을 확인하였다(도 5 및 도 6 및 표 35 참조).
본 발명에서는 추가로 상기 단계 2)의 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.
당업자라면 공지된 화학적 합성 방법으로, 본 발명의 방법으로 제조된 시스테인으로부터 시스테인 유도체를 용이하게 합성할 수 있다. 시스테인은 아세틸레이션 에이젼트(acetylation agent)와 반응하여 NAC(N-acetylcysteine)로 쉽게 합성될 수 있으며, 염기성 조건에서는 할로아세틱 에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)로 합성될 수 있다. 상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로써 진해제, 기침완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용된다.　
본 발명은 미생물 발효를 통해 획득한 OPS 발효액을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 공법을 개발하였다. 발효를 통해서 생산된 OPS 발효액을 기질로 사용했을 때는 상용되는 정제된 OPS를 기질로 사용했을 때에 비해 OPS의 정제단계가 단축되어 경제적이며 전환반응 시 필요한 보조인자인 PLP를 미생물 발효액에서도 획득할 수 있다는 장점을 가지게 된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 50 mg/ml의 농도로 Msm-T(서열번호 10)의 존재하에서, 50 mM OPS 발효액 혹은 60 mM OPS 발효 정제액과 100 mM Na2S 혹은 120 mM Na2S를 0.2 mM PLP 조건에서 반응하였을 때 최대 80% 가량의 시스테인 전환율을 보이는 공법을 개발하였다. 본 기술 분야의 당업자라면 효소 활성이 높은 효소를 이용한 효소 전환 공법을 최적화하고 Scale-up하는 것이 자명한 일로 누구나 쉽게 이해할 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 내재적 SerB의 활성이 약화된 OPS 생산용 재조합 미생물을 제공한다. 또한 본 발명의 상기 재조합 미생물은 추가로 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 또는 SerC의 활성이 강화되거나, PhnC/PhnD/PhnE 알킬포스포네이트 ABC 트랜스포터(PhnCDE 오페론)의 활성, 알칼라인 포스파타이제(PhoA)의 활성 및 에시드 포스파아타제(AphA)의 활성 중 하나 이상이 추가로 약화된 OPS 생산용 재조합 미생물일 수 있다. 바람직하게는 수탁번호 KCCM 11103P로 기탁된 OPS 생산용 재조합 미생물일 수 있다.
본 발명에서는 재조합 균주를 이용하여 O-포스포세린을 고효율로 생산한 후 효소 전환 반응을 통해 시스테인 및 이의 유도체를 생산하는 경우, 화학적 합성 방법 보다 환경 친화적이며 고효율로 시스테인을 생산할 수 있다. 본원과 같이 발효 및 생물전환을 이용하여 생산된 시스테인 및 이의 유도체는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제의 생산에 널리 사용할 수 있다.
도 1은 미생물 발효로부터 O-포스포세린을 축적하고, 축적된 O-포스포세린을 기질로 효소 전환을 통하여 L-시스테인을 생산하는 방법을 도식화한 도이다.
도 2는 OPSS 효소의 온도별 활성도를 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 OPSS 효소의 pH 민감성을 나타내는 도이다.
도 4는 동일 배양조건에서 pET system 대비 pCL-Pcj1 system을 이용한 효소 발현량의 증가를 나타내는 도이다.
도 5는 온도에 따른 OPS 발효 정제액을 기질로 OPSS 효소를 이용한 시스테인 전환반응의 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 OPS 발효액을 기질로 OPSS 효소를 이용한 시스테인 전환 반응을 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
< 코리네 유래 O- 포스포세린 생산 재조합 미생물 제작 및 이를 이용한 O- 포스포세린 생산>
실시예 1: 코리네박테리움 포스포세린 포스파타아제( SerB ) 약화 균주 제작
O-포스포세린으로부터 L-세린을 합성하는 효소인 포스포세린 포스파타아제를 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰 13032 균주의 serB 유전자 (서열번호 13, EC 3.1.3.3)를 결손하였다. 본 발명의 재조합 균주 13032-ΔserB를 생산하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, serB 의 불활성화 단편을 제작하기 위해, 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)을 근거로 하여 코리네박테리움 글루타미쿰 13032의 serB 서열을 확보하였으며 이를 바탕으로 각각 프라이머 서열번호 22 내지 27를 제작하였다. 부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDC 벡터를 사용하였다. 코리네글루타미쿰의 부위-특이적 serB 유전자 결실 균주를 제작하기 위하여 serB의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pDC-ΔserB 플라즈미드를 제작하였다. 상기 pDC-ΔserB의 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 22 및 23와 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 유전자 단편을 pDC 벡터에 도입하여 제작하였다. 상기의 재조합 플라스미드를 야생의 코리네박테리움 글루타미쿰에 전기천공법으로 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 상기 플라스미드는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입한 후, 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드를 절제(excision)하였다.
상기 2차 재조합이 완료된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주들을 대상으로 각 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer) 쌍인 서열번호 28 및 29을 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 serB 유전자의 결실을 확인하였고 본 재조합 균주는 CB01-0047이라 명명하였다.
실시예 2: 코리네박테리움 SerB 약화 균주 O- 포스포세린 ( OPS ) 생산능 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 13032 균주의 SerB가 결손되어 OPS가 축적될 것이라 예상되는 CB01-0047을 BHIS 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. BHIS 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 30℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다(표 2).
주요배지성분 미량원소
조성물 농도 (리터당) 조성물 농도 (리터당)
포도당 100 g 비오틴 0.09 g
KH2PO4 1.1 g 티아민 0.45 g
(NH4)2SO4 45 g Ca-Panththenate 0.45 g
MgSO4·7H2O 1.2 g NCA 3 g
HSM 20 g FeSO4·7H2O 9 g
미량원소 20 ml MnSO4·4H2O 9 g
탄산칼슘 30 g ZnSO4·7H2O 0.045 g
pH 7.2 CuSO4·5H2O 0.045 g
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
C.glutamicum 10302 25 100 0.02
CB01-0047 6.5 23 0.07
CB01-0047 균주의 경우, 위 역가배지 조건에서 균주 생장성이 매우 낮았으며, 이 현상은 배지에 추가로 L-글리신을 첨가해도 회복되지 않았다. 또한 배지에 L-세린을 첨가하여 테스트한 결과 균주 생장은 회복되었으나 OPS은 야생형 균주보다 미량 증가하였다(표 3).
균주명 첨가 아미노산 OD562nm 소모당(g/L) OPS (g/L)

CB01-0047
 - 6.3 21 0.09
L-글리신 6.9 22 0.09
L-세린 24.5 100 0.05
실시예 3: 코리네박테리움 유래 돌연변이형 포스포 글리세레이트 디하이드로게나아제( SerA *) 합성 유전자 클로닝
3-포스포 글리세레이트로부터 3-포스포 하이드록시 피루베이트를 합성하는 효소인 3-포스포 글리세레이트 디하이드로게나아제의 세린 저해성이 해제된(Feedback resistant, FBR) 것으로 보고된 변이 효소를 코딩하는 유전자인 코리네 박테리움 클루타미쿰 유래 serA*(E235K) (서열번호 14) 및 serA*(197Δ) (서열번호 15)를 각각 제작하였다(Peters-Wendisch P et al ., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002; 유럽등록특허 EP0943687B). serA*(E235K) 변이체는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 28 내지 31의 프라이머들을 이용하여 sewing PCR를 통하여 획득하였으며, serA*(197Δ) 변이체는 서열번호 28 및 32의 프라이머 쌍을 이용하여 얻었다. 각 변이 유전자는 통상 이용되는 T-vector의 클로닝 방법으로 Tblunt-serA*(E235K), Tblunt-serA*(197Δ)을 우선 제작하였다. 이후 상기의 두 벡터에 제한효소 EcoRV와 XbaI을 처리하여 serA*(E235K), serA*(197Δ) 단편을 획득하고, pECCG117-Pcj7-GFP-terminator 벡터 역시 동일 제한효소 처리하여 상기의 단편을 삽입하였다. 그 결과 pECCG117-Pcj7-serA*(E235K), pECCG117-Pcj7-serA*(197Δ)의 2종의 벡터를 완성하였다.
실시예 4: 코리네박테리움 유래 SerA * 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 CB01-0047을 기반 균주로 하여 실시예 3에서 제작한 2종의 코리네박테리움 유래 FBR-serA*을 도입하여 균주를 제작하였다. OPS의 생산능을 평가하기 위해 모든 균주는 BHIS 고체 배지에 도말한 후 30℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. BHIS 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 2g/L L-세린이 추가로 첨가된 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 30℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다.
균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)
CB01-0047/pECCG117 24.5 100 0.03
CB01-0047/ pECCG117-Pcj7- serA*(E235K) 25.3 100 0.3
CB01-0047/ pECCG117-Pcj7- serA*(197D) 24.3 100 0.28
상기 표 4의 결과와 같이 코리네박테리움 유래 FBR-serA* 도입을 통하여, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 0.1~0.3g/L의 OPS 축적을 확인하였다.
