MX2015000577A - Control quiral. - Google Patents

Control quiral.

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MX2015000577A
MX2015000577A MX2015000577A MX2015000577A MX2015000577A MX 2015000577 A MX2015000577 A MX 2015000577A MX 2015000577 A MX2015000577 A MX 2015000577A MX 2015000577 A MX2015000577 A MX 2015000577A MX 2015000577 A MX2015000577 A MX 2015000577A
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David Butler
Naoki Iwamoto
Meena Meena
Nenad Svrzikapa
Gregory L Verdine
Ivan Zlatev
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Abstract

La presente invención se refiere a oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de oligonucleótido quiralmente controlados, y al método para elaborar y usar los mismos.

Description

REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud Provisional Estadounidense Serie No. 61/671,655, presentada el 13 de Julio de 2012, 61/671,656, presentada el 13 de Julio de 2012, 61/671,722, presentada el 14 de Julio de 2012, y 61/671,724, presentada el 14 de Julio de 2012, la solicitud de cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los oligonucleótidos son útiles en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, búsqueda y nanomateriales. El uso de ácidos nucleicos que se originan naturalmente (por ejemplo, ADN o ARN) para terapéuticos puede ser limitado, por ejemplo, debido a su inestabilidad contra las nucleasas extra- e intracelulares y/o su pobre penetración y distribución celular. Adicionalmente, estudios in vitro han mostrado que propiedades de oligonucleótidos antisentido tales como afinidad de unión, unión especifica de secuencia al ARN complementario (Cosstick and Eckstein, 1985; LaPlanche et al . , 1986; Latimer et al . , 1989; Hacia et al . , 1994; esmaeker et al . , 1995), y estabilidad a nucleasas pueden ser afectadas por las configuraciones estereoquímicas absolutas de los átomos de fósforo (Cook, et al . US005599797A). Por lo tanto, existe una necesidad para nuevas y mejoradas composiciones de oligonucleótido.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención abarca el reconocimiento que existe una necesidad de composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados y nuevos métodos para sintetizar los mismos. La invención abarca específicamente la identificación de la fuente de ciertos problemas con metodologías previas para preparar oligonucleótidos quirales, que incluyen problemas que prohíben la preparación de composiciones completamente quiralmente controladas, particularmente composiciones que comprenden una pluralidad de tipos de oligonucleótidos .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para usar oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados.
Todas las publicaciones y documentos de patente citados en esta solicitud están incorporados en la presente por referencia en su totalidad.
Definiciones Alif ático: El término "alifático" o "grupo alifático", como se usa en la presente, significa una cadena recta (es decir, no ramificada) o ramificada, cadena hidrocarburo sustituida o no sustituida que es completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo monocíclico o hidrocarburo bicielico o policiclico que es completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero la cual no es aromática (también referido en la presente como "carbociclo", "cicloalifático" o "cicloalquilo"), que tiene un punto único de unión al resto de la molécula. En algunas modalidades, los grupos alifáticos contienen 1-50 átomos de carbono alifáticos. A menos que se especifique de otro modo, los grupos alifáticos contienen 1-10 átomos de carbono alifáticos. En algunas modalidades, los grupos alifáticos contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. En algunas modalidades, los grupos alifáticos contienen 1-5 átomos de carbono alifáticos. En otras modalidades, los grupos alifáticos contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras modalidades, los grupos alifáticos contienen 1- 3 átomos de carbono alifáticos, y en aún otras modalidades, los grupos alifáticos contienen 1-2 átomos de carbono alifáticos. En algunas modalidades, "cicloalifático" (o "carbociclo" o "cicloalquilo") se refiere a un hidrocarburo C3-C10 monocíclico o biciclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero el cual no es aromático, que tiene un punto único de unión al resto de la molécula. En algunas modalidades, "cicloalifático" (o "carbociclo" o "cicloalquilo") se refiere a un hidrocarburo C3-C6 monociclico que es completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero el cual no es aromático, que tiene un punto único de unión al resto de la molécula. Grupos alifáticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo, alquenilo, aquinilo lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos e híbridos de los mismos tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
Alquileno: El término "alquileno" se refiere a un grupo alquilo bivalente. Una "cadena alquileno" es un grupo polimetileno, es decir, -(CH2)n_, en donde n es un número entero positivo, preferiblemente desde 1 hasta 6, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 2, o desde 2 hasta 3. Una cadena alquileno sustituida es un grupo polimetileno en el cual uno o más átomos de hidrógeno de metileno son reemplazados con un sustituyente. Sustituyentes adecuados incluyen aquellos descritos abajo para un grupo alifático sustituido.
Alquenileno: El término "alquenileno" se refiere a un grupo alquenilo bivalente. Una cadena alquenileno sustituida es un grupo polimetileno que contiene al menos un doble enlace en el cual uno o más átomos de hidrógeno son reemplazados con un sustituyente. Sustituyentes adecuados incluyen aquellos descritos abajo para un grupo alifático sustituido.
Animal : Como se usa en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas modalidades, "animal" se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas modalidades, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas modalidades, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, vaca, un primate, y/o un cerdo). En algunas modalidades, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, y/o gusanos. En algunas modalidades, un animal puede ser un animal transgénico, un animal diseñado por ingeniería genética, y/o un clon.
Aproximadamente: Como se usa en la presente, los términos "aproximadamente" o "alrededor" con referencia a un número en general son tomados para incluir números que caen dentro de un intervalo de 5%, 10%, 15%, o 20% en cualquier dirección (mayor que o menor que) del número a menos que se declare de otro modo o sea evidente de otro modo a partir del contexto (excepto donde tal número podría ser menor de 0% o exceder de 100% de un valor posible). En algunas modalidades, el uso del término "aproximadamente" con referencia a dosificaciones significa ± 5 mg/kg/día.
Arilo: El término "arilo" usado solo o como parte de una porción más grande como en "aralquilo," "aralcoxi", o "ariloxialquilo", se refiere a sistemas de anillo monocíclico y bicielico que tienen un total de cinco a catorce elementos en el anillo, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el sistema contiene tres a siete elementos en el anillo. El término "arilo" puede ser usado intercambiablemente con el término "anillo arilo". En ciertas modalidades de la presente invención, "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático el cual incluye, pero no se limita a, fenilo, bifenilo, naftilo, antracilo y similares, el cual puede portar uno o más sustituyentes. También incluido dentro del alcance del término "arilo", como se usa en la presente, es un grupo en el cual un anillo aromático está fusionado a uno o más anillos no aromáticos, tales como indanilo, ftalimidilo, naftimidilo, fenantridinilo, o tetrahidronaftilo, y similares.
Porción característica : Como se usa en la presente, la frase una "porción característica" de una proteína o polipéptido es una que contiene un estiramiento continuo de aminoácidos, o una colección de estiramientos continuos de aminoácidos, que en conjunto, son característicos de una proteína o polipéptido. Cada uno de tales estiramientos continuos en general contendrá al menos dos aminoácidos. Además, aquellos de habilidad ordinaria en la téenica apreciarán que típicamente al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos son requeridos para ser característicos de una proteína. En general, una porción característica es una que, además de la identidad de secuencia especificada anteriormente, porta al menos una característica funcional con la proteína intacta relevante.
Secuencia característica: Una "secuencia característica" es una secuencia que es encontrada en todos los miembros de una familia de polipéptidos de ácidos nucleicos, y por lo tanto puede ser usada por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica para definir miembros de la familia.
Elemento estructural característico; El término "elemento estructural característico" se refiere a un elemento estructural distintivo (por ejemplo, estructura nuclear, recolección de porciones colgantes, elemento de secuencia, etc.) que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos, moléculas pequeñas, o ácidos nucleicos, y por lo tanto puede ser usado por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica para definir elementos de la familia.
Comparable : El término "comparable" es usado en la presente para describir dos (o más) series de condiciones o circunstancias que son suficientemente similares a otra para permitir la comparación de resultados obtenidos o fenómenos observados. En algunas modalidades, series comparables de condiciones o circunstancias son caracterizadas por una pluralidad de características sustancialmente idénticas y uno o un número pequeño de características variadas. Aquellos de habilidad ordinaria en la téenica apreciarán que series de condiciones son comparables con otras cuando se caracterizan por un número y tipo suficiente de características sustancialmente idénticas para garantizar una conclusión razonable de que diferencias en resultados obtenidos o fenómenos observados bajo las diferentes series de condiciones o circunstancias son causadas por o indicativas de la variación en aquellas características que son variadas.
Régimen de dosificación : Como se usa en la presente, un "régimen de dosificación" o "régimen terapéutico" se refiere a una serie de dosis unitarias (típicamente más de una) que son administradas individualmente a un sujeto, típicamente separado por periodos de tiempo. En algunas modalidades, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado, el cual puede involucrar una o más dosis. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis cada una de las cuales son separadas de entre sí por un periodo de tiempo de la misma longitud; en algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y al menos dos diferentes periodos de tiempo que separan dosis individuales. En algunas modalidades, todas las dosis dentro de un régimen de dosificación son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas modalidades, diferentes dosis dentro de un régimen de dosificación son de diferentes cantidades. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguido por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis la misma como la primera cantidad de dosis.
Agentes Equivalentes : Aquellos de habilidad ordinaria en la téenica, que leen la presente descripción, apreciarán que el campo de agentes útiles en el contexto de la presente invención no está limitado a aquellos especificamente mencionados o ejemplificados en la presente. En particular, aquellos expertos en la técnica reconocerán que agentes activos típicamente tienen una estructura que consiste de un núcleo y porciones colgantes unidas, y además apreciarán que variaciones simples de tales porciones nucleares y/o colgantes pueden no alterar significantemente la actividad del agente. Por ejemplo, en algunas modalidades, la sustitución de una o más porciones colgantes con grupos de estructura tri-dimensional comparable y/o características de reactividad química puede generar un compuesto sustituido o porción equivalente a un compuesto o porción de referencia precursor. En algunas modalidades, la adición o remoción de una o más porciones colgantes puede generar un compuesto sustituido equivalente a un compuesto de referencia precursor. En algunas modalidades, la alteración de una estructura nuclear, por ejemplo, por adición o remoción de un número pequeño de enlaces (típicamente no más de 5, 4, 3, 2, o 1 enlaces, y a menudo solamente un enlace único), puede generar un compuesto sustituido equivalente a un compuesto de referencia precursor. En muchas modalidades, los compuestos equivalentes pueden ser preparados por métodos ilustrados en esquemas de reacción generales como, por ejemplo, descritos abajo, o por modificaciones de los mismos, usando materiales de partida fácilmente disponibles, reactivos y procedimientos de síntesis convencional o proporcionada. En estas reacciones, también es posible hacer uso de variantes, las cuales son ellas mismas conocidas, pero no mencionadas en la presente.
Dosificación Equivalente : El término "dosificación equivalente" se usa en la presente para comparar dosificaciones de diferentes agentes farmacéuticamente activos que efectúan el mismo resultado biológico. Dosificaciones de dos diferentes agentes son consideradas por ser "equivalentes" de entre sí de conformidad con la presente invención si logran un nivel comparable o extensión del resultado biológico. En algunas modalidades, dosificaciones equivalentes de diferentes agentes farmacéuticos para uso de conformidad con la presente invención son determinadas usando ensayos in vitro y/o in vivo como se describe en la presente. En algunas modalidades, uno o más agentes de activación lisosomal para uso de conformidad con la presente invención se utilizan a una dosis equivalente a una dosis de un agente de activación lisosomal de referencia; en algunas de tales modalidades, el agente de activación lisosomal de referencia para tal propósito se selecciona a partir del grupo que consiste de activadores alostéricos de molécula pequeña (por ejemplo, pirazolpirimidinas) , iminoazúcares (por ejemplo, isofagomina) , antioxidantes (por ejemplo, n-acetil-cisteina), y reguladores del tráfico celular (por ejemplo, polipéptido Rabia) .
Heteroalif ático: El término "heteroalifático" se refiere a un grupo alifático en donde una o más unidades seleccionadas a partir de C, CH, CH2, o CH3 son reemplazadas independientemente por un heteroátomo. En algunas modalidades, un grupo heteroalifático es heteroalquilo. En algunas modalidades, un grupo heteroalifático es heteroalquenilo.
Heteroarilo: Los términos "heteroarilo" y "heteroar-", usados solos o como parte de una porción más grande, por ejemplo, "heteroaralquilo", o "heteroaralcoxi", se refieren a grupos que tienen 5 hasta 10 átomos en el anillo, preferiblemente 5, 6, o 9 átomos en el anillo; que tiene 6, 10, o 14 electrones p portados en un arreglo cíclico; y que tienen, además de átomos de carbono, desde uno hasta cinco heteroátomos. El término "heteroátomo" se refiere a nitrógeno, oxígeno, o azufre, e incluye cualquier forma oxidada de nitrógeno o azufre, y cualquier forma cuaternizada de un nitrógeno básico. Grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, tienilo, furanilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolizinilo, purinilo, naftiridinilo, y pteridinilo. Los términos "heteroarilo" y "heteroar-", como se usan en la presente, también incluyen grupos en los cuales un anillo heteroaromático es fusionado a uno o más anillos arilo, cicloalifáticos o heterociclilos, donde el radical o punto de unión está en el anillo heteroaromático. Ejemplos no limitantes incluyen indolilo, isoindolilo, benzotienilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, indazolilo, bencimidazolilo, benztiazolilo, quinolilo, isoquinolilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 4Jí-quinolizinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, y pirido[2,3-b]-1,4-oxazin-3 (4H)- ona. Un grupo heteroarilo puede ser mono- o bicíclico. El término "heteroarilo" puede ser usado intercambiablemente con los términos "anillo heteroarilo", "grupo heteroarilo" o "heteroaromático", cualquiera de tales términos incluye anillos que son opcionalmente sustituidos. El término "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido por un heteroarilo, en donde las porciones alquilo y heteroarilo son independientemente opcionalmente sustituidas.
Heteroátomo : El término "heteroátomo" significa uno o más de oxigeno, azufre, nitrógeno, fósforo, o silicio (que incluyen, cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre, fósforo, o silicio; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico o; un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo) , NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en N-pirrolidinilo sustituido)).
Heterociclo: Como se usa en la presente, los términos "heterociclo", "heterociclilo", "radical heterocíclico" , y "anillo heterocíclico" son usados intercambiablemente y se refieren a una porción heterocíclica estable monocíclica de 3 a 7 elementos o bicíclica de 7-10 elementos que es ya sea saturada o parcialmente insaturada, y que tiene, además de átomos de carbono, uno o más, preferiblemente uno a cuatro, heteroátomos, como se define anteriormente. Cuando se usa con referencia a un átomo en el anillo de un heterociclo, el término "nitrógeno" incluye un nitrógeno sustituido. Como un ejemplo, en un anillo saturado o parcialmente insaturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados a partir de oxigeno, azufre o nitrógeno, el nitrógeno puede ser N (como en 3,4-dihidro-2íí-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo), o +NR (como en 7-pirrolidinilo sustituido).
Un anillo heterocielico puede ser unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que resulta en una estructura estable y cualquiera de los átomos en el anillo puede ser opcionalmente sustituido. Ejemplos de tales radicales heterociclicos saturados o parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenil pirrolidinilo, piperidinilo, pirrolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, diazepinilo, oxazepinilo, tiazepinilo, orfolinilo, y quinuclidinilo. Los términos "heterociclo", "heterociclilo", "anillo heterociclilo", "grupo heterociclico", "porción heterociclica", y "radical heterociclico", son usados intercambiablemente en la presente, y también incluyen grupos en los cuales un anillo heterociclilo es fusionado a uno o más anillos arilo, heteroarilo o cicloalifáticos, tales como indolinilo, 3fí- indolilo, cromanilo, fenantridinilo, o tetrahidroquinolinilo, donde el radical o punto de unión está en el anillo heterociclilo. Un grupo heterociclilo puede ser mono- o biciclico. El término "heterociclilalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido por un heterociclilo, en donde las porciones alquilo y heterocielilo son independientemente opcionalmente sustituidas.
Intraperitoneal : Las frases "administración intraperitoneal" e "intraperitonealmente administrado" como se usan en la presente tienen su significado entendido en la téenica con referencia a la administración de un compuesto o composición en el peritoneo de un sujeto.
In vitro: Como se usa en la presente, el término "in vitro" se refiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc. , en lugar de dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta, y/o microbio).
In vivo: Como se usa en la presente, el término " in vivo" se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta, y/o microbio).
Alquilo inferior : El término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo Ci-.4 recto o ramificado. Grupos alquilo inferiores ejemplares son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, y tere-butilo.
Haloalquilo inferior : El término "haloalquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo Ci_4 recto o ramificado que es sustituido con uno o más átomos de halógeno.
Opcionalmente sustituido : Como se describe en la presente, los compuestos de la invención pueden contener porciones "opcionalmente sustituidas". En general, el término "sustituido", sea precedido por el término "opcionalmente" o no, significa que uno o más hidrógenos de la porción designada son reemplazados con un sustituyente adecuado. A menos que se indica de otro modo, un grupo "opcionalmente sustituido" puede tener un sustituyente adecuado en cada posición sustituible del grupo, y cuando más de una posición en cualquier estructura dada puede ser sustituida con más de un sustituyente seleccionado a partir de un grupo especificado, el sustituyente puede ser ya sea el mismo o diferente en cada posición. Combinaciones de sustituyentes contemplados por esta invención son preferiblemente aquellos que resultan en la formación de compuestos químicamente factibles o estables. El término "estable", como se usa en la presente, se refiere a compuestos que no son sustancialmente alterados cuando se someten a condiciones para permitir su producción, detección, y, en ciertas modalidades, su recuperación, purificación, y uso para uno o más de los propósitos descritos en la presente.
Sustituyentes monovalentes adecuados en un átomo de carbono sustituible de un grupo "opcionalmente substituido" son independientemente halógeno; -(CH)0-4R°; -(CH2)0-4OR0; 0(CH2)O-4R°, -O-(CH2)0-4C(O)0R°; -(CH2)0-4CH(0R°)2; -(CH2)0-4SR0; - (CH2)o-4Ph, el cual puede ser sustituido con R°; —(CH2)0_ 40(CH2)o-iPh el cual puede ser sustituido con R°; -CH=CHPh, el cual puede ser sustituido con R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-i-piridilo el cual puede ser sustituido con R°; -NO2; -CN; -N3; - - 4N (R° )C (0)NRO2; -N(R°)C(S)NR°2; - (CH2) 0-4N (R° ) C (0) OR° ; N(R°)N(R°)C(O)R°; -N (R° ) N (R° ) C (O) NR°2; -N (R° ) N (R° ) C (0) OR° ; - (CH2) 0-4C (0) R° ; -C(S)R°; - (CH2) o-4C (0) 0R° ; - (CH2) 0-4C (0) SR° ; - (CH2) 0-4C (O) OSiR°3,' - (CH2) 0-4OC (0) R°; -0C (O) (CH2) 0-4SR-, SC(S)SR°; - (CH2)0-4SC (0)R°; - (CH2)0-4C (O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; - SC (S)SR°, - (CH2)0-4OC (0)NR°2; -C (0)N (0R°)R°; -C(0)C(0)R°; - C (0)CH2C (0)R°; -C (NOR°}R°; - (CH2)0-4SSR°; - (CH2)0-4S(O)2R°; - CCH2)0-S(O)20R°; -(CH2)O-4OS(0)2R°; -S(0)2NRO2; -(CH2)0-4S (0)R°; - N (R°)S(0)2NR°2; -N (R°)S (0)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(0)2R°; -P (0)R°2; -OP(0)R°2; -0P(0)(0R°)2; -SiR°3; -(alquileno C1-4 recto o ramificado)0-N (R°)2; o -(alquileno Ci_4 recto o ramificado)C (0)0-N (R°)2, en donde cada R° puede ser sustituido como se define abajo y es independientemente hidrógeno, alifático C1-6, -CH2Ph, -0 (CH2)o-iPh, -CH2- (heteroarilo de 5-6 elementos en el anillo), o un anillo arilo de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre, o, no obstante la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, tomadas junto con su(s) átomo (s) de intervención, forman un anillo arilo de 3-12 elementos saturado, parcialmente insaturado, o mono o bicielico que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre, el cual puede ser sustituido como se define abajo.
Sustituyentes monovalentes adecuados en R° (o el anillo formado tomando dos apariciones independientes de R° junto con sus átomos de intervención), son independientemente halógeno, -(CH2)0-2R·, -(haloR·), -(CH2)0-2OH, -(CH2)o-2ORef - (CH2)O-2CH(OR*)2; -0(haloR*), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R·, -(CH2)0_ 2C(O)0H, -(CH2)0-2C(0)OR*, -(CH2)0-2SR*, -(CH2)O-2SH, -(CH2)O-2NH2, - (CH2)O-2NHR·, -(CH2)o-2NRe2í -NO2, -SiR*3, -0SiR*3, -C(0)SR', - (alquileno C1-4 recto o ramificado)C(0)OR*, o -SSR* en donde cada R* es no sustituido o donde precedido por "halo" es sustituido solamente con uno o más halógenos, y es independientemente seleccionado a partir de alifático C1-4, - CH2Ph, -0(CH2)o-iPh o un anillo arilo de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. Sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de R° incluyen =0 y =S .
Sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de un grupo "opcionalmente sustituido" incluyen los siguientes: =0, =S, =NNR*2, =NNHC(0)R*, _ S(C(R*2))2-3S-, en donde cada aparición independiente de R* es seleccionada a partir de hidrógeno, alifático Ci_6 el cual puede ser sustituido como se define abajo, o un anillo arilo no sustituido de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
Sustituyentes divalentes adecuados que están unidos a carbonos sustituibles vecinales de un grupo "opcionalmente sustituido" incluyen: -0(CR*2)2-3O-, en donde cada aparición independiente de R* es seleccionada a partir de hidrógeno, alifático C1-6 el cual puede ser sustituido como se define abajo, o un anillo arilo no sustituido de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
Sustituyentes adecuados en el grupo alifático de R* incluyen halógeno, -R*, -(haloR*), -OH, -0R#, -0(haloRe), -CN, -C (O)OH, -C(O)0Re, -NH2, -NHR*, -NR#2, o -NO2, en donde cada R* es no sustituido o donde precedido por "halo" es sustituido solamente con uno o más halógenos, y es independientemente alifático C1-4, -CH2Ph, -0(CH2)0-iPh, o un anillo arilo de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
Sustituyentes adecuados en un nitrógeno sustituible de un grupo "opcionalmente sustituido" incluyen -R†, -NR†2, - C(O)R†, -C(0)0R†, -C(0)C(0)R†, -C(0)CH2C (0)R†, -S(O)2R†, - S(0)2NR†2, -C(S)NR†2, -C(NH)NR†2, O -N(R†)S(0)2R†; en donde cada R† es independientemente hidrógeno, alifático Ci_6 el cual puede ser sustituido como se define abajo, -OPh no sustituido, o un anillo arilo no sustituido de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre, o, no obstante la definición anterior, dos apariciones independientes de R†, tomados junto con su átomo(s) de intervención forman un anillo no sustituido de 3-12 elementos saturados, parcialmente insaturados, o mono- o bicíclico que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
Sustituyentes adecuados en el grupo alifático de R† son independientemente halógeno, -R*, -(haloR*), -OH, -OR*, -0 (haloR*), -CN, -C(O)OH, -C(O)0R*, -NH2, -NHR*, -NR*2, o -NO2, en donde cada R* es no sustituido o donde precedido por "halo" es sustituido solamente con uno o más halógenos, y es independientemente alifático Ci-4, -CH2Ph, -O(CH2)o-iPh, o un anillo arilo de 5-6 elementos saturado, o parcialmente insaturado que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
Oral : Las frases "administración oral" y "oralmente administrado" como se usan en la presente tienen su significado entendido en la téenica con referencia a la administración por la boca de un compuesto o composición.
Parenteral : Las frases "administración parenteral" y "parenteralmente administrado" como se usan en la presente tienen su significado entendido en la técnica con referencia a modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, usualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraenoide, intraespinal, e inyección intrasternal e infusión.
Parcialmente insaturado : Como se usa en la presente, el término "parcialmente insaturado" se refiere a una porción de anillo que incluye al menos un enlace doble o triple. El término "parcialmente insaturado" está propuesto para abarcar anillos que tienen sitios múltiples de insaturación, pero no están propuestos para incluir porciones arilo o heteroarilo, como se define en la presente.
Composición farmacéutica : Como se usa en la presente, el término "composición farmacéutica" se refiere a un agente activo, formulado junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para administración en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significante para lograr un efecto terapéutico determinado cuando se administra a una población relevante. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden ser especialmente formuladas para administración en forma sólida o líquida, que incluyen aquellas adaptadas para lo siguiente: administración oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), tabletas, por ejemplo, aquellas dirigidas para absorción bucal, sublingual, y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o formulación de liberación sostenida; aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento, o un parche de liberación controlada o atomizador aplicado a la piel, pulmones, o cavidad oral; intravaginalmente o intrarrectalmente, por ejemplo, como un pesario, crema, o espuma; sublingualmente; ocularmente; transdermalmente; o nasalmente, pulmonarmente, y a otras superficies de la mucosa.
Farmacéuticamente aceptable: Como se usa en la presente, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación las cuales son, dentro del alcance del juicio médico sano, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otros problemas o complicaciones, conmensurados con una relación de riesgo/beneficio razonable.
Portador farmacéuticamente aceptable : Como se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, tal como un rellenador liquido o sólido, diluyente, excipiente, o material encapsulante de solvente, involucrado en llevar o transportar el compuesto sujeto a partir de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no nocivo al paciente. Algunos ejemplos de materiales los cuales pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de soya; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicoles; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar ; agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógeno; salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones amortiguadoras de pH; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Sal farmacéuticamente aceptable: El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, se refiere a sales de tales compuestos que son apropiadas para uso en contextos farmacéuticos, es decir, sales las cuales son, dentro del campo del juicio médico sano, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, y son conmensurados con una relación beneficio/riesgo razonable. Sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la téenica. Por ejemplo, S. M. Berge, et al., describe sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). En algunas modalidades, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácido no tóxicas, las cuales son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclóríco o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. En algunas modalidades, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencensulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, camforato, camforsulfonato, citrato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodecilsulfato, etansulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etansulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluensulfonato, undecanoato, valerato, y similares. Sales de metal alcalinotérreo o álcali incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. En algunas modalidades, sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando es apropiado, cationes de amonio no tóxico, amonio cuaternario, y de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, sulfonato y arilsulfonato.
Pro fármaco : En general, un "profármaco", como tal término se usa en la presente y como se entiende en la téenica, es una entidad que, cuando se administra a un organismo, es metabolizado en el cuerpo para suministrar un agente activo (por ejemplo, terapéutico o diagnóstico) de interés. Típicamente, tal metabolismo involucra remoción de al menos una "porción de profármaco" de manera que se forma el agente activo. Varias formas de "profármacos" se conocen en la técnica. Para ejemplos de tales porciones de profármacos, véase: a) Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) y Methods in Enzymology, 42:309-396, editado por K. Widder, et al . (Academic Press, 1985); b) Prodrugs and Targeted Delivery , editado por J. Rautio (Wilcy, 2011); c) Prodrugs and Targeted Delivery, editado por J. Rautio (Wiley, 2011); d) A Textbook of Drug Design and Development, editado por Krogsgaard-Larsen; e) Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Prodrugs", por H. Bundgaard, p.113-191 (1991); f) Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:1-38 (1992); g) Bundgaard, et al . , 10urnal of Pharmaceutical Sciences, 77:285 (1988); y h) Kakeya, et al . , Chem . Pharm . Bull . , 32:692 (1984).
Como con otros compuestos descritos en la presente, los profármacos pueden ser proporcionados en cualquiera de una variedad de formas, por ejemplo, formas de cristal, formas de sal, etcétera. En algunas modalidades, los profármacos son proporcionados como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Grupo protector : El término "grupo protector", como se usa en la presente, es bien conocido en la téenica e incluye aquellos descritos en detalle en Protecting Grupos in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3ra edición, John Wiley & Sons, 1999, la totalidad del cual se incorpora en la presente por referencia. También se incluyen aquellos grupos protectores especialmente adaptados para química de nucleósido y nucleótido descritos en Current Protocole in Nucleic Acid Chemistry, editado por Serge L. Beaucage et al . 06/2012, la totalidad del Capítulo 2 se incorpora en la presente por referencia. Grupos protectores amino adecuados incluyen metil carbamato, etil carbamato, 9-fluorenilmetilcarbamato (Fmoc), 9-(2-sulfo)fluorenilmetil carbamato, 9-(2,7-dibromo)fluoroenilmetil carbamato, 2,7-di-t-butil- [9-(10,10-dioxo-10,10,10,10-tetrahidrotioxantil )]metil carbamato (DBD-Tmoc), 4-metoxifenacil carbamato (Fenoc), 2,2,2-tricloroetil carbamato (Troc), 2-trimetilsililetil carbamato (Teoc), 2-feniletil carbamato (hZ), 1-(1-adamantil)-1-metiletil carbamato (Adpoc), 1,l-dimetil-2-haloetil carbamato, 1,l-dimetil-2,2-dibromoetil carbamato (DB-t-BOC), 1,l-dimetil-2,2,2- tricloroetil carbamato (TCBOC), 1-metil-1-(4-bifenilil)etil carbamato (Bpoc), 1-(3,5-di-t-butilfenil)-1-metiletil carbamato (t-Bumeoc), 2- (2' - y 4'-piridil)etil carbamato (Pyoc), 2-(i\J,-diciclohexilcarboxamido)etil carbamato, t- butil carbamato (BOC), 1-adamantil carbamato (Adoc), vinil carbamato (Voc), alil carbamato (Alloc), 1-isopropilalil carbamato (Ipaoc), cinamil carbamato (Coc), 4-nitrocinamil carbamato (Noc), 8-quinolil carbamato, A7-hidroxipiperidinil carbamato, alquilditio carbamato, bencil carbamato (Cbz), p- metoxibencil carbamato (Moz), p-nitobencil carbamato, p- bromobencil carbamato, p-clorobencil carbamato, 2,4-diclorobencil carbamato, 4-metilsulfinilbencil carbamato (Msz), 9-antrilmetil carbamato, difenilmetil carbamato, 2- etiltioetil carbamato, 2-metilsulfoniletil carbamato, 2-(p-toluensulfonil)etil carbamato, [2-(1,3-ditianil)]metil carbamato (Dmoc), 4-metiltiofenil carbamato (Mtpc), 2,4-dimetiltiofenil carbamato (Bmpc), 2-fosfonioetil carbamato (Peoc), 2-trifenilfosfonioisopropil carbamato (Ppoc), 1,1-dimetil-2-cianoetil carbamato, m-cloro-p-aciloxibencil carbamato, p- (dihidroxiboril)bencil carbamato, 5-bencisoxazolilmetil carbamato, 2-(trifluorometil)-6-cromonilmetil carbamato (Tcroc), m-nitrofenil carbamato, 3,5-dimetoxibencil carbamato, o-nitrobencil carbamato, 3,4-dimetoxi-6-nitrobencil carbamato, fenil(o-nitrofenil)metil carbamato, derivado de fenotiazinil-(10)-carbonilo, derivado de N'-p-toluensulfonilaminocarbonilo, derivado de N'- fenilaminotiocarbonilo, t-amil carbamato, S-bencil tiocarbamato, p-cianobencil carbamato, ciclobutil carbamato, ciclohexil carbamato, ciclopentil carbamato, ciclopropilmetil carbamato, p-deciloxibencil carbamato, 2,2- dimetoxicarbonilvinil carbamato, o- (N,N- dimetilcarboxamido)bencil carbamato, 1,l-dimetil-3- (N,N- dimetilcarboxamido)propil carbamato, 1,1-dimetilpropinil carbamato, di(2-piridil)metil carbamato, 2-furanilmetil carbamato, 2-yodoetil carbamato, isoborinl carbamato, isobutil carbamato, isonicotinil carbamato, p-(p'- metoxifenilazo)bencil carbamato, l-metilciclobutil carbamato l-metilciclohexil carbamato, 1-metil-1-ciclopropilmetil carbamato, 1-metil-l- (3,5-dimetoxifenil)etil carbamato, 1-metil-1- (p-fenilazofenil)etil carbamato, 1-metil-l-feniletil carbamato, 1-metil-l-(4-piridil)etil carbamato, fenil carbamato, p-(fenilazo)bencil carbamato, 2,4,6-tri-t-butilfenil carbamato, 4- (trimetilamonio)bencil carbamato, 2,4,6-trimetilbencil carbamato, formamida, acetamida, cloroacetamida, tricloroacetamida, trifluoroacetamida, fenilacetamida, 3-fenilpropanamida, picolinamida, 3-piridilcarboxamida, derivado de N-benzoilfenilalanilo, benzamida, p-fenilbenzamida, o-nitofenilacetamida, o nitrofenoxiacetamida, acetoacetamida, {N'~ ditiobenciloxicarbonilamino) acetamida, 3-(p- hidroxifenil)propanamida, 3-(o-nitrofenil)propanamida, 2-metil-2- (o-nitrofenoxi)propanamida, 2-metil-2- (o- fenilazofenoxi)propanamida, 4-clorobutanamida, 3-metil-3- nitrobutanamida, o-nitrocinamida, derivado de N- acetilmetionina, o-nitrobenzamida, o- (benzoiloximetil)benzamida, 4,5-difenil-3-oxazolin-2-ona, N- ftalimida, N-ditiasuccinimida (Dts), N-2,3-difenilmaleimida, N-2,5-dimetilpirrol, aducto de N-l,1,4,4- tetrametildisililazaciclopentano (STABASE), 1,3-dimetil- 1,3,5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituida, 1,3-dibencil- 1,3,5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituida, 3,5-dinitro-4- piridona 1-sustituida, N-metilamina, N-alilamina, N- [2- (trimetilsilil)etoxi]etilamina (SEM) N-3-acetoxipropilamina, N- (l-isopropil-4-nitro-2-oxo-3-pirrolin- 3-il)amina, sales de amonio cuaternarias, N-bencilamina, N-di(4-metoxifenil)metilamina, AJ-5-dibenzosuberilamina, N-trifenilmetilamina (Tr), N- [(4-metoxifenil)difenilmetil]amina (MMTr), N-9-fenilfluorenilamina (PhF), N-2,7-dicloro-9-fluorenilmetilenamina, N-ferrocenilmetilamino (Fcm), N'-óxido de N-2-picolilamino, N-l,1-dimetiltiometilenamina, N-bencilidenamina, W-p-metoxibencilidenamina, N-difenilmetilenamina, N- [ (2-piridil)mesitil]metilenamina, N- (N' ,N'-dimetilaminometilen)amina, l\7,I\7'-isopropilidendiamina, W-p-nitrobencilidenamina, N-salicilidenamina, N-5-clorosalicilidenamina, N- (5-cloro-2-hidroxifenil )fenilmetilenamina, W-ciclohexilidenamina, N- (5,5-dimetil-3-oxo-1-ciclohexenil)amina, derivado de N-borano, derivado de ácido N-difenilborínico, N- [fenil(pentacarbonilcromio- o tungsteno)carbonil]amina, quelato de W-cobre, quelato de N-zinc, N-nitroamina, N- nitrosoamina, AJ-óxido de amina, difenilfosfinamida (Dpp), dimetiltiofosfinamida (Mpt), difeniltiofosfinamida (Ppt), dialquil fosforamidatos, dibencil fosforamidato, difenil fosforamidato, bencensulfenamida, o-nitrobencensulfenamida (Nps), 2,-dinitrobencensulf enamida, pentaclorobencensulfenamida, 2-nitro-4- metoxibencensulfenamida, trifenilmetilsulfenamida, 3- nitropiridinsulfenamida (Npys) p-toluensulfonamida (Ts) bencensulfonamida, 2, 3, b, -trimetil-4-metoxibencensulfonamida (Mtr), 2, ,6-trimetoxibencensulfonamida (tb), 2,6-dimetil-4-metoxibencensulfonamida (Pme), 2,3,5,6-tetrametil-4-metoxibencensulfonamida (Mte), 4-metoxibencensulfonamida (Mbs), 2,4,6-trimetilbencensulfonamida (Mts), 2,6-dimetoxi-4-metilbencensulfonamida (iMds), 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonamida (Pmc), metansulfonamida (Ms), b-trimetilsililetansulfonamida (SES), 9-antracensulfonamida, 4- (4',8'-dimetoxinaftilmetil)bencensulfonamida (DNMBS), bencilsulfonamida, trifluorometilsulfonamida, y fenacilsulfonamida . Ácidos carboxilicos adecuadamente protegidos adicionales incluyen, pero no se limitan a, ácidos carboxilicos silil-, alquil-, alquenil-, aril-, y arilalquil-protegidos. Ejemplos de grupos sililo adecuados incluyen trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, t- butildifenilsililo, triisopropilsililo, y similares. Ejemplos de grupos alquilo adecuados incluyen metilo, bencilo, p- metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, trifilo, t-butilo, tetrahidropiran-2-ilo. Ejemplos de grupos alquenilo adecuados incluyen alilo. Ejemplos de grupos arilo adecuados incluyen fenilo, bifenilo, o naftilo opcionalmente sustituidos. Ejemplos de grupos arilalquilo adecuados incluyen bencilo (por ejemplo, p-metoxibencilo (MPM), 3,4-dimetoxibencilo, 0- nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6- diclorobencilo, p-cianobencil) , y 2- y 4-picolilo opcionalmente sustituidos.