<대장균 유래 O- 포스포세린 생산 재조합 미생물 제작 및 이를 이용한 O- 포스포세린 생산>
실시예 5: 대장균 포스포세린 포스파타아제( SerB ) 약화 균주 제작
O-포스포세린으로부터 L-세린을 합성하는 효소인 포스포세린 포스파타아제를 코딩하는 SerB 유전자(서열번호 16)를 결손하였다. 유전자가 결손된 변이체 대장균 K12는 원스탭 불화성화 방법(Datsenko KA and Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 6640-6645, 2000)에 의해 제작하였으며, 항생제 내성부여 표식 유전자를 제거하였다. serB 유전자 결손 균주를 제작하기 위해서, 서열번호 33와 서열번호 34의 프라이머 쌍과 pKD3 플라스미드 (Datsenko KA and Wanner BL, 2000; GenBank No. AY048742)를 이용하여 PCR 반응을 수행하고, 그 결과 획득한 DNA 단편을 pKD46 (Datsenko KA and Wanner BL, 2000; GenBank No. AY048746)을 함유하는 야생형 대장균 K12의 컴피턴트 세포 (competent cell)에 일렉트로포레이션 (electroporation)하였다. 이후 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여, serB 유전자의 결실여부를 확인하고 pCP20 (Datsenko KA and Wanner BL, 2000) 플라스미드를 도입하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하였다. 본 제작 균주는 CA07-0012(DserB)라 명명하였다.
또한 포스포세린 포스파타아제 활성이 약화되도록 개시코돈이 변형된 serB를 클로닝하였다. 클로닝은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 개시코돈이 ATG코돈으로 시작하는 야생형 SerB 유전자는 대장균 W3110의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 통하여 획득하였고, 개시코돈이 CTG로 시작되는 변이 serB는 sewing PCR를 통하여 획득하였다. 야생형 serB PCR은 서열 번호 35 및 36의 프라이머 쌍을 이용하였으며, 변이 SerB PCR은 서열번호 35 내지 38의 프라이머들을 이용하였다. 증폭된 각 유전자의 단편은 HindIII의 제한 효소로 처리하였으며, pccBAC1(Epicentre)에 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pccBAC1-Pself-ATG-serB, pccBAC1-Pself-CTG-serB를 제작하였다. 상기의 제작된 야생형 및 변이형 serB 벡터를 CA07-0012에 도입하여 포스포세린 포스파타아제의 활성이 동등하거나 약화된 균주를 제작하였다.
실시예 6: 대장균 SerB 약화 균주의 OPS생산능 평가
O-포스포세린이 축적될 것이라 예상되는 SerB 결손 균주인 CA07-0012와 상기의 균주에 변이형 SerB을 도입시킨 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 5의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 6에 나타내었다.　
조성물 농도 (리터당) 조성물 농도 (리터당)
포도당 40 g MnSO4·4H2O 10 mg
KH2PO4 2 g ZnSO4·7H2O 10 mg
(NH4)2SO4 17 g 효모액기스 2 g
MgSO4·7H2O 1 g 탄산칼슘 30 g
FeSO4·7H2O 10 mg pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS (g/L)
E.coli W3110 16 40 0.03
CA07-0012 9.8 16 0.5
CA07-0012 / pccBAC1-Pself-ATG-serB 20 40 0
CA07-0012 / pccBAC-Pself-CTG-serB 15 40 0.7
또한, CA07-0012의 생장 및 O-포스포세린의 생산성 및 균주 생육을 향상시키고자 표 5의 역가 배지에 1g/L L-글리신을 첨가하여 위와 동일한 방법으로 48시간 배양하였다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS (g/L)
E.coli W3110 16 40 0.03
CA07-0012 18 40 1.5
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이 배지에 L-글리신을 첨가한 경우, 균주 생육 및 O-포스포세린 생산량이 증가함을 확인하였다.
실시예 7: 대장균 유래 돌연변이형 포스포 글리세레이트 디하이드로게나아제( SerA *) 합성 유전자 제작
3-포스포 글리세레이트로부터 3-포스포 하이드록시 피루베이트를 합성하는 효소인 3-포스포 글리세레이트 디하이드로게나아제의 세린 저해성이 해제된(Feedback resistant, FBR) 것으로 보고된 변이 효소를 코딩하는 유전자인 serA*(G336V) (서열번호 18), serA*(G336V, G337V) (서열번호 19), serA*(G336V, R338G) (서열번호 20)를 각각 제작하였다(Grant GA et al ., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al ., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001). serA 유전자(서열번호 17)에 각 해당 변이를 도입하는 방법은 통상 이용되는 Sewing PCR법을 이용하였으며, 하기 프라이머들을 이용하여 변이가 포함된 DNA 단편을 제작하였다.
서열번호 39 및 41의 프라이머쌍은 serA* 유전자에 공통으로 이용하였으며, serA 유전자의 각 변이를 도입하기 위하여 serA*(G336V)는 서열번호 42, 43 프라이머를, serA*(G336V, G337V)는 서열번호 44, 45 프라이머를, serA*(G336V, R338G)는 서열번호 46, 47 프라이머를 이용하였다. 이때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)에 등록되어 있는 K12 W3110 유전자 (GenBank accession number AP 003471) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.
실시예 8: 대장균 유래 SerA , SerA * 및 3- 포스포세린 아미노트랜스펴라아제( SerC ) 합성 유전자 클로닝
serA (서열번호 17, EC 1.1.1.95), serC (서열번호 21, EC 2.6.1.52), serA*(G336V), serA*(G336V, G337V), serA*(G336V, R338G) 클로닝은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. serA, serC 유전자는 대장균 W3110의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 통하여 획득하였고, serA*(G336V), serA*(G336V, G337V), serA*(G336V, R338G)는 실시예 7에서 제작된 DNA 단편을 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다. serA PCR은 서열번호 48, 49, serC PCR은 50, 51의 프라이머를 이용하였다. 증폭된 각 유전자의 단편은 EcoRV와 HindIII의 제한 효소로 처리하였으며, pCL1920 벡터(GenBank No AB236930)에 대장균의 rmf 유전자의 프로모터가 삽입되어 있는 pCL-Prmf 벡터의 EcoRV와 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-Prmf-serA, pCL-Prmf-serC, pCL-Prmf-serA*(G336V), pCL-Prmf-serA*(G336V, G337V), pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V)를 제작하였다.
또한 serA 및 3종의 돌연변이 serA와 serC가 오페론 형태로 발현될 수 있는 플라스미드인 pCL-Prmf-serA-(RBS)serC, pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC, pCL-Prmf-serA*(G336V, G337V)-(RBS)serC, pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V)-(RBS)serC를 제작하였다. 각각의 플라스미드는 서열번호 51과 서열번호 52를 이용하여 (RBS)serC 단편을 획득한 후, pCL-Prmf-serA, pCL-Prmf-serA*(G336V), pCL-Prmf-serA*(G336V, G337V), pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V) 벡터의 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여 제작하였다.
실시예 9: 대장균 유래 SerA , SerA * 및 SerC 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 8에서 제작된 8종의 플라스미드를 각각 CA07-0012 균주에 도입한 균주를 제작하여 OPS의 생산능을 평가하였다. 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다.　
조성물 농도 (리터당) 조성물 농도 (리터당)
포도당 40 g ZnSO4·7H2O 10 mg
KH2PO4 4 g L-글리신 2.5 g
(NH4)2SO4 17 g 트립톤 2 g
MgSO4·7H2O 1 g 효모액기스 2 g
FeSO4·7H2O 10 mg 탄산칼슘 30 g
MnSO4·4H2O 10 mg pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
CA07-0012 23 40 1.7
CA07-0012 / pCL-Prmf-serA 25 40 1.8
CA07-0012 / pCL-Prmf-serA*(G336V) 23 37 2.2
CA07-0012/
pCL-Prmf-serA*(G336V,G337V)		 21 36 2.1
CA07-0012 /
pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V)		 22 37 2.2
CA07-0012 / pCL-Prmf-serA-(RBS)serC 20 35 2.1
CA07-0012 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 18 31 2.5
CA07-0012 /
pCL-Prmf-serA*(G336V,G337V)-(RBS)serC		 17 32 2.5
CA07-0012 /
pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V)-(RBS)serC		 16 30 2.6
그 결과, 표 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주에 SerA를 추가로 도입한 경우, OPS의 생산량이 CA07-0012에 비하여 증가하였으며, 각 3종의 돌연변이형 SerA*가 도입된 경우 OPS이 생산량이 더욱 증가하였다. 또한 SerA 또는 3종의 돌연변이형 SerA*와 SerC가 동시에 강화된 균주의 경우 O-포스포세린의 생산량이 SerA, SerA* 단독으로 강화한 경우에 비하여 더욱 더 증가하였는데, 특히 돌연변이형 SerA*와 SerC가 강화된 균주의 경우 O-포스포세린의 생산량이 가장 높은 것으로 확인되었다.
실시예 10: 대장균 PhnC / PhnD / PhnE 알킬포스포네이트 ABC 트랜스포터( PhnCDE 오페론) 결손 균주 제작
대장균에서 PhnC/PhnD/PhnE 알킬포스포네이트 ABC 트랜스포터는 O-포스포세린을 세포내로 유입할 수 있다고 알려져 있다 (Wanner BL and Metcalf WW. FEMS Microbiol. Lett., 15:133-139, 1992). PhnC/PhnD/PhnE 알킬포스포네이트 ABC 트랜스포터 단백질을 코딩하는 phnCDE 오페론을 SerB가 약화된 균주에 추가로 결손하여 CA07-0016 균주를 제작하였다. phnCDE 오페론의 결손은 서열번호 53와 서열번호 54의 프라이머 쌍을 이용하였다. 자세한 유전자 결손 방법은 실시예 5에 기술한 바와 동일하다
또한, 실시예 8에서 제작된 플라스미드인 pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC를 CA07-0016 균주에 도입하였다.
실시예 11: 대장균 phnCDE 오페론 결손 균주 OPS 생산능 평가
실시예 10에서 제작된 CA07-0016 균주 및 CA07-0016/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC 균주의 OPS의 생산능을 평가하였다. 각각의 균주를 LB 고체 배지 또는 LB (spectinomycin) 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycin) 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다.　
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
CA07-0012 22 40 1.8
CA07-0016 23 38 2.0
CA07-0012
/ pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 21 35 2.1
CA07-0016
/ pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 20 40 2.4
그 결과, 표 10의 결과와 같이 phnCDE 오페론이 결손된 균주의 경우, OPS의 생산량이 미량 증가하였다.
실시예 12: 대장균 알칼라인 포스파타아제( PhoA ), 에시드 포스파타아제( AphA ) 결손 균주 제작
대장균에서 알칼라인 포스파타아제를 코딩하는 phoA 유전자 및 에시드 포스파타아제를 코딩하는 aphA를 포스포세린 포스파타아제가 결손된 균주에 추가로 결손하였다. phoA 유전자를 결손하기 위한 단편은 서열번호 55 및 서열번호 56 프라이머 쌍을 pkD3 플라스미드를 주형으로하여 PCR 함으로써 획득하였으며, aphA 유전자를 결손하기 위한 단편은 서열번호 57 및 서열번호 58 프라이머 쌍을 이용하여 위와 동일한 방법으로 획득하였다. 각 유전자 결손 균주를 제작하기 위한 방법은 실시예 5에 기술한 바와 동일하다.
phoA와 aphA가 동시에 결손된 균주는 phoA가 결손된 균주에 pKD46을 다시 도입하고 컴피턴트 세포 (competent cell)을 제작한 후, aphA를 결손하기 위한 단편을 본 세포에 일렉트로포레이션 (electroporation)하였다. 이후 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여, aphA의 추가 결실여부를 확인하고 pCP20 플라스미드를 도입하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하였다.
위에서 제작된 균주명 및 유전자 타입은 표 11과 같다.
균주명 Genotype
CA07-0013 W3110 ΔserB ΔphoA
CA07-0015 W3110 ΔserB ΔaphA
CA07-0018 W3110 ΔserB ΔphoA ΔaphA
위의 각각의 결손 균주에는 실시예 10과 동일하게 실시예 8에서 제작된 플라스미드인 pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC를 도입하였다.
실시예 13: 대장균 알칼라인 포스파타아제( PhoA ), 에시드 포스파타아제( AphA ) 결손 균주 O- 포스포세린 분해 저감능 평가
실시예 12에서 제작된 균주를 이용하여 OPS 생산능 및 OPS 분해 저감능을 평가하였다. 각각의 균주를 LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycine) 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycine) 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 72 시간 배양하였다.　OPS 분해 저감능은 포스페이트 이온 분석을 통하여 이의 증감 여부를 비교하였다.
균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L) PO4 (ppm)
CA07-0012 23 40 0.3 692
CA07-0013 22 40 1.6 459
CA07-0015 7.4 25 0 1098
CA07-0018 19 40 1.7 487
CA07-0012 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 20 40 0.1 714
CA07-0013 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 16 40 1.8 385
CA07-0018 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 17 40 1.6 593
그 결과, 표 12에 나타난 바와 같이 aphA 결손주의 경우, 비정상적인 균주 생육 현상을 나타내었으나, phoA 결손주 및 phoA, aphA 동시 결손주의 경우, O-포스포세린의 생산량이 다소 증가하고 O-포스포세린의 분해능이 감소하는 결과를 보였다. phoA 및 aphA가 결손되지 않은 균주의 경우, 72시간 배양시 생성되었던 OPS 이 분해되어, PO4 농도가 증가하는 양상을 나타내었다.
실시예 14: PhnCDE 오페론 , PhoA 및 AphA 결손 균주 제작
SerB가 약화된 균주(CA07-0012)에 phnCDE 오페론 및 phoA, aphA를 추가로 결손한 균주를 제작하였다. 제작된 각 균주의 균주명은 유전형은 표 13에 표시하였으며, 제작 방법은 실시예 5에서 기술한 원스탭 불화성화 방법을 이용하였다.
균주명 Genotype
CA07-0020 W3110 ΔserB ΔphoA ΔphnCDE
CA07-0022 W3110 ΔserB ΔphoA ΔaphA ΔphnCDE
위의 각각의 결손 균주에는 실시예 10과 동일하게 실시예 8에서 제작된 플라스미드인 pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC를 도입하였다.
실시예 15: PhnCDE 오페론 , PhoA 및 AphA 결손 균주 OPS 생산능 평가
실시예 14에서 제작된 균주를 이용하여 OPS 생산능을 평가하였다. 각각의 균주를 LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycin) 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycin) 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 72 시간 배양하였다.
균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L) PO4 (ppm)
CA07-0012 23 40 0.3 692
CA07-0020 18.3 40 1.9 262
CA07-0022 19.1 40 2 263
CA07-0012 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 20 40 0.1 714
CA07-0020 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 17.6 40 2.5 174
CA07-0022 /
pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC		 17 40 2.6 218
그 결과, CA07-0020 및 CA07-0022 균주의 경우, CA07-0012 균주와 비교했을 때, OPS의 생산량은 증가하였고, 분해능은 감소하였다. 이 특성은 각각의 균주에 pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC를 추가로 도입한 균주에서도 나타남을 알 수 있다.
실시예 16: PhnCDE 오페론 , PhoA 및 AphA 결손 및 serA * 염기서열 치환 균주 제작
CA07-0022 균주의 serA를 세린 저해성이 해제된 것으로 보고된 serA*(G336V), serA*(G336V, G337V), serA*(G336V, R338G)로 염색체 상에서 치환된 균주를 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
serA의 각 변이를 염색체에 도입하기 위하여 다음과 같이 벡터를 제작하였다. 실시예 7에서 제작된 serA*(G336V), serA*(G336V, G337V), serA*(G336V, R338G)의 단편을 서열번호 40 및 서열번호 41을 이용하여 PCR하고, 얻어진 폴리뉴클레오티드를 SacI 및 BamHI로 제한 효소 처리를 한 후 pSG76C 벡터의 SacI , BamHI 자리에 클로닝하여 대장균 BW에 형질전환 한 후 LB 고체배지에 도말하였다. 얻어진 콜로니의 염기서열 분석을 통하여 각 변이가 도입된 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 플라스미드는 도입된 변이에 따라 pSG76C-serA*(G336V), pSG76C-serA*(G336V, G337V) 및 pSG76C-serA*(G336V, R338G)로 명명하였다.
각 변이체 대장균은 문헌에 제시된 방법 (Posfai G et al ., Nucleic Acids Res. 27: 4409-4415, 1999)에 의해 제작하였으며, 항생제 내성부여 표식 유전자를 제거하였다. 특히, serA*(G336V) 변이체를 제작하기 위하여, pSG76C-serA*(G336V)를 CA07-0022의 컴피턴트 세포 (competent cell)에 일렉트로포레이션 (electroporation)하였다. 이후 클로로암페니콜(Chlroloampenicol) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여, serA*(G336V) 변이 도입여부를 확인하고 pST76-ASceP (Posfai G et al ., 1999) 플라스미드를 도입하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하였다. 제작된 균주는 CA07-0022 serA*(G336V)로 명명하였다. serA*(G336V, G337V), serA*(G336V, R338G) 변이체는 제작된 CA07-0022 serA*(G336V) 균주와 pSG76C-serA*(G336V, G337V), pSG76C-serA*(G336V, R338G)를 이용하여 위와 동일한 방법으로 제작하여 각각 CA07-0022 serA*(G336V, G337V), CA07-0022 serA*(G336V, R338G)으로 명명하였다.
실시예 17: PhnCDE 오페론 , PhoA 및 AphA 결손 및 serA * 염기서열 치환 균주 OPS 생산능 평가
실시예 16에서 제작된 균주에 대하여 OPS 생산능을 평가하였다. 각각의 균주를 LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycine) 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지 또는 LB(spectinomycine) 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
CA07-0022 22 40 2.2
CA07-0022 serA*(G336V) 21 35 2.7
CA07-0022 serA*(G336V, G337V) 20 36 2.8
CA07-0022 serA*(G336V, R338G) 20 38 2.7
SerA 유전자가 세린 저해성이 해제된 형태로 변경된 균주의 경우, 성장 속도는 다소 감소하였으나 OPS의 생산량은 증가하였다.
실시예 18: PhnCDE 오페론 , PhoA 및 AphA 결손 및 serA * 염기서열 치환 및 3-포 스포세 린 아미노트랜스펴라아제 추가 강화 균주 제작 및 O- 포스포세린 생산능 평가
실시예 16에서 제작된 균주인 CA07-0022 serA*(G336V), CA07-0022 serA*(G336V, G337V), CA07-0022 serA*(G336V, R338G)에 실시예 8에서 제작된 pCL-Prmf-serC 플라스미드를 각각 도입하여 실시예 9와 동일한 방법으로 OPS의 생산능을 평가하였다.
균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)
CA07-0022 / pCL-Prmf-serC 20 38 2.9
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-serC 19.5 34 3.45
CA07-0022 serA*(G336V, G337V) / pCL-Prmf-serC 20 33 3.55
CA07-0022 serA*(G336V, R338G) / pCL-Prmf-serC 19 35 3.6
그 결과, 표 16에 나타난 바와 같이 serC 유전자가 강화된 균주에서 OPS의 생산성이 향상되었음을 알 수 있다. 또한 이 현상은 SerA 유전자가 세린 저해성이 해제된 형태로 변경된 균주에서 더욱 더 분명하였다.