Protectores de grupo hidroxilo adecuados incluyen metilo, metoxilmetilo (MOM), metiltiometilo (MTM), t-butiltiometilo, (fenildimetilsilil)metoximetilo (SMOM), benciloximetilo (BOM), p-metoxibenciloximetilo (PMBM), (4-metoxifenoxi)metilo (p-AOM), guayacolmetilo (GUM), t-butoximetilo, 4-penteniloximetilo (POM), siloximetilo, 2-metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetilo, bis(2-cloroetoxi)etilo, 2-(trietilsilil) etoximetilo (SEMOR), tetrahidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 1-metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo (MTHP), 4-metoxi tetrahidrotiopiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo S,S-dióxido, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4- ilo (CTMP), 1,4-dioxan-2-ilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahidro-7,8,8- trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ilo, 1-etoxietilo, l-(2- cloroetoxi)etilo, 1-metil-1-metoxietilo, 1-metil-l- benciloxietilo, l-metil-l-benciloxi-2-fluoroetilo, 2,2,2- tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 2- (fenilselenil)etilo, t-butilo, alilo, p-clorofenilo, p-metoxifenilo, 2,4- dinitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6- diclorobencilo, p-cianobencilo, p-fenilbencilo, 2-picolilo, 4-picolilo, -óxido de 3-metil-2-picolilo, difenilmetilo, r,r'-dinitrobenzhidrilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, a-naftildifenilmetilo, p-metoxifenildifenilmetilo, di(p-metoxifenil)fenilmetilo, tri (p-metoxifenil)metilo, 4-( 4 ' -bromofenaciloxifenil)difenilmetilo, 4,4',4''-tris(4,5-dicloroftalimidofenil)metilo, 4,4', 4 ' ' -tris (levulinoiloxifenil)metilo, 4,4',4''-tris (benzoiloxifenil)metilo, 3-(imidazol-1-i1)bis(4',4''-dimetoxifenil )metilo, 1,1-bis(4-metoxifenil)-1'-pirenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo, 1,3-benzoditiolan-2-ilo, bencisotiazolilo S,S-dióxido, trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), triisopropilsililo (TIPS), dimetilisopropilsililo (IPDMS), dietilisopropilsililo (DEIPS), dimetiltexilsililo, t-butildimetilsililo (TBDMS), t-butildifenilsililo (TBDPS), tribencilsililo, tri-p-xililsililo, trifenilsililo, difenilmetilsililo (DPMS), t-butil etoxifenilsililo (TBMPS), formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p- clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4- (etilenditio)pentanoato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6- trimetilbenzoato (mesitoato), alquilmetil carbonato, 9- fluorenilmetil carbonato (Fmoc), alquiletil carbonato, alquil 2,2,2-tricloroetilcarbonato (Troc), 2- (trimetilsilil)etil carbonato (TMSEC), 2-(fenilsulfonil)etil carbonato (Psec), 2- (trifenilfosfonio)etil carbonato (Peoc), alquilisobutil carbonato, alquilvinil carbonato, alquilalil carbonato, alquil p-nitrofenilcarbonato, alquilbencil carbonato, alquil p-metoxibencilcarbonato, alquil 3,-dimetoxibencilcarbonato, alquil o-nitrobencilcarbonato, alquil p-nitrobencilcarbonato, alquil S-benciltiocarbonato, 4-etoxi-1-naftilcarbonato, metil ditiocarbonato, 2-yodobenzoato, 4-azidobutirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2-formilbencensulfonato, 2-(metiltiometoxi)etilo, 4- (metiltiometoxi)butirato, 2-(metiltiometoximetil)benzoato, 2 ,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1- dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (£)-2-metil-2-butenoato, o- (metoxicarbonil)benzoato, a-naftoato, nitrato, alquil N, N,N' ,N'-tetrametilfosforodiamidato, alquil N- fenilcarbamato, borato, dimetilfosfinotioilo, alquil 2,4- dinitrofenilsulfenato, sulfato, metansulfonato (mesilato), bencilsulfonato, y tosilato (Ts). Para proteger 1,2- o 1,3- diol, los grupos protectores incluyen metilen acetal, etiliden acetal, 1-t-butiletiliden cetal, 1-feniletiliden cetal, (4-metoxifenil)etiliden acetal, 2,2,2-tricloroetiliden acetal, acetonido, ciclopentiliden cetal, ciclohexiliden cetal, cicloheptiliden cetal, benciliden acetal, p- metoxibenciliden acetal, 2,4-dimetoxibenciliden cetal, 3,4- dimetoxibenciliden acetal, 2-nitrobenciliden acetal, metoximetilen acetal, etoximetilen acetal, dimetoximetilen orto éster, 1-metoxietiliden orto éster, 1-etoxietilidin orto éster, 1,2-dimetoxietiliden orto éster, a-metoxibenciliden orto éster, derivado de 1-(WVW-dimetilamino)etiliden, derivado de a- (,W'-dimetilamino)bencilideno, 2-oxaciclopentiliden orto éster, grupo di-t-butilsilileno (DTBS), derivado de 1,3-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxanilideno) (TIPDS), derivado de tetra-t-butoxidisiloxan-1 ,3-diilideno (TBDS), carbonatos cíclicos, boronatos cíclicos, etil boronato, y fenilboronato.
En algunas modalidades, un grupo protector hidroxilo es acetilo, t-butilo, t-butoximetilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, 1-etoxietilo, 1 -(2-cloroetoxi)etilo, 2- trimetilsililetilo, p-clorofenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, benzoilo, p-fenilbenzoilo, 2,6-diclorobencilo, difenilmetilo, p-nitrobencilo, trifenilmetil(tritilo), 4,4’- dimetoxitritilo, trimetilsililo, trietilsililo, t- butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, trifenilsililo, triisopropilsililo, benzoilformiato , cloroacetilo, tricloroacetilo, trifiuoroacetilo, pivaloilo, 9- fluorenilmetil carbonato, mesilato, tosilato, triflato, tritilo, monometoxitritilo (MMTr), 4,4'-dimetoxitritilo, (DMTr) y 4,4',4''-trimetoxitritilo (TMTr), 2-cianoetilo (CE o Cne), 2-(trimetilsilil)etilo (TSE), 2-(2-nitrofenil)etilo, 2- (4-cianofenil)etil 2-(4-nitrofenil)etilo (NPE), 2-(4- nitrofenilsulfonil)etilo 3,5-diclorofenilo 2,4- dimetilfenilo 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 2,4,6-trimetilfenilo, 2- (2-nitrofenil)etilo, butiltiocarbonilo, 4,4',4''-tris (benzoiloxi)tritilo, dif enilcarbamoilo, levulinilo, 2-(dibromometil)benzoilo (Dbmb), 2- (isopropiltiometoximetil)benzoilo (Ptmt), 9-fenilxanten-9-ilo (pixil) o 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX). En algunas modalidades, cada uno de los grupos protectores hidroxilo es, seleccionado independientemente a partir de acetilo, bencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo y 4,4'-dimetoxitritilo . En algunas modalidades, el grupo protector hidroxilo es seleccionado a partir del grupo que consiste de tritilo, monometoxitritilo y grupo 4,4'-dimetoxitritilo.
En algunas modalidades, un grupo protector de fósforo es un grupo unido al enlace de fósforo internucleótido a través de la síntesis de oligonucleótido. En algunas modalidades, el grupo protector de fósforo está unido al átomo de azufre del enlace de fosforotioato internucleótido. En algunas modalidades, el grupo protector de fósforo está unido al átomo de oxígeno del enlace de fosforotioato internucleótido. En algunas modalidades, el grupo protector de fósforo está unido al átomo de oxígeno del enlace de fosfato internucleótido. En algunas modalidades el grupo protector de fósforo es 2-cianoetilo (CE o Cne), 2- trimetilsililetilo, 2-nitroetilo, 2-sulfoniletilo, metilo, bencilo, o-nitrobencilo, 2-(p-nitrofenil)etilo (NPE o Npe), 2-feniletilo, 3- {N-terc-butilcarboxamido)-1-propilo, 4- oxopentilo, 4-metiltio-1-butilo, 2-ciano-l,1-dimetiletilo, 4-N-metilaminobutilo, 3-(2-piridil)-1-propilo, 2-[A7-metil-N-(2-piridil)]aminoetilo, 2-(-formil, N-metil)aminoetilo, 4-[-metil-N- (2,2,2-trifluoroacetil)amino]butilo.
Proteína : Como se usa en la presente, el término "proteína" se refiere a un polipéptido (es decir, una cadena de al menos dos aminoácidos ligados entre sí por enlaces peptídicos) . En algunas modalidades, las proteínas incluyen solamente aminoácidos que se originan naturalmente. En algunas modalidades, las proteínas incluyen uno o más aminoácidos que no se originan naturalmente (por ejemplo, porciones que forman uno o más enlaces peptídicos con aminoácidos adyacentes). En algunas modalidades, uno o más residuos en una cadena de proteína contienen una porción no aminoácido (por ejemplo, un glicano, etc.). En algunas modalidades, una proteína incluye más de una cadena de polipéptido, por ejemplo, ligada por uno o más enlaces disulfuro o asociadas por otros medios. En algunas modalidades, las proteínas contienen L-aminoácidos, D- aminoácidos, o ambos; en algunas modalidades, las proteínas contienen una o más modificaciones o análogos de aminoácido conocidos en la téenica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, a idación, metilación, etc. El término "péptido" es en general usado para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos, o menos de 10 aminoácidos. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, porciones de las mismas biológicamente activas, y/o porciones de las mismas características.
Muestra : Como se usa en la presente, el término "muestra" se refiere a una muestra biológica obtenida o derivada a partir de una fuente de interés, como se describe en la presente. En algunas modalidades, una fuente de interés comprende un organismo, tal como un animal o humano. En algunas modalidades, una muestra biológica comprende tejido o fluido biológico. En algunas modalidades, una muestra biológica es o comprende médula ósea; sangre; glóbulos; ascitos; muestras de biopsia de aguja fina o tejido; fluidos corporales que contienen células; ácidos nucleicos de flotación libre; esputo; saliva; orina; fluido cerebroespinal, fluido peritoneal; fluido pleural; heces; linfa; fluidos ginecológicos; hisopos de piel; hisopos vaginales; hisopos orales; hisopos nasales; lavados o enjuagues tales como lavados ductales o lavados broncoalveolares; aspirados; raspados; especímenes de médula ósea; especímenes de biopsia de tejidos; especímenes quirúrgicos; heces, otros fluidos corporales, secreciones, y/o excreciones; y/o células a partir de los mismos, etc. En algunas modalidades, una muestra biológica es o comprende células obtenidas a partir de un individuo. En algunas modalidades, una muestra es una "muestra primaria" obtenida directamente a partir de una fuente de interés por cualquiera de otros medios apropiados. Por ejemplo, en algunas modalidades, una muestra biológica primaria se obtiene por métodos seleccionados a partir del grupo que consiste de biopsia ( por ejemplo, aspiración de aguja fina o biopsia de tejidos), cirugía, recolección de fluido corporal (por ejemplo, sangre, linfa, heces, etc. ) , etc. En algunas modalidades, como será claro a partir del contexto, el término "muestra" se refiere a una preparación que se obtiene por procesamiento (por ejemplo, removiendo uno o más componentes de y/o por adición de uno o más agentes a) una muestra primaria. Por ejemplo, filtración usando una membrana semi-permeable. Tal "muestra procesada" puede comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas extraídas a partir de una muestra u obtenidos sometiendo una muestra primaria a téenicas tales como amplificación o transcripción inversa de ARNm, aislamiento y/o purificación de ciertos componentes, etc.
Formas estereoquímicamente isoméricas : La frase "formas estereoquímicamente isoméricas", como se usa en la presente, se refiere a diferentes compuestos elaborados de los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces pero que tienen diferentes estructuras tri-dimensionales las cuales no son intercambiables. En algunas modalidades de la invención, las composiciones químicas proporcionadas pueden ser o incluyen preparaciones puras de formas estereoquimicamente isoméricas individuales de un compuesto; en algunas modalidades, composiciones químicas proporcionadas pueden ser o incluyen mezclas de dos o más formas estereoquimicamente isoméricas del compuesto. En ciertas modalidades, tales mezclas contienen cantidades iguales de diferentes formas estereoquimicamente isoméricas; en ciertas modalidades, tales mezclas contienen diferentes cantidades de al menos dos diferentes formas estereoquimicamente isoméricas. En algunas modalidades, una composición química puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros del compuesto. En algunas modalidades, una composición química puede contener menos de todos los diastereómeros y/o enantiómeros de un compuesto. En algunas modalidades, si un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención se desea, puede ser preparado, por ejemplo, por síntesis asimétrica, o por derivación con un auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomérica resultante es separada y el grupo auxiliar desdoblado para proporcionar los enantiómeros deseados puros. Alternativamente, donde la molécula contiene un grupo funcional básico, tal como amino, las sales diastereoméricas son formadas con un ácido ópticamente activo apropiado, y resueltas, por ejemplo, por cristalización fraccional.
Sujeto : Como se usa en la presente, el término "sujeto" o "sujeto de prueba" se refiere a cualquier organismo al cual un compuesto o composición proporcionada se administra de conformidad con la presente invención por ejemplo, para propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, y/o terapéuticos. Sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos; insectos; gusanos; etc. ) y plantas. En algunas modalidades, un sujeto puede estar sufriendo de, y/o susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición.
Sustancialmente: Como se usa en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de presentar extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Uno de habilidad ordinaria en las téenicas biológicas entenderá que el fenómeno biológico y químico rara vez, sino siembre, llega a su finalización y/o precede a terminación o logra o evita un resultado absoluto. El término "sustancialmente" es por lo tanto usado en la presente para capturar la carencia potencial de terminación inherente en muchos fenómenos biológicos y/o químicos.
Sufriendo de: Un individuo quién está "sufriendo de" una enfermedad, trastorno, y/o condición que ha sido diagnosticado con y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno, y/o condición.
Susceptible a : Un individuo quién es "susceptible a" una enfermedad, trastorno, y/o condición es uno quién tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad, trastorno, y/o condición que un miembro de la población general. En algunas modalidades, un individuo quién es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición puede no haber sido diagnosticado con la enfermedad, trastorno, y/o condición. En algunas modalidades, un individuo quién es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición, puede presentar síntomas de la enfermedad, trastorno, y/o condición. En algunas modalidades, un individuo quién es susceptible a una enfermedad, trastorno, y/o condición puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno, y/o condición. En algunas modalidades, un individuo quién es susceptible a una enfermedad, trastorno, y/o condición desarrollará la enfermedad, trastorno, y/o condición. En algunas modalidades, un individuo quién es susceptible a una enfermedad, trastorno, y/o condición no desarrollará la enfermedad, trastorno, y/o condición.
Sistémica : Las frases "administración sistémica", "administrado sistémicamente", "administración periférica", y "administrado periféricamente" como se usan en la presente tienen su significado entendido en la téenica con referencia a la administración de un compuesto o composición de manera que entra en el sistema del recipiente.
Formas tautoméricas : La frase "formas tautoméricas", como se usa en la presente, se usa para describir diferentes formas isoméricas de compuestos orgánicos que son capaces de facilitar la interconversión.
Los tautómeros pueden ser caracterizados por la migración formal de un átomo o protón de hidrógeno, acompañado por un cambio de un enlace único y enlace doble adyacente. En algunas modalidades, los tautómeros pueden resultar del tautomerismo prototrópico (es decir , la reubicación de un protón) . En algunas modalidades, los tautómeros pueden resultar del tautomerismo de la valencia (es decir, la rápida reorganización de los electrones de unión). Todas de tales formas tautoméricas están propuestas para ser incluidas dentro del alcance de la presente invención. En algunas modalidades, existen formas tautoméricas de un compuesto en equilibrio móvil entre si, de manera que los intentos por preparar las sustancias separadas resultan en la formación de una mezcla. En algunas modalidades, las formas tautoméricas de un compuesto son compuestos separables y aislables. En algunas modalidades de la invención, las composiciones químicas pueden ser proporcionadas que son o que incluyen preparaciones puras de una forma tautomérica única de un compuesto. En algunas modalidades de la invención, las composiciones químicas pueden ser proporcionadas como mezclas de dos o más formas tautoméricas de un compuesto. En ciertas modalidades, tales mezclas contienen cantidades iguales de diferentes formas tautoméricas; en ciertas modalidades, tales mezclas contienen diferentes cantidades de al menos dos diferentes formas tautoméricas de un compuesto. En algunas modalidades de la invención, las composiciones químicas pueden contener todas las formas tautoméricas de un compuesto. En algunas modalidades de la invención, las composiciones químicas pueden contener menos de todas las formas tautoméricas de un compuesto. En algunas modalidades de la invención, las composiciones químicas pueden contener uno o más formas tautoméricas de un compuesto en cantidades que varían con el tiempo como un resultado de la interconversión. En algunas modalidades de la invención, el tautomerismo es tautomerismo ceto-enol. Uno de habilidad en las artes químicas podría reconocer que un tautómero ceto- enol puede ser "atrapado" (es decir, químicamente modificado de manera que permanece en la forma "enol") usando cualquier reactivo adecuado conocido en las artes químicas para proporcionar un derivado enol que puede ser subsecuentemente aislado usando una o más téenicas adecuadas conocidas en el arte. A menos que se indica de otro modo, la presente invención abarca todas las formas tautoméricas de compuestos relevantes, sean en forma pura o en mezcla entre sí.
Agente terapéutico : Como se usa en la presente, la frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacéutico deseado. En algunas modalidades, un agente terapéutico es cualquier sustancia que puede ser usada para mitigar, aliviar, mejorar, inhibir, prevenir, retardar el comienzo de, reducir la severidad de, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno, y/o condició .
Cantidad terapeuticamente efectiva : Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de una sustancia (por ejemplo, un agente terapéutico, composición, y/o formulación) que provoca una respuesta biológica deseada cuando se administra como parte de un régimen terapéutico. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia es una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que sufre de o susceptible a una enfermedad, trastorno, y/o condición, para tratar, diagnosticar, prevenir, y/o retardar el comienzo de la enfermedad, trastorno, y/o condición. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en esta téenica, la cantidad efectiva de una sustancia puede variar dependiendo de tales factores como el punto final biológico deseado, la sustancia a ser suministrada, la célula o tejido objetivo, etc. Por ejemplo, la cantidad efectiva de un compuesto en una formulación para tratar una enfermedad, trastorno, y/o condición es la cantidad que alivia, mejora, mitiga, inhibe, previene, retarda el comienzo de, reduce la severidad de, y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de la enfermedad, trastorno, y/o condición. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva es administrada en una dosis única; en algunas modalidades, se requieren dosis unitarias múltiples para suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva.
Trata : Como se usa en la presente, el término-"trata", "tratamiento", o "tratar" se refiere a cualquier método usado para parcialmente o completamente, aliviar, mejorar, mitiqar, inhibir, prevenir, retardar el comienzo de, reducir la severidad de, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno, y/o condición. El tratamiento puede ser administrado a un sujeto quién no presenta signos de una enfermedad, trastorno, y/o condición. En algunas modalidades, el tratamiento puede ser administrado a un sujeto quién presenta solamente signos tempranos de la enfermedad, trastorno, y/o condición, por ejemplo con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad, trastorno, y/o condición.
Insaturado: El término "insaturado", como se usa en la presente, significa que una porción tiene una o más unidades de insaturación.
Dosis unitaria: La expresión "dosis unitaria" como se usa en la presente se refiere a una cantidad administrada como una dosis única y/o en una unidad físicamente discreta de una composición farmacéutica. En muchas modalidades, una dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de un agente activo. En algunas modalidades, una dosis unitaria contiene una dosis individual completa del agente. En algunas modalidades, se administra más de una dosis unitaria para lograr una dosis única total. En algunas modalidades, se requiere la administración de dosis unitarias múltiples, o se espera se requiera, con el fin de lograr un efecto propuesto. Una dosis unitaria puede ser, por ejemplo, un volumen de liquido (por ejemplo, un portador aceptable) que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agente terapéuticos, una cantidad predeterminada de uno o más agente terapéuticos en forma sólida, una formulación de liberación sostenida o dispositivo de suministro de fármaco que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agente terapéuticos, etc. Se apreciará que una dosis unitaria puede estar presente en una formulación que incluye cualquiera de una variedad de componentes además del (los) agentes terapéutico(s). Por ejemplo, portadores aceptables (por ejemplo, portadores farmacéuticamente aceptables), diluyentes, estabilizadores, amortiguadores, preservativos, etc., pueden ser incluidos como se describe anteriormente. Se apreciará por aquellos expertos en la téenica, en muchas modalidades, una dosificación diaria apropiada total de un agente terapéutico particular puede comprender una porción, o una pluralidad, de dosis unitarias, y puede ser decidida, por ejemplo, por el especialista que atiende dentro del alcance del juicio médico sano. En algunas modalidades, el nivel de dosis efectiva específica para cualquier sujeto u organismo particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno a ser tratado y la severidad del trastorno; actividad del compuesto activo especifico empleado; composición especifica empleada; edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; tiempo de administración, y velocidad de excreción del compuesto activo especifico empleado; duración del tratamiento; fármacos y/o terapias adicionales usados en combinación o coincidentes con el(los) compuesto (s) especifico(s) usado(s), y factores similares bien conocidos en las artes médicas.
Tipo nativo: Como se usa en la presente, el término "tipo nativo" tiene su significado en la téenica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (como se contrarresta con el mutante, enfermo, alterado, etc.). Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica apreciarán que genes de tipo nativo y polipéptidos a menudo existen en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos). Ácido nucleico: El término "ácido nucleico" incluye algunos nucleótidos, análogos de los mismos, y polímeros de los mismos. El término "polinucleótido" como se usa en la presente se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de las moléculas y, de este modo, incluye ADN de doble y hebra única, y ARN de doble y hebra única.
Estos términos incluyen, como equivalentes, análogos de ya sea ARN o ADN hechos de análogos de nucleótido y polinucleótidos modificados tales como, aunque no limitado a, polinucleótidos o nucleótidos metilados, protegidos y/o tapados. Los términos abarcan poli- u oligo-ribonucleótidos (ARN) y poli- u oligo-desoxirribonucleótidos (ADN); ARN o ADN derivado de N-glicósidos o C-glicósidos de nucleobases y/o nucleobases modificadas; ácidos nucleicos derivados de azúcares y/o azúcares modificados; y ácidos nucleicos derivados de puentes de fosfato y/o puentes modificados de átomos de fósforo (también referidos en la presente como "enlaces de internucleótidos") . El término abarca ácidos nucleicos que contienen cualquiera de las combinaciones de nucleobases, nucleobases modificadas, azúcares, azúcares modificados, puentes de fosfato o puentes modificados de átomos de fósforo. Ejemplos incluyen, y no se limitan a, ácidos nucleicos que contienen porciones ribosa, los ácidos nucleicos que contienen porciones desoxi-ribosa, ácidos nucleicos que contienen tanto porciones de ribosa como desoxirribosa, ácidos nucleicos que contienen ribosa y porciones de ribosa modificadas. El prefijo poli- se refiere a un ácido nucleico que contiene 2 hasta aproximadamente 10,000 unidades monoméricas de nucleótidos y en donde el prefijo oligo- se refiere a un ácido nucleico que contiene 2 hasta aproximadamente 200 unidades monoméricas de nucleótidos.
Nucleótido : El término "nucleótido" como se usa en la presente se refiere a una unidad monomérica de un polinucleótido que consiste de una base heterocielica, un azúcar, y uno o más grupos fosfato o enlaces internucleotidicos que contienen fósforo. Las bases que se originan naturalmente, (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T), y uracilo (ü)) son derivadas de purina o pirimidina, aunque se debe entender que los análogos de bases que se originan naturalmente y que no se originan naturalmente también están incluidos. El azúcar que se origina naturalmente es la pentosa (azúcar de cinco carbonos), desoxirribosa (la cual forma ADN) o ribosa (la cual forma ARN), aunque se debe entender que análogos de azúcar que se originan naturalmente y que no se originan naturalmente también están incluidos. Los nucleótidos están ligados mediante enlaces internucleotidicos para formar ácido nucleicos, o polinucleótidos . Muchos enlaces internucleotidicos se conocen en la téenica (tales como, aunque no se limita a, fosfato, fosforotioatos, boranofosfatos y similares). Ácido nucleicos artificiales incluyen PNAs (ácidos nucleicos peptidicos), fosfotriésteres, fosforotionatos, H-fosfonatos , fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, fosfonoacetatos, tiofosfonoacetatos y otras variantes del armazón de fosfato de ácidos nucleicos nativos, tales como aquellos descritos en la presente.
Nucleósido: El término "nucleósido" se refiere a una porción en donde una nucleobase o una nucleobase modificada está covalentemente unida a un azúcar o azúcar modificada.
Azúcar: El término "azúcar" se refiere a un monosacárido en forma cerrada y/o abierta. Los azúcares incluyen, pero no se limitan a, porciones de ribosa, desoxirribosa, pentofuranosa, pentopiranosa, y hexopiranosa. Como se usa en la presente, el término también abarca análogos estructurales usados en lugar de moléculas de azúcar convencional, tales como glicol, polímero del cual forma la estructura del análogo de ácido nucleico, ácido nucleico de glicol ( "GNA").
Azúcar modificado: El término "azúcar modificado" se refiere a una porción que puede reemplazar un azúcar. El azúcar modificado imita el arreglo espacial, propiedades electrónicas, o algunas otras propiedades fisicoquímicas de un azúcar.
Núcleobase: El término "núcleobase" se refiere a las partes de ácidos nucleicos que están involucradas en el enlace de hidrógeno que une una hebra de ácido nucleico a otra hebra complementaria en una manera específica de la secuencia. Las nucleobases que se originan naturalmente más comunes son adenina (A), guanina (G), uracilo (U), citosina (C), y timina (T). En algunas modalidades, las núcleobases que se originan naturalmente son adenina, guanina, uracilo, citosina, o timina modificadas. En algunas modalidades, las núcleobases que se originan naturalmente son adenina, guanina, uracilo, citosina, o timina metilada. En algunas modalidades, una núcleobase es una "núcleobase modificada", por ejemplo, una núcleobase distinta de adenina (A) , guanina (G), uracilo (U), citosina (C), y timina (T). En algunas modalidades, las núcleobases modificadas son adenina, guanina, uracilo, citosina, o timina metilada. En algunas modalidades, la núcleobase modificada imita el arreglo espacial, propiedades electrónicas, o algunas otras propiedades fisicoquímicas de la núcleobase y retiene la propiedad de enlace de hidrógeno que une una hebra de ácido nucleico a otra en una manera específica de la secuencia. En algunas modalidades, una núcleobase modificada puede aparearse con todas las cinco bases que se originan naturalmente (uracilo, timina, adenina, citosina, o guanina) sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusión, reconocimiento por enzimas intracelulares o actividad del dúplex de oligonucleótido.
Ligando quíral : El término "ligando quiral" o "auxiliar quiral" se refiere a una porción que es quiral y que puede ser incorporada en una reacción de manera que la reacción se puede llevar a cabo con cierta estereoselecti idad.
Reactivo de condensación: En una reacción de condensación, el término "reactivo de condensación" se refiere a un reactivo que activa un sitio menos reactivo y lo proporciona más susceptible al ataque por otro reactivo. En algunas modalidades, tal otro reactivo es un nucleófilo.
Grupo de bloqueo: El término "grupo de bloqueo" se refiere a un grupo que enmascara la reactividad de un grupo funcional. El grupo funcional puede ser subsecuentemente desenmascarado por remoción del grupo de bloqueo. En algunas modalidades, un grupo de bloqueo es un grupo protector.
Porción: El término "porción" se refiere a un segmento especifico o grupo funcional de una molécula. Las porciones químicas son a menudo entidades químicas reconocidas incrustadas en o adjuntadas a una molécula.
Soporte sólido: El término "soporte sólido" se refiere a cualquier soporte el cual permite la síntesis de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, el término se refiere a un vidrio o un polímero, que es insoluble en el medio empleado en las etapas de reacción realizadas para sintetizar ácidos nucleicos, y es derivatizado para comprender grupos reactivos. En algunas modalidades, el soporte sólido es Poliestireno Altamente Reticulado (HCP= o Vidrio de Poro Controlado (CPG). En algunas modalidades, el soporte sólido es Vidrio de Poro Controlado (CPG). En algunas modalidades, el soporte sólido es soporte híbrido de Vidrio de Poro Controlado (CPG) y Poliestireno Altamente Reticulado (HCP).
Porción enlazante: El término "porción enlazante" se refiere a cualquier porción opcionalmente posicionada entre el nucleósido terminal y el soporte sólido o entre el nucleósido terminal y otro nucleósido, nucleótido, o ácido nucleico.
Molecula de ADN: Una "Molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) en su forma ya sea de hebra única o una hélice de doble hebra. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a cualquiera de las formas terciarias particulares. De este modo, este término incluye ADN de doble hebra encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos, y cromosomas. Discutiendo la estructura de las moléculas de ADN de doble hebra particulares, las secuencias pueden ser descritas en la presente de conformidad con la convención normal de proporcionar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' junto a la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al ARNm) .
Secuencia codificante: Una "secuencia codificante" o "región codificante" de ADN es una secuencia de ADN de doble hebra la cual es transcrita y traducida en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de las secuencias de control de expresión apropiadas. Los limites de la secuencia codificante (el "marco lector abierto" u "ORF") son determinados por un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón de detención de traducción al término 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procarióticas, ADNc a partir de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por ejemplo, mamífero), y secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción está, usualmente, siendo localizada 3' a la secuencia codificante. El término "secuencia no codificante" o "región no codificante" se refiere a regiones de una secuencia de polinucleótido que no son traducidas en aminoácidos (por ejemplo, regiones 5' y 3' no traducidas).