실시예 19: 피리미딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제 ( PntAB ) 강화 균주 및 글루타메이트 디하이드로게나아제 ( GdhA ) 강화 벡터 클로닝
피리미딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제를 코딩하는 pntAB 유전자 강화 균주를 제작하기 위하여 pntAB 유전자의 프로모터를 mutant loxP system (Arakawa H et al .,BMC Biotechnol. 1: 7, 2001)을 응용하여 프로모터를 교체하였다. trc 프로모터로 교체된 pntAB 균주를 제작하기 위해서 서열번호 59와 서열번호 60의 프라이머 쌍과 pmlox-trc (ref) 플라스미드를 이용하여 PCR 반응을 수행하고, 그 결과 획득한 DNA 단편을 pKD46을 함유하는 CA07-0022 serA*(G336V)의 컴피턴트 세포 (competent cell)에 일렉트로포레이션 (electroporation)하였다. 이후 클로람페니콜 (Chloramphenicol) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여, 프로모터 교체여부를 확인한 후, pJW168 (Le Borgne S et al ., Methods Mol Biol. 267: 135-43, 2004) 플라스미드를 도입하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하였으며, 그 결과 제작된 균주는 CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB로 명명하였다. 이 때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)에 등록되어 있는 K12 W3110 유전자 (GenBank accession number AP 002223, AP002224) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.
글루타메이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 gdhA 강화 벡터는 서열번호 61과 서열번호 62의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR법을 통하여 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭하였으며, 서열번호 61과 서열번호 62의 프라이머는 제한 효소 HindIII을 가지고 있다. 이 때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)에 등록되어 있는 K12 W3110 유전자 (GenBank accession number AP 002380) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.
PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1714 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드를 HindIII의 제한 효소 처리를 한 후 pCC1BAC 벡터의 HindIII자리에 클로닝하여 대장균 DH5α 형질전환한 후 LB 고체배지에 도말하였다. 얻어진 콜로니의 염기서열 분석을 통하여 변이가 없는 gdhA가 도입된 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 플라스미드는 pCC1BAC-P(native)-gdhA로 명명하였다.
실시예 20: PntAB , GdhA 를 OPS 생산 균주에 도입 및 OPS 생산능 평가
pntAB, gdhA가 강화된 OPS 생산주를 제작하기 위해서 아래 표와 같이 CA07-0022 serA*(G336V), CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB 균주에 pCL-P(trc)-serA*(G336V)-serC, pCC1BAC-P(native)-gdhA 플라스미드를 각각 또는 조합으로 형질전환 하였다. 각 형질전환체를 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 8의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48 시간 배양하였다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
CA07-0022 serA*(G336V)
/pCL-P(trc)-serA*(G336V)-serC		 20 37 3.1
CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB
/pCL-P(trc)-serA*(G336V)-serC		 19 35 3.4
CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB
/pCC1BAC-P(native)-gdhA		 7.2 11 0.2
CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB
/pCC1BAC-P(native)-gdhA
/pCL-P(trc)-serA*(G336V)-serC		 27.0 40 3.95
그 결과, 표 17에서 보는 바와 같이 pntAB가 강화된 균주는 대조군에 비해 OPS 생산능이 증가 하였으며, pntAB와 gdhA 동시 강화시 대조군에 비해 OPS의 생산능이 더욱 더 증가하였다. 따라서 pntAB와 gdhA 강화는 OPS의 생산에 중요한 유전자임을 판단할 수 있었다.
실시예 21: 대장균 O- 아세틸세린 /시스테인 배출 단백질( YdeD ), O- 아세틸세린 /시스테인 Efflux Permease ( YfiK ), 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질( RhtB ), 쓰레오닌 /호모세린 배출 단백질( RhtC ), arsenite / antimonite 트랜스포터 ( AsrB ), 루이신/ 이소루이신 /발린 트랜스포트 서브 유닛( livHM ) 강화 벡터 클로닝
생성된 O-포스포세린이 세포 밖으로 원활하게 배출되기 위하여 적절한 배출 인자가 필요하지만, 현재까지 문헌상에 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 기존에 밝혀진 다양한 종류의 transporter를 기반으로 O-아세틸세린/시스테인 배출 단백질을 코딩하는 ydeD, O-아세틸세린/시스테인 Efflux Permease을 코딩하는 yfiK (Franke I et al ., J. Bacteriology, 185: 1161-166, 2003), 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질을 코딩하는 rhtB, 쓰레오닌/호모세린 배출 단백질을 코딩하는 rhtC, arsenite/antimonite 트랜스포터를 코딩하는 asrB, 루이신/이소루이신/발린 트랜스포트 서브 유닛을 코딩하는 livHM의 6종의 유전자를 선별하여, 클로닝하고, 평가함으로써 이의 영향성을 파악하고자 하였다.
각각의 유전자는 대장균 W3110의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행함으로써 획득하였다. ydeD는 서열번호 63, 서열번호 64, yfiK는 서열번호 65 서열번호 66, rhtB는 서열번호 67, 서열번호 68, rhtC는 서열번호 69, 서열번호 70, asrB는 서열번호 71, 서열번호 72, livHM는 서열번호 73, 서열번호 74의 프라이머쌍을 이용하였다. 각 유전자 단편은 EcoRV, HindIII로 제한 효소 처리하여, pCL-Prmf-GFP벡터의 EcoRV와 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-Prmf-ydeD, pCL-Prmf-yfiK, pCL-Prmf-rhtB, pCL-Prmf-rhtC, pCL-Prmf-arsB, pCL-Prmf-livHM를 제작하였다.
실시예 22: YdeD , YfiK , RhtB , RhtC , AsrB , livHM 강화 OPS 생산 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 21에서 제작된 6종의 플라스미드를 CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 도입한 후, 실시예 9와 동일한 방법으로 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다.
균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)
CA07-0022 serA*(G336V) 22.1 37.7 2.5
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-ydeD 7.4 22.3 0.69
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-yfiK 21 40 2.55
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-rhtB 23 40 2.8
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-rhtC 22.5 40 2.75
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-arsB 21 38 2.4
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-livHM 8 23 0.8
각 유전자에 대한 평가 결과, ydeD, livHM 유전자가 도입된 균주의 경우, 균주 생육이 저하되고, OPS 생성량도 저하되었으나, yfiK, rhtB, rhtC 유전자가 도입된 균주의 경우, 균주 생육 및 OPS의 생성량이 증가하였다(표 18).
실시예 23: 포스포글리세레이트 뮤테이즈 ( GpmI , GpmA 및 GpmB ) 결손 균주 제작
CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 포스포글리세레이트 뮤테이즈를 코딩하는 유전자인 gpmI, gpmA 및 gpmB를 단독 또는 동시에 결손하여 각각, CA07-0022 serA*(G336V)DgpmI, CA07-0022 serA*(G336V)DgpmA, CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmB, CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmIΔgpmA, CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmAΔgpmB, CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmIΔgpmAΔgpmB균주를 제작하였다. gpmA 및 gpmB 각 결손 균주의 제작 방법은 실시예 5에 기술한 바와 같으며, gpmA은 서열번호 75및 서열번호 76의 프라이머 쌍을, gpmB는 서열번호 81 및 서열번호 82의 프라이머 쌍을 이용하였다. gpmI 결손 균주의 제작 방법은 실시예 16에 기술한 바와 같이 pSG76C 벡터를 이용하여 stop codon을 포함한 gpmI 변이를 도입하는 방법을 이용하였다. stop codon을 포함한 gpmI 변이체는 K12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 77내지 81의 프라이머들을 이용하여 sewing PCR를 통하여 획득하였으며, pSG76C 벡터의 SacI과 BamHI 자리에 클로닝하였다.
실시예 24: GpmI , GpmA 및 GpmB 결손 균주 OPS 생산능 평가
실시예 23에서 제작된 균주를 실시예 9에서 기술한 바와 동일한 방법으로 OPS의 생산능을 평가하였다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
CA07-0022 serA*(G336V) 23 40 2.4
CA07-0022 serA*(G336V)DgpmI 22 38 2.5
CA07-0022 serA*(G336V)DgpmA 20 34 2.8
CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmB 20 34 2.7
CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmIΔgpmA 19 32 2.6
CA07-0022 serA*(G336V)ΔgpmAΔgpmB 21 35 3.3
각 균주에 대한 평가 결과 gpmI, gpmA 및 gpmB 단독 결손시 당 소모속도는 하락하나, OPS 생성량은 대조군 대비 증가하는 것을 확인하였다. 특히 gpmA와 gpmB 동시 결손시 gpmA 또는 gpmB 단독 결손 균주에 비해 당 소모속도는 비슷하나, OPS 생성량이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 gpmI, gpmA 및 gpmB 결손은 OPS의 전구물질인 3-포스포글리세레이트의 양을 증가시킴으로써 OPS의 생성량을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 25: 2-아미노-3- 케토부티레이트 CoA 리가아제 ( Kbl ), L-세린 디아미네이즈 I( SdaA ) 결손 균주 제작
CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 2-아미노-3-케토부티레이트 CoA 리가아제를 코딩하는 유전자인 kbl 및 L-세린 디아미네이즈 I을 코딩하는 유전자인 sdaA를 결손하여 각각, CA07-0022 serA*(G336V)Dkbl, CA07-0022 serA*(G336V)DsdaA 균주를 제작하였다. kbl 및 sdaA 각 결손 균주의 제작 방법은 실시에 5에 기술한 바와 같으며, kbl은 서열번호 83과 서열번호 84의 프라이머 쌍을, sdaA는 서열번호 85과 서열번호 86의 프라이머 쌍을 이용하였다.
실시예 26 : Kbl , SdaA 결손 균주의 글리신 첨가량에 따른 OD 및 당소모량 평가
실시예 25에서 제작된 균주에 대하여 실시예 9의 표 8에 기술된 배지 조건에서 글리신의 농도를 0~2.5g/L로 달리하여 OD, 소모당 및 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다.
글리신 첨가 농도(g/L) 균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)

0		 CA07-0022 serA*(G336V) 8 10 0.7
CA07-0022 serA*(G336V)Dkbl 7 8 0.7
CA07-0022 serA*(G336V)DsdaA 9 10 0.7

1		 CA07-0022 serA*(G336V) 15 30 1.5
CA07-0022 serA*(G336V)Dkbl 14 28 1.2
CA07-0022 serA*(G336V)DsdaA 22 39 2.4

2		 CA07-0022 serA*(G336V) 19 35 2.1
CA07-0022 serA*(G336V)Dkbl 17 32 1.7
CA07-0022 serA*(G336V)DsdaA 23 40 2.5

2.5		 CA07-0022 serA*(G336V) 22 38 2.5
CA07-0022 serA*(G336V)Dkbl 23 39 2.7
CA07-0022 serA*(G336V)DsdaA 24 40 2.3
각 균주에 대한 평가 결과, 표 20에 나타난 바와 같이 3 균주에서 모두 배지 내 첨가하는 글리신 농도를 증가시킬수록 OD 및 당 소비 속도가 증가하였으며 특히 sdaA 결손 균주의 경우, 1 g/L 글리신이 첨가된 조건에서 OD 및 당 소비 속도가 상당히 증가했음을 확인하였다. 또한 kbl 결손 균주의 경우, 2.5 g/L 글리신이 첨가된 조건에서 OPS 생산성 향상도 확인하였다.
실시예 27: 전사조절인자 IclR 결손 균주 제작
CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 전사조절인자인 iclR을 결손하여 CA07-0022 serA*(G336V)ΔiclR 균주를 제작하였다. iclR 결손 균주의 제작은 실시예 5의 방법과 마찬가지로 원스탭 불화성화 방법에 의해 제작하였으며, 항생제 내성부여 표식 유전자를 제거하였다. iclR 결손 균주는 서열번호 87와 서열번호 88의 프라이머 쌍을 이용하였다.
실시예 28: IclR 결손 균주 OPS 생산능 평가
실시예 27에서 제작된 균주를 실시예 9에서 기술한 바와 동일한 방법으로 OPS의 생산능을 평가하였다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) OPS(g/L)
CA07-0022 serA*(G336V) 22 38 2.5
CA07-0022 serA*(G336V)DiclR 22 40 2.7
각 균주에 대한 평가 결과, 표 21에 나타난 바와 같이 iclR이 결손된 균주의 경우 OPS의 생산량이 증가하였다.
실시예 29: 대장균 Acetyl CoA 신테타아제 ( Acs ), 피루베이트 옥시데이즈 모노머( PoxB ), 아세테이트 카이네이즈 ( AckA ), 포스페이트 아시틸트랜스퍼라아제 ( Pta ) 강화 벡터 클로닝
O-포스포세린 생산 균주에서 아세테이트 생성 및 재이용성을 증가시키기 위하여 대장균에서 Acetyl CoA 신테타아제를 코딩하는 유전자인 acs, 피루베이트 옥시데이즈 모노머를 코딩하는 유전자인 poxB, 아세테이트 카이네이즈를 코딩하는 유전자인 ackA 및 포스페이트 아시틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 pta를 각각 발현할 수 있는 플라스미드를 제작하였다.
각각의 유전자는 대장균 W3110의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행함으로써 획득하였다. acs는 서열번호 89, 서열번호 90, poxB는 서열번호 91, 서열번호 92, ackA 및 pta는 서열번호 93, 서열번호 94의 프라이머쌍을 이용하였으며, pfu PCR을 수행하였다. 각 유전자 단편은 HindIII로 제한 효소 처리하여, pCL1920 벡터에 대장균의 rmf 유전자의 프로모터가 삽입되어 있는 pCL-Prmf-GFP벡터의 EcoRV와 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-Prmf-acs, pCL-Prmf-poxB, pCL-Prmf-ackA-pta를 제작하였다. 이후, 각 플라스미드를 EcoRI으로 제한효소 처리하여 Prmf-acs, Prmf-poxB, Prmf-ackA-pta의 insert를 획득한 후, pCC1BAC(EcoRI) (CopyControlTM pcc1BACTM Vector, Epicentre. Cat. Nos. CBAC311) 벡터에 클로닝하여 각각, pCC1BAC-Prmf-acs, pCC1BAC-Prmf-poxB, pCC1BAC-Prmf-ackA-pta를 제작하였다.
실시예 30: 대장균 Acs , PoxB , AckA , Pta 강화 OPS 생산 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 29에서 제작된 3종의 벡터를 CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 도입한 후, 실시예 9와 동일한 방법으로 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다.
균주명 OD562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)
CA07-0022 serA*(G336V) 21.9 35.5 2.45
CA07-0022 serA*(G336V) / pCC1BAC-Prmf-acs 23.6 40 2.65
CA07-0022 serA*(G336V) / pCC1BAC-Prmf-poxB 18.3 36.8 1.86
CA07-0022 serA*(G336V) / pCC1BAC-Prmf-ackA-pta 21.8 40 2.65
각 유전자에 대한 평가 결과, 표 22에 나타난 바와 같이 poxB가 도입된 경우에는 O-포스포세린의 생산량이 감소하였으나, acs 또는 ackA-pta가 도입된 균주에서 균주 생육 및 O-포스포세린의 생산량이 증가했음을 알 수 있다.
실시예 31: 대장균 말레이트 신타아제 A( AceB ), 아이소사이트레이트 라이에이즈 모노머 ( AceA ), 포스포이놀피루베이트 카복시카이네이즈 ( PckA ), 말레이트 신타아제 G( GlcB ), 말레이트 디하이드로게나아제 ( MaeB ) 강화 벡터 클로닝
대장균에서 말레이트 신타아제 A를 코딩하는 유전자인 aceB 및 아이소사이트레이트 라이에이즈 모노머를 코딩하는 유전자인 aceA, 포스포이놀피루베이트 카복시카이네이즈를 코딩하는 유전자인 pckA, 말레이트 신타아제 G를 코딩하는 유전자인 glcB, 말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 maeB를 각각 발현할 수 있는 플라스미드를 제작하였다.
각각의 유전자는 대장균 W3110의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행함으로써 획득하였다. aceBA는 서열번호 95, 서열번호 96, pckA는 서열번호 97, 서열번호 98, glcB는 서열번호 99, 서열번호 100, maeB는 서열번호 101, 서열번호 102의 프라이머쌍을 이용하였으며, pfu PCR을 수행하였다. 각 유전자 단편은 HindIII로 제한 효소 처리하여, pCL1920 벡터에 대장균의 rmf 유전자의 프로모터가 삽입되어 있는 pCL-Prmf-GFP벡터의 EcoRV와 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-Prmf-aceBA, pCL-Prmf-pckA, pCL-Prmf-glcB, pCL-Prmf-maeB를 제작하였다.
실시예 32: 대장균 AceB , AceA , PckA , GlcB , MaeB 강화 OPS 생산 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 31에서 제작된 4종의 플라스미드를 CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 도입한 후, 실시예 9와 동일한 방법으로 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다.
균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)
CA07-0022 serA*(G336V) 23 40 2.4
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-aceBA 20 36 1.9
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-pckA 10 11 0
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-glcB 21 40 2.8
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-maeB 21 40 2.9
각 유전자에 대한 평가 결과, 표 23에 나타난 바와 같이 aceBA가 도입된 균주의 경우 당소모 속도 및 OPS 의 생산량은 다소 감소하였고, pckA가 도입된 균주의 경우 균주 생육이 매우 저하되는 결과를 나타내었다. glcB와 maeB가 도입된 균주의 경우, OPS의 생산량은 증가하였다.
실시예 33: 글리옥실레이트 카보리가아제 ( Glc ), 타르트로네이트 세미알데히드 리덕타아제 2( GlxR ), 글리세레이트 카이네이즈 II ( GlxK ) 강화 벡터 클로닝
글리옥실레이트를 3-포스포글리세레이트로 전환시키기 위해 글리옥실레이트 카보리가아제를 코딩하는 gcl, 타르트로네이트 세미알데히드 리덕타아제 2를 코딩하는 glxR, 글리세레이트 카이네이즈 II를 코딩하는 glxK 유전자의 클로닝을 다음과 같은 방법으로 제작하였다. gcl, glxR-glxK 의 유전자 단편은 대장균 W3110의 genomic DNA를 주형으로 하였으며, gcl 단편은 서열번호 103, 104의 프라이머를, glxR-glxK 절편은 서열번호 105 내지 108의 프라이머를 이용하여 PCR을 통하여 획득하였다. 증폭된 각 유전자의 단편은 EcoRV와 HindIII의 제한 효소로 처리하였으며, pCL1920 벡터에 대장균의 rmf 유전자의 프로모터가 삽입되어 있는 pCL-Prmf-GFP벡터의 EcoRV와 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-Prmf-gcl, pCL-Prmf-glxR-glxK, pCL-Prmf-glxR-glxK-Prmf-gcl을 제작하였다.
실시예 34: Glc , GlxR , GlxK 강화 OPS 생산 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 33에서 제작된 3종의 플라스미드를 CA07-0022 serA*(G336V) 균주에 도입한 후, 실시예 9와 동일한 방법으로 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다. 이의 결과는 표 24에 나타내었다.
시간 균주명 OD 562nm 소모당 (g/L) OPS (g/L)

24h

 CA07-0022 serA*(G336V) 15.6 24 1.25
CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-gcl 19.6 29.7 1.2
CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-glxR-glxK 21 33 1.3
CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-glxR-glxK-Prmf-gcl 18.4 29.7 1.03

48h

 CA07-0022 serA*(G336V) 23 40 2.4
CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-gcl 31.5 40 1.67
CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-glxR-glxK 26.2 40 1.5
CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-glxR-glxK-Prmf-gcl 22 40 1.61
각 유전자에 대한 평가 결과, 표 24에 나타난 바와 같이 gcl, glxR-glxK, glxR-glxK-gcl이 각각 도입된 균주의 경우 해당 유전자가 도입되지 않은 CA07-0022 serA*(G336V)과 비교했을 때, 최종 OPS 의 생성량은 감소하였으나, 균주 생육 및 당소모 속도가 증가했음을 알 수 있다. 특히 glxR-glxK 유전자가 도입된 균주의 균주 생육 및 당소모 속도가 가장 크게 증가했다.