Marco lector : El término "marco lector" se refiere a uno de los seis marcos lectores posibles, tres en cada dirección, de la molécula de ADN de doble hebra. El marco lector que se usa determina cuales codones son usados para codificar aminoácidos dentro de la secuencia codificante de una molécula de ADN.
Antisentido: Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótido la cual es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra, complementaria a una secuencia de ARNm o complementaria a la hebra codificante de un gen. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico antisentido puede asociarse mediante enlaces de hidrógeno a una molécula de ácido nucleico sentido.
Posición wobble (tambaleante) : Como se usa en la presente, una "posición wobble" se refiere a la tercera posición de un codón. Las mutaciones en una molécula de ADN dentro de la posición wobble de un codón, en algunas modalidades, resultan en mutaciones silentes o conservativas al nivel de aminoácido. Por ejemplo, existen cuatro codones que codifican a Glicina, es decir GGU, GGC, GGA y GGG, de este modo la mutación de cualquier nucleótido de posición wobble, a cualquier otro nucleótido seleccionado a partir de A, U, C y G, no resulta en un cambio al nivel de aminoácido de la proteina codificada y, por lo tanto, es una sustitución silente.
Sustitución silente: Una "sustitución silente" o "mutación silente" es una en la cual un nucleótido dentro de un codón es modificado, pero no resulta en un cambio en el residuo de aminoácido codificado por el codón. Ejemplos incluyen mutaciones en la tercera posición de un codón, como también en la primera posición de ciertos codones tales como en el codón "CGG", el cual, cuando se muta a AGG, todavía codifica a Arg.
Gen : Los términos "gen", "gen recombinante" y "constructo de gen" como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ADN, o porción de una molécula de ADN, que codifica una proteina o una porción de la misma. La molécula de ADN puede contener un marco lector abierto que codifica la proteína (como secuencias de exón) y puede además incluir secuencias de intrón. El término "intrón" como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado el cual no es traducido en la proteina y es encontrado en algunos casos, pero no en todos, entre los exones. Puede ser deseable para que el gen sea operablemente ligado a, (o pueda comprender), una o más secuencias promotoras, potenciadoras, represoras y/u otras secuencias reguladoras para modular la actividad o expresión del gen, como es bien conocido en la téenica.
ADN Complementario: Como se usa en la presente, un "ADN complementario" o "ADNc" incluye polinucleótidos recombinantes sintetizados por transcripción inversa del ARNm y a partir del cual las secuencias de intervención (intrones) han sido removidas.
Homología : "Homología" o "identidad" o "similitud" se refiere a una similitud de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología e identidad pueden ser cada una determinada comparando una posición en cada secuencia la cual puede ser alineada para propósitos de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas a tal posición; cuando el sitio equivalente es ocupado por el mismo o por un similar residuo de ácido nucleico (por ejemplo, similar en naturaleza estérica y/o electrónica), entonces las moléculas pueden ser referidas como homologas (similares) en tal posición. La expresión como un porcentaje de homologia/similitud o identidad, se refiere a una función del número de ácidos nucleicos idénticos o similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Una secuencia la cual es "no relacionada" o "no homologa" comparte menos de 40% de identidad, menos de 35% de identidad, menos de 30% de identidad, o menos de 25% de identidad con una secuencia descrita en la presente. En la comparación de las dos secuencias, la ausencia de residuos (aminoácidos o ácidos nucleicos) o presencia de residuos extra también disminuye la identidad y homologia/similitud.
En algunas modalidades, el término "homología" describe una comparación matemáticamente basada de similitudes de secuencia la cual se usa para identificar genes con funciones o porciones similares. Las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente pueden ser usadas como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia, secuencias u homólogos relacionados. En algunas modalidades, tales búsquedas pueden ser realizadas usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. En algunas modalidades, las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden ser realizadas con el programa NBLAST, registro=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleótido homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. En algunas modalidades, para obtener alineamientos con huecos para propósitos de comparación, puede ser utilizado BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con huecos, los parámetros de falta de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y BLAST) pueden ser usados (Véase www.ncbi.nlm.nih.gov).
Identidad: Como se usa en la presente, "identidad" significa el porcentaje de residuos nucleótidos idénticos en posiciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias son alineadas para maximizar el apareamiento de secuencia, es decir, tomando en cuenta huecos e inserciones. La identidad puede ser fácilmente calculada por métodos conocidos, gue incluyen pero no se limitan a aguellos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jerscy, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad son diseñados para dar el apareamiento más grande entre las secuencias probadas. Sin embargo, los métodos para determinar la identidad son codificados en los programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programas de computadoras para determinar la identidad entre las dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol . 215: 403-410 (1990) y Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa BLAST X está públicamente disponible de fuentes NCBI y otras (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM N1H Bethesda, Md.20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también puede ser usado para determinar la identidad.
Heteróloga: Una región "heteróloga" de una secuencia de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una secuencia de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la secuencia más grande en naturaleza. De este modo, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen puede ser usualmente flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo de fuente. Otro ejemplo de una secuencia heteróloga codificante es una secuencia en donde la secuencia codificante misma no es encontrada en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones o porciones diferentes que el gen no modificado). Variaciones alélicas o eventos de mutación que se originan naturalmente no dan origen a una región heteróloga de una ADN como se define en la presente.
Mutación de transición : El término "mutaciones de transición" se refiere a cambios de base en una secuencia de ADN en la cual una pirimidina (citidina (C) o timidina (T) es reemplazada por otra pirimidina, o una purina (adenosina (A) o guanosina (G) es reemplazada por otra purina.
Mutación de transversión : El término "mutaciones de transversión" se refiere a cambios de base en una secuencia de ADN en la cual una pirimidina (citidina (C) o timidina (T) es reemplazada por una purina (adenosina (A) o guanosina (G), o una purina es reemplazada por a pirimidina.
Oligonucleótido: el término "oligonucleótido" se refiere a un polímero u oligómero de monómeros de nucleótido, que contienen cualquier combinación de núcleobases, núcleobases modificadas, azúcares, azúcar modificadas, puentes de fosfato, o puentes modificados de átomos de fósforo (también referidos en la presente como "enlace internucleotídico", definido además en la presente).
Los oligonucleótidos pueden ser de hebra única o de doble hebra. Como se usa en la presente, el término "hebra de oligonucleótido" abarca un oligonucleótido de hebra única. Un oligonucleótido de hebra única puede tener regiones de doble hebra y un oligonucleótido de doble hebra puede tener regiones de hebra única. Oligonucleótidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y terminación, sistemas auto-replicantes tales como ADN viral o plásmido, ARNsi de hebra única y de doble hebra y otros reactivos de interferencia de ARN (agentes ARNi o agentes iARN), ARNsh, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, microARNs, miméticos de microARN, supermirs, aptámeros, antimirs, antagomirs, adaptadores Ul, oligonucleótidos que forman triples, oligonucleótidos que formas cuádruplos-G, activadores de ARN, oligonucleótidos inmunoestimuladores, y oligonucleótidos señuelos.
Los oligonucleótidos de hebra única y de doble hebra que son efectivos en inducir interferencia de ARN son también referidos como ARNsi, agente ARNi, o agente ARNi, en la presente. En algunas modalidades, esta interferencia de ARN que induce oligonucleótidos se asocia con un complejo de proteina múltiple citoplásmica conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARNi (RISC). En muchas modalidades, los agentes ARNi de hebra única y de doble hebra son suficientemente largos que pueden ser desdoblados por una molécula endógena, por ejemplo, por Dicer, para producir oligonucleótidos más pequeños que pueden entrar a la maquinaria RISC y participar en el desdoblamiento mediado por RISC de una secuencia objetivo, por ejemplo, un ARNm objetivo.
Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser de varias longitudes. En modalidades particulares, los oligonucleótidos pueden variar desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. En varias modalidades relacionadas, los oligonucleótidos, de hebra única, de doble hebra y de triple hebra, pueden variar en longitud desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10 nucleótidos, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 nucleótidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 nucleótidos, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 39 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 4 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 5 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 6 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 7 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 8 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 9 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 10 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 11 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 12 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 15 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 20 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 25 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es un duplo de hebras complementarias de al menos 18 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es un duplo de hebras complementarias de al menos 21 nucleótidos de longitud.
Enlace internucleotldico: Como se usa en la presente, la frase "enlace internucleotldico" se refiere en general al enlace que contiene fósforo entre unidades de nucleótido de un oligonucleótido, y es intercambiable con "enlace inter-azúcar" y "puente de átomo de fósforo", como se usa anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, un enlace internucleotldico es un enlace fosfodiéster, como se encuentra en moléculas de ADN y ARN que se originan naturalmente. En algunas modalidades, un enlace internucleotldico es un "enlace internucleotldico modificado" en donde cada átomo de oxigeno del enlace fosfodiéster es opcionalmente e independientemente reemplazado por una porción orgánica o inorgánica. En algunas modalidades, tal porción orgánica o inorgánica es seleccionada a partir de pero no se limita a =S, =Se, =NR', -SR', -SeR', -N(R' ) 2, B(R')3, -S-, -Se-, y -N(R')-, en donde cada R' es independientemente como se define y describe abajo. En algunas modalidades, un enlace internucleotidico es un enlace fosfotriéster, enlaces fosforotioato diéster ( ), o enlace modificado de fosforotioato triéster. Es entendido por una persona de habilidad ordinaria en la téenica, que el enlace internucleotidico puede existir como un anión o catión a un pH dado debido a la existencia de porciones de ácido o base en el enlace.
A menos que se especifique de otro modo, cuando se usa con una secuencia de oligonucleótido, cada uno de s, si, s2, s3, s4, s5, s6 y s7 representa independientemente el siguiente enlace internucleotidico modificado como se ilustra en la Tabla 1, abajo.
Tabla 1. Enlace Internucleotidico Modificado Ejemplar Por ejemplo, (Rp, Sp)-ATsCslGA tiene 1) un enlace -f-O-P-O-- fosforotioato internucleotidico ( S~ ) entre T y C; y 2) un enlace internucleotidico fosforotioato triéster que tiene 5 la estructura de entre C y G. A menos que se especifique de otro modo, las designaciones Rp/Sp que preceden una secuencia de oligonucleótido describen las configuraciones del enlace de átomos de fósforo del enlace quiral en los enlaces internucleotidicos secuencialmente a partir de 5' a 3' de la secuencia de oligonucleótido. Por ejemplo, en ( Rp, Sp)-ATsCslGA, el fósforo en el enlace "s" entre T y C tiene la configuración Rp y el fósforo en el enlace "si" entre C y G tiene la configuración Sp. En algunas modalidades, "All-(Ap)" o "All-(Sp)" se usa para indicar que todos los átomos de fósforo del enlace quiral en el oligonucleótido tienen la misma configuración Rp o Sp, respectivamente. Por ejemplo, All-(Pp)- GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC indica que todos los átomos de fósforo del enlace quiral en el oligonucleótido tienen la configuración Rp; All-(Sp)- GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC indica que todos los átomos de fósforo del enlace quiral en el oligonucleótido tienen la configuración Sp.
Tipo de Oligonucleótido : Como se usa en la presente, la frase "tipo de oligonucleótido" se usa para definir un oligonucleótido que tiene una secuencia base particular, patrón de enlaces de armazón (es decir, patrón de tipos de enlaces internucleotidicos, por ejemplo, fosfato, fosforotioato, etc. ) , patrón de centros quirales de armazón (es decir, patrón de estereoquímica de enlace de fósforo (Rp/Sp) ) , y patrón de armazón de modificaciones de fósforo (por ejemplo, patrón de grupos "-XLR1" en la fórmula I). Los oligonucleótidos de un "tipo" común designado son estructuralmente idénticos entre sí.
Uno de habilidad en la téenica apreciará que los métodos sintéticos de la presente invención proporcionan un grado de control durante la síntesis de una hebra de oligonucleótido de manera que cada unidad de nucleótido de la hebra de oligonucleótido puede ser diseñada y/o seleccionada en adelante para tener una estereoquímica particular en el enlace de fósforo y/o una modificación particular en el enlace de fósforo, y/o una base particular, y/o un azúcar particular. En algunas modalidades, una hebra de oligonucleótido es diseñada y/o seleccionada en adelante para tener una combinación particular de estereocentros en el enlace de fósforo. En algunas modalidades, una hebra de oligonucleótido es diseñada y/o determinada para tener una combinación particular de modificaciones en el enlace de fósforo. En algunas modalidades, una hebra de oligonucleótido es diseñada y/o seleccionada para tener una combinación particular de bases. En algunas modalidades, una hebra de oligonucleótido es diseñada y/o seleccionada para tener una combinación particular de una o más de las características estructurales anteriores. La presente invención proporciona composiciones que comprenden o consisten de una pluralidad de moléculas de oligonucleótido (por ejemplo, composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados) . En algunas modalidades, todas de tales moléculas son del mismo tipo (es decir, son estructuralmente idénticas entre si). En muchas modalidades, las composiciones proporcionadas comprenden una pluralidad de oligonucleótidos de diferentes tipos, típicamente en cantidades relativas pre-determinadas.
Control quiral : Como se usa en la presente, "control quiral" se refiere a una capacidad para controlar la designación estereoquímica de cada fósforo de enlace quiral dentro de una hebra de oligonucleótido. La frase "oligonucleótido quiralmente controlado" se refiere a un oligonucleótido el cual existe en una forma diastereomérica única con respecto al fosforo el enlace quiral.
Composición de oligonucleótido quiralmente controlado : Como se usa en la presente, la frase "composición de oligonucleótido quiralmente controlado" se refiere a una composición de oligonucleótido que contiene niveles predeterminados de oligonucleótidos de tipo individuales. Por ejemplo, en algunas modalidades una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende un tipo de oligonucleótido. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende más de un tipo de oligonucleótido. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende una mezcla de tipos de oligonucleótidos múltiples. Composiciones ejemplares de oligonucleótidos quiralmente controlados se describen además en la presente.
Quiralmente puro: como se usa en la presente, la frase "quiralmente puro" se usa para describir una composición de oligonucleótido quiralmente controlado en la cual existen todos los oligonucleótidos en una forma diastereomérica única con respecto al fósforo del enlace.
Quiralmente uniforme : como se usa en la presente, la frase "quiralmente uniforme" se usa para describir una molécula o tipo de oligonucleótido en el cual todas las unidades de nucleótido tienen la misma estereoquímica en el enlace de fósforo. Por ejemplo, un oligonucleótido cuyas unidades de nucleótido todas tienen estereoquímica Rp en el enlace de fósforo es quiralmente uniforme. Del mismo modo, un oligonucleótido cuyas unidades de nucleótido todas tienen estereoquímica Sp en el enlace de fósforo es quiralmente uniforme.
Predeterminado: Por predeterminado significa deliberadamente seleccionado, por ejemplo contrario a lo que ocurre o se logra aleatoriamente. Aquellos de habilidad ordinaria en la téenica, que leen la presente especificación, apreciarán que la presente invención proporciona nuevas y sorprendentes tecnologías que permiten la selección de tipos de oligonucleótidos particulares para la preparación y/o inclusión en composiciones proporcionadas, y además permite la preparación controlada de precisamente los tipos particulares seleccionados, opcionalmente en cantidades relativas particulares seleccionadas, de manera que se preparan las composiciones proporcionadas. Tales composiciones proporcionadas son "predeterminadas" como se describe en la presente. Composiciones que pueden contener ciertos oligonucleótidos de tipo individuales debido a que ocurren por haber sido generados a través de un proceso que no puede ser controlado para generar intencionalmente los tipos de oligonucleótidos particulares no son una "composiciones predeterminadas". En algunas modalidades, una composición predeterminada es una que puede ser intencionalmente reproducida (por ejemplo, a través de repetición de un proceso controlado).
Fósforo de enlace: como se define en la presente, la frase "fósforo de enlace" se usa para indicar que el átomo de fósforo particular siendo referido como es al átomo de fósforo presente en el enlace internucleotidico, en el cual el átomo de fósforo corresponde al átomo de fósforo de un fosfodiéster de un enlace internucleotidico como ocurre en ADN y ARN que se origina naturalmente. En algunas modalidades, un átomo de fósforo de enlace está en un enlace internucleotidico modificado, en donde cada átomo de oxigeno de un enlace de fosfodiéster es opcionalmente e independientemente reemplazado por una porción orgánica o inorgánica. En algunas modalidades, un átomo de fósforo de enlace es P* de fórmula I. En algunas modalidades, un átomo de fósforo de enlace es quiral. En algunas modalidades, un átomo de fósforo de enlace quiral es P* de fórmula I.
Modificación-P: como se usa en la presente, el término "modificación-P" se refiere a cualquier modificación en el enlace de fósforo distinta de una modificación estereoquímica. En algunas modalidades, una modificación-P comprende adición, sustitución, o remoción de una porción colgante covalentemente unida a un fósforo de enlace. En algunas modalidades, la "modificación-P" es -X-L-R1 en donde cada uno de X, L y R1 es independientemente como se define y describe en la presente y abajo.
Blockmero : el término "blockmero", como se usa en la presente, se refiere a una hebra de oligonucleótido cuyo patrón de factores estructurales que caracterizan cada unidad de nucleótido individual está caracterizada por la presencia de al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos que portan una característica estructural común en el enlace de fósforo internucleotídico. Por característica estructural común significa estereoquímica común en el enlace de fósforo o una modificación común en el enlace de fósforo. En algunas modalidades, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos que portan una característica de estructura común en el enlace fosforoso internucleotídico son referidas como un "bloque".
En algunas modalidades, un blockmero es un "estereoblockmero", por ejemplo, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos tienen la misma estereoquímica en el enlace de fósforo. Tales al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos forman un "estereobloque". Por ejemplo, (Sp, Sp)-ATsCslGA es un estereoblockmero debido a que al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos, el Ts y el Csl, tienen la misma estereoquímica en el enlace de fósforo (ambos Sp). En el mismo oligonucleótido (Sp, Sp)-ATsCslGA, TsCsl forma un bloque, y es un estereobloque.
En algunas modalidades, un blockmero es un "blockmero de modificación-P", por ejemplo, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos tienen la misma modificación en el enlace de fósforo. Tales al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos forman un "bloque de modificación-P". Por ejemplo, (Rp, Sp)-ATsCsGA es un blockmero de modificación-P debido a que al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos, el Ts y el Cs, tienen la misma modificación-P (es decir, ambos son un fosforotioato diéster). En el mismo oligonucleótido de (Rp, Sp)-ATsCsGA, TsCs forma un bloque, y es un bloque de modificación-P.
En algunas modalidades, un blockmero es un "blockmero de enlace", por ejemplo, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos tienen estereoquímica idéntica y modificaciones idénticas en el enlace de fósforo. Al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos forman un "bloque de enlace". Por ejemplo, (Rp, Pp)-ATsCsGA es un blockmero de enlace debido a que al menos dos unidades de nucleótidos consecutivos, el Ts y el Cs, tienen la misma estereoquímica (ambos Rr) y modificación-P (ambos fosforotioato). En el mismo oligonucleótido de (.Rp, Rp)-ATsCsGA, TsCs forma un bloque, y es un bloque de enlace.
En algunas modalidades, un blockmero comprende uno o más bloques seleccionados independientemente a partir de un estereobloque, un bloque de modificación-P y un bloque de enlace. En algunas modalidades, un blockmero es un estereoblockmero con respecto a un bloque, y/o un bloque de modif icación-Pmero con respecto a otro bloque, y/o un blockmero de enlace con respecto a todavía otro bloque. Por ejemplo, {Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp) -AAsTsCsGsAslTslCslGslATCG es un estereoblockmero con respecto al estereobloque AsTsCsGsAsl (todo Rp en el fósforo de enlace) o TslCslGsl (todo Sp en el fósforo de enlace), un bloque de modificación-Pmero con respecto al bloque de modificación-P AsTsCsGs (todo el enlace s) o AslTslCslGsl (todo el enlace si), o un blockmero de enlace con respecto al bloque de enlace AsTsCsGs (todo Rp en el fósforo de enlace y todo el enlace) o TslCslGsl (todo Sp en el fósforo de enlace y todo el enlace si).
Altmero : el término "altmero", como se usa en la presente, se refiere a una hebra de oligonucleótido cuyos patrones de factores estructurales que caracterizan cada unidad de nucleótido individual se caracterizan en que ninguna de las dos unidades de nucleótidos consecutivos de la hebra de oligonucleótido portan una característica estructural particular en el enlace de fósforo internucleotídico. En algunas modalidades, un altmero es diseñado de manera que comprende un patrón de repetición. En algunas modalidades, un altmero es diseñado de manera que no comprende un patrón de repetición.
En algunas modalidades, un altmero es un "estereoaltmero" , por ejemplo, ninguna de las dos unidades de nucleótidos consecutivos tienen la misma estereoquímica en el enlace de fósforo. Por ejemplo, {Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp) -GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC .
En algunas modalidades, un altmero es un ''altmero de modificación-P" por ejemplo, ninguna de las dos unidades de nucleótidos consecutivos tienen la misma modificación en el enlace de fósforo. Por ejemplo, All-(Sp)-CAslGsT, en el cual cada fósforo de enlace tiene una modificación-P diferente que los otros.
En algunas modalidades, un altmero es un "altmero de enlace", por ejemplo, ninguna de las dos unidades de nucleótidos consecutivos tienen estereoquímica idéntica o modificaciones idénticas en el enlace de fósforo. Por ejemplo, {Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp) - GsCslCsTslCsAslGsTslCsTslGsCslTsTs2CsGs3CsAs4CsC.
Unimero: el término "unímero", como se usa en la presente, se refiere a una hebra de oligonucleótido cuyos patrones de factores estructurales que caracterizan cada unidad de nucleótido individual es tal que todas las unidades de nucleótidos dentro de la hebra comparten al menos una característica estructural común en el enlace de fósforo internucleotidico. Por característica estructural común significa la estereoquímica común en el enlace de fósforo o una modificación común en el enlace de fósforo.
En algunas modalidades, un unímero es un "estereounímero", por ejemplo, todas las unidades de nucleótidos tienen la misma estereoquímica en el enlace de fósforo. Por ejemplo, All-(Sp)-CsAslGsT, en el cual todos los enlaces tienen fósforo Sp.
En algunas modalidades, un unímero es un "unímero de modif icación-P", por ejemplo, todas las unidades de nucleótido tienen la misma modificación en el enlace de fósforo. Por ejemplo, (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rpr Sp RP, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp)- GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC, en el cual todos los enlaces internucleotídicos son fosforotioato diéster.
En algunas modalidades, un unímero es un "unímero de enlace", por ejemplo, todas las unidades de nucleótido tienen la misma estereoquímica y las mismas modificaciones en el enlace de fósforo. Por ejemplo, All-(Sp)- GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC, en el cual todos los enlaces internucleotídicos son fosforotioato diéster que tienen fósforo de enlace Sp.
Gapmero: como se usa en la presente, el término "gapmero" se refiere a una hebra de oligonucleótido caracterizada porque al menos un enlace de fósforo internucleotídico de la hebra de oligonucleótido es un enlace de fosfato diéster, por ejemplo tales como aquellos encontrados en ADN o ARN que se origina naturalmente. En algunas modalidades, más de un enlace de fósforo internucleotídico de la hebra de oligonucleótido es un enlace de fosfato diéster tal como aquellos encontrados en ADN o ARN que se origina naturalmente. Por ejemplo, All-(Sp)-CAslGsT, en el cual el enlace internucleotídico entre C y A es un enlace de fosfato diéster.
Skipmero: como se usa en la presente, el término "skipmero" se refiere a un tipo de gapmero en el cual cada otro enlace de fósforo internucleotídico de la hebra de oligonucleótido es un enlace de fosfato diéster, por ejemplo tal como aquellos encontrados en ADN o ARN que se origina naturalmente, y cada otro enlace de fósforo internucleotídico de la hebra de oligonucleótido es un enlace internucleotídico modificado. Por ejemplo, All-(Sp)-AsTCslGAs2TCs3G.
Para propósitos de esta invención, los elementos químicos son identificados de conformidad con la Tabla Periódica de los Elementos, CAS versión, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87, cubierta interior.
Los métodos y estructuras descritos en la presente que se refieren a compuestos y composiciones de la invención también aplican a las sales de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptables y a todas las formas estereoisoméricas de estos compuestos y composiciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. El oligonucleótido quiralmente controlado tiene tiempo de retención significantemente diferente en HPLC comparado con el oligonucleótido estereoaleatorio . 1A: oligonucleótido quiralmente controlado crudo (Oligonucleótido 101); 1C: el oligonucleótido estereoaleatorio correspondiente (Oligonucleótido 118).
Figura 2. HPLC de oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio. 2A: Oligonucleótido 101 (all-Rp); B: Oligonucleótido 102 (all- Sp); y C: Oligonucleótido 118 (estereoaleatorio).
Figura 3. Tm de oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio.
Figura 4. Datos representativos: Análisis de curva de fusión de los pares de control endógenos y objetivos, proporcionando amplicones únicos.
Figura 5. Datos representativos y curvas de IC5o para los compuestos.
Figura 6. HPLC de (Rp, Rp , Sp, R , Rp , Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp) - d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] crudo ((RRS)6~R, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 7. HPLC de (Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp) -d [GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] purificado ((RRS)6-R estereoblockmero y unímero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 8. LCMS de (Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rpr Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp) -d [GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] ((RRS)6~R, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 9. HPLC de (Sp, Rp, JRp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp)-d [GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] crudo (S-(RRS)6, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 10. HPLC de (Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, R , S )— d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] purificado (S- (RRS)6, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 11. LCMS de (Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp)- d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (S-(RRS)6, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 12. HPLC de (Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp) d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] crudo (RS-(RRS)5-RR, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 13. HPLC de {Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp) d [GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] purificado (RS- (RRS)5~RR, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 14. LCMS de (Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp) -d [GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (RS-(RRS)5-RR, estereoblockmero y unimero de modificación-P (unimero-s)).
Figura 15. HPLC de (Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp) -d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] crudo (3R-5S-3R, estereoblockmero y unimero de modificación-P (sl-unimero)).
Figura 16. HPLC de (Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp)-d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] purificado (3R-5S-3R, estereoblockmero y unimero de modificación-P (sl-unimero)).
Figura 17. LCMS de (Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp)-d [5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (3R-5S-3R, estereoblockmero y unimero de modificación-P (sl- unimero)).
Figura 18. HPLC de All-(Rp)-d[Cs3As3Gs3T] crudo (unimero de modificación-P (unímero-s3), estereounimero y unimero de enlace).
Figura 19. LCMS de All- (Rp) -d[Cs3As3Gs3T] (unimero de modificación-P (unimero-s3), estereounimero y unimero de enlace).
Figura 20. HPLC de All-(Pp)-d[Cs2As2Gs2T] crudo (unimero de modificación-P (unimero-s2), estereounimero y unimero de enlace).
Figura 21. LCMS de All- {Rp) -d[Cs2As2Gs2T] (unimero de modificación-P (unimero-s2), estereounimero y unimero de enlace) .
Figura 22. HPLC de All- (Sp)-d[CslAGslT] crudo (gapmero, estereoaltmero, altmero de modificación-P y altmero de enlace).
Figura 23. LCMS de All-(Sp)-d[CslAGslT] (gapmero, estereoaltmero, altmero de modificación-P y altmero de enlace).
Figura 24. All- ( Rp) -d[TsCslAsT] crudo (estereounimero, altmero de modificación-P y altmero de enlace).
Figura 25. LCMS de All-(p) -d [TsCslAsT] (estereounimero, altmero de modificación-P y altmero de enlace).
Figura 26. Oligonucleótidos ejemplares descritos en el documento W02012/030683 y contemplados para la síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 21. Oligonucleótidos ejemplares descritos en el documento W02012/030683 y contemplados para la síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 28. Oligonucleótidos ejemplares descritos en el documento W02012/030683 y contemplados para la síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 29. Oligonucleótidos ejemplares descritos en el documento W02012/030683 y contemplados para la síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 30. Oligonucleótidos ejemplares descritos en el documento W02012/030683 y contemplados para la síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 31. Enlazadores ejemplares descritos en el documento W02012/030683 para uso en los métodos de la presente invención.
Figura 32. Enlazadores ejemplares descritos en el documento W02012/030683 para uso en los métodos de la presente invención.
Figura 33. Enlazadores ejemplares descritos en el documento W02012/030683 para uso en los métodos de la presente invención.
Figura 34. Enlazadores ejemplares descritos en el documento W02012/030683 para uso en los métodos de la presente invención.
Figura 35. RP-HPLC de DMT crudo en el oligonucleótido: ONT-75 (Panel A); ONT-80 (Panel B); ONT-77 (Panel C); ONT-81 (Panel D); ONT-87 (Panel E); ONT-88 (Panel F); ONT-89 (Panel G); ONT-82 (Panel H); ONT-84 (Panel I); ONT-85 (Panel J); ONT-86 (Panel K).
Figura 36. RP-HPLC de oligonucleótido desactivado DMT purificado: ONT-75 (Panel A); ONT-80 (Panel B); ONT-77 (Panel C); ONT-81 (Panel D); ONT-87 (Panel E); ONT-88 (Panel F); ONT-89 (Panel G); ONT-82 (Panel H); ONT-84 (Panel I); ONT-85 (Panel J); ONT-86 (Panel K).
Figura 37. Superposición de rastros de RP-HPLC de oligonucléótido desactivado de DMT purificado: ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89, y ONT-41 (Panel A); vista expandida de superposición de ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89, y ONT-41 (Panel B).
Figura 38. Superposición de rastros de RP-HPLC de oligonucleótido desactivado de DMT purificado: ONT-82, ONT- 84, ONT-85, ONT-86, y ONT-83 (Panel A); vista expandida de superposición de ONT-82, ONT-84, ONT-85, ONT-86, y ONT-83 (Panel B).
Figura 39. Superposición de Tm de oligonucleótidos quiralmente controlados ONT-81, ONT-41, ONT-75, ONT-77, y ONT-80.
Figura 40. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 5 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para ONT- 41, ONT-75, ONT-80, ONT-77, y ONT-81. Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 41. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 5 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para mipomersen, mipomersen "R lleno", mipomersen "S lleno", mipomersen "RSR", y mipomersen "SRS". Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 42. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para mipomersen, mipomersen "R lleno", mipomersen "S lleno", mipomersen "RSR", y mipomersen "SRS". Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 43. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 5 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para mipomersen, ONT-87, ONT-88, y ONT-89. Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 44. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para ONT- 87, ONT-88, y ONT-89. Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 45. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 restante después del tratamiento de Hep38 con ARNsi dúplex.
Figura 46. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 restante después del tratamiento de Hep38 con ajuste de curva de ARNsi dúplex.
Figura 47. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con ARNsi dúplex.
Figura 48. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con ajuste de curva de ARNsi dúplex.
Figura 49. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con ARNsi dúplex que contiene estereo-centros de 3 Fosforotiato.
Figura 50. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con ARNsi dúplex que contiene estereo-centros de ajuste de curva de 3 Fosforotiato.
Figura 51. Superposición de rastros de RP-HPLC de oligonucleótido desactivado de DMT purificado: ONT-108, ONT- 109, y ONT-114.
Figura 52. Superposición de rastros de RP-HPLC de oligonucleótido desactivado de DMT purificado: ONT-106, ONT- 107, y ONT-114.
Figura 53. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 g/kg de dosificación IP de estereoisó ero o mipomersen en ratones huApoB. Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 54. Representación gráfica del curso de tiempo de niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de dosis IP múltiples de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB (n = 3-4). Una flecha hacia abajo indica los dias de dosificación.
Figura 55. Día 17 niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero (ONT-87, ONT-88 o ONT-89) o mipomersen en ratones huApoB.
Figura 56. Día 24 Niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 mg/kg dosificación IP de estereoisómero (ONT-87, ONT-88 o ONT-89) o Mipomersen en ratones huApoB.
Figura 57. Niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 mg/kg de dosificación de estereoisómero (ONT-41, ONT-87, ONT-88 o ONT- 89) en ratones huApoB.
Figura 58. Niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 10 mg/kg de dosificación de estereoisómero (ONT-87, ONT-88 o ONT-89) en ratones huApoB.
Figura 59. Trazo de análisis de cuantificación de IEX-HPLC del estudio de digestión svPDE para oligonucleótidos ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41.
Figura 60. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-75 (All (Rp) ) Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC .
Figura 61. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-77 {Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp , Sp, Sp, Sp , Rp , Rp, Rp, Rp) ~ Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC (5R-10S-4R).
Figura 62. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-80 (All (Sp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCs Gs5mCsAs 5mCs5mC.
Figura 63. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-81 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp , Rp, Rp , Sp, Sp, Sp, Sp)- Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC (5S-10R-4S).
Figura 64. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-87 (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, JRp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp)- Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC (5R-(SSR)3-5R) .
Figura 65. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-88 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5S-(RRS)3-5S).
Figura 66. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-89 (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, RP, Sp)- Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC ((SR)gS).
Figura 61. IEX-HPLC de estudio de digestión enzimática usando nPl para el oligonucleótido ONT-41 ( diastereomezcla ) -Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs 5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC.
Figura 68. Comparación de estabilidad de oligonucleótidos quiralmente puros ONT-75 y ONT-77 con el oligonucleótido "parental" estereoaleatorio" ONT-41 (Mipomersen) en homogenado de hígado completo de rata preincubado.
Figura 69. Perfil de UPLC para producir derivado de oligonucleótido usando el monómero de 13b.
Figura 70. Perfil de UPLC para producir derivado de oligonucleótido usando el monómero de 27.
Figura 71. Niveles de ARNm de Apolipoproteina B/GAPDH Con relación a controles falsos y no tratados después de la transfección de hepatocitos de ratón primario con estereoisómeros (ONT-82, ONT-83, ONT-84, ONT-85 o ONT-86).
Figura 72. Niveles de ARNm de Apolipoproteina B/GAPDH Con relación a controles falsos y no tratados después de la transfección de hepatocitos de ratón primario con estereoisómeros (ONT-83, ONT-84, ONT-85 o ONT-86).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los oligonucleótidos sintéticos proporcionan herramientas moleculares útiles en una amplia variedad de aplicaciones . Por ejemplo, los oligonucleótidos son útiles en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, investigación y nuevos nanomateriales. El uso de ácidos nucleicos que se originan naturalmente (por ejemplo, ADN o ARN no modificado) está limitado, por ejemplo, por su susceptibilidad a endo- y exo-nucleasas. Como tal, varias contrapartes sintéticas han sido desarrolladas para eludir estas deficiencias. Estas incluyen oligonucleótidos sintéticos que contienen modificaciones de armazón, las cuales proporcionan estas moléculas menos susceptibles a degradación. Desde un punto de vista, tales modificaciones a los enlaces de fosfatos internucleótidos introducen quiralidad. Ha llegado a ser claro que ciertas propiedades de oligonucleótidos pueden ser afectadas por las configuraciones de los átomos de fósforo que forman el armazón de los oligonucleótidos. Por ejemplo, estudios in vitro han mostrado que las propiedades de nucleótidos antisentido tales como afinidad de unión, unión especifica de la secuencia al ARN complementario, estabilidad a las nucleasas, son afectadas por, entre otros, la quiralidad del armazón (por ejemplo, las configuraciones de los átomos de fósforo). De este modo, la presente invención abarca el reconocimiento de que existe una necesidad de oligonucleótidos quiralmente controlados los cuales comprenden ácidos nucleicos modificados con átomos de fósforo, asi como también composiciones y métodos relacionados. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados que son estructuralmente optimizados para presentar ciertas características deseables, tales como, por ejemplo, estabilidad incrementada y eficacia mejorada para aplicaciones in vitro y/o in vivo.
Los oligonucleótidos en los cuales uno o dos de los átomos de oxígeno no puenteados del fosfato internucleotídico son reemplazado por un tipo diferente de átomo o sustituyente son conocidos por ser útiles como agente terapéuticos y sondas para elucidar los mecanismos de reacción enzimática. Sin embargo, tales oligonucleótidos a menudo presentan propiedades indeseables (por ejemplo, susceptibilidad a la degradación por las nucleasas, escasa permeabilidad de la membrana celular) que prohíben su uso en numerosas aplicaciones. De este modo, varios tipos de modificaciones químicas han sido desarrollados en un intento por mejorar sus propiedades y/o impartir nueva funcionalidad.
Estructuras de Oligonucleótidos Modificados Como se indica anteriormente, en vista de la utilidad de las composiciones de oligonucleótidos en varias aplicaciones e indicaciones, aquellos expertos en la téenica se han esforzado para desarrollar modificaciones de estructuras de oligonucleótidos que pueden haber sido preferidas o características o atributos deseables comparados con moléculas de oligonucleótido que se originan naturalmente, por ejemplo como se usa en aplicaciones e indicaciones particulares. Ejemplares de tales modificaciones se describen abajo.
El documento W02010/141471 (en la presente "Traversa I") muestra la modificación de diferentes tipos de constructos de ácido nucleico modificados para tener una carga polianiónica pura reducida. El documento W02010/039543 (en la presente "Travera II") muestra composiciones y métodos para elaborar polinucleótidos neutrales (NNs) con carga polianiónica reducida. El documento W02008/008476 (en la presente, "Traversa III") describe la síntesis de profármacos 5 de fosfato SATE (tipo Imbach). Traversa I, II, y III no muestran oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
El documento W02010/072831 (en la presente "Girindus et al".) también muestra la modificación de oligonucleótidos. En particular, Girindus et al. muestra el uso de reactivos de sulfurización para generar triésteres de fosforotioato como profármacos. Girindus et al. no muestra oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
De manera similar, el documento W02004/085454 (en la presente "Avecia I") muestra la preparación de fosforotioato oligonucleótidos a través de, por ejemplo, la sililación temporal de diésteres de poli-H-fosfonato. El documento W02001/027126 (en la presente "Avecia II") muestra procesos para la síntesis de fase sólida de oligonucleótidos de fosfotriéster por acoplamiento de monómeros de íf-fosfonato a un soporte sólido de 5'-hidroxil oligonucleótido y sulforización adicional del diéster de H-fosfonta resultante en un fosforotioato triéster. La descripción del documento W02001/064702 (en la presente "Avecia III") es similar a Avecia II y además describe la síntesis de fase-sólida en diferentes soportes sólidos. Avecia I, II, y III no muestran oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
El documento WO1997/006183 (en la presente "Chiron") muestra oligonucleótidos con enlaces catiónicos de internucleótidos que comprenden fósforo asimétrico, tales como amidatos estereopuros. Chiron muestra oligonucleótidos estereopuros obtenidos mediante cristalización de una mezcla de diaestereómeros o mediante resolución usando, por ejemplo, cromatografía en columna. Chiron no muestra oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
El documento WO2009/146123 (en la presente "Spring Bank I") muestra composiciones y métodos para tratar infecciones virales usando oligonucleótidos de fosfato sustituidos y fosforotioato triésteres. El documento W02007/070598 (en la presente "Spring Bank II") muestra profármacos de fosfotriéster como ácidos nucleicos antivirales y muestra la sintesis de profármacos de fosforotioato. Spring Bank I y II no muestra oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
El documento EP0779893 (en la presente "Hybridon") muestra profármacos lipofilicos para la absorción celular incrementada de oligonucleótidos antisentido y observa que los dímeros de fosforotioatos y fosforotioato triéster Ep y Sp pueden tener diferentes propiedades de estabilidad enzimática. Hybridon no muestra oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
El documento WO1997/047637 (en la presente "Imbach I") muestra en general las composiciones y métodos de oligonucleótido de profármaco Imbach "SATE" (S-acil tioetilo) . Imbach I describe, por ejemplo, profármacos de fosfotriéster biorreversibles y la preparación de ciertos oligonucleótidos de profármacos usando fosforamiditas que contienen grupo de profármaco o alquilación post-sintética. El documento US 6,124,445 (en la presente "Imbach II") muestra oligonucleótidos de profármaco quiméricos y antisentido modificados. Imbach I y II no muestra oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
El documento W02006/065751 (en la presente "Beaucage") muestra CpG profármacos de fosforotioato de oligonucleótidos que comprenden sustituyente termolábiles (en los cuales los sustituyentes son introducidos mediante un monómero de fosforamidita), y aplicaciones de los mismos. Beaucage no muestra oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe por la presente invención.
Takeshi Wada et al. desarrollaron nuevos métodos para la síntesis estereo-controlada de ácidos nucleicos quirales-P usando auxiliares quirales de amidita (documentos JP4348077, W02005/014609, W02005/092909, y W02010/064146, cumulativamente referidos como "Wada I"). En particular, el documento W02010/064146 (referido en la presente como "Wada II") describe métodos para sintetizar ácidos nucleicos modificados con átomos de fósforo en donde la configuración estereoquímica en fósforo es controlada. Sin embargo, los métodos de Wada II están limitados en que no proporcionan odificación-P individual de cada fósforo de enlace quiral en una manera controlada y designada. Es decir, los métodos para enlaces modificados-P de Wada II proporcionan la generación de una hebra de polinucleótido poli Jí-fosfonato intermediaria condensada que, una vez construida a una longitud deseada, es modificada de masa en el enlace de fósforo para proporcionar, por ejemplo, un fosforotioato diéster deseado, fosforamidato o boranofosfato u otros de tales ácidos nucleicos modificados con átomos de fósforo (referidos como Ruta B en el documento - Esquema de reacción 6, página 36). Además, las hebras de oligonucleótidos de Jí-fosfonato de Wada II son de longitudes más cortas (por ejemplo, dímero, trímero, o tetrámero). Combinado con el hecho de que no existe etapa de tapado en la ruta B, la cual en general presenta baja pureza cruda como un resultado de la construcción de subproductos de tipo "n-1", la ruta de Wada II contiene limitaciones con respecto a la síntesis de oligonucleótidos más largos. Mientras Wada II contempla en general que un oligonucleótido particular podría ser contemplado para contener diferentes modificaciones en cada enlace de fósforo, Wada II no describe o sugiere métodos para la instalación iterativa controlada de tales modificaciones, como se describe en la presente. En la magnitud de que Wada II represente un ciclo sintético que no requiere un oligonucleótido intermediario de H-fosfonato para ser completamente ensamblado previo a la modificación en el enlace de fósforo (en este referido como Ruta A, página 35, Esquema de reacción 5, "Síntesis de un ácido nucleico que comprende una porción de X-fosfonato quiral de fórmula 1 mediante la Ruta A"), esta descripción general no muestra ciertas etapas claves que son requeridas para instalar ciertas modificaciones-P, como se proporciona por la presente invención, y especialmente sin algún grado de eficiencia y versatilidad de manera que este ciclo podría ser útil en la síntesis de oligonucleótidos modificados-P quiralmente controlados, y especialmente oligonucleótidos de longitudes más largas.
Al menos una de tal ineficiencia de Wada II se nota por Wada et al. en el documento WO2012/039448 (en la presente "Wada III"). Wada III muestra nuevos auxiliares quirales para uso en los métodos para producir oligonucleótidos de H- fosfonato de Wada II que, una vez construidos, pueden ser subsecuentemente modificados para proporcionar, entre otros, fosforotioatos y similares. Wada et al. observa en Wada III que los cuatro tipos de auxiliares quirales descritos en Wada II forman enlaces fuertes con fósforo en el enlace de fósforo y de este modo no permiten la remoción eficiente. Wada III observa que la remoción de auxiliares quirales de Wada II requiere condiciones bruscas, en las cuales las condiciones son propensas para comprometer la integridad del oligonucleótido del producto. Wada III observa que esto es especialmente problemático cuando se sintetizan oligonucleótidos de cadena larga por al menos la razón de que la(s) reacción(es) de degradación proceden, se generan subproductos adicionales que pueden reaccionar además con y degradar el oligonucleótido del producto. Wada III por lo tanto proporciona auxiliares quirales que pueden ser más eficientemente desdoblados del oligonucleótido bajo condiciones acídicas leves por medio de un mecanismo de SN1 de liberación del enlace internucleótido de H-fosfonato (ruta B), o bajo condiciones básicas relativamente leves, por una trayectoria de eliminación-b.
Uno de habilidad en las artes químicas y sintéticas apreciará inmediatamente que las complejidades asociadas con la generación de oligonucleótidos quiralmente controlados tales como aquellos proporcionados por la presente invención. Por ejemplo, con el fin de sintetizar y aislar un oligonucleótido quiralmente controlado, las condiciones para cada adición de monómero deben ser designadas de manera que (1) la química es compatible con cada porción del oligonucleótido de crecimiento; (2) los subproductos generados durante cada adición de monómero no comprometen la integridad estereoquímica y estructural del oligonucleótido de crecimiento; y (3) la composición de producto final crudo es una composición la cual permite el aislamiento del producto de oligonucleótido quiralmente controlado deseado.
Los fosforotioatos de oligonucléotidos han mostrado potencial terapéutico (Stein et al . , Science (1993), 261:1004-12; Agrawal et al . , Antisence Res. and Dev. (1992), 2:261-66; Bayever et al., Antisense Res. and Dev. (1993), 3:383-390). Los fosforotioatos de oligonucléotidos preparados sin relación a la estereoquímica de los fosforotioatos existen como una mezcla de diastereómeros 2n, donde n es el número de enlaces de fosforotioatos internucleótidos. Las propiedades químicas y biológicas de estos fosforotioatos diastereoméricos pueden ser distintas. Por ejemplo, Wada et al (Nucleic Acids Symposium Series No. 51 p. 119-120; doi:10.1093/nass/nrm060) encontró que el duplo estereodefinido-(p) -(Ups)9U/(Ap)9A mostró un valor Tm superior que aquel del (Up)9U/(Ap)9A-natural y (Sp)-(Ups)9U- estereodefinido que no forma un duplo. En otro ejemplo, en un estudio por Tang et al . , (Nucleosides Nucleotides (1995), 14:985-990) fosforotioatos de Rp-oligodeoxirribonucleósidos Estereopuros se encontraron por poseer estabilidad inferior a endonucleasas endógenas al suero humano que a los fosforotioatos de oligodesoxirribonucleósido precursor con quiralidad de fósforo no definida.
Oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados La presente invención proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados, y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados las cuales son de alta pureza cruda y de alta pureza diastereomérica. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados, y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados las cuales son de alta pureza cruda. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados, y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados las cuales son de alta pureza diastereomérica.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones quiralmente controladas que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos de al menos un tipo, en donde cada tipo es definido por: 1) secuencia base; 2) patrón de enlaces de armazón; 3) patrón de centros quirales de armazón; y 4) patrón de modificaciones-P de armazón.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones quiralmente controladas que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos del mismo tipo, en donde cada tipo es definido por: 1) secuencia base; 2) patrón de enlaces de armazón; 3) patrón de centros quirales de armazón; y 4) patrón de modificaciones-P de armazón. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones quiralmente controladas que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos de dos o más tipos, en donde cada tipo es definido por: 1) secuencia base; 2) patrón de enlaces de armazón; 3) patrón de centros quirales de armazón; y 4) patrón de modificaciones-P de armazón.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros con respecto al fósforo de enlace quiral. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros que tienen la estructura de fórmula I. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros con respecto al fósforo de enlace quiral, y uno o más enlaces de fosfato diéster. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros que tienen la estructura de fórmula I, y uno o más enlaces de fosfato diéster. En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros que tienen la estructura de fórmula I-c, y uno o más enlaces de fosfato diéster. En algunas modalidades, tales oligonucleótidos son preparados usando sintesis de oligonucleótido estereoselectiva, como se describe en esta solicitud, para formar enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros pre-diseñados con respecto al fósforo de enlace quiral. Por ejemplo, en un oligonucleótido ejemplar de (Rp/Sp, Rp/Sp, Rp/Sp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp) -d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGslCslAslCsC], los primeros tres enlaces internucleotidicos son construidos usando el método de sintesis de oligonucleótido tradicional, y los enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros son construidos con control estereoquímico como se describe en esta solicitud. Enlaces internucleotidicos ejemplares, que incluyen aquellos que tienen estructuras de fórmula I, son además descritos abajo. En algunas modalidades, tales oligonucleótidos comprenden una secuencia adicional descrita en la solicitud, que incluye pero no se limita a aquellas descritas en las Tablas 2 y 4, y Apéndices A, B y C.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una combinación de enlaces internucleotidicos estereopuros y estereoaleatorios con respecto a la quiralidad en el enlace de fósforo. Por ejemplo, en algunas modalidades es deseable tener un bloque de uno o más enlaces internucleotidicos estereodefinidos dentro de un oligonucleótido que es de otro modo estereoaleatorio con respecto a la quiralidad en el enlace de fósforo. En algunas modalidades, es deseable tener un bloque de uno o más enlaces internucleotídicos que son estereoaleatorios dentro de un oligonucleótido que es de otro modo estereodefinido con respecto a la quiralidad en el enlace de fósforo.
En algunas modalidades, al menos una unidad nucleotidica de un oligonucleótido proporcionado es instalada usando síntesis de oligonucleótido estereoselectiva, como se describe en esta solicitud, para formar un enlace internucleotídico diastereoméricamente puro pre-diseñado con respecto al fósforo de enlace quiral. En algunas modalidades, al menos dos unidades de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado son instaladas usando síntesis de oligonucleótido estereoselectiva, como se describe en esta solicitud, para formar al menos dos enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros pre-diseñados con respecto al fósforo de enlace quiral. En algunas modalidades, al menos tres unidades de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado son instaladas usando síntesis de oligonucleótido estereoselectiva, como se describe en esta solicitud, para formar al menos tres enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros pre-diseñados con respecto al fósforo de enlace quiral. En algunas modalidades, al menos uno, dos, o tres enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros pre-diseñados son adyacentes entre sí. En algunas modalidades, al menos uno, dos, o tres enlaces internucleótidos diastereoméricamente puros pre-diseñados no son adyacentes entre si.
En algunas modalidades, al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% de las unidades nucleotidicas de un oligonucleótido proporcionado son instaladas usando síntesis de oligonucleótido estereoselectiva, como se describe en esta solicitud, para formar un enlace internucleotídico diastereoméricamente puro pre-diseñado con respecto al fósforo de enlace quiral. Como se describe en la presente, en algunas modalidades al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% de las unidades de nucleótido ocurren en uno o más bloques para proporcionar un blockmero. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% de las unidades de nucleótido ocurren en un patrón de alternación para proporcionar unn altmero. Uno de habilidad en las téenicas relevantes reconocerá que cualquier patrón deseable se puede lograr usando métodos de la presente invención y están contemplados en la presente.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes estereoquímicas y/o diferentes modificaciones-P relativas entre sí. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos un enlace internucleotidico de fosforotioato diéster. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico fosforotioato triéster. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos un enlace internucleotidico fosforotioato triéster.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados independientemente que tienen la estructura de fórmula I: (I) en donde cada variable es como se define y describe abajo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados de fórmula I, y en donde enlaces internucleotidicos individuales de fórmula I dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados de fórmula I, y en donde enlaces internucleotidicos individuales de fórmula I dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes -X-L-R1 relativas entre si. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados de fórmula I, y en donde enlaces internucleotidicos individuales de fórmula I dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes X relativas entre si. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados de fórmula I, y en donde enlaces internucleotidicos individuales de fórmula I dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes -L-R1 relativas entre si.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes estereoquímicas y/o diferentes modificaciones-P relativas entre sí. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes estereochemistry relativas entre sí, y en donde al menos una porción de la estructura del oligonucleótido quiralmente controlado se caracteriza por un patrón de repetición de estereoquímica alterna.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes modificaciones-P relativas entre si, en que tienen diferentes átomos de X en sus porciones -XLR1, y/o en que tienen diferentes grupos L en sus porciones -XLR1, y/o que tienen sus diferentes átomos de R1 en sus porciones -XLR1.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotidicos individuales dentro de los oligonucleótidos tienen diferentes estereoquímicas y/o diferentes modificaciones-P relativas entre sí y el oligonucleótido tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: [SBnlRBn2SBn3RBn4 . . SBnxRBny] en donde: cada RB representa independientemente un bloque de unidades nucleotídicas que tienen la configuración R en el enlace de fósforo; cada SB representa independientemente un bloque de unidades nucleotídicas que tiene la configuración S en el enlace fósforo; cada uno de nl-ny es cero o un número entero, con el requerimiento que al menos un n impar y al menos uno incluso n debe ser no cero demanera que el oligonucleótido incluye al menos dos enlaces internucleotidicos individuales con diferentes estereoquímicas relativas entre si; y en donde la suma de nl-ny es entre 2 y 200, y en algunas modalidades es entre un límite inferior seleccionado a partir del grupo que consiste de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más y un límite superior seleccionado a partir del grupo que consiste de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, y 200, el límite superior es más grande que el límite inferior.
En algunas de tales modalidades, cada n tiene el mismo valor; en algunas modalidades, cada incluso n tiene el mismo valor como cada incluso otro n; en algunas modalidades, cada n impar tiene el mismo valor que cada otro n impar; en algunas modalidades, al menos dos incluso ns tienen diferentes valores de entre sí; en algunas modalidades, al menos dos ns impares tienen diferentes valores de entre sí.
En algunas modalidades, al menos dos ns adyacentes son iguales a otro, de manera que un oligonucleótido proporcionado incluye bloques adyacentes de enlaces de estereoquímica S y enlaces de estereoquímica R de longitudes iguales. En algunas modalidades, oligonucleótidos proporcionados incluyen bloques de repetición de S y enlaces de estereoquímica R de longitudes iguales. En algunas modalidades, oligonucleótidos proporcionados incluyen bloques de repetición de S y enlaces de estereoquímica R, donde al menos dos de tales bloques son de diferentes longitudes de entre sí; en algunas de tales modalidades bloque de estereoquímica S es de la misma longitud, y es de una longitud diferente a partir de cada longitud de estereoquímica R, la cual puede ser opcionalmente de la misma longitud como la otra.
En algunas modalidades, al menos dos ns de saltos adyacentes son iguales a otro, de manera que un oligonucleótido proporcionado incluye al menos dos bloques de enlaces de una primera estereoquímica que son iguales en longitud a otro y son separados por un bloque de enlaces de la otra estereoquímica, en la cual el bloque de separación puede ser de la misma longitud o una longitud diferente a partir de los bloques de la primera estereoquímica.
En algunas modalidades, ns asociado con los bloques de enlace en los extremos de un oligonucleótido proporcionado son de la misma longitud. En algunas modalidades, oligonucleótidos proporcionados tienen bloques terminales de la misma estereoquímica de enlace. En algunas de tales modalidades, los bloques terminales son separados de entre sí por un bloque medio de la otra estereoquímica de enlace.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] es un estereoblockmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] es un estereoskipmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] es un estereoaltmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] es un gapmero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] es de cualquiera de los patrones descritos anteriormente y comprende además patrones de modificaciones-P. Por ejemplo, en algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] y es un estereoskipmero y skipmero de modificación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] y es un estereoblockmero y almero de modificación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] y es un estereoaltmero y blockmero de modificación-P.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado de fórmula [SBnlRBn2SBn3RBn4..SBnxRBny] es un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados independientemente que tienen la estructura de fórmula I: (I) en donde: P* es un átomo de fósforo asimétrico y es ya sea p o Sp; W es 0, S o Se; cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S-, -N(-L-R1) o L; L es un enlace covalente o un alquileno Ci-Cio lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, — CºC— , -c(R')2-, -Cy-, -0-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, —C(S)—, -C(NR')-, - C (0)N (R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N (R')C(0)0-, 0C (0)N(R')-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, - SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o -C(0)0-; R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -0-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(0)- , -C(S)-, -C(NR')-, -C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(0)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, - N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, O -C(0)0-; cada R' es independientemente -R, -C(0)R, -CO2R, o - S02R, O: dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterocielico opcionalmente sustituido, o dos R'en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbociclico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido; -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado a partir de fenileno, carbociclíleño, arileno, heteroarileno, o heterociclileno; cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático Ci-C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo; y cada representa independientemente una conexión a un nucleósido.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende uno o más enlaces de fósforo internucleotidicos modificados. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende, por ejemplo, un fosforotioato o un enlace de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende un enlace de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos dos enlaces de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos tres enlaces de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos cuatro enlaces de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos cinco enlaces de fosforotioato triéster. Ejemplares de tales enlaces de fósforo internucleotidicos modificados se describen además en la presente .
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende diferentes enlaces de fósforo internucleotidicos. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos un enlace internucleotidico modificado. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos un enlace de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos dos enlaces de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos tres enlaces de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos cuatro enlaces de fosforotioato triéster. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de fosfato diéster y al menos cinco enlaces de fosforotioato triéster. Ejemplares de tales enlaces de fósforo internucleotidicos modificados se describen además en la presente.
En algunas modalidades, un enlace de fosforotioato triéster comprende un auxiliar quiral, el cual, por ejemplo, es usado para controlar la estereoselectividad de una reacción. En algunas modalidades, un enlace de fosforotioato triéster no comprende un auxiliar quiral. En algunas modalidades, un enlace de fosforotioato triéster es intencionalmente mantenido hasta y/o durante la administración a un sujeto.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado está ligado a un soporte sólido. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es desdoblado a partir de un soporte sólido.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de fosfato diéster y al menos dos enlaces internucleotidicos modificados consecutivos. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de fosfato diéster y al menos dos enlaces internucleotidicos de fosforotioato triéster consecutivos.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un blockmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un estereoblockmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un bloque de modificación-Pmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un blockmero de enlace.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un altmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un estereoaltmero . En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un altmero de modificación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un altmero de enlace.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un unímero. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un estereounimero. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un unimero de modificación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un unimero de enlace.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un gapmero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es un skipmero.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotidicos modificados independientemente que tienen la estructura de fórmula I: 1 (I) en donde: P* es un átomo de fósforo asimétrico y es ya sea Rp o Sp; W es 0, S o Se; cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S- , -N (-L-R1) o L; L es un enlace covalente o un alquileno Ci-Cio lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci~C6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -0-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, - C(0)N(R')—, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)0-, OC(0)N (R')-, -S(0)-, -S(O)2-, -S(0)2N(R')-, -N (R')S(0)2-, - SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o -C(0)0-; R1 es halógeno, R, o un alifático Ci-C50 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R') -N(R')S(0)2-, -SC(0) —C(O)S-, -OC(O)—, o -C(0)0-; cada R' es independientemente -R, -C(0)R, -CO2R, o - S02R, O: dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterocielico opcionalmente sustituido, o dos R' en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbociclico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido; -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado a partir de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno, o heterociclileno; cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático Ci~C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo; y cada representa independientemente una conexión a un nucleósido.
Como se define en general anteriormente y en la presente, P* es un átomo de fósforo asimétrico y es ya sea Rp o Sp. En algunas modalidades, P* es Rp. En otras modalidades, P* es Sp. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleotidicos de fórmula I en donde cada P* es independientemente Rp o Sp. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleotidicos de fórmula I en donde cada P* es Rp . En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleotidicos de fórmula I en donde cada P* es Sp. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde P* es Rp . En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde P* es Sp. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde P* es Rp, y al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde P* es Sp.
Como se define en general anteriormente y en la presente, W es 0, S, o Se. En algunas modalidades, W es 0. En algunas modalidades, W es S. En algunas modalidades, W es Se. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde W es 0. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde W es S. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotidico de fórmula I en donde W es Se.
Como se define en general anteriormente y en la presente, cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático C1-C6, fenilo, carbocielilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo.
En algunas modalidades, R es hidrógeno. En algunas modalidades, R es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático Ci-C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo.
En algunas modalidades, R es un alifático C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un alquilo Ci-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es hexilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es pentilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es butilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es propilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es etilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es metilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es fenilo sustituido. En algunas modalidades, R es fenilo.
En algunas modalidades, R es carbociclilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es carbociclilo C3-C10 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es carbociclilo monociclico opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es cicloheptilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es ciclohexilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es ciclopentilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es ciclobutilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un ciclopropilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es carbociclilo biciclico opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R es un arilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un anillo arilo biciclico opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R es un heteroarilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo monociclico de 5-6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, azufre, u oxigeno. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo monociclico de 5-6 elementos sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo monociclico de 5-6 elementos no sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, azufre, u oxigeno.
En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo monociclico de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo monocielico de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo monociclico de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es seleccionado a partir de pirrolilo, furanilo, o tienilo.
En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1 nitrógeno átomo, y un heteroátomo adicional seleccionado a partir de azufre o oxigeno. Grupos R ejemplares incluyen pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo o isoxazolilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo de 6 elementos que tiene 1-3 átomos de nitrógeno. En otras modalidades, R es un anillo heteroarilo de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 átomos de nitrógeno. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 átomos de nitrógeno. En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1 nitrógeno. Grupos R ejemplares incluyen piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo, o tetrazinilo opcionalmente sustituido.
En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo bicielico de 8-10 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En otras modalidades, R es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un indolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un azabiciclo[3.2.1]octanilo opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo 5-6- fusionado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un azaindolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un bencimidazolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un benzotiazolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un benzoxazolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un indazolilo opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
En ciertas modalidades, R es un anillo heteroarilo 6,b-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En otras modalidades, R es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un quinolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un isoquinolinilo opcionalmente sustituido. De conformidad con un aspecto, R es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R es una quinazolina o una quinoxalina.
En algunas modalidades, R es un heterocielilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 3-7 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 3-7 elementos sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 3-7 elementos no sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
En algunas modalidades, R es un heterocielilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado, de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado, de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 átomo de oxígeno.
En ciertas modalidades, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 elementos que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En ciertas modalidades, R es oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, oxepanilo, aziridinilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, azepanilo, tiiranilo, tietanilo, tetrahidrotiof enilo, tetrahidrotiopiranilo, tiepanilo, dioxolanilo, oxatiolanilo, oxazolidinilo, imidazolidinilo, tiazolidinilo, ditiolanilo, dioxanilo, morfolinilo, oxatianilo, piperazinilo, tiomorfolinilo, ditianilo, dioxepanilo, oxazepanilo, oxatiepanilo, ditiepanilo, diazepanilo, dihidrofuranonilo, tetrahidropiranonilo, oxepanonilo, pirolidinonilo, piperidinonilo, azepanonilo, dihidrotiofenonilo, tetrahidrotiopiranonilo, tiepanonilo, oxazolidinonilo, oxazinanonilo, oxazepanonilo, dioxolanonilo, dioxanonilo, dioxepanonilo, oxatiolinonilo, oxatianonilo, oxatiepanonilo, tiazolidinonilo, tiazinanonilo, tiazepanonilo, imidazolidinonilo, tetrahidropirimidinonilo, diazepanonilo, imidazolidindionilo, oxazolidindionilo, tiazolidindionilo, dioxolandionilo, oxatiolandionilo, piperazindionilo, morfolindionilo, tiomorfolindionilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, tetrahidrotiofenilo, o tetrahidrotiopiranilo. En algunas modalidades, R es un anillo heterocielico saturado o parcialmente insaturado, de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En ciertas modalidades, R es un anillo monocíclico parcialmente insaturado de 5-6 elementos, opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En ciertas modalidades, R es un grupo tetrahidropiridinilo, dihidrotiazolilo, dihidrooxazolilo, u oxazolinilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R es un anillo heterocielico saturado o parcialmente insaturado, de 8-10 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R es un indolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es un isoindolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R es una 1,2,3,4-tetrahidroquinolina opcionalmente sustituida. En algunas modalidades, R es una 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina opcionalmente sustituida.
Como se define en general anteriormente y en la presente, cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2R, o - S02R, O: dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterociclico opcionalmente sustituido, o dos R' en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbocielico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R' es -R, -C(0)R, -CO2R, o -SO2R, en donde R es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, R' es -R, en donde R es como se define y describe anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, R' es hidrógeno.
En algunas modalidades, R' es -C(O)R, en donde R es como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R' es -CO2R, en donde R es como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R' es -SO2R, en donde R es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterociclico opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, dos R' en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbociclico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido.
Como se define en general anteriormente y en la presente, -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado a partir de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno, o heterociclileno.
En algunas modalidades, -Cy- es fenileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, -Cy- es carbocielileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, -Cy- es arileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, -Cy- es heteroarileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, -Cy- es heterociclileno opcionalmente sustituido.
Como se define en general anteriormente y en la presente, cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S-, -N(—L-R1)-, o L, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se define anteriormente y describe posteriormente .
En algunas modalidades, X es -O-. En algunas modalidades, X es -S-. En algunas modalidades, X es -0- o S-. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde X es -0-. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde X es —S—. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde X es -0-, y al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde X es -S-. En algunas modalidades, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde X es -0-, y al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde X es -S-, y al menos un enlace internucleotídico de fórmula I en donde L es un alquileno Ci-Cio lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, CºC , - C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, - C(NR')~, -C(0)N (R') -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(0)-, - - - - N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)s-, -0C(0)-, o -C(0)0-.
En algunas modalidades, X es -Ní-L-R1)-. En algunas modalidades, X es -NCR1)-. En algunas modalidades, X es -N(R' )-. En algunas modalidades, X es -N(R)-. En algunas modalidades, X es -NH-.
En algunas modalidades, X es L. En algunas modalidades, X es un enlace covalente. En algunas modalidades, X es o un alquileno Ci-Cio lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6,—CºC—r -c(R')2-, -Cy-, -0-, -S-, -S-S-, - N(R')-, -C(0)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(0)N(R')-, N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, - S(0)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R )S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o -C(0)0—. En algunas modalidades, X es un alquileno Ci-Cio opcionalmente sustituido o alquenileno Ci-Ci0. En algunas modalidades, X es metileno. algunas modalidades, Y es -0-. En algunas modalidades, Y es -S-.
En algunas modalidades, Y es -N (-L-R1)-. En algunas modalidades, Y es -NÍR1)-. En algunas modalidades, Y es -N(R')-. En algunas modalidades, Y es -N(R)-. En algunas modalidades, Y es -NH-.
En algunas modalidades, Y es L. En algunas modalidades, Y es un enlace covalente. En algunas modalidades, Y es o un alquileno C1-C10 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C!-C6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C (0)N (R')-, N(R' )C(O)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N (R')-, - S ( O )-, -S(0)2-, -s(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o —C(0)0—. En algunas modalidades, Y es un alquileno Ci-Cio opcionalmente sustituido o alquenileno Ci-Cio. En algunas modalidades, Y es metileno.
En algunas modalidades, Z es -0-. En algunas modalidades, Z es -S-.
En algunas modalidades, Z es -Ní-L-R1)-. En algunas modalidades, Z es -NÍR1)-. En algunas modalidades, Z es - N(R')-. En algunas modalidades, Z es -N (R)-. En algunas modalidades, Z es -NH-.
En algunas modalidades, Z es L. En algunas modalidades, Z es un enlace covalente. En algunas modalidades, Z es o un alquileno C1-C10 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, cºc , -C(R')2~, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')~, N(R' )C(0)N(R )-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, - S (O)-, -S(O)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o —C(0)0—. En algunas modalidades, Z es un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido o alquenileno C1-C10. En algunas modalidades, Z es metileno.