실시예 35: O- 포스포세린 생산 균주의 발효조 평가
CA07-0022 serA*(G336V) / pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC 균주를 50 ㎍/㎖의 스펙티노마이신을 함유하는 MMYE 한천 배지 플레이트(2g/L의 글루코스, 2 mM의 황산마그네슘, 0.1 mM의 염화칼슘, 6 g/L의 피로인산나트륨, 0.5 g/L의 염화나트륨, 3 g/L의 인산이수소칼륨, 10 g/L의 효모추출물, 18g/L의 한천)상에서 33℃, 24시간 배양하고, 플레이트 상의 1/10의 세포를 하나의 플레이트로부터 긁어내어 배플(baffle) 플라스크 중에 50 ㎍/㎖의 스펙티노마이신을 함유한 50 ml의 플라스크 씨드 배지(10 g/L의 클루코스, 0.5 g/L의 황산마그네슘, 3 g/L의 인산이수소칼륨, 10 g/L의 효모추출물, 0.5 g/L의 염화나트륨, 1.5 g/L의 염화암모늄, 12.8 g/L의 피로인산나트륨, 1 g/L의 글리신) 에 접종시켜 30℃에서 200rpm으로 6시간 동안 씨드 배양하였다.
씨드 배양이 완료된 후 본배양 배지 용적의 16%에 상응하는 용적의 씨드 배양 배지를 300ml의 본배양 배지로 채워진 1L 소형 발효기에 접종하고, 배양을 33℃에서 pH 7.0에서 수행하였다. 본배양 배지 조성물은 표 25에 나타내었다.
주요성분 미량원소
조성물 농도 (리터당) 조성물 농도 (리터당)
글루코스 20g/L 염화코발트 0.7g/L
황산마그네슘 0.3g/L 황산아연 0.3g/L
인산이수소칼륨 1.5g/L 몰리브데이트 0.15g/L
효모 추출물 5g/L 붕산 1.2g/L
황산암모늄 5g/L 황산망가니즈 1.6g/L
트립톤 10g/L 황산구리 0.25g/L
글리신 2g/L
염화나트륨 0.5g/L
구연산나트륨 1g/L
황화철 75mg/L
염화칼슘 15mg/L
미량원소 1ml/L
배양물을 배양 동안에 암모니아수를 첨가하여 pH 7.0으로 조정했다. 배지 중 글루코스가 고갈된 후 520g/L의 글루코스 수용액을 첨가하여 유가 배양을 수행했다. 80시간의 배양 후, HPLC로 확인한 결과, 19.5g/L의 OPS가 측정되었다.
<O- 포스포세린 설프하이드릴라아제 ( OPS sulfhydrase , OPSS ) 발굴 및 효소 특성 규명>
실시예 36: OPSS 효소 확보
Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis , Trichomonas vaginalis 에서는 기존에 대장균에서 알려진 경로와 달리 시스테인 합성에 OAS(O-acetyl-serine)를 이용하지 않고 OPS(O-phospho-L-serine)를 이용하여 L-시스테인을 합성하는 효소인 OPSS(O-phosphoserine sulfhydrylase)가 존재한다고 보고되었다 (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al ., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD et al ., J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). 상기의 문헌 보고를 바탕으로 OPS을 기질로 하여 시스테인을 합성하는 총 2종의 OPSS 효소를 Aeropyrum pernix , Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래로부터 확보하였다. 상기의 2종의 효소 중 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래 OPSS 효소를 기반으로 하여 아미노산 상동성 검색을 통해 Mycobacterium smegmatics str . MC2 155, Rhodococcus jostii RHA1 , Nocardia farcinica IFM 10152 유래 3종의 OPSS 효소를 선별하였다.
각각의 균주로부터 OPSS 효소를 획득하기 위하여, 통상적으로 효소 발현을 위해 이용되는 pET28a (novagen) 벡터 시스템을 제작하였다. 총 5종의 OPSS 효소 발현 벡터명과 벡터를 제작하기 위해 사용한 각각의 주형 및 프라이머는 하기 표 26과 같다. 주형과 프라이머 조합을 맞추어 PCR기법을 통해 각각의 OPSS 유전자를 증폭하여 얻은 유전자 단편과 벡터 pET28a을 NdeI과 HindIII 제한효소를 처리(37℃, 3시간 반응)하였다. 이후 통상적인 라이게이션 기법을 사용하여 pET28a (novagen) 벡터에 각각의 유전자 단편을 삽입하였다. 각각의 효소 발현 벡터 제작 유무 및 유전자 서열은 시퀀싱 기법으로 모두 확인하였다. 상기 제작된 효소 발현 벡터를 DE3 유전자형을 가진 대장균에 도입하여 총 5종의 OPSS 효소를 획득할 수 있는 균주를 제작하였다. 효소명은 하기 표 26과 같다.
효소명 벡터명 사용한 주형 사용한 프라이머
Ape-OPSS pET28a-Ape-OPSS 합성 DNA 서열번호 109
서열번호 110
Mtb-OPSS pET28a-Mtb-OPSS Mtb genomic DNA 서열번호 111
서열번호 112
Msm-OPSS pET28a-Msm-OPSS Msm genomic DNA 서열번호 113
서열번호 114
Rjo-OPSS pET28a-Rjo-OPSS Rjo genomic DNA 서열번호 115
서열번호 116
Nfa-OPSS pET28a-Nfa-OPSS Nfa genomic DNA 서열번호 117
서열번호 118
효소를 발현하기 위한 방법은 pET system 매뉴얼 (novagen)을 참조하였다. 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 5 ml LB 액체배지에 접종하여 37℃, 200 rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25ml LB 액체배지(250 ml 용량의 플라스크)에 250 ml 재접종하여 OD600이 0.5~0.6 되도록(2~3시간) 동일 배양 조건에서 키운 직후, 1 mM IPTG을 배지에 첨가하여 18℃, 120 rpm, 18 시간 배양하여 효소 발현을 유도하였다. 효소의 정제를 위한 방법은 his-tag을 이용하여 Ni-NTA columns으로 분리하였다. 정제 방법은 His spintrap(GE healthcare)을 인용하였다. 상기의 과정으로 획득한 총 5종의 OPSS효소는 14% SDS PAGE을 통해 각각 확인한 결과, 응집체(inclusion body) 형태로 발현되는 Rjo-OPSS 효소를 제외한 총 4종의 가용성의 OPSS 효소를 확보하였다.
실시예 37: OPSS 효소의 시스테인 합성 활성 평가
OPS 기질로 시스테인 합성여부를 파악하기 위해 다양한 미생물 유래로부터 확보한 총 4종의 OPS sulfhydrase의 효소 활성을 측정하였다. 시스테인 합성 활성 평가(cysM enzyme assay) 조건 및 방법은 문헌 보고(Mino K and Ishikawa K, 2003; Burns KE et al .,, 2005; Westrop GD et al ., 2006)를 인용하였다. 기질의 첨가 단위는 ml이며, 효소 활성을 측정하기 위한 조건은 하기 표 27과 같다.
Stock sol'n Final Conc. Blank OPSS
6xhis-enzyme 　 - 40 (50 mg)
1 M HEPES(pH7.4) 100 mM HEPES 100 100
0.5 M Na2S 10 mM Na2S 20 20
10 mM PLP 0.2 mM PLP 20 20
100mM OPS 5mM OPS 0 50
DW 　 790 750
Total 　 1000 1000
효소를 제외한 반응액을 37℃에서 5분간 배양시킨 후, 정제된 OPSS 효소 50 mg을 첨가하여 37℃ 반응하여 시간 별로 효소 반응액 100 ml 취하여 33.2% TCA 100ml 와 혼합하여 반응을 중지시켰다. 효소 반응액 내의 시스테인의 농도는 Gaitonde 방법으로 OD560 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 하기 표 28에서는 총 4종의 OPSS 효소들의 시스테인 전환 활성을 보여주며, 반응 시간 별 시스테인 전환율을 비교하여 OPSS 효소들의 시스테인 전환 역가를 평가하였다.
시스테인 전환율(%)
10min 30min 60min
Ape-OPSS 63.4 89.7 97.4
Mtb-OPSS 1.7 4.8 10.1
Msm-OPSS 12.8 25 43.7
Nfa-OPSS 0.1 0.1 0.2
문헌 보고 (Mino K and Ishikawa K, 2003; Westrop GD et al ., 2006)를 통해 획득한 Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래의 OPSS의 경우 OPS을 기질로 하여 시스테인으로 전환하는 활성을 가지고 있음을 검증하였으며, Mtb-OPSS 효소 기반으로 아미노산 상동성 탐색을 통해 확보한 신규 Mycobacterium smegmatis str . MC2 155 유래 OPSS의 시스테인으로 전환하는 활성을 처음으로 확인하였다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, Ape-OPSS 효소의 경우 동일 효소 반응시간 1시간에 OPS을 기질로 하여 시스테인으로 전환하는 전환율이 100%에 가까운 결과를 나타내었으며, 기존에 문헌을 통해 보고된 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래 OPSS 효소를 기반으로 효소 스크리닝 기법을 통해 새로 선별된 Msm-OPSS 효소의 최종 시스테인 전환율은 43.7%로 Mtb-OPSS 효소 대비 효소 활성이 4.3배 증가되었음을 확인하였다. 하지만 상동성 탐색을 통해 확보한 신규 Nocardia farcinica IFM 10152 유래 OPSS의 경우 O-포스포세린을 기질로 한 시스테인으로 전환하는 효소 활성이 미미하였다.