Como se define en general anteriormente y en la presente, L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, — CºC— , -C(R')2~ , -Cy-, -0-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(0)-, -C(S)-, -C(NR')-, - C(0)N(R')- -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(O)O-, - OC(O)N(R')-, -S(0)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, - SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o -C(0)0-.
En algunas modalidades, L es un enlace covalente. En algunas modalidades, L es un alquileno C1-C10 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, cºc , -C(R')2- , -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-f -C(NRf) -C(O)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N (Rf)C(O)O-, - 0C(0)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, - SC(O)-, -C(0)S-, -OC(O)-, o -C(0)0-.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de -L1-V-, en donde: L1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alquileno Ci-C6, alquenileno C1-C6, carbocielileno, arileno, heteroalquileno Ci-C6, heterociclileno, y heteroarileno; V es seleccionado a partir de -O-, -S-, -NR'-, C(R')2, -S-S-, - - o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alquileno Ci-C6, arileno, heteroalquileno C1-C6, heterociclileno, y heteroarileno; A es =0, =S, =NR', o =C(R')2; cada uno de B y C es independientemente -O-, -S-, NR'-, -C(R' ) 2~ o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alquileno C1-C6, carbocielileno, arileno, heterociclileno, o heteroarileno; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L1 es En algunas modalidades, L1 es en donde el Anillo Cy' es un arileno, carbociclileno, heteroarileno o heterociclileno opcionalmente sustituido En algunas modalidades, L1 es opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, L es En algunas modalidades, L1 está conectado a X. En algunas modalidades, L1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de y el átomo de azufre está conectado a V. En algunas modalidades, L1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de y el átomo de carbono está conectado a X.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2~; es un enlace sencillo o doble; los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo arilo, carbocielico, heteroarilo, heterociclico opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es ? , -S- o -NR'; es un enlace sencillo o doble; y los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocielico, carbociclico C3-Cio, arilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-? D es =N-, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)-, =0(1)-, =C (CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2~(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: / en donde: G es -O-, -S-, o -NR'; D es =N-, =C(F)-, =C (Cl) =C(Br)-, =C(I)-, C(CN)-, =C(N02)-, =C(C02-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)- En algunas modalidades, L tiene la estructura de en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-; D es =N—, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)-, =C(I)—, =C (CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -0-, -S-, o -NR'; D es =N-, =C(F) =C(C1)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN) C(N02)-, =C(C02-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: r en donde: E es -0-, -S-, -NR'- o -C(R')2-; == es un enlace sencillo o doble; los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocíclico carbocielico C3-C10, arilo opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -O-, -S-, o -NR'; es un enlace sencillo o doble; los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocíclico, carbociclico C3-Ci0, arilo opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -0-, -S-, -NR'- o -C(R')2-; D es =N-, =C(F)-, =C (Cl)-, =C(Br)-, =C (I) =C(CN) =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático Ci-Ce))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -O-, -S-, o -NR'; D es =N—, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)-, 'C(I)-, =C(CN)-, =C(N02)-, =C(C02~(alifático Ci-C6)) o =C(CF3) ¡ y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-; D es =N-, =C(F)-, =C(C1)~, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)- , =C(N02)-,—C(C02-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define 5 anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -O-, -S-, o -NR' ; D es =N-f =C(F) =C(C1)-, =C(Br)-, =C(I)—, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-; es un enlace sencillo o doble; los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocielico, carbociclico C3-C10, arilo opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: t en donde: G es -O-, -S-, o -NR'; es un enlace sencillo o doble; los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocíclico, carbocíclico C3-Ci0, arilo opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R' ) 2~; D es =N-, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)- , =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -0-, -S-, o -NR'; D es =N-, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)~, =C(I)-, =C(CN) C(N02)-, =C(C02-(alifático Ci-C6))~, o =C(CF3)-; y R' es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-; D es =N-, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)- , =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -0-, -S-, o -NR'; D es =N-, =C(F)-, =C(C1)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)- , =C(N02)-, =C(C02-(alifático Ci-C6))-, o =C(CF3)-; y R' es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde el anillo fenilo es opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, el anillo fenilo no es sustituido. En algunas modalidades, el anillo fenilo es sustituido.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde el anillo fenilo es opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, el anillo fenilo no es sustituido. En algunas modalidades, el anillo fenilo es sustituido .
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: es un enlace sencillo o doble; y los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocielico, carbociclico C3-Cio, arilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde: G es -O-, -S-, o -NR'; es un enlace sencillo o doble; y los dos RL1 son tomados junto con los dos átomos de carbono a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocielico, carbociclico C3-C10, arilo opcionalmente sustituido.
Como se define en general anteriormente y en la presente, E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-, en donde cada R' independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, E es -O-, -S-, o -NR'-.
En algunas modalidades, E es -0-, -S-, o -NH-. En algunas modalidades, E es -0-. En algunas modalidades, E es -S-. En algunas modalidades, E es -NH-.
Como se define en general anteriormente y en la presente, G es -0-, -S-, o -NR', en donde cada R' independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, G es -0-, -S-, o -NH-.
En algunas modalidades, G es -0-. En algunas modalidades, G es -S-. En algunas modalidades, G es -NH-.
En algunas modalidades, L es -L3-G-, en donde: L3 es un alquileno o alquenileno C1-C5 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -O-, -S- ,-N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NRf)-, -S(O)-, -S(0)2-, o; y en donde cada uno de G, R' y el Anillo Cy' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L es -L3-S-, en donde L3 es como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L es -L3-O-, en donde L3 es como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L es -L3-N(R')-, en donde cada uno de L3 y R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L es -L3-NH-, en donde cada uno de L3 y R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L3 es un alquileno o alquenileno C5 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente - - -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, - - - , y cada uno de R' y el Anillo Cy' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L3 es un alquileno C5 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades -L3-G- es En algunas modalidades, L3 es un alquileno o alquenileno C4 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -O-, - - - -C(O)-, —C(S)—, -C(NR')-, -S(O)-, - S(0)2-, ,y cada uno de R' y Cy' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
- - - En algunas modalidades, L3 es un alquileno o alquenileno C3 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -0-, -S-,-N(R')-, -C(0)-, -C(S)-, -C(NR')-, -S(0)-, - S(0)2-, o y cada uno de R' y Cy' es independientemente como e define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L3-G- es En algunas modalidades, L es En algunas modalidades, - - g , En algunas modalidades, L3 es un alquileno o alquenileno C2 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -O-, -S-,-N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, —S(O)—, —S(O)2 o (tf , y cada uno de R' y Cy' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L3-G- en donde cada uno de G y Cy' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L es En algunas modalidades, L es -L4-G-, en donde L4 es un alquileno Ci-C2 opcionalmente sustituido; y G es como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L es -L4-G-, en donde L4 es un alquileno Ci-C2 opcionalmente sustituido; G es como se define anteriormente y describe en la presente; y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es -L4-G-, en donde L4 es un metileno opcionalmente sustituido; G es como se define anteriormente y describe en la presente; y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es -L4-G-, en donde L4 es metileno; G es como se define anteriormente y describe en la presente; y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es -L4-G-, en donde L4 es un-(CH2)2- opcionalmente sustituido; G es como se define anteriormente y describe en la presente; y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es -L4-G-, en donde L4 es - (CH2)2-; G es como se define anteriormente y describe en la presente; y G está conectado a R1.
En algunas modalidades, 5 donde G es como se define anteriormente y describe en la presente, y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es ¾ , en donde G es 1c5o0mo se define anteriormente y describe en la presente, y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es , en donde G es como se define anteriormente y describe en la presente, y G está conectado a R1. En algunas modalidades, L es r en donde el átomo de azufre está conectado a R1. En algunas modalidades, L es f en donde el átomo de oxigeno está conectado a R1.
En algunas modalidades, L es , en donde G es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L es -S-RL3- o -S-C(0)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C9, lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC- , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, - C ( O )-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, - N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N (R')-, -S(O)-, -S(0)2-, - S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o - C(0)0-, en donde cada uno de R' y -Cy- es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, L es -S-RL3- o -S-C(0)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno Ci-C6, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, L es -S-RL3- o -S-C(0)-RL3-, en donde RL3 es un alquenileno C1-C6 opcionalmente sustituido, En algunas modalidades, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquenileno, arileno o heteroarileno Ci-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, En algunas modalidades, RL3 es un-S-(alquenileno Ci-C6)-, -S-(alquileno Ci-C6)-, -S-(alquileno Ci-C6)-arileno-(alquileno Ci-C6)-, -S- CO-arileno- (alquileno Ci-C6)-, o -S-CO-(alquileno Ci-C6)~ arileno- (alquileno C.-C6)- opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, L es “ En algunas modalidades, L es En algunas modalidades, L es . En algunas modalidades, En algunas modalidades, el átomo de azufre en las modalidades descritas anteriormente y en la presente de L está conectado a X. En algunas modalidades, el átomo de azufre en las modalidades descritas anteriormente y en la presente de L está conectado a R1.
Como se define en general anteriormente y en la presente, R1 es halógeno, R, o un alifático Ci-C50 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — C=C— , _C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')~, - C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C (O)N (R')-, -N(Rf)C(O)N(R')-, - N(R')C(O)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(O)-, -S(0)2-, - S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o - C(0)0-, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC- , —C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, - C(0)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, - N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -0C(O)N(R')- -S(O)-, -S(O)2-, - S(0)2N(R')~, —N(R')S(0)2—, -SC(O) -C(0)S-, —OC(O)—, o -C(0)0-, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, R1 es hidrógeno. En algunas modalidades, R1 es halógeno. En algunas modalidades, R1 es -F. En algunas modalidades, R1 es -C1. En algunas modalidades, R1 es -Br. En algunas modalidades, R1 es -I.
En algunas modalidades, R1 es R en donde R es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, R1 es hidrógeno. En algunas modalidades, R1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático C1-C50, fenilo, carbocielilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo.
En algunas modalidades, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un alifático Ci-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un alquilo Ci-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es hexilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es pentilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es butilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es propilo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es etilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es metilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R1 es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es fenilo sustituido. En algunas modalidades, R1 es fenilo.
En algunas modalidades, R1 es carbocielilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es carbociclilo C3-C10 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es carbociclilo monociclico opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es cicloheptilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es ciclohexilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es ciclopentilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es ciclobutilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un ciclopropilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es carbociclilo biciclico opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R1 es un hidrocarburo policiclico C1-C50 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un hidrocarburo policiclico Ci-C50 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno O-Ob opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC— , _C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, - C ( O )-, -C(S)-, C(NR')-, —C(O)N(R')-, -N(R')C(0)N (R')-, - N(R')C(0)-, -N(R#)C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(O)-, -S(0)2-, - S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -OC(0)-, O - C(O)0-, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es opcionalmente sustituido En algunas modalidades, En algunas modalidades, R1 es opcionalmente sustituido En algunas modalidades, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido que comprende una o más porciones de hidrocarburo policielico opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido que comprende una o más porciones de hidrocarburo policiclico opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C ~C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC ~C(R')2- , -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-f -C(NR')-, - C(0)N(R')—, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(O)0-, - OC(O)N(R')-, -S(O) -S(O)2-, -S(0)2N(R')-, -N (R')S(0)2-, - SC(O)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o -C(0)0-, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido que comprende uno o más de algunaí modalidades, En algunas modalidades, En algunas modalidades, R1 es En algunas modalidades, R1 es un arilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un anillo arilo bicielico opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R1 es un heteroarilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo monociclico de 5-6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, azufre, u oxigeno. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo monociclico de 5-6 elementos sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo monociclico de 5-6 elementos no sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, azufre, u oxigeno.
En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo monociclico de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo monociclico de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo monociclico de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es seleccionado a partir de pirrolilo, furanilo, o tienilo.
En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1 nitrógeno átomo, y un heteroátomo adicional seleccionado a partir de azufre o oxigeno. Grupos R1 ejemplares incluyen pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo o isoxazolilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo de 6 elementos que tiene 1-3 átomos de nitrógeno. En otras modalidades, R1 es un anillo heteroarilo de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 átomos de nitrógeno. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 átomos de nitrógeno. En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1 nitrógeno. Grupos R1 ejemplares incluyen piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo, o tetrazinilo opcionalmente sustituido.
En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo bicielico de 8-10 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En otras modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un indolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un azabiciclo[3.2.1]octanilo opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un azaindolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un bencimidazolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un benzotiazolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un benzoxazolilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un indazolilo opcionalmente sustituido. En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 5-6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 3 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En ciertas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En otras modalidades, R1 es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un quinolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un isoquinolinilo opcionalmente sustituido. De conformidad con un aspecto, R1 es un anillo heteroarilo 6,6-fusionado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es una quinazolina o una quinoxalina.
En algunas modalidades, R1 es un heterocielilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterociclico saturado o parcialmente insaturado, de 3-7 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterociclico saturado o parcialmente insaturado, de 3-7 elementos sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 3-7 elementos no sustituido que tiene 1-2 heteroáto os seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En algunas modalidades, R1 es un heterocielilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado, de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado, de 6 elementos opcionalmente sustituido que tiene 2 átomo de oxígenos.
En ciertas modalidades, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 elementos que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno, o azufre. En ciertas modalidades, R1 es oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, oxepanilo, aziridinilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, azepanilo, tiiranilo, tietanilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tiepanilo, dioxolanilo, oxatiolanilo oxazolidinilo imidazolidinilo tiazolidinilo ditiolanilo dioxanilo, morfolinilo, oxatianilo, piperazinilo tiomorfolinilo, ditianilo, dioxepanilo, oxazepanilo oxatiepanilo, ditiepanilo, diazepanilo, dihidrofuranonilo, tetrahidropiranonilo, oxepanonilo, pirolidinonilo, piperidinonilo, azepanonilo, dihidrotiofenonilo, tetrahidrotiopiranonilo, tiepanonilo, oxazolidinonilo, oxazinanonilo, oxazepanonilo, dioxolanonilo, dioxanonilo dioxepanonilo, oxatiolinonilo, oxatianonilo, oxatiepanonilo tiazolidinonilo, tiazinanonilo, tiazepanonilo imidazolidinonilo, tetrahidropirimidinonilo, diazepanonilo imidazolidindionilo, oxazolidindionilo, tiazolidindionilo, dioxolandionilo, oxatiolandionilo, piperazindionilo, morfolindionilo, tiomorfolindionilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo. tetrahidrotiofenilo, o tetrahidrotiopiranilo. En algunas modalidades, R1 es un anillo heterocielico saturado o parcialmente insaturado, de 5 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En ciertas modalidades, R1 es un anillo monociclico parcialmente insaturado de 5-6 elementos, opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre.
En ciertas modalidades, R1 es un grupo tetrahidropiridinilo, dihidrotiazolilo, dihidrooxazolilo, u oxazolinilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R1 es un anillo heterocielico saturado o parcialmente insaturado, de 8-10 elementos opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxigeno, o azufre. En algunas modalidades, R1 es un indolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es un isoindolinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R1 es una 1,2,3,4-tetrahidroquinolina opcionalmente sustituida. En algunas modalidades, R1 es una 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina opcionalmente sustituida.
En algunas modalidades, R1 es un alifático Ci-Cio opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-c6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -o-, -s-, -S-S-, -N(R')-, - C ( O )~, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, - N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, - S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -c(0)s-, -0C(0)-, o - C(0)0-, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es un alifático Ci-Cio opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un opcionalmente -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')~, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N (R')C(O)N (R')-, -N(R')C(O)-, N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(O) -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, - N(R')S(0)2-, —OC(O)—, o —C(O)O—, en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es un alifático CiCío opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un opcionalmente -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N (R')-, -C(0)-, -OC(O)-, o —C(O)O—, en donde cada Rf es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, R1 es - - - - _ _ 1 FmocHN FmocHN FmocHNk O - - En algunas modalidades, R1 comprende una porción terminal 5 (CH2) 2~ opcionalmente sustituida la cual está conectada a L Ejemplares de tales grupos R1 son representados abajo: En algunas modalidades, R1 comprende una porción terminal -(CH2)- opcionalmente sustituida la cual está conectada a L. Ejemplares de tales grupos R1 son representados abajo: I En algunas modalidades, R1 es -S-RL2, en donde RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, N(R')C(0)N(R')-, -N (R')C(O)-, -N(R')C(O)0-, -OC(0)N(R') - S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2N(Rr)-, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, —OC(0)—, o -C(0)0-, y cada uno de R' y -Cy- es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es -S-RL2, en donde el átomo de azufre está conectado con el átomo de azufre en el grupo L.
En algunas modalidades, R1 es -C(O)-RL2, en donde RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno CI-CÉ, CºC , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C (S) -, -C(NR')-, - C(0)N(R')-, -N(R')C (0)N (R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(O)O-, -0C(0)N(R')-, ~S(0) -S(0)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(O)-, -C(0)S-, -00(0)-, o -C(0)0-, y cada uno de R' y -Cy-es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, R1 es -C(0)-RL2, en donde el grupo carbonilo está conectado con G en el grupo L. En algunas modalidades, R1 es -C(0)-RL2, en donde el grupo carbonilo está conectado con el átomo de azufre en el grupo L.
En algunas modalidades, RL2 es alifático C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es alguilo C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es alquenilo C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es alquinilo C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -Cy- o -C(0)-. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -Cy-. En algunas modalidades, RL2 es un alifático Ci-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un heterocielileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un arileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un heteroarileno opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un carbociclileno C3-C10 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde dos unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -Cy- o —C(O)—. En algunas modalidades, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde dos unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por -Cy- o -C(O)-. Grupos RL2 ejemplares son representados abajo: En algunas modalidades, R1 es hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de I - -S-(alifático Ci-Cio), alifático Ci-Cio, arilo, heteroalquilo Ci-C6, heteroarilo y heterocielilo. En algunas modalidades, R1 - -Cio).
En algunas modalidades, R1 es En algunas modalidades, R1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de -S-(alifático Ci-C6), alifático Ci-Cio, heteroalifático Ci-C6, arilo, heterocielilo y heteroarilo.
En algunas modalidades, R1 es En algunas modalidades, el átomo de azufre en las modalidades descritas anteriormente y en la presente de R1 está conectado con el azufre átomo, porción G, E, o -C(O)- en las modalidades descritas anteriormente y en la presente de L. En algunas modalidades, la porción -C(O)- en las modalidades descritas anteriormente y en la presente de R1 está conectado con el azufre átomo, porción G, E, o -C (0) - en las modalidades descritas anteriormente y en la presente de L.
En algunas modalidades, -L-R1 es cualquier combinación de las modalidades de L y modalidades descritas anteriormente y en la presente de R1.
En algunas modalidades, -L-R1 es -L3-G-R1 en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 es -L4-G-R1 en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 es -L3-G-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 es -L3-G-C(0)-RL2, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 es en donde RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, — cºc— , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, - C( O)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, 0C(O)N(R')-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, - SC(O)-, -C(O)S-, -OC (O) o -C(O)O-, y cada G es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 es -RL3-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, -L-R1 es -RL3-C(0)-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: . en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en 5 la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: R1 gq en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : r en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es 5 independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades , -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se def anteriormente y describe en la presente. 5 En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de : en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, L tiene la estructura de: en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -X-L-R1 tiene la estructura de : en donde: el anillo fenilo es opcionalmente sustituido, y cada uno de R1 y X es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. 5 En algunas modalidades, -L-R1 es - .
- I En algunas modalidades, -L-R1 es 183 En algunas modalidades, -L-R1 es CH3-, E g , - En algunas modalidades, -L-R1 comprende una porción terminal -(CH2)2_ opcionalmente sustituida la cual está conectada a X. En algunas modalidades, -L-R1 comprende una porción terminal -(CH2)2- la cual está conectada a X. Ejemplares de tales porciones -L-R1 son representadas abajo: En algunas modalidades, -L-R1 comprende una porción terminal -(CH2)- opcionalmente sustituida la cual está conectada a X. En algunas modalidades, -L-R1 comprende una porción terminal -((¾ )- la cual está conectada a X. Ejemplares de tales porciones -L-R1 son representadas abajo: 5 En algunas modalidades, -L-R1 es En algunas modalidades, -L-R1 es CH3 , o - - En algunas modalidades, -L-R1 es CH3-, - O-, y Z es -O-.
En algunas modalidades, R1 es - ( co C1-C10) En algunas modalidades, R1 es En algunas modalidades, X es -O- o -S-, y R1 es ( ico C1-C10).
En algunas modalidades, X es -0- o -S-, y R1 es - 10) o -S-(alifático Ci-C50).
En algunas modalidades, L es un enlace covalente y -L-R1 es R1. En algunas modalidades, -L-R1 no es hidrógeno.
En algunas modalidades, -X-L-R1 es R1 es - ( 1 10) o -S- (alifático C1-C50)· En algunas modalidades, -X-L-R1 tiene la estructura es opcionalmente sustituida. En algunas modalidades, -X-L-R1es En algunas modalidades, -X-L-R1es En algunas modalidades, -X-L-R1 es ades, -X-L-R1tiene la estructura de donde X' es O u S, Y' es -O-, -S- o -NR'-, y la porción es opcionalmente sustituida. En algunas modalidades, Y' es -O-, -S- o -NH-. En algunas modalidades, s modalidades, En algunas modalidades, -X-L-R1tiene la estructura de , en donde X' es 0 u S, y la porción , es opcionalmente sustituida. En algunas . modalidades, En algunas modalidades, -X L-R1 es en donde el :L=A: es opcional ente sustituido. En algunas - modalidades, - - - en donde el 190 sustituido. En algunas modalidades, -X-L-R1 en donde el = no sustituido.
En algunas modalidades, -X-L-R1 es R1-C(O)-S-Lx-S-, en donde Lx es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir En algunas modalidades, Lx es t En algunas modalidades, -X-L-R1 es (CH3)3C-S-S-LX-S-. En algunas modalidades, -X-L-R1 es R1-C(=X')-Y'-C(R)2~S-LX-S-. En algunas modalidades, -X-L-R1 es R-C(=X')-Y'-CH2~S-LX-S-. En OH^OH algunas modalidades, -X-L-R1 es HO¾i/S-L--S- NHAc Como se apreciará por una persona experta en la téenica, muchos de los grupos -X-L-R1 descritos en la presente son desdoblables y pueden ser convertidos a -X después de la administración a un sujeto. En algunas modalidades, -X-L-R1 es desdoblable. En algunas modalidades, -X-L-R1 es -S-L-R1, y es convertido a -S después de la administración a un sujeto. En algunas modalidades, la conversión es promovida por una enzima de un sujeto. Como se aprecia por una persona experta en la técnica, los métodos para determinar si el grupo -S-L-R1 es convertido a -S después de la administración se conocen ampliamente y se practican en la téenica, incluyendo aquellos usados para estudiar el metabolismo y farmacocinéticas del fármaco.
En algunas modalidades, el enlace internucleotidico 0 > 1 > -O-P-Oi- 1 que tiene la estructura de fórmula I es S .
En algunas modalidades, el enlace internucleotidico de fórmula I tiene la estructura de fórmula I-a: I (I-a) en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, el enlace internucleotidico de fórmula I tiene la estructura de fórmula I-b: , | (I-b) en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, el enlace internucleotidico de fórmula I es un enlace de fosforotioato triéste que tiene la estructura de fórmula I-c: > OII > i-o-p -cH- S-L-R1 (I-c) en donde: P* es un átomo de fósforo asimétrico y es ya sea Rp o Sp; L es un enlace covalente o un alquileno Ci-Cio lineal o ramificado, opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci~C6, — CºC— / -C(R')2- , -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C (O)N(Rf)-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N (R')C(O)O-, - OC (O)N(Rf)-, -S(O)-, -S(O)2~, -S(0)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, - SC(O)-, -C(0)S-, -OC(O)-, o -C(O)0-; R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC- , -C(R')2 -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, - C(O)-, -C (S)-, -C(NR')- -C(O)N(R')—, -N(R')C(O)N (R') -N (R')C(O) -N(R')C(O)0-, -0C(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, - S(0)2N(R')~, -N(R')S(0}2-, -SC(O)-, -C(0)S-, -OC(O)-, O - C (O)O-; cada R' es independientemente -R, -C(0)R, -CO2R, o -SO2R, o: dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterocielico opcionalmente sustituido, o dos R' en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbociclico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido; -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado a partir de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno, o heterociclileno; cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático C1-C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo; cada representa independientemente una conexión a un nucleósido; y R1 no es -H cuando L es un enlace covalente.
En algunas modalidades, el enlace internucleotidico II que tiene la estructura de fórmula I es En algunas modalidades, el enlace internucleotidico que tiene la estructura de fórmula I-c es .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces de fosfato diéster, y uno o más enlaces de internucleótidos modificados que tienen la fórmula de I-a, I-b, o I-c.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos un enlace de fosforotioato triéster que tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos dos enlaces de fosforotioato triéster que tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos tres enlaces de fosforotioato triéster que tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos cuatro enlaces de fosforotioato triéster que tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster y al menos cinco enlaces de fosforotioato triéster que tienen la estructura de fórmula I-c.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en cualquiera de los Apéndices de la solicitud. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en el Apéndice A. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en el Apéndice B. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en el Apéndice C. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiral ente controlado que tiene una secuencia encontrada en cualquiera de los Apéndices de la solicitud. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en el Apéndice A. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en el Apéndice B. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en el Apéndice C.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde tal secuencia tiene más de 50% de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde tal secuencia tiene más de 60% de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde tal secuencia tiene más de 70% de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde tal secuencia tiene más de 80% de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde tal secuencia tiene más de 90% de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde tal secuencia tiene más de 95% de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotidico tiene un enlace quiral fosforoso. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotidico tienen la estructura de fórmula I. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotidico tienen la estructura de fórmula I. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotidico tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotidico tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, O - o-P-o4 en donde al menos un enlace internucleotídico es En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada O O-P-0+ enlace internucleotídico es S .En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido guiralmente controlado gue comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene un enlace quiral fosforoso. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tienen la estructura de fórmula ? . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tienen la estructura de fórmula I. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es -,f-o-p-oi>. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es · En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene un enlace quiral fosforoso. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tienen la estructura de fórmula X. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tienen la estructura de fórmula I. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace 5 internucleotídico tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotidico tienen la estructura de fórmula I-c. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace -f0-P-O-f-internucleotídico es S . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en O ^-0-P-o donde cada enlace internucleotidico es s- . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotidico es En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotidico En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un fósforo de enlace es Rp. Se entiende por una persona de habilidad ordinaria en la téenica que en ciertas modalidades en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende una secuencia de ARN, cada T es independientemente y opcionalmente reemplazado con U. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada fósforo de enlace es Rp. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un fósforo de enlace es Sp. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada fósforo de enlace es Sp. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un blockmero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un estereoblockmero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un bloque de modificación-Pmero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un blockmero de enlace. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un altmero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un estereoaltmero . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un altmero de modificación-P. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un altmero de enlace. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un unimero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un estereounimero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un unímero de modificación-P. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un unimero de enlace. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un gapmero. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un skipmero.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada citosina es opcionalmente e independientemente reemplazada por 5-metilcitosina. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos una citosina es opcionalmente e independientemente reemplazada por 5-metilcitosina. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada citosina es opcionalmente e independientemente reemplazada por 5- metilcitosina. Oligonucleótidos quiralmente controlados jempiares que tienen la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC se representan en la Tabla 2 , abajo : 2. Oligonucleótidos quiralmente controlados ejemplares . 5 En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es diseñado de manera que uno o más nucleótidos comprenden una modificación de fósforo propensa a "autoliberación" bajo ciertas condiciones. Es decir, bajo ciertas condiciones, una modificación de fósforo particular está diseñada de manera que se auto-desdobla a partir del oligonucleótido para proporcionar, por ejemplo, un fosfato diéster tal como aquel encontrado en ADN y ARN que se originan naturalmente. En algunas modalidades, tal modificación de fósforo tiene una estructura de -O-L-R1, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, un grupo de auto-liberación comprende un grupo morfolino. En algunas modalidades, un grupo de autoliberación se caracteriza por la capacidad para suministrar un agente al enlazador de fósforo internucleotídico, en el cual el agente facilita la modificación adicional del el átomo de fósforo tal como, por ejemplo, desulfurización. En algunas modalidades, el agente es agua y la modificación adicional es hidrólisis para formar un fosfato diéster como se encuentra en ADN y ARN que se origina naturalmente.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es diseñado de manera que las propiedades farmacéuticas resultantes son mejoradas a través de una o más modificaciones particulares en fósforo. Está bien documentado en la téenica que ciertos oligonucleótidos son rápidamente degradados por nucleasas y presentan escasa absorción celular a través de la membrana celular citoplásmica (Poijarvi-Virta et al., Curr. Med. Chem. (2006), 13(28);3441-65; Wagner et al., Med. Res. Rev. (2000), 20(6):417-51; Pcyrottes et al., Mini Rev. Med. Chem. (2004), 4(4)-.395-408; Gosselin et al., (1996), 43(1):196-208; Bologna et al., (2002), Antisense & Nucleic Acid Drug Development 12:33-41). Por ejemplo, Vives et al., (Nucleic Acids Research (1999), 27(20):071-76) encuentra que pro-oligonucleótidos SATE de tere-butilo presentan penetración celular marcadamente incrementada comparada con .el oligonucleótido precursor.
En algunas modalidades, una modificación en un fósforo de enlace se caracteriza por su capacidad para ser transformada a un fosfate diéster, tal como aquellos presentes en ADN y ARN que se origina naturalmente, por una o más enzimas esterasas, nucleasas, y/o del citocromo P450, que incluye pero no se limita a, aquellas listadas en la Tabla 3, abajo.
Tabla 3. Enzimas ejemplares En algunas modalidades, una modificación en fósforo resulta en una porción de modificación-P caracterizada porque actúa como un pro-fármaco, por ejemplo, la porción de modificación-P facilita el suministro de un oligonucleótido a una ubicación deseada previo a la remoción. Por ejemplo, en algunas modalidades, una porción de modificación-P resulta de la PEGilación en el enlace de fósforo. Uno de habilidad en las téenicas relevantes apreciará que varias longitudes de cadena PEG son útiles y que la selección de la longitud de cadena será determinada en parte por el resultado que se busca lograr por la PEGilación. Por ejemplo, en algunas modalidades, la PEGilación se efectúa con el fin de reducir la absorción de RES y extender la vida útil de circulación in vivo de un oligonucleótido.
En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación para uso de conformidad con la presente invención es de un peso molecular de aproximadamente 300 g/mol hasta aproximadamente 100,000 g/mol. En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 300 g/mol hasta aproximadamente 10,000 g/mol. En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 300 g/mol hasta aproximadamente 5,000 g/mol. En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 500 g/mol. En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación de un peso molecular de aproximadamente 1000 g/mol. En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 3000 g/mol. En algunas modalidades, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 5000 g/mol.
En ciertas modalidades, un reactivo de PEGilación es PEG500. En ciertas modalidades, un reactivo de PEGilación es PEG1000. En ciertas modalidades, un reactivo de PEGilación es PEG3000. En ciertas modalidades, un reactivo de PEGilación es PEG5000.
En algunas modalidades, una porción de modificación-P se caracteriza porque actúa como un potenciador de PK, por ejemplo, lípidos, lipidos PEGilados, etc.
En algunas modalidades, una porción de modificación-P se caracteriza porque actúa como un agente el cual promueve la entrada celular y/o escape endosomal, tal como un lipido o péptido de membrana disruptiva.
En algunas modalidades, una porción de modificación-P se caracteriza porque actúa como un agente de objetivo. En algunas modalidades, una porción de modificación-P es o comprende un agente de objetivo. La frase "agente de objetivo", como se usa en la presente, es una entidad que se asocia con una carga útil de interés (por ejemplo, con un oligonucleótido o composición de oligonucleótido) y también interactúa con un sitio objetivo de interés de manera que la carga útil de interés es dirigida al sitio objetivo de interés cuando se asocia con el agente de objetivo en una magnitud materialmente mayor que la que se observa bajo condiciones de otro modo comparables cuando la carga útil de interés no está asociada con el agente de objetivo. Un agente de objetivo puede ser, o comprende, cualquiera de una variedad de porciones químicas, que incluyen, por ejemplo, porciones de molécula pequeña, ácidos nucleicos, polipéptidos, carbohidratos, etc. Agentes de objetivo son descritos además por Adarsh et al., "Organelle Specific Targeted Drug Delivery - A Review," International Journal of Research in Pharmaceutical and Bio edical Sciences, 2011, p.895.
Ejemplares de tales agente de objetivos incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, Transferrina), oligopéptidos (por ejemplo, oligopéptidos que contienen RGD cíclicos y acíclicos), anticuerpos (anticuerpos monoclonales y policlonales, por ejemplo, anticuerpos IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) , azúcares/carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos y/u oligosacáridos (mañosa, manosa-6-fosfato, galactosa, y similares)), vitaminas (por ejemplo, folato), u otras biomoléculas pequeñas. En algunas modalidades, una porción de objetivo es una molécula esteroide (por ejemplo, ácidos biliares que incluyen ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido deshidrocólico; cortisona; digoxigenina; testosterona; colesterol; esteroides catiónicos tales como cortisona que tienen un grupo trimetilaminometil hidrazida unido mediante un doble enlace en la posición-3 del anillo cortisona, etc.). En algunas modalidades, una porción de objetivo es una molécula lipofílica (por ejemplo, hidrocarburos aliciclicos, ácidos grasos saturados e insaturados, ceras, terpenos, e hidrocarburos polialicíclicos tales como adamantina y buckminsterfulerenos). En algunas modalidades, una molécula lipofílica es un terpenoide tal como vitamina A, ácido retinóico, retinal, o deshidroretinal. En algunas modalidades, una porción de objetivo es un péptido.