실시예 38: Mtb - OPSS , Msm - OPSS 기반 C말단으로부터 5개의 아미노산이 결실된 Mtb -T, Msm -T 변이체 확보
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래 OPSS 효소는(Mtb-OPSS) 보조효소인 mec+, cysO의 도움을 받아 OPS를 시스테인으로 전환시키는데 C-말단의 5개 아미노산을 제거할 경우 이러한 보조 효소들의 도움 없이, S2-기를 지닌 황 소스를 이용하여 OPS를 시스테인으로 전환시킨다는 보고가 있다(Agren D et al ., FEBS letters, 583: 330-336, 2009). 상기의 문헌 보고를 바탕으로 하여 S2-기를 지닌 황 소스를 이용하여 OPS을 빠르게 시스테인 전환하는 Mtb-T(서열번호 11)를 확보하였다. 또한 Mtb-OPSS 효소와 아미노산 상동성을 보이는 Msm-OPSS(서열번호 9) 효소를 기반으로 하여 Msm-T 효소를 추가 확보하였다. 2종의 변이체 효소 발현 벡터를 제작하기 위해 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 및 Mycobacterium smegmatics str . MC2 155 의 genomic DNA를 주형으로 서열번호 119, 서열번호 120 및 서열번호 121, 서열번호 122의 각각의 프라이머 쌍을 이용하였으며, pfu PCR을 수행하였다. 각각의 OPSS 유전자 단편은 NdeI, HindIII로 제한 효소 처리하여, NdeI, HindIII로 절단된 pET28a 벡터에 클로닝 하여, pET28a-Mtb-T 및 pET28a-Msm-T 벡터를 제작 하였다. 위의 제작된 효소 발현 벡터를 DE3 유전자형을 가진 대장균에 도입하였다. 효소 발현 및 정제는 상기 실시예 35와 동일한 조건으로 수행하여 얻어진 2종의 변이체 OPSS 효소는 14% SDS PAGE을 통해 효소 발현을 확인하였으며, 그 결과 Mtb-T(서열번호 11), Msm-T(서열번호 10) 효소를 확보하였다.
실시예 39: Mtb -T, Msm -T 변이체의 시스테인 전환 활성 평가
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 유래의 OPSS 효소의 5개의 C말단이 제거된 변이체의 경우, 조효소들이 존재하지 않은 조건에서 S2-기를 지닌 황 소스에 대한 기질 친화도가 증가한다는 문헌 결과를(Agren D, Schnell R and Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009) 바탕으로 Mtb-T, Msm-T 효소를 확보하여 최종 시스테인 전환율을 측정하여 효소 활성을 평가하였다. 효소 활성 평가를 위한 효소 반응 조건 및 방법은 실시예 37과 동일하게 수행하였으며, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다.
시스테인 전환율(%)
10min 30min 60min
Mtb-T 9.5 18.6 37.1
Msm-T 20.3 54.6 100
상기 표 29의 결과로부터 Mycobacterium smegmatics str . MC2 155 유래 OPSS 효소로부터 5개의 C말단이 제거된 Msm-T 변이체의 경우, 시스테인 전환 반응 1시간에 100%의 시스테인 전환율을 보였다.
상기와 같이 당해 균주의 O-포스포세린 설피드릴레이즈(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)의 아미노산을 변형시켜 L-시스테인 전환 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 40: OPSS 효소의 보조인자( cofactor ) 요구성
시스테인 전환반응에 있어 보조인자의 요구성을 확인하기 위해 Msm-T로 PLP (pyridoxal-5'-phosphate)와 DTT (dithiothreitol)의 유무에 따른 시스테인 전환율을 확인하였다. 50 mM OPS broth, 100 mM Na2S를 기질로 25 mM DTT 또는 0.2 mM PLP 조건에서 37℃에서 30분간 반응하였고 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 하기 표 30의 결과에서 보듯이 PLP와 DTT가 첨가되지 않은 대조군 대비 PLP와 DTT가 첨가된 실험군에서의 시스테인 전환율이 2.3배 가량 증가하였다. 즉, 시스테인 전환 시 PLP와 DTT가 반응에 긍정적으로 작용함을 확인하였다.
Msm-T 시스테인 전환율 (%)
(-) PLP, (-) DTT 23.62
(+) PLP, (-) DTT 33.21
(-) PLP, (+) DTT 40.08
(+) PLP, (+) DTT 54.65
실시예 41: OPSS 효소의 온도 별 활성도
Ape-OPSS와 Msm-T의 온도 별 시스테인 전환율을 확인하였다. 37℃, 60℃별 활성도를 2, 5, 10, 30, 60분 간격으로 측정하였고, 반응은 100 mM Hepes (pH 7.4), 5 mM OPS, 10 mM Na2S, 0.2 mM PLP, CysM 50 ㎍/ml의 조건에서 수행하였으며, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 2의 결과에서 알 수 있듯이 버퍼가 있는 조건에서 37℃조건에서 Ape-OPSS가 Msm-T보다 초기 효소 반응속도가 빠를 뿐 아니라 60℃에서는 보다 빠른 활성을 있음을 확인하였다.
실시예 42: OPSS 효소의 열 안정성
Ape-OPSS와 Msm-T의 열 안전성을 확인하였다. 두 효소를 각각 OPS 발효액으로 2 mg/ml로 희석하여 37℃와 60℃조건에서 10, 30, 60, 120, 240분간 열처리하였다. 그 후, 5 mM OPS, 10 mM Na2S, 0.2 mM PLP, 100 mM HEPES (pH 7.4) 조건에서 37℃, 30분간 반응하였다. 이때 사용한 효소의 양은 Ape-OPSS 10㎍/ml와 Msm-T 50㎍/ml을 사용하여 반응하였고, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과 Ape-OPSS는 60℃, 4시간 동안 열 처리하였어도 활성을 그대로 가지고 있는 반면, Msm-T은 37℃에서 그대로 활성을 유지했지만, 60℃, 30분 동안 열처리하면서 50%의 활성을 잃어버렸다(표 31).
Relative activity (%)
Heating time (min) (-) 10 min 30 min 60 min 120 min 240 min
Ape-OPSS 100 102 107 100 107 101
Msm-T 100 82 50 32 19 8
또한, OPS 발효액에 정제된 OPS의 전환반응과 동일한 농도로 50 ㎍/ml의 Msm-T이 포함된 경우, 상기 효소가 37℃에서 활성을 유지하는 기간을 확인하였다. Na2S가 없는 조건에서 50 mM OPS 발효액, 0.2 mM PLP, 50 ㎍/ml Msm-T의 샘플을 37℃에서 0.5, 1, 2, 4, 6시간 처리 후, Na2S를 넣고 30분간 반응하여 Msm-T의 잔존 활성을 측정하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과 OPS 발효액 조건에서 Msm-T의 활성이 37℃에서 2시간 이후에는 50% 이하의 활성만 가지고 있음을 확인하였다(표 32).
Time 0 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min
시스테인 전환율(%) 100 88 73 47 11 3
실시예 43: OPSS 효소의 pH 민감성
Ape-OPSS와 Msm-T의 pH별 시스테인 전환율을 확인하였다. 100 mM buffer 조건에서 Ape-OPSS와 Msm-T는 50 ㎍/ml 사용하여 37℃, 10분간 반응하였다. K-phosphate buffer pH 6.4 / 7.0 / 7.4 / 8.0, Tris-HCl buffer pH 7.0 / 7.4 / 8.0 / 8.5 / 8.8, Na-carbonate buffer 8.0 / 8.5 / 9.0 / 10.0을 사용하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, Msm-T의 경우 buffer에 상관없이 pH 8.0~9.0 사이에서 가장 높은 활성을 보였다. 또한 Ape-OPSS의 경우, 가장 높은 활성을 보인 조건은 K-Phosphate (pH7.4)이며 buffer 별로 최적 pH는 상이하였다.
실시예 44: OPSS 효소의 이온 영향성
각 효소들의 이온들에 대한 영향을 파악하기 위해 실험하였다. 실험 조건은 다음과 같다. 5 mM OPS, 10 mM Na2S, 0.2 mM PLP, 100 mM HEPES (pH 7.4) 반응혼합액에 (NH4)2SO4 [1, 3, 5, 10, 20 g/L], KH2PO4 [0.5, 1, 2, 4, 8 g/L], NH4Cl [0.2, 0.5, 1, 2 g/L] 를 각각 첨가하여 37℃, 30분간 반응하였다. 이때 사용한 효소의 양은 Ape-OPSS 10 ㎍/ml와 Msm-T 50 ㎍/ml을 사용하였으며, 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다.
실험 측정결과 (NH4)2SO4 와 KH2PO4를 넣은 혼합액의 시스테인 전환율은 변화가 없었다. 반면 하기 표 33의 결과에서 보듯이 NH4Cl을 주입하고 반응하였을 경우 NH4Cl 농도에 비례하여 시스테인 전환율이 감소하였다. 특히 2 g/L NH4 Cl이 첨가된 혼합액의 경우 최대 효소 활성이 최대 70% 감소하였다. 즉, 시스테인 전환반응을 촉매하는 OPSS 활성이 NH4Cl에 의한 부정적인 영향을 받는 것을 확인하였다.