En algunas modalidades, una porción de modificación-P es un agente de objetivo de fórmula — X-L-R1en donde cada uno de X, L, y R1 son como se definen anteriormente en la Fórmula I anterior.
En algunas modalidades, una porción de modificación-P se caracteriza porque facilita el suministro especifico de la célula.
En algunas modalidades, una porción de modificación-P se caracteriza porque cae en una o más de las categorías descritas anteriormente. Por ejemplo, en algunas modalidades, una porción de modificación-P actúa como un potenciador de PK y un ligando de objetivo. En algunas modalidades, una porción de modificación-P actúa como un profármaco y un agente de escape endosomal. Uno de habilidad en las téenicas relevantes podría reconocer que numerosas otras de tales combinaciones son posibles y están contempladas por la presente invención.
Núcleobases En algunas modalidades, una núcleobase presente en un oligonucleótido proporcionado es una natural núcleobase o una núcleobase modificada derivada a partir de una núcleobase naturales. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, uracilo, timina, adenina, citosina, y guanina que tienen sus grupos amino respectivos protegidos por grupos protectores acilo, 2- fluorouracilo 2-fluorocitosina 5-bromouracilo 5-yodouracilo, 2,6-diaminopurina, azacitosina, análogos de pirimidina tales como pseudoisocitosina y pseudouracilo y otras núcleobases modificadas tales como purinas 8-sustituidas, xantina, o hipoxantina (las últimas dos son los productos de degradación natural). Núcleobases modificadas ejemplares se describen en Chiu and Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al . Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 y Revankar and Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol.7, 313.
Los compuestos representados por las siguientes fórmulas generales también están contemplados como núcleobases modificadas: en donde R8 es un grupo lineal o ramificado, opcionalmente sustituido seleccionado a partir de un grupo alifático, arilo, aralquilo, ariloxilalquilo, carbocielilo, heterociclilo o heteroarilo que tiene 1 hasta 15 átomos de carbono, que incluye, por medio del ejemplo solamente, un grupo metilo, isopropilo, fenilo, bencilo, o fenoximetilo; y cada uno de R9 y R10 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo lineal o ramificado.
Las núcleobase modificadas también incluyen núcleobases de tamaño expandido en las cuales uno o más anillos arilo, tales como anillos fenilo, han sido agregados. Los reemplazos de base nucleica descritos en el catálogo de Búsqueda Glen (www.glenresearch.com); Krueger AT et al, Acc. Chem . Res . , 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc . Chem . Res . , 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat . Rev. Genet . , 2005, b, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Cpin . Chem .
Biol . , 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin . Chem . Biol . , 2006, 10, 622-627, son contemplados como útiles para la síntesis de los ácidos nucleicos descritos en la presente. Algunos ejemplos de estas núcleobases de tamaño expandido se muestran abajo: En la presente, las núcleobase modificadas también abarcan estructuras que no son consideradas núcleobases sino son otras porciones tales como, pero no limitadas a, anillos derivados de corrina o porfirina. Reemplazos base derivados de porfirina han sido descritos en Morales-Rojas, H and Kool, ET, Org. Lett., 2002, 4, 4377-4380. Mostrado abajo está un ejemplo de un anillo derivado de porfirina el cual puede ser usado como un reemplazo de base: En algunas modalidades, las núcleobase modificadas son de cualquiera de las siguientes estructuras, opcionalmente sustituidas: En algunas modalidades, una núcleobase modificada es fluorescente. Ejemplares de tales núcleobase modificadas fluorescentes incluyen fenantreno, pireno, estilbeno, isoxantina, isozantopterina, terfenilo, tertiofeno, benzotertiofeno, cumarina, lumazina, estilbeno tethered, benzo-uracilo, y nafto-uracilo, como se muestra abajo: En algunas modalidades, una núcleobase modificada es no sustituida. En algunas modalidades, una núcleobase modificada es sustituida. En algunas modalidades, una núcleobase modificada es sustituida de manera tal que contiene, por ejemplo, heteroátomos, grupos alquilo, o porciones enlazantes conectadas a porciones fluorescentes, porciones biotina o avidina, u otra proteina o péptidos. En algunas modalidades, una núcleobase modificada es una "base universal" que no es una núcleobase en el sentido más clásico, pero que funciona de manera similar a una núcleobase. Un ejemplo representativo de tal base universal 5 es 3-nitropirrol.
En algunas modalidades, otros nucleósidos también pueden ser usados en los procesos descritos en la presente e incluyen nucleósidos que incorporan núcleobases modificadas, o núcleobases covalentemente unidas a azúcares modificados. Algunos ejemplos de nucleósidos que incorporan núcleobases modificadas incluyen 4-acetilcitidina; 5- (carboxihidroxilmetil)uridina; 2 '-O-metilcitidina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; dihidrouridina; 2 ' -0-metilpseudouridina; beta,D-galactosilqueosina; 2'-0-metilguanosina; A^-isopenteniladenosina; 1-metiladenosina; 1-metilpseudouridina; 1-metilguanosina; 1-metilinosina; 2,2-dimetilguanosina; 2-metiladenosina; 2-metilguanosina; N1-metilguanosina; 3-metil-citidina; 5-metilcitidina; 5- hidroximetilcitidina; 5-formilcitosina; 5-carboxilcitosina; A^-metiladenosina; 7-metilguanosina; 5-metilaminoetiluridina; 5-metoxiaminometil-2-tiouridina; beta,D-manosilqueosina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 2-metiltio- N6- isopenteniladenosina; N- ((9-beta,D-ribofuranosil-2- metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina; N- ((9-beta,D- ribofuranosilpurina-6-il)-l\7-metilcarbamoil)treonina; metiléster del ácido uridin-5-oxiacético; ácido uridin-5- oxiacético (v); pseudouridina; queosina; 2-tiocitidina; 5- metil-2-tiouridina; 2-tiouridina; 4-tiouridina; 5- metiluridina; 2'-0-metil-5-metiluridina; y 2'-O-metiluridina.
En algunas modalidades, los nucleósidos incluyen análogos de nucleósido bicielico 6'-modificado que tiene ya sea quiralidad (R) o (S) en la posición-6' e incluyen los análogos descritos en la Patente Estadounidense No. 7,399,845. En otras modalidades, los nucleósidos incluyen análogos de nucleósido bicielicos 5'-modificados que tienen ya sea la quiralidad (R) o ( S) en la posición-5' e incluyen los análogos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No.20070287831.
En algunas modalidades, una núcleobase o núcleobase modificada comprende una o más porciones de unión de biomolécula tales como por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, biotina, avidina, estreptavidina, ligandos del receptor, o porciones quelantes. En otras modalidades, una núcleobase o núcleobase modificada es 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, o 2,6-diaminopurina. En algunas modalidades, una núcleobase o núcleobase modificada es modificada por sustitución con una porción de unión de biomolécula o fluorescente. En algunas modalidades, el sustituyente en una núcleobase o núcleobase modificada es una porción fluorescente. En algunas modalidades, el sustituyente en una núcleobase o núcleobase modificada es biotina o avidina.
Patentes Estadounidenses representativas que muestran la preparación de ciertas de las núcleobases modificadas indicadas anteriormente asi como también otras núcleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, la Patente Estadounidense indicada anteriormente No.3,687,808, asi como también las Patentes Estadounidenses Nos.4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,457,191; 5,459,255; 5,484,908; 5, 502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; y 7,495,088, cada una de las cuales está en la presente incorporada por referencia en su totalidad.
Azúcares Los nucleótidos más comúnes que se originan naturalmente están comprendidos de azúcares de ribosa ligados a las núcleobases adenosina (A), citosina (C), guanina (G), y ti ina (T) o uracilo (U). También contemplados están nucleótidos modificados en donde un grupo fosfato o fósforo de enlace en los nucleótidos pueden ser ligados a varias posiciones de un azúcar o azúcar modificado. Como ejemplos no limitantes, el grupo fosfato o fósforo de enlace puede ser ligado a la porción hidroxilo 2', 3', 4' o 5' de un azúcar o azúcar modificado. Nucleótidos que incorporan núcleobases modificadas como se describe en la presente también están contemplados en este contexto. En algunas modalidades, los nucleótidos o nucleótidos modificados que comprenden una porción -OH no protegida son usados de conformidad con métodos de la presente invención.
Otros azúcares modificados también pueden ser incorporados dentro de un oligonucleótido proporcionado. En algunas modalidades, un azúcar modificado contiene uno o más sustituyentes en la posición 2' que incluyen uno de los siguientes: -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -0R', -SR', o - N (R')2, en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente; -O-(alquilo Ci-Ci0), -S- (alquilo Ci-C10), -NH-(alquilo Ci~Ci0), o -N (alquilo Ci~Cio)2; -0-(alquenilo C2-Ci0), -S-(alquenilo C2-Ci0), -NH- (alquenilo C2-Ci0), o -N (alquenilo C2-Ci0)2; -0-(alquinilo C2-Ci0), -S-(alquinilo C2-Ci0), -NH-(alquinilo C2-Cio), o - N (alquinilo C2-Ci0)2; o -0— (alquileno Ci~Cio)-0— (alquilo Ci-Cio), -O- (alquileno Ci-Cio)-NH-(alquilo Ci-Ci0) o -0- (alquileno Ci~Ci0)-NH(alquilo Ci-Cio)2 -NH-(alquileno Ci-Cio)-0- (alquilo Ci-Cio), o -N (alquilo Ci-Cio)-(alquileno Ci-Ci0)-O- (alquilo Oc-Oco), en donde el alquilo, alquileno, alquenilo y alquinilo puede ser sustituido o no sustituido. Ejemplos de sustituyentes incluyen, y no se limitan a, -O (CH2)n0CH3, y - 0(CH2)nNH2, en donde n es desde 1 hasta aproximadamente 10, MOE, DMAOE, DMAEOE. También contemplados en la presente están azúcares modificados descritos en el documento W0 2001/088198; y Martin et al . , Helv. Chim . Acta, 1995, 78, 486-504. En algunas modalidades, un azúcar modificado comprende uno o más grupos seleccionados a partir de un grupo sililo sustituido, un grupo de desdoblamiento de ARN, un grupo reportero, una etiqueta fluorescente, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ácido nucleico, un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ácido nucleico, u otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas modalidades, las modificaciones se hacen en una o más de las posiciones 2', 3', 4', 5', o 6' del azúcar o azúcar modificado, que incluyen la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3'-terminal o en la posición 5' del nucleótido 5'-terminal.
En algunas modalidades, el 2'-OH de una ribosa es reemplazado con un sustituyente que incluye uno de los siguientes: -H, -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -OR', -SR', o -N (R')2, en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente; -O-(alquilo 0c-0co), -S- (alquilo Oc-Oc0), -NH-(alquilo 0c-0co), o -N (alquilo Oc-Cxo)2 -O-(alquenilo C2-C10), -S-(alquenilo C2-Cx0), -NH- (alquenilo C2-C10), o -N (alquenilo C2-Cio)2; -O-(alquinilo C2- C10), -S- (alquinilo C2-C10), -NH-(alquinilo C2-Cx0), o N (alquinilo C2-Cx0)2; o -O— (alquileno 0c-0co)-0— (alquilo Oc- Oco), -O-(alquileno Oc-Oco)-NH-(alquilo Oc-Oc0) o -O-(alquileno C1-C10)-NH(alquilo Ci-Ci0)2, -NH-(alquileno Oc-Oc0)-O-(alquilo Cx-Cxo), o -N(alquilo Oc-O10)-(alquileno Oc-Oco)-O-(alquilo Oc- Cxo), en donde el alquilo, alquileno, alquenilo y alquinilo puede ser sustituido o no sustituido. En algunas modalidades, el 2' -OH es reemplazado con -H (desoxiribosa). En algunas modalidades, el 2' -OH es reemplazado con -F. En algunas modalidades, el 2'-OH es reemplazado con -OR'. En algunas modalidades, el 2'-OH es reemplazado con -OMe. En algunas modalidades, el 2'-0H es reemplazado con -OCH2CH2OMe.
Los azúcares modificados también incluyen ácidos nucleicos bloqueados (LNAs). En algunas modalidades, el ácido nucleico bloqueado tiene la estructura indicada abajo. Un ácido nucleico bloqueado de la estructura abajo está indicado, en donde Ba representa una núcleobase o núcleobase modificada como se describe en la presente, y en donde R2s es -OCH2C4'-.
C2OCH2C4'=LNA(AddoNucleicoBloqueado) R2S=OCH2C4* En algunas modalidades, un azúcar modificado es un ENA tal como aquellos descritos en, por ejemplo, Seth et al., J Am Chem Soc.2010 Octubre 27; 132(42): 14942-14950. En algunas modalidades, un azúcar modificado es cualquiera de aquellos encontrados en un XNA (ácido xenonucleico), por ejemplo, arabinosa, anhidrohexitol, treosa, 2'fluoroarabinosa, o ciclohexeno.
Los azúcares modificados incluyen miméticos de azúcar tales como porciones ciclobutilo o ciclopentilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Patentes Estadounidenses representativas que muestran la preparación de tales estructuras de azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos . : 4 , 981 , 957 ; 5,118,800; 5,319,080 ; y 5,359,044. Algunos azúcares modificados que son contemplados incluyen azúcares en los cuales el átomo de oxigeno dentro del anillo ribosa es reemplazado por nitrógeno, azufre, selenio, o carbono. En algunas modalidades, un azúcar modificado es una ribosa modificada en donde el átomo de oxígeno dentro del anillo ribosa es reemplazado con nitrógeno, y en donde el nitrógeno es opcionalmente sustituido con un grupo alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, etc).
Ejemplos no limitantes de azúcares modificados incluyen glicerol, el cual forma análogos de ácido nucleico de glicerol (GNA). Un ejemplo de un análogo de GNA se muestra abajo y se describe en Zhang, R et al., J. Am. Chem. Soc. , 2008, 130, 5846-5847; Zhang L, et al . , J. Am. Chem. Soc. , 2005, 127, 4174-4175 y Tsai CH et al . , PNAS, 2007, 14598- 14603 (X = O): i i Otro ejemplo de un análogo derivado de GNA, ácido nucleico flexible (FNA) con base en el acetal a inal mezclado de for il glicerol, se describe en Joyce GF et al . , PNAS, 1987, 84, 4398-4402 y Heuberger BD and Switzer C, J. Am. Chem. Soc. , 2008, 130, 412-413, y se muestra abajo: - Ejemplos no limitantes adicionales de azúcares modificados incluyen azúcares de hexopiranosilo (6' a 4'), pentopiranosilo (4' a 2'), pentopiranosilo (4' a 3'), o tetrofuranosilo (3' a 2'). En algunas moda lidades, un azúcar de hexopiranosilo (6' a 4') es cualquiera de las siguientes fórmulas: i I 1 en donde Xs corresponde al grupo de modificación-P XLR1" descrito en la presente y Ba es como se define en la presente.
En algunas modalidades, un azúcar de pentopiranosilo (4f a 2' ) es de cualquiera de las siguientes fórmulas : en donde Xs corresponde al grupo de modificación-P "-XLR1" descrito en la presente y Ba es como se define en la presente .
En algunas modalidades, un azúcar pentopiranosilo ( 4 ' a 3' ) es de las en donde Xs corresponde al grupo de modificación-P "-XLR1" descrito en la presente y Ba es como se define en la presente.
En algunas modalidades, un azúcar tetrofuranosilo (3' a 2' ) es de cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde Xs corresponde al grupo de modificación-P "-XLR1" descrito en la presente y Ba es como se define en la presente.
En algunas modalidades, un azúcar modificado es de cualquiera de las siguientes fórmulas: , en donde Xs corresponde al grupo de modificación-P "-XLR1" descrito en la presente y Ba es como se define en la presente.
En algunas modalidades, uno o más grupos hidroxilos en una porción de azúcar es opcionalmente e independientemente reemplazado con halógeno, R' -N(R')2 OR', o -SR', en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, un mimético de azúcar es como se ilustra abajo, en donde Xs corresponde al grupo de modificación-P "-XLR1" descrito en la presente, Ba es como se define en la presente, y X1 es seleccionado a partir de -S-, -Se-, -CH2-, -NMe-, -NEt- o -NiPr-. i I - I 1 , I En algunas modalidades, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% o más (por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más), inclusivo, de los azúcares en una composición de oligonucleótido quiralmente controlado son modificados. En algunas modalidades, solamente residuos purina son modificados (por ejemplo, aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% o más [por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más] de los residuos purina son modificados). En algunas modalidades, solamente residuos pirimidina son modificados (por ejemplo, aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% o más [por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más] de los residuos piridimina son modificados). En algunas modalidades, residuos tanto purina como pirimidina son modificados.
Azúcares modificados y miméticos de azúcar pueden ser preparados por métodos conocidos en la téenica, que incluyen, pero no se limitan a: A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118; M. Bohringer et al , Helv. Chim. Acta (1992), 75:1416-1477; M. Egli et al, J. A . Chem. Soc. (2006), 128(33):10847-56; A. Eschenmoser in Chemical Synthesis : Gnosis to Prognosis , C. Chatgilialoglu and V.
Sniekus, Ed., (Kluwer Academic, Netherlands, 1996), p.293; K.-U. Schoning et al, Science (2000), 290:1347-1351; A.
Eschenmoser et al, Helv. Chim. Acta (1992), 75:218; J.
Hunziker et al , Helv. Chim. Acta (1993), 76:259; G. Otting et al, Helv. Chim. Acta (1993), 76:2701; K. Groebke et al, Helv. Chi . Acta (1998), 81:375; y A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118. Modificaciones a las modificaciones en 2' se pueden encontrar en Verma, S. et al. Annu . Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 y todas las referencias a estas. Modificaciones especificas a la ribosa se pueden encontrar en las siguientes referencias: 2'-fluoro (Kawasaki et. al., J. Med. Chem . , 1993, 36, 831- 841), 21-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "LNA" (engel, J. Acc. Chem. Res . 1999, 32, 301-310)). En algunas modalidades, un azúcar modificado es cualquiera de aquellos descritos en la Publicación de PCT No. WO2012/030683, incorporada en la presente por referencia, y representada en las Figuras 26-30 de la presente solicitud. 01 i gon ucleóti dos En algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos y oligonucleótido composiciones que son quiralmente controlados. Por ejemplo, en algunas modalidades, una composición proporcionada contiene niveles predeterminados de uno o más oligonucleótidos de tipo individuales, en donde un tipo de oligonucleótido es definido por: 1) secuencia base; 2) patrón de enlaces de armazón; 3) patrón de centros quirales de armazón; y 4) patrón de modificaciones-P de armazón.
En algunas modalidades, un oligonucleót ido proporcionado es un unímero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de modificación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un estereounímero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un estereounímero de configuración Pp. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un estereounímero de configuración Sp.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un altmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un altmero de modificación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un estereoaltmero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un blockmero. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un blockmero de modif icación-P. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un estereoblockmero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un gapmero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un skipmero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es una combinación de uno o más de unímero, altmero, blockmero, gapmero, y skipmero. Por ejemplo, en algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es tanto un altmero como un gapmero. En algunas modalidades, un nucleótido proporcionado es tanto un gapmero como un skipmero. Uno de habilidad en las artes químicas y sintéticas reconocerá que numerosas otras combinaciones de patrones están disponibles y son limitadas solamente por la disponibilidad comercial y/o accesabilidad sintética de partes constituyentes requeridas para sintetizar un oligonucleótido proporcionado de conformidad con métodos de la presente invención.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleótidos opcionalmente sustituidos. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleósidos opcionalmente sustituidos. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleósidos modificados. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más LNAs opcionalmente sustituidos.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más núcleobases opcionalmente sustituidas. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más núcleobases naturales opcionalmente sustituidas. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más núcleobases opcionalmente sustituidas modificadas. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más 5-metilcitidina; 5-hidroximetilcitidina, 5-formilcitosina, o 5-carboxilcitosina. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más 5-metilcitidina .
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más azúcares opcionalmente sustituidos. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más azúcares opcionalmente sustituidos encontrados en ADN y ARN que se origina naturalmente. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más ribosa o desoxirribosa opcionalmente sustituidas. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más ribosa o desoxirribosa opcionalmente sustituidas, en donde uno o más grupos hidroxilos de la porción ribosa o desoxirribosa es opcionalmente e independientemente reemplazado por halógeno, R', -N(R')2r -0R', o -SR' , en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con halógeno, R', -N(R')2, -0R', o -SR', en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, un oligonucleótído proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con halógeno. En algunas modalidades, un oligonucleótído proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con uno o más -F. halógeno. En algunas modalidades, un oligonucleótído proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con -OR', en donde cada R' es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, un oligonucleótído proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con -OR', en donde cada R' es independientemente un alifático Ci-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, un oligonucleótído proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2 ' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con -OR', en donde cada R' es independientemente un alquilo Ci~C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, un oligonucleótído proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con -OMe . En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa es opcionalmente e independientemente sustituida con -O-metoxietilo.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es oligonucleótido de hebra única.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es una hebra de oligonucleótido hibridizada. En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es una hebra de oligonucleótido parcialmente hibridizada. En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es una hebra de oligonucleótido completamente hibridizada. En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido de doble hebra. En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido de triple hebra (por ejemplo, un triple).
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es quimérico. Por ejemplo, en algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es quimera de ADN-ARN, quimera de ADN-LNA, etc.
En algunas modalidades, cualquiera de las estructuras que comprende un oligonucleótido representado en el documento W02012/030683 puede ser modificada de conformidad con métodos de la presente invención para proporcionar variantes de los mismos quiralmente controladas. Por ejemplo, en algunas modalidades las variantes quiralmente controladas comprenden una modificación estereoquímica en cualquiera o más del fósforo de enlace y/o una modificación-P en cualquiera uno o más del fósforo de enlace. Por ejemplo, en algunas modalidades, una unidad de nucleótido particular de un oligonucleótido del documento W02012/030683 es preseleccionada para ser estereoquímicamente modificada en el enlace de fósforo de tal unidad de nucleótido y/o P-modificada en el enlace de fósforo de tal unidad de nucleótido. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es de cualquiera de las estructuras representadas en las Figuras 26-30. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado es una variante (por ejemplo, versión modificada) de cualquiera de las estructuras representadas en las Figuras 26-30. La descripción del documento WO2012/030683 está en la presente incorporada por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un agente terapéutico.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido antísentido.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido antigen.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido señuelo.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es parte de una vacuna de ADN.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido inmunomodulador, por ejemplo, oligonucleótido inmunoestimulador y oligonucleótido inmunoinhibidor.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un adyuvante.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un aptámero.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es una ribozima.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es una desoxirribozima (ADNzi as o enzimas de ADN ).
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un ARNsi.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un microARN, o miARN.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un ncARN (ARNs no codificantes), que incluyen un ARN no codificante largo (IncARN) y un ARN no codificante pequeño, tal como ARN de interacción piwi (piARN).
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es complementario a un ARN estructural, por ejemplo, ARNt.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un análogo de ácido nucleico, por ejemplo, GNA, LNA, PNA, TNA y Morfolino.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un profármaco modificado-P.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un cebador. En algunas modalidades, un cebador es para uso en reacciones de cadena a base de polimerasa (es decir, PCR, para amplificar ácidos nucleicos. En algunas modalidades, un cebador es para uso en cualquiera de las variaciones conocidas de PCR, tal como PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y PCR en tiempo ral.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado se caracteriza como que tiene la capacidad para modular la activación de RNase H. Por ejemplo, en algunas modalidades, la activación de RNase H es modulada por la presencia de análogos de ácido nucleico de fosforotioato estereocontrolados, con ADN/ARN natural siendo más o igualmente susceptibles que el estereoisómero Rp, el cual a su vez es más susceptible que el estereoisómero correspondiente Sp.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es caracterizado como que tiene la capacidad para indirectamente o directamente incrementar o disminuir la actividad de una proteina o inhibición o promoción de la expresión de una proteína. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado se caracteriza porque es útil en el control de la proliferación celular, replicación viral, y/o cualquiera de otros procesos de señalización celular.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 180 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 160 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 140 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 120 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 90 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 80 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 70 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 60 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 40 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 29 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 28 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 27 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 26 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 24 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 23 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 22 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 21 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20 unidades de nucleótidos en longitud.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 200 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 180 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 160 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 140 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 120 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 100 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 90 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 80 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 70 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 60 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 50 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 40 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 30 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 29 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 28 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 27 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 26 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 25 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 24 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 23 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 22 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 21 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 20 unidades de nucleótidos en longitud.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 unidades de nucleótidos en longitud.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es desde aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 unidades de nucleótidos en longitud.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 2 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 3 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 4 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 5 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 6 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 7 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 8 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 9 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 10 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 11 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 12 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 15 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 20 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el oligonucleótido es al menos 25 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas otras modalidades, el oligonucleótido es al menos 30 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas otras modalidades, el oligonucleótido es un duplo de hebras complementarias de al menos 18 unidades de nucleótidos en longitud. En algunas otras modalidades, el oligonucleótido es un duplo de hebras complementarias de al menos 21 unidades de nucleótidos en longitud.
En algunas modalidades, el extremo 5' y/o el extremo 3' de un oligonucleótido proporcionado es modificado. En algunas modalidades, el extremo 5' y/o el extremo 3' de un oligonucleótido proporcionado es modificado con una porción de tapa terminal. Ejemplares de tales modificaciones, que incluyen porciones de tapa terminal son extensivamente descritas en la presente y en la téenica, por ejemplo, pero no limitado a aquellas descritas en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense US 2009/0023675A1.
Especies de oligonucleótidos En ciertas modalidades, un oligonucleótido de fórmula I es de cualquiera de las estructuras mostradas en la Tabla 2, anterior y aquellas descritas en los ejemplos.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende la secuencia de, o parte de la secuencia de mipomersen. El mipomersen se basa en la siguiente base de secuencia GCCT/UCAGT/UCT/UGCT/UT/UCGCACC. En algunas modalidades, uno o más de cualquiera de los nucleótidos o enlaces puede ser modificado de conformidad con la presente invención. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de G*-C*-C*-U*-C*-dA-dG-dT-dC-dT-dG-dmC-dT--dT-dmC-G*-C*-A*-C*-C* [d = 2'-desoxi, * = 2'-O-(2-metoxietil)] con enlaces fosforotioato 3' 5'. Secuencias de mipomersen modificadas ejemplares son descritas a través de la solicitud, que incluyen pero no se limita a aquellas en la Tabla 4.
En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de mipomersen. En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un unimero de mipomersen de configuración Rp. En ciertas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de mipomersen de configuración Sp.
Oligonucleótidos quiralmente controlados ejemplares que comprenden la secuencia de, o parte de la secuencia de mipomersen se representan en la Tabla 4, abajo.
Tabla 4. Secuencias relacionadas a Mipomersen ejempiares 5 Composiciones de oligonucleótidos La presente invención proporciona composiciones que comprenden o consisten de una pluralidad de oligonucleótidos proporcionados (por ejemplo, composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados) . En algunas modalidades, todos de tales oligonucleótidos proporcionados are del mismo tipo, es decir, todos tienen la misma secuencia base, patrón de enlaces de armazón (es decir, patrón de tipos de enlaces internucleotidicos, por ejemplo, fosfato, fosforotioato, etc), patrón de centros quirales de armazón (es decir, patrón de estereoquímica de enlace de fósforo (Rp/Sp)), y patrón de modificaciones de armazón de fósforo (por ejemplo, patrón de grupos "-XLR1" en la fórmula I). En muchas modalidades, sin embargo, las composiciones proporcionadas comprenden una pluralidad de tipos de oligonucleótidos, típicamente en cantidades relativas pre determinadas .
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada es una composición de mipomersen quiralmente puro. Es decir, en algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada proporciona mipomersen es un diastereómero único con respecto a la configuración del fósforo de enlace.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada es una composición de mipomersen quiralmente uniforme. Es decir, en algunas modalidades, cada fósforo de enlace de mipomersen está en la configuración Rp o cada fósforo de enlace de mipomersen está en la configuración Sp.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de uno o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. Uno de habilidad en las artes químicas y medicinales reconocerá que la selección y cantidad de cada uno de uno o más tipos de oligonucleótidos proporcionados en una composición proporcionada dependerá del uso propuesto de tal composición. Es decir, uno de habilidad en las téenicas relevantes podría diseñar una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada de manera que las cantidades y tipos de oligonucleótidos proporcionados contenidos en esta causan que la composición como un todo tenga ciertas características deseables (por ejemplo, biológicamente deseable, terapéuticamente deseable, etc.).
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de dos o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de tres o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de cuatro o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de cinco o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de seis o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de siete o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de ocho o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de nueve o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de diez o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada comprende una combinación de quince o más tipos de oligonucleótidos proporcionados.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada es una combinación de una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Rp y una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Sp.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada es una combinación de una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Rp, una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Sp, y una cantidad de uno o más de mipomersen quiralmente puro de una forma diastereomérica deseada.
Métodos para Elaborar Oligonucleótidos Quiralmente Controlados y Composiciones de los Mismos La presente invención proporciona métodos para elaborar oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones quiralmente controladas que comprenden uno o más tipos de nucleótidos específicos. Como se indica anteriormente, la frase "tipo de oligonucleótido", como se usa en la presente, define un oligonucleótido que tiene una secuencia base particular, patrón de enlaces de armazón, patrón de centros quirales de armazón, y patrón de modificaciones de armazón de fósforo (por ejemplo, grupos XLR1"). Oligonucleótidos de un "tipo" común designado son estructuralmente idénticos a otros con respecto a una secuencia base, patrón de enlaces de armazón, patrón de centros quirales de armazón, y patrón de modificaciones de armazón de fósforo.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado en la invención tiene diferentes propiedades a partir de aquellas de la mezcla de oligonucleótido estereoaleatorio correspondiente. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene diferente lipofilicidad a partir de aquella de la mezcla de oligonucleótido estereoaleatorio. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene diferente tiempo de retención en HPLC. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado puede tener un tiempo de retención máximo significantemente diferente a partir de aquel de la mezcla de oligonucleótido estereoaleatorio correspondiente. Durante la purificación de oligonucleótido usando HPLC como se practica en general en la téenica, ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados serán ampliamente si no totalmente perdidos. Durante la purificación de oligonucleótido usando HPLC como se practica en general en la técnica, ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados serán ampliamente si no totalmente perdidos. Una de las consecuencias es que ciertos diastereómeros de una mezcla de oligonucleótido estereoaleatorio (ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados) no son probados en ensayos. Otra consecuencia es que de lotes a lotes, debido al instrumental inevitable y errores humanos, el oligonucleótido estereoaleatorio supuestamente "puro" tendrá composiciones inconsistentes en que los diastereómeros en la composición y sus cantidades relativas y absolutas, son diferentes de lotes a lotes. El oligonucleótido quiralmente controlado y la composición de oligonucleótido quiralmente controlado proporcionada en esta invención superan tales problemas, ya que un oligonucleótido quiralmente controlado es sintetizado en formas quiralmente controladas es un diastereómero único, y una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende niveles predeterminados de uno o más oligonucleótidos de tipo individual.
Uno de habilidad en las artes químicas y sintéticas apreciará que los métodos sintéticos de la presente invención proporcionan un grado de control durante cada etapa de la síntesis de un oligonucleótido proporcionado de manera que cada unidad de nucleótido del oligonucleótido puede ser diseñada y/o seleccionada en adelante para tener una estereoquímica particular en el enlace de fósforo y/o una modificación particular en el enlace de fósforo, y/o una base particular, y/o un azúcar particular. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es diseñado y/o seleccionado en adelante para tener una combinación particular de estereocentros en el enlace de fósforo del enlace internucleotídico .
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado elaborado usando métodos de la presente invención es diseñado y/o determinado por tener una combinación particular de modificaciones de fósforo de enlace. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado elaborado usando métodos de la presente invención es diseñado y/o determinado por tener una combinación particular de bases. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado elaborado usando métodos de la presente invención es diseñado y/o determinado por tener una combinación particular de azúcares. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado elaborado usando métodos de la presente invención es diseñado y/o determinado por tener una combinación particular de uno o más de las características estructurales anteriores.
Los métodos de la presente invención presentan un alto grado de control quiral. Por ejemplo, los métodos de la presente invención facilitan el control de la configuración estereoquímica de cada fósforo de enlace único dentro de un oligonucleótido proporcionado. En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados independientemente que tienen la estructura de fórmula X.
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido el cual es un unímero de mipomersen. En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido el cual es un unímero de mipomersen de configuración Rp . En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido el cual es un unímero de mipomersen de configuración Sp.
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, es decir, una composición de oligonucleótido que contiene niveles predeterminados de oligonucleótidos de tipo individuales. En algunas modalidades una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende un tipo de oligonucleótido. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende más de un tipo de oligonucleótido. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado comprende una pluralidad de tipos de oligonucleótidos. Composiciones ejemplares de oligonucleótidos quiralmente controlados elaboradas de conformidad con la presente invención son descritas en la presente.
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de mipomersen quiralmente puro con respecto a la configuración del fósforo de enlace. Es decir, en algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de mipomersen en donde el mipomersen existe en la composición en la forma de un diastereómero único con respecto a la configuración del fósforo de enlace.
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de mipomersen quiralmente uniforme con respecto a la configuración del fósforo de enlace. Es decir, en algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de mipomersen en las cuales todas las unidades de nucleótido en este tienen la misma estereoquímica con respecto a la configuración del fósforo de enlace, por ejemplo, todas las unidades de nucleótido son de la configuración Rp en el enlace de fósforo o todas las unidades de nucleótido son de la configuración Sp en el enlace de fósforo.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de 50% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 55% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 60% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 65% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 70% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 75% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 80% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 85% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 90% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 91% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 92% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 93% puro, En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 94% puro.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 95% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 96% puro.
En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 97% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 98% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 99% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 99.5% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 99.6% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 99.7% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 99.8% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de aproximadamente 99.9% puro. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado es más de al menos aproximadamente 99% puro.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado es una composición diseñada para comprender un tipo único de oligonucleótido. En ciertas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 50% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 50% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 50% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 55% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 60% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 65% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 70% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 75% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 80% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 85% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 90% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 91% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 92% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 93% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 94% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 95% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 96% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 97% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 98% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 99% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 99.5% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 99.6% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 99.7% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 99.8% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, tales composiciones son aproximadamente 99.9% diastereoméricamente puras. En algunas modalidades, such composiciones are al menos aproximadamente 99% diastereoméricamente puras.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado es una composición diseñada para comprender tipos de oligonucleótidos múltiples. En algunas modalidades, los métodos de la presente invención permiten la generación de una biblioteca de oligonucleótidos quiralmente controlados de manera que una cantidad pre seleccionada de cualquiera o más tipos de oligonucleótidos quiralmente controlados puede ser mezclada con cualquiera o más de otros tipos de oligonucleótidos quiral ente controlados para crear una composición de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, la cantidad pre-seleccionada de un tipo de oligonucleótido es una composición que tiene cualquiera de las purezas diastereoméricas descritas anteriormente.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada.
Cuando se describen los métodos proporcionados, la palabra "ciclo" tiene su significado ordinario como se entiende por una persona de habilidad en la téenica. En algunas modalidades, una ronda de etapas (1)—(4) es referida como un ciclo-.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados, que comprenden las etapas de: (a) proporcionar una cantidad de un primer oligonucleótido quiralmente controlado; y (b) opcionalmente proporcionar una cantidad de uno o más oligonucleótidos quiralmente controlados adicionales.
En algunas modalidades, un primer oligonucleótido quiralmente controlado es un tipo de oligonucleótido, como se describe en la presente. En algunas modalidades, a uno o más oligonucleótidos quiralmente controlados adicionales es un uno o más tipo de oligonucleótido, como se describe en la presente.
Uno de habilidad en las téenicas químicas y sintéticas relevantes reconocerá el grado de versatilidad y control sobre la variación estructural y configuración estereoquímica de un oligonucleótido proporcionado cuando se sintetiza usando métodos de la presente invención. Por ejemplo, después que un primer ciclo se completa, un ciclo subsecuente puede ser realizado usando una unidad de nucleótido individualmente seleccionada para que el ciclo subsecuente el cual, en algunas modalidades, comprende una núcleobase y/o un azúcar que es diferente a partir de la primera núcleobase y/o azúcar del ciclo. Del mismo modo, el auxiliar quiral usado en la etapa de acoplamiento del ciclo subsecuente puede ser diferente del auxiliar quiral usado en el primer ciclo, de manera que el segundo ciclo genera un enlace fósforo de una configuración estereoquímica diferente. En algunas modalidades, la estereoquímica del fósforo de enlace en el recientemente formado enlace internucleotídico es controlada usando fosforamiditas estereoquímicamente puras. Adicionalmente, el reactivo de modificación usado en la etapa de modificación de un ciclo subsecuente puede ser diferente del reactivo de modificación usado en el primero o anterior ciclo. El efecto cumulativo de este procedimiento de ensamble iterativo es de manera aque cada componente de un oligonucleótido proporcionado puede ser estructuralmente y configuracionalmente ajustado a un alto grado. Una ventaja adicional a este procedimiento es que la etapa de tapado minimiza la formación de impurezas "n-l" que podrían de otro modo hacer el aislamiento de un oligonucleótido proporcionado extremadamente desafiante, y especialmente oligonucleótidos de longitudes más largas.
En algunas modalidades, un ciclo ejemplar del método para elaborar oligonucleótidos quiralmente controlados se ilustra en el Esquema de reacción I. En el Esquema de reacción I, ® representa el soporte sólido, y opcionalmente una porción del crecimiento del oligonucleótido quiralmente controlado unido al soporte sólido. El auxiliar quiral ejemplificado tiene la estructura de fórmula 3-1: Fórmula 3-1 la cual se describe además posteriormente. "Cap" es cualquier porción química introducida en el átomo de nitrógeno por la etapa de tapado, y en algunas modalidades, es un grupo protector amino. Uno de habilidad ordinaria en la téenica entiende que en el primer ciclo, puede existir solamente un nucleósido unido al soporte sólido cuando se inicia, y la salid adel ciclo uede ser realizada opcionalmente después del desbloqueo. Como se entiende por una persona de habilidad en la técnica, BPR0 es una base protegida usada en la síntesis de oligonucleótido. Cada etapa del ciclo representado anteriormente del Esquema de reacción I se describe además abajo.
Esquema de reacción I. Síntesis de oligonucleótido quiralmente controlado. : i .
. ? Q§go ¡deGfck> Quíratoierte Cortrolado w DESACTIVA Auxiar Quiraf Síntesis en soporte sólido En algunas modalidades, la sintesis de un oligonucleótido proporcionado se realiza en fase sólida. En algunas modalidades, los grupos reactivos presentes en un soporte sólido son protegidos. En algunas modalidades, los grupos reactivos presentes en un soporte sólido son no protegidos. Durante la sintesis de oligonucleótido un soporte sólido es tratado con varios reactivos en varios ciclos de síntesis para lograr la elongación en forma de etapa de un crecimiento de cadena de oligonucleótido con unidades de nucleótido individuales. La unidad de nucleósido en el extremo de la cadena la cual está directamente ligada al soporte sólido es llamada "elprimer nucleósido" como se usa en la presente. Un primer nucleósido está unido a un soporte sólido mediante una porción enlazadora, es decir, un diradical con enlaces covalentes entre cualquiera de un CPG, un polímero u otro soporte sólido y un nucleósido. En enlazador permanece intacto durante los ciclos de síntesis realizados para ensamblar la cadena de oligonucleótido y es desdoblado después del ensamble de cadena para liberar el oligonucleótido a partir del soporte.
Soportes sólidos para la síntesis de ácido nucleico de fase sólida incluyen los soportes descritos en, por ejemplo , las Patentes Estadounidenses 4,659,774, 5,141,813, 4,458,066; Patentes Estadounidenses de Caruthers Nos. 4,415,732, 4,458,066, 4,500,707, 4,668,777, 4,973,679, y 5,132,418; Patentes Estadounidenses de Andrus et al . Nos. 5,047,524, 5,262,530; y Patentes Estadounidenses de Koster Nos. 4,725,677 (republicadas como Re34,069). En algunas modalidades, una fase sólida es un soporte de polímero orgánico. En algunas modalidades, una fase sólida es un soporte de polímero inorgánico. En algunas modalidades, un soporte de polímero orgánico es poliestireno, aminometil poliestireno, un copolímero de injerto de polietilenglicol-poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilato, alcohol polivinílico, polímero altamente reticulado (HCP), u otros polímeros sintéticos, carbohidratos tales como celulosa y almidón u otros carbohidratos poliméricos, u otros polímeros orgánicos y cualquiera de los copolímeros, materiales compuestos o combinación de los materiales orgánicos o inorgánicos anteriores. En algunas modalidades, un soporte de polímero inorgánico es sílice, alúmina, polividrio controlado (CPG), el cual es un soporte de gel de sílice, o CPG aminopropilo. Otros soportes sólidos útiles incluyen soportes sólidos fluorados (véase por ejemplo,. el documento IVO/2005/070859), soportes sólidos de vidrio de poro controlado (CPG) de alquilamina de cadena larga (LCAA) (véase por ejemplo , S. P. Adams, K. S. Kavka, E. J. Wykes, S. B.
Holder and G. R. Galluppi, J. ñm . Chem. Soc. , 1983, 105, 661- 663; G. R. Gough, M. J. Bruden and P. T. Gilham, Tetrahedron Lett . , 1981, 22, 4177-4180). Soportes de membrana y membranas poliméricas (véase por ejemplo, Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, ch 21 pp 157-162, 1994, Ed. Roger Epton y Patente Estadounidense No. 4,923,901) son también útiles para la síntesis de ácidos nucleicos. Una vez formada, una membrana puede ser químicamente funcionalizada para uso en la síntesis de ácido nucleico. Además de la unión de un grupo funcional a la mebrana, el uso de un grupo enlazador o espaciador unido a la membrana es también usado en algunas modalidades para minimizar el impedimento estérico entre la membrana y la cadena sintetizada.
Otros soportes sólidos adecuados incluyen aquellos en general conocidos en la téenica por ser adecuados para uso en metodologías de fase sólida, que incluyen, por ejemplo, soporte de vidrio como soporte Pri erTM 200, vidrio de poro controlado (CPG), vidrio de poro oxalil-controlado (véase, por ejemplo, Alul, et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1527), soporte derivado de un amipopilietilenglicol-soporte TentaGel (véase, por ejemplo, Wright, et al . , Tetrahedron Lett . , 1993, 34, 3373), y copolímero Poros-a de poliestireno/divinilbenceno.
Polímeros activados de superficie han sido demostrados par auso en la síntesis de ácidos nucleicos naturales y modificados y proteínas en varios medios de soportes sólidos. Un material de soporte sólido puede ser cualquier polímero adecuadamente uniforme en porosidad, que tiene suficiente contenido de amina, y suficiente flexibilidad para sufrir cualquiera de las manipulaciones propuestas sin perder su integridad. Ejemplos de materiales seleccionados adecuados incluyen nylón, polipropileno, poliéster, politetrafluoroetileno, poliestireno, policarbonato, y nitrocelulosa. Otros materiales pueden servir como un soporte sólido, dependiendo del diseño del investigador. En consideración de algunos diseños, por ejemplo, un metal recubierto, en particular oro o platino pueden ser seleccionados (véase por ejemplo , Publicación Estadounidense No.20010055761). En una modalidad de síntesis de oligonucleótido, por ejemplo, un nucleósido es anclado a un soporte sólido el cual es funcionalizado con residuos hidroxilo o amino. Alternativamente, un soporte sólido es derivatizado para proporcionar un grupo tialcoxitritilo de ácido lábil, tal como un grupo trimetoxitritilo (TMT). Sin ser ligado por teoría, se espera que la presencia de un grupo protector trialcoxitritilo permitirá la destritilación inicial bajo condiciones comúnmente usadas en sintetizadores de ADN. Para una liberación más rápida de material de oligonucleótido en solución con amoníaco acuoso, un enlazador de diglicolato es opcionalmente introducido sobre el soporte.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado alternativamente es sintetizado a partir de la dirección 5' a 3'. En algunas modalidades, un ácido nucleico está unido a un soporte sólido a través de su extremo 5' del ácido nucleico de crecimiento, de este modo presentando su grupo 3' para reacción, es decir, usando fosforamiditas de 5 '-nucleósido o en reacción enzimática (por ejemplo,· ligación y polimerización usando nucleósido de 5'-trifosfatos). Cuando se considera la síntesis de 5' a 3' las etapas iterativas de la presente invención permanecen sin cambio (es decir, tapado y modificación en el fósforo quiral).
Porción enlazante Una porción enlazante o enlazador es opcionalmente usada para conectar un soporte sólido a un compuesto que comprende una porción nucleofílica libre. Enlazadores adecuados son conocidos tales como moléculas cortas las cuales sirven para conectar un soporte sólido a grupos funcionales (por ejemplo, grupos hidroxilo) de moléculas de nucleósido iniciales en téenicas sintéticas de fase sólida. En algunas modalidades, la porción enlazante es un enlazador de ácido succinámico, o un enlazador de succinato (-CO-CH2- CH2-CO-), o un enlazador de oxalilo (-CO-CO-). En algunas modalidades, la porción enlazante y el nucleósido son unidos en conjunto a través de un enlace éster. En algunas modalidades, una porción enlazante y un nucleósido son unidos en conjunto a través de un enlace amida. En algunas modalidades, una porción enlazante conecta un nucleósido a otro nucleótido o ácido nucleico. Enlazadores adecuados se describen en, por ejemplo, Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, Capítulo 1 y Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis, Pon, R. T., Curr. Prot . Nucleic Acid Chem. , 2000, 3.1.1-3.1.28.
Una porción enlazadora se usa para conectar un compuesto que comprende una porción nucleofílica libre a otro nucleósido, nucleótido, o ácido nucleico. En algunas modalidades, una porción enlazante es un enlace fosfodiéster. En algunas modalidades, una porción enlazante es una porción H-fosfonato . En algunas modalidades, una porción enlazante es un enlace de fósforo modificado como se describe en la presente. En algunas modalidades, un enlazador universal (Unienlazador) se usa para unir el oligonucleótido al soporte sólido (Ravikumar et al., Org. Process Res. Dev. , 2008, 12 (3), 399-410)). En algunas modalidades, otros enlazadores universales son usados (Pon, R. T., Curr. Prot . Nucleic Acid Chem. , 2000, 3.1.1-3.1.28). En algunas modalidades, varios enlazadores ortogonales (tales como enlazadores de disulfuro) son usados (Pon, R. T., Curr. Prot . Nucleic Acid Chem. , 2000, 3.1.1-3.1.28).
Condiciones generales - solventes para síntesis Las síntesis de oligonucleótidos proporcionados son en general realizadas en solvente sorgánicos aprótcos. En algunas modalidades, un solvente es un solvente de nitrilo tal como, por ejemplo, acetonitrilo. En algunas modalidades, un solvente es un solvente de amina básica tal como, por ejemplo, piridina. En algunas modalidades, un solvente es un solvente étere tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano. En algunas modalidades, un solvent es un hidrocarburo halogenado tal como, por ejemplo, diclorometano. En algunas modalidades, se usa una mezcla de solvents. En ciertas modalidades un solvente es una mezcla de cualquiera o más de las clases de solventes desritas anteriormente.
En algunas modalidades, cuando un solvente orgánico aprótico no es básicto, una base está presente en la etapa de reacción. En algunas modalidades donde una base está presente, la base es una base amina tal como, por ejemplo, piridina, quinolina, o N, N-dimetilanilina. Otras bases amina ejemplares incluyen pirrolidina, piperidina, N-metil pirrolidina, piridina, quinolina, N, -dimetilaminopiridina (DMAP), o N, N-dimetilanilina.
En algunas modalidades, una base es distinta de una base amna.
En algunas modalidades, un solvente orgánico aprótico es anhidro. En algunas modalidades, un solvente orgánico aprótico anhidro es destilado libremente. En algunas modalidades, un solvente orgánico aprótico anhidro destilado libremente es un solvente de amina básica tal como, por ejemplo, piridina. En algunas modalidades, un solvente orgánico aprótico anhidro destilado recientemente es un solvente etéreo tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano. En algunas modalidades, un solvente orgánico aprótico anhidro destilado recientemente es un solvente de nitrilo tal como, por ejemplo, acetonitrilo.
Reactivo quiral En métodos proporcionados, los reactivos quirales son usados para conferir estereoselectividad en la producción de oligonucleótidos quiralmente controlados. Muchos quirales reactivos diferentes, también son referidos por aquellos de habilidad en la téenica y en la presente como auxiliares quirales, pueden ser usados de conformidad con métodos de la presente invención. Ejemplares de tales reactivos quirales se describen en la presente y en Wada I, II y III, referenciado anteriormente. En ciertas modalidades, un reactivo quiral es como se describe por Wada I. En algunas modalidades, un reactivo quiral para uso de conformidad con los métodos de la presente invención son de fórmula 3-1, abajo: Fórmula 3-1 en donde W1 y W2 son cualquiera de -O-, -S-, o NG5-, Ui y U3 son átomos de carbono los cuales están unidos a U2 si está presente, o a cada otro si r es 0, mediante un enlace único, doble o triple. U2 es -C-, -CG8-, -CG8G8-, -NG8-, -N-, -O-, o -S- donde r es un número entero de 0 a 5 y no más de dos heteroátomos son adyacentes. Cuando uno cualquiera de U2 es C, se debe formar un enlace triple entre un segundo caso de U2, el cual es C, o a uno de Ui o U3. De manera similar, cuando uno cualquiera de U2 es CG8, se forma un doble enlace entre un segundo caso de U2 el cual es -CG8- o -N-, o a uno de Ui o U3.
En algunas modalidades, -Ui-(U2)r-U3- es -CG3G4-CG1G2-. En algunas modalidades, -Ui~(U2)r-U3- es -CG3= CG1-. En algunas modalidades, -Ui-(U2)r-U3- es -CºC-. En algunas modalidades -Ui- (U2) r-U3- es -CG3=CG8-CG1G2 En algunas modalidades, -Ui- (U2 ) r-U3- es -CG3G4-O-CG1G2 En algunas modalidades, -UI- (U2) r-Us- es -CG3G4-NG8-CG1G En algunas modalidades -Ui-(U2)r-U3- es -CG3G4-N-CG2-. En algunas modalidades, -üi-(U2)r-ü3- es -CG3G4-N=C G8-CG1G2-.
Como se define en la presente, G1, G2, G3, G4, G5, y G8 son independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo, y arilo; o dos de G1, G2, G3, G4, y G5 son G6 tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo o carbociclico saturado, parcialmente insaturado o no saturado, opcionalmente sustituido de hasta aproximadamente 20 átomos en el anillo el cual es monociclico o policiclico, y es fusionado o no fusionado. En algunas modalidades, un anillo así formado es sustituido por porciones oxo, tioxo, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo, o arilo. En algunas modalidades, cuando un anillo formado tomando dos G6 en conjunto es sustituido, es sustituido por una porción la cual es bastante voluminosa para conferir estereoselectividad durante la reacción.
En algunas modalidades, un anillo formado tomando dos de G6 en conjunto es ciclopentilo, pirrolilo, ciclopropilo, ciclohexenilo, ciclopentenilo, tetrahidropiranilo, o piperazinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, un anillo formado tomando dos de G6 en conjunto es ciclopentilo, pirrolilo, ciclopropilo, ciclohexenilo, ciclopentenilo, tetrahidropiranilo, pirrolidinilo, o piperazinilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, G1 es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, G1 es fenilo. En algunas modalidades, G2 es metilo o hidrógeno. En algunas modalidades, G1 es fenilo opcionalmente sustituido y G2 es metilo. En algunas modalidades, G1 es fenilo y G2 es metilo.
En algunas modalidades, r es 0.
En algunas modalidades, W1 es -NG5-. En algunas modalidades, uno de G3 y G4 es tomado en conjunto con G5 para formar un anillo pirrolidinilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, uno de G3 y G4 es tomado en conjunto con G5 para formar un anillo pirrolidinilo.
En algunas modalidades, W2 es -O-.
En algunas modalidades, un reactivo quiral es un compuesto de fórmula 3-AA: 1. Fórmula 3-DA en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades de fórmula 3AA, W1 y W2 son independientemente -NG5-, -O-, o -S-; G1, G2, G3, G4, y G5 son independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alguilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo, o arilo; o dos de G1, G2, G3, G4, y G5 son G6 tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo o carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, opcionalmente sustituido de hasta aproximadamente 20 átomos en el anillo el cual es monociclico o policiclico, fusionado o no fusionado, y no más de cuatro de G1, G2, G3, G4, y G5 son G6. De manera similar a los compuestos de fórmula 3-1, cualquiera de G1, G2, G3, G4, o G5 son opcionalmente sustituidos por porciones oxo, tioxo, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo, o arilo. En algunas modalidades, tal sustitución induce estereoselectividad en la producción de oligonucleótido quiral ente controlado.
En algunas modalidades, un reactivo quiral tiene una o más de las siguientes fórmulas: - Fórmulas 3-AB 3-BB 3-CC 3-DD 3-EE 3-FF En algunas modalidades, un reactivo quiral es un aminoalcohol. En algunas modalidades, un reactivo quiral es un aminotiol. En algunas modalidades, un reactivo quiral es un aminofenol. En algunas modalidades, un reactivo quiral es (S)- y (R)-2-metilamino-1-feniletanol, { IR, 2S) -efedrina, o { IR, 2 S) -2-metilamino-1,2-difeniletanol.
En algunas modalidades de la invención, un reactivo quiral es un compuesto de una de las siguientes fórmulas: Fórmula O Fórmula P Fórmula Q FórmulaR La elección del reactivo quiral, por ejemplo, el isómero representado por la Fórmula Q o su estereoisómero, Fórmula R, permite el control especifico de quiralidad en un fósforo de enlace. De este modo, ya sea una configuración Rp o Sp puede ser seleccionada en cada ciclo sintético, permitiendo el control de la estructura tridimensional total de un oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene todos los estereocentros Rp. En algunas modalidades de la invención, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene todos los estereocentros Sp. En algunas modalidades de la invención, cada fósforo de enlace en el oligonucleótido quiralmente controlado es independientemente Rp o Sp. En algunas modalidades de la invención, cada fósforo de enlace en el oligonucleótido quiralmente controlado es independientemente Rp o Sp, y al menos uno es Rp y al menos uno es Sp. En algunas modalidades, la selección de centros Rp y Sp se hace para conferir una superestructura tridimensional especifica a un oligonucleótido quiral ente controlado. Ejemplares de tales selecciones se describen en detalle adicional en la presente.
En algunas modalidades, un reactivo quiral para uso de conformidad con la presente invención se selecciona por su capacidad para ser removido en una etapa particular en el ciclo representado anteriormente. Por ejemplo, en algunas modalidades es deseable remover un reactivo quiral durante la etapa demodificación del fósforo de enlace. En algunas modalidades, es deseable remover un reactivo quiral antes de la etapa de modificación del fósforo de enlace. En algunas modalidades, es deseable remover un reactivo quiral después de la etapa de modificación del fósforo de enlace. En algunas modalidades, es deseable remover un reactivo quiral después que una primera etapa de acoplamiento ha ocurrido pero antes de que una segunda etapa de acoplamiento ha ocurrido, de manera que un reactivo quiral no está presente en el oligonucleótido de crecimiento durante el segundo acoplamiento (y del mismo modo para etapas de acoplamiento subsecuentes adicionales) . En algunas modalidades, un reactivo quiral es removido durante la reacción de "desbloqueo" que ocurre después de la modificación del fósforo de enlace pero antes de que un ciclo subsecuente comience. Métodos y reactivos ejemplares para remoción osn descritos en la presente.
En algunas modalidades, la remoción del auxiliar quiral se logra cuando se realiza la etapa de modificación y/o desbloqueo, como se ilustra en el Esquema de reacción I. Puede ser benéfico combinar la remoción del auxiliar quiral en conjunto con otras transformaciones, tales como modificación y desbloqueo. Una persona de habilidad ordinaria en la téenica podría apreciar que las etapas guardadas/transformación podrían mejorar la eficiencia total de la síntesis, por ejemplo, con respecto a un rendimiento y pureza del prodcuto, especialmente para oligonucleótidos más largos. Un ejemplo en donde el auxiliar quiral es removido durante la modificación y/o desbloqueo se ilustra en el Esquema de reacción I.
En algunas modalidades, un reactivo quiral para uso de conformidad con métodos de la presente invención se caracteriza porque es removible bajo ciertas condiciones. Por ejemplo, en algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido bajo condiciones acídicas. En ciertas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido bajo condiciones levemente acídicas. En ciertas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido por medio de una reacción de eliminación El (por ejemplo, la remoción ocurre debido a la formación de un intermediario de catión en el reactivo quiral bajo condiciones acidicas, causando que el reactivo quiral se desdoble a partir del oligonucleótido). En algunas modalidades, un reactivo quiral se caracteriza porque tiene una estructura reconocida por ser capaz de acomodar o facilitar una reacción de eliminación El. Uno de habilidad en las téenicas relevantes apreciará cuales estructuras podrían ser contempladas por ser propensas hacia sufrir tales reacciones de eliminación.
En algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido con un nucleófilo. En algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido con un nucleófilo de amina. En algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido con un nucleófilo distinto de una amina.
En algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido con una base. En algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido con una amina. En algunas modalidades, un reactivo quiral se selecciona por su capacidad para ser removido con una base distinta de una amina.
Modalidades Adicionales de Reactivos Quirales En algunas modalidades, la presente invención se dirige a un reactivo quiral que es usado para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son estables a las etapas de modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son estables a las etapas de sulfurización y desbloqueo descritas anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son estables a la etapa de oxidación descrita anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, tal reactivo quiral tiene una estructura de fórmula Z-I.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son removidos por tratamiento con una base y/o un nucleófilo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son removidos por tratamiento con una base y/o un nucleófilo, y son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son removidos por tratamiento que comprende una amina. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son removidos por tratamiento que comprende una amina, y son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos quirales que son removidos por las condiciones de desprotección/desdoblamiento descritas en esta solicitud, y son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, tal reactivo quiral tiene una estructura de fórmula Z-I.
En algunas modalidades, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo son usados para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados descritos anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo son usados para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados descritos anteriormente y en la presente, en donde los oligonucleótidos quiralmente controlados comprenden uno o más enlaces de fosfato diéster o fosforotioato diéster. En algunas modalidades, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo son usados para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces de fosfato diéster o fosforotioato diéster, y no son removidos hasta que se han logrado las longitudes de oligonucleótidos deseadas. En algunas modalidades, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo son usados para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces de fosfato diéster o fosforotioato diéster, y no son removidos hasta después de la salida del ciclo. En algunas modalidades, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo son usados para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces de fosfato diéster o fosforotioato diéster, y no son removidos hasta que se desdoblan del soporte sólido. En algunas modalidades, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo son usados para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces de fosfato diéster o fosforotioato diéster, y no son removidos hasta que se desdoblan del soporte sólido, y la remoción se realiza en la misma etapa como se desdobla a partir del soporte sólido. En algunas modalidades, tal reactivo quiral tiene una estructura de fórmula Z-I.
En algunas modalidades, cuando un reactivo quiral que es estable a las etapas de acoplamiento, tapado, modificación y desbloqueo se usa en la sintesis de oligonucleótido, el oligonucleótido con 5'-OH listo para acoplamiento puede ser a partir de cualquier ciclo sintetico, que incluye aquellos descritos en los Esquemas de reacción I, I-b, I-c, I-d, Z-l y Z-2 . En algunas modalidades, el oligonucleótido con 5'-OH para acoplamiento comprende varios tipos de enlaces internucleotidicos como se describe anteriormente y en la presente. Después del acoplamiento, la etapa de modificación como se describe en esta solicitud instala la modificación deseada al fósforo de enlace. El producto puede ya sea ir a la salida del ciclo antes/después del desbloqueo, o entrar al siguiente ciclo después del desbloqueo del 5'-OH. Se entiende por una persona de habilidad ordinaria en la téenica que el siguiente ciclo puede ser cualquiera de los ciclos sintéticos descritos en esta solicitud, que incluyen pero no se limitan a aquellos en los Esquemas de reacción I, I-b, I-c, I-d, Z-l y Z-2.
En algunas modalidades, un reactivo quiral o una sal del mismo para uso de conformidad con la presente invención es de la fórmula química (Z-I).
En la fórmula (Z-I), Gzl y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro (-NO2), un átomo de halógeno, un grupo ciano (-CN), un grupo de fórmula (Z-II) o (Z-III), o ambos G y G tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV) .
En algunas modalidades, un grupo de fórmula (Z-II) es como se representa abajo: en donde G21 hasta G23 ssoonn independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci-3.
En algunas modalidades, un grupo de fórmula (Z-III) es como se representa abajo: G31 - Si— G32 (Z-1II) G33 en donde G31hasta G33 son independientemente grupo alquilo Ci_4, grupo arilo C6-i4, grupo alcoxi Ci-4, grupo aralquilo C7-i4, grupo aril C6_14 alquilo Ci_4, grupo aril C6-i4 alcoxi Ci_4, o grupo alquil Ci_4 arilo C6-i4.
En algunas modalidades, un grupo de fórmula (Z-IV) es como se representa abajo: (Z-IV) en donde G41 hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3.
Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-14, o ambos Gz3 y Gz4 tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo que tiene 3 hasta 16 átomos de carbono, en conjunto con la porción NH en la fórmula (Z-I).
En algunas modalidades, un reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I'): (Z-lj 5 en donde Gzl y Gz2 son los mismos como anteriormente.
Es decir, Gzl y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de fórmula (Z-II) o (Z-III), o ambos Gzl y Gz2 tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV).
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gzl y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci_3.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gzl y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II) y cada uno de G21 hasta G23 es un átomo de hidrógeno .
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, GzZ es un grupo de fórmula (Z-II), y G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci3.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), cada uno de G21 y G22 es un átomo de hidrógeno y G23 es un grupo nitro.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno y Gz2 es un grupo de fórmula (III), y G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-i4, grupo aralquilo C7_i4/ grupo aril C6-i4 alquilo Ci-4, grupo aril C6-i4 alcoxi C1-4, o grupo alquil C1-4 arilo C6-14· En algunas modalidades, el reactivo quiral tiene la fórmula química (I') y G1 es un átomo de hidrógeno y G2 es un grupo de fórmula (III), y G31hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6, grupo aralquilo C7-10, grupo aril C6 alquilo C1-4, grupo aril C6 alcoxi C1-4, o grupo alquil C1-4 arilo C6.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4 o grupo arilo C6. Ejemplos de grupo alquilo Ci_4 son grupos metilo, grupo etilo, grupo n-propilo, grupo iso-propilo, grupo n-butilo y grupo tere-butilo.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 y G33 son grupo arilo C6 y G32 es grupo alquilo Ci_4.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl y Gz2 son tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), y G41 hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-4.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl y Gz2 son tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), en donde cada uno de G41hasta G46 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral es seleccionado a partir de una de las fórmulas químicas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, lia y 11b: En algunas modalidades, un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido para uso de conformidad con la presente invención es representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb): en donde Gz1 hasta Gz4 son los mismos como anteriormente, Gz5 es un grupo protector del grupo hidroxilo, y Bs es un grupo seleccionado a partir de los grupos representados por las siguientes fórmula (Z-VI) a (Z-XI), o derivados de los mismos.
- Ejemplos de Bs son una adenina, una timina, una citosina, una guanina, un uracilo, una -metilcitosina o derivados de los mismos; Rz2 es independientemente hidrógeno -OH, -SH NRdRd, -N3, halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, ORb, o -SRb, en donde Rh es una porción de bloqueo; Y1 es O, NRd, S, o Se; Rd es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2, o -HP(O)(Re); Re es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2-, o heteroaril-Y2-, o un catión el cual es Na+, Li+, o K+, o -O; Y2 es O, NRd, o S; Rz3 es un grupo representado por -CH2-, -(CH2)2-, - CH2NH-, O -CH2N(CH3) Ejemplos de G5 son tritilo, 4-monometoxitritilo, 4,4'-dimetoxitritilo, 4,4',4''-trimetoxitritilo, 9- fenilxantin-9-ilo (Pixil) y 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (OX) .
En algunas modalidades, un derivado de 3'- fosforamidita de nucleósido es representado por la fórmula (Z-Va') o (Z-Vb'): en donde cada uno de Gz1, Gz2, Gz5, Bs, Rz2, y Rz3 es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para la síntesis de un oligonucleótido quiralmente controlado.
En algunas modalidades, un método proporcionado comprende una primera etapa de hacer reaccionar una molécula que comprende una porción de íí-fosfonato aqural, el primer reactivo de activación y un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero. En algunas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I) y el monómero puede ser representado por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb'). El monómero reacciona con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado. En algunas modalidades, una etapa subsecuente comprende convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral.
En algunas modalidades, los presentes métodos proporcionan materiales estables y comercialmente disponibles como materiales de partida. En algunas modalidades, los presentes métodos proporcionan un oligonucleótido modificado de átomo de fósforo estereocontrolado usando un material de partida aquiral.
Como se muestra en los ejemplos de trabajo, en algunas modalidades los métodos de la presente invención no causan degradación durante las etapas de desprotección. Además, el método no requiere agentes de tapado especiales para producir derivados de oligonucléotido modificados de átomo de fósforo.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados usando un monómero quiral. En algunas modalidades, la primera etapa es hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido el cual es representado por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb') con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado. La segunda etapa es convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente descritas en la presente en esta especificación están aquí incorporadas por referencia en su totalidad en la misma magnitud como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.