Relative activity (%)
NH4Cl Ape-OPSS Msm-T
0 100.00 100.00
0.2 86.26 91.49
0.5 73.35 91.30
1 49.11 67.11
2 27.72 47.12
실시예 45: OPSS 효소의 황 source 따른 시스테인 전환
각 효소들의 황 소스에 따른 시스테인 전환에 미치는 영향성을 확인하는 실험을 수행하였다. 각 효소 Ape-OPSS 및 Msm-T(각, 50 ㎍/ml), OPS 5 mM, Na2S 혹은 NaSH 혹은 Na2S2O3 10 mM, PLP 0.2 mM, HEPES 100 mM 의 반응 혼합액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. Ape-OPSS는 Na2S2O3를 황 소스로 더 선호하는 것으로 보였으나 Msm-T는 Na2S를 더 선호하는 것으로 보여진다(표 34).
Relative activity (%)
효소명 Na2S NaSH Na2S2O3
Ape-OPSS 100.0 95.2 142.3
Msm-T 106.7 98.3 66.2
실시예 46: OPSS 효소 발현 벡터 제작( pCL - Pcj1 system ) 및 효소 발현
앞서 제작한 pET28a-Msm-T를 주형으로 하여 서열번호 123와 124 프라이머를 이용하여 PCR기법으로 유전자 단편을 증폭한 후, EcoRV와 HindIII 제한효소를 처리하였다. 상기 제한된 단편을 pCL-P(CJ1)에 연결하여 pCL-P(CJ1)-Msm-T 벡터를 제작 하였다. pET system과 pCL-Pcj1 system의 Msm-T 발현량 차이 여부를 확인하고자 효소 발현을 위한 균주를 제작하였다. pET system은 Rosetta (DE3)에 도입하였고, pCL-Pcj1 system은 K12G 균주를 사용하였다. 효소 발현을 위해 평판 LB 배지에서 각각의 균주의 단일 콜로니를 선별하여 5ml LB 액체배지에 접종하여 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25ml LB + Kanamycin 또는 spectinomycin + 0.2% glucose 액체배지(250 ml 용량의 플라스크)에 재접종하여 OD600이 0.5~0.6 되도록 배양하였다. 이후 0.1 mM IPTG로 발현을 유도하였으며, 37℃, 200rpm, 배양 시간 별로(8, 16, 24시간) 발현량을 확인하였다. 두 system간의 효소 발현량은 14% SDS PAGE 상에서 확인하였다(도 4).
실시예 47: OPS 발효 정제액을 기질로 OPSS 효소를 이용한 시스테인 전환 반응
발효액으로부터 정제된 OPS에서의 Msm-T과 Ape-OPSS의 시스테인 전환율을 확인하였다. OPS 발효액으로부터 정제한 60 mM 정제 OPS, 120 mM Na2S, 0.2 mM PLP가 있는 조건에서 효소농도는 75 ㎍/ml로 37℃ 30, 60, 90, 120분간 반응하였다. 이때 Msm-T은 37℃에서만, Ape-OPSS의 경우 37℃와 70℃에서 반응을 진행하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 OPS 발효 정제액을 이용한 시스테인 전환반응 가능성을 확인하였으며, 특히 정제 OPS, 70℃ 조건에서 Ape의 시스테인 전환율이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 48: OPS 발효액을 기질로 OPSS 효소를 이용한 시스테인 전환 반응
OPS 발효액을 기질로 Msm-T와 Ape-OPSS의 농도 별 시스테인 전환율을 확인하였다. 50 mM OPS 발효액, 100 mM Na2S, 0.2 mM PLP조건에서 Msm-T와 Ape-OPSS 농도를 5 ㎍ 또는 50 ㎍/ml 조건으로 37℃에서 시스테인 전환 반응을 수행하였다. 생성된 시스테인은 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 상기 전환 반응 조건에서, 50 ㎍/ml Msm-T를 사용하였을 때 가장 높은 전환율을 보였다. 또한 OPS 발효액을 기질로 하였을 때 Msm-T의 활성이 Ape-OPSS보다 높음을 확인하였다.
실시예 49: OPS 농도별 시스테인 전환 반응
Msm-T의 OPS 농도에 따른 전환률을 측정하기 위해 각각 OPS 발효액에 일정량의 정제된 OPS를 첨가 하여 전환 반응을 수행하였다. 효소의 량은 50 ㎍을 사용하였고 효소 반응액 내의 시스테인 농도는 Gaitonde 방법으로 정량하였다. 그 결과 OPS의 농도가 약 30 g/l 일 때 전환률이 Msm-T는 100%로 가장 높게 나타났다.
또한 OPS의 농도가 50 g/l 이상이 되면 효소 전환 속도 및 전환율이 감소하는 양상을 확인하였다. 이로부터 OPS 발효액을 기질로 하여 전환 반응을 할 시, OPS 농도에 따른 최적 효소량 비가 있는 것으로 판단된다.
시스테인 전환률 (Msm-T 50 mg)
Time 0 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
OPS 측정량 10.65g/l 0 23.03 65.38 65.70 61.95 55.35
OPS 측정량 36.09g/l 0 1.15 10.23 28.07 97.84 100.34
OPS 측정량 55.6g/l 0 0 2.36 7.41 42.69 66.67
한국미생물보존센터(국외) KCCM11103P 20100928
서열목록 전자파일 첨부

Claims (30)

1) 포스포세린 포스파타아제(phosphoserin phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성보다 약화된 재조합 미생물을 배양하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산하는 단계; 및
2) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재하에, 상기 단계 1)에서 생성된 OPS를 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체를 제조하는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 포스포세린 포스파타아제는 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 SerB의 활성 약화 방법은 상기 효소의 활성이 감소된 유전자로 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 이보다 활성이 약한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자를 결손시키는 방법 및 상기 염색체 상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 SerB의 활성이 내재적 활성보다 약화된 재조합 미생물을 추가로 글리신 또는 세린을 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제4항에 있어서, 상기 글리신 첨가량은 0.1 내지 10 g/L인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법
제4항에 있어서, 상기 세린 첨가량은 0.1 내지 5 g/L 인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 강화된 것인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 SerA는 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제7항에 있어서,
i) 상기 SerA는 서열번호 3 내지 7로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고;
ii) SerC는 서열번호 8로 기재된 아미노산 서열을 갖는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 PhnCDE 오페론[포스포네이트 트랜스포터의ATP-결합요소(ATP-binding component of phosphonate transport, PhnC; EG 10713)-Pn 이송의 주변세포질 결합단백질 요소(periplasmic binding protein component of Pn transporter, PhnD; EG 10714)-알킬포스포네이트 ABC 수송체의 내재막 요소(integral membrane component of the alkylphosphonate ABC transporter, PhnE; EG 11283)]의 활성이 내재적 활성보다 약화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase; PhoA); 또는 알칼라인 포스파타아제 및 에시드 포스파아제(acid phosphatase; AphA)의 활성이 내재적 활성보다 약화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 피리미딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제(nucleotide transhydrogenase, PntAB)의 활성이 강화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 O-아세틸세린/시스테인 배출 퍼미아제 (O-Acetylserine/Cysteine Efflux Permease, YfiK), 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질(homoserine/homoserine lactone efflux protein, RhtB) 또는 쓰레오닌/호모세린 배출 단백질(threonine/homoserine efflux protein, RhtC)의 효소의 활성이 강화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제7항, 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 강화 방법은 상기 효소를 암호화하는 유전자의 세포내 카피수 증가, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열을 이보다 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소의 활성이 증가된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 효소의 활성이 강화되도록 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스트글리세레이트 뮤테이즈 (phosphoglycerate mutase; GpmA, GpmI 또는 GpmB)의 활성이 내재적 활성보다 약화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 L-세린 디아미네이즈 I(L-serine dehydratase I, SdaA)의 활성이 내재적 활성보다 약화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 2-아미노-3-케토부티레이트 CoA 리가아제(2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase; Kbl) 또는 전사조절인자(transcription factor; IclR) 효소의 활성이 내재적 활성보다 약화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로아세틸-CoA 신테타아제(Acetyl-CoA synthetase, Acs), 아세트산 키나아제(acetic acid kinase, AckA)-포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase, Pta), 말레이트 신타아제 G(malate synthase G, GlcB), 말레이트 디하이드로게나아제(malate dehydrogenase, MaeB), 글루타메이트 디하이드로게나아제(glutamate dehydrogenase, GdhA), 글리옥실레이트 카보리가아제(glyoxylate carboligase, Glc), 타르트로네이트 세미알데히드 리덕타아제 2(tartronate semialdehyde reductase 2, GlxR) 및 글리세레이트 카이네이즈 II(Glycerate kinase II, GlxK)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 강화된, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제18항에 있어서, 상기 Glc, GlxR 및 GlxK로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 강화됨으로써, 상기 재조합 미생물의 당소모 및 생육이 개선되는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 에스케리키아(Escherichia) 속 또는 코리네형(Coryneform) 미생물인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 황화물의 첨가량은 반응시 첨가되는 OPS 몰 농도의 0.1 내지 3배인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 OPSS는 애로피룸 페닉스(Aeropyrum pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics) 및 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 종으로부터 유래한 것인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제23항에 있어서, 상기 OPSS는 C 말단으로부터 3 내지 7개의 아미노산 잔기가 결실된 것인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 반응 시, 보조인자로서 0.001 내지 2 mM의 PLP (pyridoxal-5-phosphate) 또는 0.001 내지 100 mM의 DTT (dithiothreitol)를 추가로 첨가하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 시스테인 또는 이의 유도체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법.
삭제
SerB의 활성이 내재적 활성보다 약화되고, 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 또는 SerC의 활성이 강화된, OPS 생산용 재조합 미생물.
SerB의 활성이 내재적 활성보다 약화되고, PhnCDE 오페론, PhoA 및 AphA로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소의 활성이 내재적 활성보다 약화된, OPS 생산용 재조합 미생물.
수탁번호 KCCM 11103P으로 기탁된 OPS 생산용 재조합 미생물.
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