Como se usa en esta sección de "Modalidades adicionales de Reactivos quinales" , en una reacción de condensación, el término "reactivo de activación" se refiere a un reactivo que activa un sitio menos reactivo y los proporciona más susceptible al ataque por un nucleófilo.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quinales", un grupo "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático. La porción alquilo puede ser un grupo alquilo saturado (lo cual significa que no contiene algunas unidades de insaturación, por ejemplo, enlaces dobles carbono-carbono o enlaces triples carbono-carbono) o la porción alquilo puede ser un grupo alquilo insaturado (lo cual significa que contiene al menos una unidad de insaturación). La porción alquilo, sea saturada o insaturada, puede ser de cadena recta, ramificada, o incluye una porción cíclica. El punto de unión de un alquilo es en un átomo de carbono que no es parte de un anillo. La porción "alquilo" puede tener 1 hasta 10 átomos de carbono (siempre que aparezca en la presente, un intervalo numérico tal como "1 hasta 10" se refiere a cada número entero en el intervalo dado; por ejemplo, "1 hasta 10 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede consistir de 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta y que incluye 10 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquilo" donde no se designa un intervalo numérico). Alquilo incluye tanto grupos alquilo de cadena recta como ramificada. El grupo alquilo de los compuestos descritos en la presente puede ser designado como "alquilo Ci-C6" o designaciones similares. Por medio del ejemplo solamente, "alquilo Oi-Ob" indica que existen uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis átomos de carbono en la cadena alquilo, es decir, la cadena alquilo es seleccionada a partir de por ejemplo, metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, y tere-butilo. Grupos alquilo típicos incluyen, pero no están en ninguna forma limitados a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo, alilo, ciclopropilmetilo, ciclobutilmetilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo, y similares. En un aspecto, un alquilo es un alquilo C1-C6. El grupo alquilo C1-3 significa un grupo alquilo recto o ramificado que tiene 1 hasta 3 átomos de carbono. Ejemplos de grupo alquilo C1-3 son metilo, etilo, propilo y isopropilo. Grupo alquilo C1-4 significa grupo alquilo recto o ramificado que tiene 1 hasta 4 átomos de carbono. Ejemplos de grupo alquilo Ci_4 son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, y tere-butilo.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "arilo" se refiere a un anillo aromático en donde cada uno de los átomos que forman el anillo es un átomo de carbono. Los anillos arilo son formados por cinco, seis, siete, ocho, nueve o más de nueve átomos de carbono. Los grupos arilo son uno sustituido o insustituido. En un aspecto, an arilo es un fenilo o un naftalenilo. Dependiendo de la estructura, un grupo arilo puede ser un monoradical o un diradical (es decir, un grupo arileno). En un aspecto, an arilo es un arilo C6-Cio· El grupo arilo C6-i4 significa un grupo arilo que tiene 6 hasta 14 átomos de carbono. Los ejemplos de grupo arilo C6-14 son fenilo, bifenilo, naftilo, antracilo, indanilo, ftalimidilo, naftimidilo, fenantridiní lo, y tetrahidronaftilo.
El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. Grupos aralquilo adecuados incluyen bencilo, picolilo, y similares, todos los cuales pueden ser opcionalmente sustituidos.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", una "porción acilo" se refiere a un grupo alquil(C=0), aril(C=0), o aralquil(C=0). Una porción acilo puede tener una porción de intervención (Y) es decir oxi, amino, tio, o seleno entre el grupo carbonilo y el hidrocarburo. Por ejemplo, un grupo acilo puede ser alquil-Y-(C=0), aril- Y-(C=0) o aralquil- Y-(C=0).
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", grupos "alquenilo" son hidrocarburos cíclicos y de cadena recta, cadena ramificada, que contienen al menos un enlace doble carbono-carbono. Los grupos alquenilo pueden ser sustituidos.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales" , grupos "alquinilo" son grupos hidrocarburos cíclicos y de cadena recta, cadena ramificada que contienen al menos un enlace triple carbono-carbono. Los grupos alquinilo pueden ser sustituidos.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales" , un grupo "alcoxi" se refiere a un grupo alquilo ligado a oxigeno, es decir, grupo (alquil)-O-, donde alquilo es como se define en la presente. Ejemplos incluyen grupos metoxi (-0CH3) o etoxi (-OCH2CH3).
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un grupo "alqueniloxi" se refiere a un grupo alquenilo ligado a oxigeno es decir, grupo (alquenil)-0-, donde alquenilo es como se define en la presente .
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un grupo "alquiniloxi" se refiere a un grupo alquinilo ligado a oxigeno, es decir, grupo (alquinil)-0-, donde alquinilo es como se define en la presente .
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un grupo "ariloxi" se refiere a un grupo arilo ligado a oxigeno es decir, grupo (aril)-O-, donde el arilo es como se define en la presente. Un ejemplo incluye grupo fenoxi (-OC6H5).
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "alquilseleno" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido adjunto a este, es decir, un grupo (alquil)-Se-, en donde alquilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quinales", el término "alquenilseleno" se refiere a un grupo alquenilo que tiene un grupo seleno sustituido adjunto a este, es decir, un grupo (alquenil)-Se-, en donde alquenilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quinales", el término "alquinilseleno" se refiere a un grupo alquinilo que tiene un grupo seleno sustituido adjunto a este, es decir, grupo (alquinil)-Se-, en donde alquenilo es definido en la presente .
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quinales", el término "alquiltio" se rpfiere a un grupo alquilo adjunto a un átomo de azufre puenteado, es decir, un grupo (alquil)-S-, en donde alquilo fs definido en la presente. Por ejemplo, un alquiltio es un pietiltio y similares.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quinales", el término "alqueniltio" se refiere a un grupo alquenilo adjunto a un átomo de azufre puenteado, es decir, un grupo (alquenil)-S-, en donde alquenilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "alquiniltio" se refiere a un grupo alquinilo adjunto a un átomo de azufre puenteado, es decir, un grupo (alquinil)-S-, en donde alquenilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales" , el término "alquilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquilo, es decir, -NH (alquil) o -N(alquil)2, en donde alquilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "alquenila ino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquenilo Le - NH(alquenil) o -N (alquenil)2, en donde alquenilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "alquinilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquinilo, es decir, - NH(alquinil) o - N (alquinil)2, en donde alquinilo es definido en la presente.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "halógeno" está propuesto para incluir flúor, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un "grupo fluorescente" se refiere a una molécula que, cuando se excita con luz que tiene una longitud de onda seleccionada, emite luz de una longitud de onda diferente. Los grupos fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, grupos indol, fluoresceina, tetrametilrodamina, Rojo Texas, BODIPY, ácido 5—[(2— aminoetil)amino]naftalen-1-sulfónico (EDANS), cumarina y amarillo Lucifer.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un "ión de amonio" es un catión poliatómico positivamente cargado de la fórmula química NH4 +.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un "ión de alquilamonio" es un ión de amonio que tiene al menos uno de sus átomos de hidrógeno reemplazados por un grupo alquilo, en donde alquilo es definido en la presente. Ejemplos incluyen ión de trietilamonio, ión de N,N-diisopropiletilamonio.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quirales", un "ión iminio" tiene la estructura general (Rx)2C=N(Rx)2+. Los grupos Rx se refieren a grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo como se definen en la presente. Un "ión imino heteroaromático" se refiere a un ión imino en donde el nitrógeno y sus grupos Rx adjuntos forman un anillo heteroaromático. Un "ión imino heterocíclico" se refiere a un ión imino en donde el nitrógeno y sus grupos Rx adjuntos forman un anillo heterocíclico.
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quinales", los términos "amino" o "amina" se refieren a un grupo de radical -N(Rh)2, donde cada Rh es independientemente hidrógeno, alquilo, fluoroalquilo, carbocielilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo, a menos que se declare de otro modo específicamente en la especificación. Cuando un grupo -N(Rh)2 tiene dos Rh distintos de hidrógeno puede ser cobinado con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4-, 5-, 6-, o 7-elementos. Por ejemplo, -N(Rh)2 significa que incluye, pero no se limita a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. Uno cualquiera o más de hidrógeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo son opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes los cuales son independientemente alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, hidroxi, halo, ciano, trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, trimetilsililo, -0R1, -SR1, -0C(O)Rl, -N(Ri)2, -CfOlR1, C( O)0Ri, -0C(0)N(Ri)2, -C(0)N(RÍ)2, -N(Ri)C(0)0R, -N(R1)C(O)R1, - N(R1)C(0)N(R1)2, N(R1)C(NR1)N(R1)2I, -NÍR^SÍOÍtR1 (donde t es 1 o 2), -S(O), o -S(O)tN(R1)2 (donde t es 1 o 2), donde cada R1 es independientemente hidrógeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterocielilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo.
Como se usa en esta sección "Modalidades adicionales de Reactivos quinales" , "carbamato" como se usa en la presente, se refiere a una porción unida a un grupo amino el cual tiene la fórmula -C(O)0R donde R es alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo. Ejemplos incluyen pero no se limitan a grupo Boc (terc-butil-OC(0)-), CBz (bencil-OC(0)-), Teoc (Me3SiCH2CH2OC(O)-), alloc (alil-OC(0)-), o Fmoc (9-fluorenilmetil-OC (0)-).
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", "sililo sustituido" como se usa en la presente, se refiere a una porción la cual tiene la fórmula Rx3Si-. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, TBDMS (terc-butildimetilsilil), TBDPS (terc- butildifenilsilil) o TMS (trimetilsilil).
Como se usa en esta sección " Modalidades adicionales de Reactivos quirales", el término "tiol" se refiere a grupos -SH, e incluye grupos tiol sustituidos, es decir, grupos -SRJ, en donde RJ son cada uno independientemente un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo aralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido como se define en la presente.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral o una sal del mismo. En algunas modalidades, un reactivo quiral es de la siguiente fórmula química (Z-I): (Z-I) en donde Gzl y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano (-CN), un grupo de fórmula (Z-II) o (Z-III), o ambos Gzl y Gz2 tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z- IV). En algunas modalidades, el término "reactivo quiral" es una composición química la cual es usada para producir derivados de oligonucleótido o nucleótido modificado de átomo de fósforo estereocontrolado. Un reactivo quiral reacciona con un nucleósido para formar un intermediario quiral.
En algunas modalidades, un grupo de fórmula (Z-II) es de la siguiente fórmula: en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un 5 grupo ciano o grupo alquilo Ci_3. En algunas modalidades, ejemplos de G21 hasta G23 son un átomo de hidrógeno.
En algunas modalidades, un grupo de fórmula (Z-III) : en donde G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo Ci_4, grupo arilo C6-i4, grupo alcoxi Ci_4, grupo aralquilo C7_14, grupo aril Ob-i4 alquilo Ci_4, grupo aril C6-i4 alcoxi Ci_4, o grupo alquil Ci_4 arilo C6_i4. Ejemplos de grupo aril Ce-14 alquilo C1-4 son grupo metilfenilo, y grupo etilfenilo. Ejemplos de grupo aril Ce-14 alcoxi Ci_4 son grupo metoxifenilo y grupo etoxifenilo. Ejemplos de grupos alquil C1-4 arilo C6-14 son grupo bencilo y grupo fenilgrupo. En algunas modalidades, ejemplos de G31 hasta G33 son independientemente un grupo metilo y un grupo fenilo.
En algunas modalidades, un grupo de fórmula (Z-IV) es de la siguiente fórmula: (Z-IV) 5 en donde G41 hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3. En algunas modalidades, ejemplos de G41 hasta G46 son un átomo de hidrógeno.
Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-i4, o ambos Gz3 y Gz4 tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo que tiene 3 hasta 16 átomos de carbono. En algunas modalidades, ejemplos de G3 y G4 son aquellos tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo que tiene 3 hasta 16 átomos de carbono con NH porción en la fórmula (I).
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I').
; En la fórmula (Z-I'), Gzl y Gz2 son los mismos como anteriormente y Gzl y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de fórmula (Z-II) o (Z-III), o ambos Gzl y Gz2 tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV).
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gzl y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alguilo Ci_3.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gzl y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II) y cada uno de G21 hasta G23 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), y G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), cada uno de G21 y G22 es un átomo de hidrógeno y G23 es un grupo nitro (-NO2).
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-i4, grupo aralquilo C7-i4, grupo aril C6-i4 alquilo Ci_4, grupo aril C6-i4 alcoxi Ci-4, o grupo alquil Ci_4 arilo C6-i4.
En algunas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo Ci_4 o grupo arilo C6 (un grupo fenilo). Ejemplos de grupo alquilo Ci_4 son grupos metilo, grupo etilo, grupo n-propilo, grupo íso-propilo, grupo n-butilo y grupo tere-butilo.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 hasta G33 son independientemente un grupo alquilo C1-2 (un grupo metilo o an grupo etilo) o grupo arilo C6 (un grupo fenilo).
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo Ci_4.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z—I') y Gzl es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), y G31 y G33 son grupo arilo C6 (un grupo fenilo) y G32 es un grupo alquilo C1-2.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gzl y Gz2 son tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), y G41 hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z—I') y Gzl y Gz2 son tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), en donde cada uno de G41hasta G46 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas modalidades, un reactivo quiral es seleccionado a partir de una de las fórmulas químicas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, lia y 11b: - Es decir en algunas modalidades un reactivo quiral es seleccionado a partir de: (S)-2-(Metildifenilsilil)-1-((S)-1-pirrolidin-2-il)etanol (3a), (R)-2-(Metildifenilsilil)-1-((R)-l-pirrolidin-2-il)etanol (3b), (S)-2-(Trimetilsilil)-1-((S)-l-pirrolidin-2- l ) etanol (5a) (R) -2- (Trimetilsilil ) -1- ( ( R) -l-pirrolidin-2 l ) etanol (Z-5b) , (R) -2 , 2-Difenil-l-((S)-pirrolidin-2-il)etanol (7a), (S)-2,2-Difenil-1-((R)-pirrolidin-2-il)etanol (7b), (R)-2-(4-Nitrofenil)-1-((S)-pirrolidin-2-il)etanol (9a) (S)-2-(4-Nitrofenil)-1-((R)-pirrolidin-2-il)etanol ( 9b) , (R)-(9íí-Fluororen-9-il)((S)-pirrolidin-2-il)metano! (Ha) , o (S)-(9íf-Fluororen-9-il)((R)-pirrolidin-2-il)metanol (Hb) .
El reactivo quiral reacciona con un ácido nucleico o ácido nucleico modificado para ser un grupo auxiliar asimétrico. Un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido, el cual es un intermedíate de manufacturación de un derivado de oligonucleótido modificado de átomo de fósforo estereocontrolado, se obtiene por hacer reaccionar un reactivo quiral con un ácido nucleico o ácido nucleico modificado.
En algunas modalidades, la invención proporciona un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido el cual es representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb). Los compuestos de fórmula (Z-Va) y (Z-Vb) son conocidos como monó eros que son usados para sintetizar derivados de oligonucleótidos.
Estos compuestos son también conocidos como monómeros de oxazafosfolidina. Las porciones de azúcar de los compuestos representados por la fórmula (Z-Vb) son conocidos como BNA y LNA (cuando Rz3 es un grupo metileno).
; En la fórmula (Z-Va) y (Z-Va), Gzlhasta Gz4 son los mismos como anteriormente, Gz5 es un grupo protector del grupo hidroxilo, y Bs es un grupo seleccionado a partir de los grupos representados por la fórmula (Z-VI) a (Z-XI) o derivados de los mismos.
(Z-IX) (Z-X) (Z-XI) Ejemplos de Bs son una adenina, una ti ina, una citosina, una guanina, un uracilo, una 5-metilcitosina o derivados de los mismos; Rz2 es independientemente hidrógeno, -OH, -SH, NRdRd, -N3, halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, ORb, o -SRb, en donde Rb es una porción de bloqueo; Y1 es 0, NRd, S, o Se; Rd es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(0)(Re)2, o -HP(0)(Re); Re es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2-, o heteroaril-Y2-, o un catión el cual es Na+, Li+, o K+, o -O; Y2 es 0, NRd, o S; Rz3 es un grupo representado por -CH2-, -(CH2)2-, - CH2NH-, o -CH2N(CH3) Ejemplos de Gz5 son tritilo, 4-monometoxitritilo, 4,4 '-dimetoxitritilo, ,4',4''-trimetoxitritilo, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixil) y 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX).
En algunas modalidades, Bs es un adenina, una timina, una citosina, una guanina, o derivados de los mismos. En algunas modalidades, Bs es una núcleobase o una núcleobase modificada. Derivados ejemplares son, por ejemplo, aquellos descritos en el documento JP 2005-89441 A, y son presentados como sigue: en donde, en la fórmula anterior, cada uno de RB a R10 es independientemente alquilo Ci-i0, arilo C6-Ci0, aralquilo C6-C10, o ariloxialquilo C6-C10. En algunas modalidades, R8 es metilo, isopropilo, fenilo, bencilo, y fenoximetilo . En algunas modalidades, R9y R10son grupos alquilo Ci_4.
En algunas modalidades, un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido es representado por la fórmula (Z-Va') o (Z-Vb'): en donde, en la fórmula (Z-Va') y (Z-Vb'), cada uno de Gzl, -.22 .z5 Bs, Rz2 y Rz3 son los mismos como anteriormente. En ciertas modalidades, un derivado de 3'- fosforamidita de nucleósido es un monómero quiral el cual es usado para producir oligonucleótido y nucleótido modificado de ácido fosforoso estereocontrolado. Ejemplos de los derivados de 3'-fosforamidita de nucleósidos son representados por las siguientes fórmulas: 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, 26b, 27a, 27b, 28a, 28b, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 31b, 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 34b y 35a. i DMTr representa un grupo 4,41-dimetoxitritilo y TOM 5 representa un grupo triisopropilsiloximetilo.
Ejemplos usando un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido se describen en, por ejemplo, el documento JP 2005-89441 A. Por etapas de repetición de condensación y des-protection, los métodos de la presente invención facilitan el alargamiento de la cadena de oligonucleótido, como se describe en esta.
En algunas modalidades, un oligonucleótido es como se muestra en la fórmula (Z-X): - en donde, en la fórmula (Z-X) Xz representa sulfuro (=S), alquilo Ci_3, alcoxi Ci_3, alquiltio Ci_3, arilo Cg-Cio, aralquilo C6-C10, o ariloxialquilo C6-Ci0- En algunas modalidades, Xz representa sulfuro (=S). nz es un número entero que representa 1 hasta 150, 1 hasta 100, 1 hasta 50, o 1 hasta 30. En algunas modalidades, nz es preferiblemente 2 hasta 100, preferiblemente 10 hasta 100, preferiblemente 10 to 50, y más preferiblemente 15 a 30.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para la sintesis de un derivado de oligonucleótido modificado de átomo de fósforo estereocontrolado. En algunas modalidades, la primera etapa es una etapa de hacer reaccionar una molécule que comprende una porción de H-fosfonato aquiral, el primer reactivo de activación y un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero. En algunas modalidades, el reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I) o (Z-I') y el monómero puede ser representado por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb')· El monómero reacciona con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado. La siguiente etapa es una etapa para convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral. En algunas modalidades, los métodos son como se describen en el documento WO 2010/064146. En algunas modalidades, las etapas son como se describen en la ruta A y ruta B del documento WO 2010/064146.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para sintetizar oligonucleótido quiralmente controlado como se ilustra en el Esquema de reacción Z-l abajo.
Esquema de reacción Z-l .
Activación Uns porción de H-fosfonato aquiral se trata con el primer reactivo de activación para formar el primer intermediario. En una modalidad, el primer reactivo de activación se agrega a la mezcla de reacción durante la etapa de condensación. El uso del primer reactivo de activación es dependiente de las condiciones de reacciónt ales como solventes que son usados para la reacción. Ejemplos del primer reactivo de activación son fosgeno, triclorometil cloroformoato, bis(triclorometil)carbonato (BTC), cloruro de oxalilo, Ph3PCl2, (PhO)3PCl2, cloruro de N, N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosínico (BopCl), hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2- (3-nitro-l,2,4-triazol-1-il)-2-pirrolidin-l-il-1,3,2-diazafosfolidinio (MNTP), o hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-l-il-tris (pirrolidin-l-il)fosfonio ( PinTP) .
El ejemplo de la porción H-fosfonato aquiral es un compuesto mostrado en el Esquema de reacción anterior. DBU representa 1,8-diazabiciclo [5.4.0]undec-7-eno. H+DBU puede ser, por ejemplo, ión de amonio, ión de alquilamonio, ión de imino heteroaromático, o ión de imino heterocí clico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o un ión de metal monovalente.
Reacción con Reactivo quiral Después de la primera etapa de activación, la porción fí-fosfonato aquiral activada reacciona con un reactivo quiral, el cual es representado por la fórmula (Z-I) o (Z-I'), para formar un intermediario quiral de fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb').
Etapa de condensación estereoespecífica Un intermediario quiral de fórmula Z-Va ((Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb')) se trata con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado. El nucleósido puede estar en un soporte sólido. Ejemplos del segundo reactivo de activación son 4,5- dicianoimidazol (DCI), 4,5-dicloroimidazol, triflato de 1- fenilimidazolio (PhIMT), triflato de bencimidazolio (BIT), benztriazol, 3-nitro-l,2,4-triazol (NT), tetrazol, 5- etiltiotetrazol (ETT), 5-benciltiotetrazol (BTT), 5-(4- nitrofeniljtetrazol, triflato de W-cianometilpirrolidinio (CMPT), triflato de N-cianometilpiperidinio, triflato de N-cianometildimetilammonio. Un intermediario quiral de fórmula Z-Va ((Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb')) puede ser aislado como un monómero. Usualmente, el intermediario quiral de Z-Va ((Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb')) no es aislado y sufre una reacción en el mismo crisol con un nucleósido o nucleósido modificado para proporcionar un compuesto de fosfito quiral, un intermediario condensado. En otras modalidades, cuando el método se realiza mediante una síntesis de fase sólida, el soporte sólido que comprende el compuesto es filtrado lejos de sus productos secundarios, impurezas, y/o reactivos.
Etapa de Tapado Si el ácido nucleico final es más grande que un dímero, la porción -OH sin reaccionar es tapada con un grupo de bloqueo y el auxiliar quiral en el compuesto también puede ser tapado con un grupo de bloqueo para formar un intermediario condensado tapado. Si el ácido nucleico final es un dímero, entonces la etapa de tapado no es necesaria.
Etapa de Modificación El compuesto es modificado por reacción con un electrófilo. El intermediario condensado tapado puede ser ejecutado en una etapa de modificación. En algunas modalidades, la etapa de modificación se realiza usando un electrófilo de azufre, un electrófilo de selenio o un agente de boración. Ejemplos de etapas de modificación son etapa de oxidación y sulfurización.
En algunas modalidades del método, el electrófilo de azufre es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas: S8 (Fórmula Z-B), Zzl-S-S-Zz2, o Zzl-S-Vz-Zz2; en donde Zzl y Zz2 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida, o tiocarbonilo, o Zzl y Zz2 son tomados en conjunto para formar un anillo heterociclico o aliciclico de 3 a 8 elementos, el cual puede ser sustituido o no sustituido; Vz es S02, 0, o NRf; y Rf es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, o arilo .
En algunas modalidades del método, el electrófilo de azufre es un compuesto de las siguientes Fórmulas Z-A, Z-B, Z-C, Z-D, Z-E, o Z-F: Fórmula Z-A Fórmula Z-B Fórmula Z-C Fórmula Z-D Fórmula Z-E FórmulaZ-F En algunas modalidades, el electrófilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas: Se (Fórmula Z-G), Zz3-Se-Se-Zz4, o Zz3-Se-Vz-Zz4; en donde Zz3 y Zz4 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida,, imida, o tiocarbonilo, o Zz3 y Zz4 son tomados en conjunto para formar un anillo heterociclico o alicíclico de 3 a 8 elementos, el cual puede ser sustituido o no sustituido; Vz es S02, S, O, o NRf; y Rf es hidróqeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, o arilo.
En algunas modalidades, el electrófilo de selenio es un compuesto de fórmula Z-G, Z-H, Z-I, Z-J, Z-K, o Z-L.
Fórmula Z-G Fórmula Z-H Fórmula Z-I Fórmula Z-J Fórmula Z-K Fórmula Z-L En algunas modalidades, el agente de boración es borano-N,N-diisopropiletilamina (BH3 DIPEA), borano-piridina (BH3 Py), borano-2-cloropiridina (BH3 CPy), borano-anilina (BH3 An), borano-tetrahidrofiirano (BH3 THF), o borano- dimetilsulfuro (BH3 Me2S).
En algunas modalidades del método, la etapa de modificación es es una etapa de oxidación. En algunas modalidades del método, la etapa de modificación es una etapa de oxidación usando condiciones similares como se describe anteriormente en esta solicitud. En algunas modalidades, una etapa de oxidación es como se describe en, por ejemplo, el documento JP 2010-265304 A y W02010/06146.
Ciclo de Elongación de Cadena y Etapa de Desprotección El intermediario condensado tapado es desbloqueado para remover el grupo de bloqueoen el extremo 5' de la cadena de ácido nucleico de crecimiento para proporcionar un compuesto. El compuesto es opcionalmente dejado reingresar al ciclo de elongación de cadena para formar un un intermediario condensado, un intermediario condensado tapado, un intermediario condensado tapado modificado, y un intermediario tapado modificado 5'-desprotegido. Siguiendo al menos una ronda del ciclo de elongación de cadenal, el intermediario tapado modificado 5'-desprotegido es además desbloqueado por remocidón del ligando auxiliar quiral y otros grupos protectores para, por ejemplo, núcleobase, núcleobase modificada, grupos protectores de azúcar y azúcar modificado, para proporcionar un ácido nucleico. En otras modalidades, el nucleósido que comprende una porción 5'-OH es un intermedíate a partir de un ciclo de elongación de cadena previo como se describe en la presente. En aún otras modalidades, el nucleósido que comprende una porción 5'-OH es un intermedíate obtenido a partir de otro método sintético de ácido nucleico conocido. En modalidades donde se usa un soporte sólido, el ácido nucleico modificado de átomo de fósforo es entonces desdoblado a partir del soporte sólido. En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos se dejan unir en el soporte sólido para propósitos de purificación y después son desdoblados del soporte sólido después de la purificación.
En aún otras modalidades, el nucleósido que comprende una porción 5'-OH es un intermedíate obtenido a partir de otro método sintético de ácido nucleico conocido. En aún otras modalidades, el nucleósido que comprende una porción 5'-OH es un intermedíate obtenido a partir de otro método sintético de ácido nucleico conocido como se describe en esta solicitud. En aún otras modalidades, el nucleósido que comprende una porción 5'-OH es un intermedíate obtenido a partir de otro método sintético de ácido nucleico conocido que comprende uno o más ciclos ilustrados en el Esquema de reacción I. En aún otras modalidades, el nucleósido que comprende una porción 5'-OH es un intermedíate obtenido a partir de otro método sintético de ácido nucleico conocido que comprende uno o más ciclos ilustrados en el Esquema de reacción i-b, I-c o I-d.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de síntesis de oligonucleótidos que usan materiales estables y comercialmente disponibles como materiales de partida. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de sintesis de oligonucleótidos para producir derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados usando un material de partida aquiral.
En algunas modalidades, el método de la presente invención no causa degradaciones bajo las etapas de desprotección. Además el método no requiere agentes de tapado especial para producir derivados de oligonucleótidos modificados de átomo de fósforo.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados usando un monómero quiral. En algunas modalidades, la primera etapa es hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido el cual es representado por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va'), o (Z-Vb') con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado. La segunda etapa es convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral. Un método ejemplar es ilustrado en el Esquema de reacción Z-2 abajo.
Esquema de reacción Z-2 - Oligos Quirales Las condiciones detalladas del Esquema de reacción Z-2 son similares a aquellas de los Esquemas de reacción Z-l. El material de partida de fórmula Z-Va (Z-Vb), especialmente de fórmula Z-Va' (or Z-Vb'), es químicamente estable. Como se muestra en un ejemplo de trabajo, el método de la presente invención no causa degradaciones bajo las etapas de desprotección. Además el método no requiere agentes de tapado especial para producir derivados de oligonucleótidos modificados de átomo de fósforo.
En algunas modalidades, el mecanismo para la remoción de auxiliares se muestra como se ilustra en el Esquema de reacción Z-3, abajo.
Esquema de reacción Z-3.
En el Esquema de reacción Z-3, Nu representa un nucleófilo. En algunas modalidades, el mecanismo en el Esquema de reacción Z-3 se piensa es diferente a partir del mecanismo previo para la remoción de auxiliares.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral o una sal del mismo, el reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I): (Z-I) en donde Gzl y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de fórmula (Z-II) o (Z-III), o ambos Gzl y Gz2 tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci-3, en donde G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo Ci_4, grupo alcoxi Ci_4, grupo arilo ?6-?4 grupo aralquilo C7_i4, grupo aril C6-14 alquilo C1-4, grupo aril C6-alcoxi C1-4, o grupo alquil Ci_4 arilo Ce-1, en donde G 1 hasta G son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci_3, Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-i4, o ambos Gz3 y Gz4 tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo que tiene 3 hasta 16 átomos de carbono.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula Z-l tiene la siguiente fórmula química (Z-I') (Z-Ij en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-I'), en donde cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-I'), en donde cada uno de Gzl y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), en donde cada uno de G21hasta G23 es un átomo de hidrógeno. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-l'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-I'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-II), en donde cada uno de G21 y G22 es un átomo de hidrógeno y G23 es un grupo nitro. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-l'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), en donde G31 hasta G33 son independientemente grupo alguilo Ci_4, grupo arilo C6_i4, grupo aralquilo C7_14, grupo aril C6-i4 alquilo Ci_4, grupo aril C6-i4 alcoxi Ci_4, o grupo alquil Ci-4 arilo C6-i4. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-I'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), en donde G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo Ci_4, grupo arilo C6, grupo aralquilo C7-i0, grupo aril C6 alquilo Ci-4, grupo aril C6 alcoxi Ci_4, o grupo alquil C1-4 arilo C6. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-l'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), en donde G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, o grupo arilo C6. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-I'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), en donde G31 y G33 son grupo arilo C6 y G32 es un grupo alquilo C1-2. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z—1'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), en donde G31hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-l'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-III), en donde G31 y G33 son grupo arilo C6 y G32 es grupo alquilo Ci_4. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-l'), en donde Gzl es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de fórmula (Z-IV), en donde G41 hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci_3. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-l'), en donde Gzl y Gz2 son tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), en donde G41hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci_3. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de fórmula (Z-I'), en donde Gzl y Gz2 son tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), en donde cada uno de G41hasta G46 es un átomo de hidrógeno.
En algunas modalidades, un reactivo quiral o una sal del mismo es seleccionado a partir de fórmulas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, lia y 11b.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido el cual es representado por la fórmula Z-Va o Z-Vb: en donde Gzl y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de fórmula (Z—11) o (Z-III), o ambos Gzl y Gz2 tomados en conjunto para formar un grupo de fórmula (Z-IV), en donde G21 hasta G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo C1-3, 3322 (Z-III) en donde G31 hasta G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, grupo alcoxi Ci_4, grupo arilo C6-i4, grupo aralquilo C7_i4, grupo aril C6-i4 alquilo Ci-4, grupo aril Ce-14 alcoxi Ci_4, o grupo alquil Ci-4 arilo C6-i4, (Z-IV) en donde G41 hasta G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o grupo alquilo Ci-3; Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo Ci_3, grupo arilo C6-i4, o ambos Gz3 y Gz4 tomados en conjunto para formar un anillo que contiene heteroátomo que tiene 3 hasta 16 átomos de carbono; Gz5 es un grupo protector de un grupo hidroxilo; Rz2 es independientemente hidrógeno, -OH, -SH, NRdRd, —N3, halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, 0Rb, o -SRb, en donde Rb es una porción de bloqueo; Y1 es O, NRd, S, o Se; Rd es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(0)(Re)2, o -HP(0)(Re); Re es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2-, o heteroaril-Y2-, o un catión el cual es Na+, Li+, o K+, o -0; Y2 es 0, NRd, o S; Rz3 es un grupo representado por -CH2-, -(CH2)2-, - CH2NH-, O -CH2N(CH3) -; y Bs es un grupo seleccionado a partir de los grupos representados por la siguiente fórmula (Z-VI) to (Z-XI) o derivados de los mismos.
I I - En algunas modalidades, la presente invención proporciona un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido de fórmula Z-Va o Z-Vb, que tiene la estructura de (Z-Va') o (Z-Vb'): en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido seleccionado a partir de fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, 26b, 27a, 27b, 28a, 28b, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 31b, 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 34b y 35a. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido seleccionado a partir de fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, o 26b.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados que comprende las etapas de: hacer reaccionar una molécula que comprende una porción de íf-fosfonato aquiral, un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero de un derivado de 3'- fosforamidita de nucleósido; hacer reaccionar el monómero y un nucleósido para formar un intermediario condensado; y convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral; en donde el reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I).
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados que comprende las etapas de: hacer reaccionar una molécula que comprende una porción de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero de un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido; hacer reaccionar el monómero y un nucleósido para formar un intermediario condensado; y convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral; en donde el reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I').
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados que comprende las etapas de: hacer reaccionar una molécula que comprende una porción de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero de un derivado de 3'- fosforamidita de nucleósido; hacer reaccionar el monómero y un nucleósido para formar un intermediario condensado; y convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral; en donde el reactivo quiral es seleccionado a partir de fórmulas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, lia y 11b.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados que comprende las etapas de: hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido el cual es representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb), con un reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado; y convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados que comprende las etapas de: hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb), con un reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado; y convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral; y en donde el derivado de 3'- fosforamidita de nucleósido representado por la fórmula (Z- Va) o (Z-Vb) es seleccionado a partir de fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, 26b, 27a, 27b, 28a, 28b, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 31b, 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 34b y 35a. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido modificados de átomo de fósforo estereocontrolados que comprende las etapas de: hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb), con un reactivo de activación y un nucleósido para formar un intermediario condensado; y convertir el intermediario condensado al ácido nucleico que comprende una porción de fosfonato-X quiral; y en donde el derivado de 3'-fosforamidita de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb) es seleccionado a partir de fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, y 26b.
Preparación y Uso de Ciertos Auxiliares Quirales de Fórmula Z-I Abrevia tura ac: acetilo bz: benzoilo CSO: (1 S) - {+) - {10-camforsulfonil)oxaziridina DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DCA: ácido dicloroacético DCM: diclorometano, CH2CI2 Tr: tritilo, trifenilmetilo Melm: N-metilimidazol NES: W-yodosuccinimida pac: fenoxiacetilo Ph: fenilo PhIMT: triflato de N-fenilimidazolio POS: 3-fenil-1,2,4-ditiazolin-5-ona TBS: terc-butildimetilsililo TBDPS: terc-butildifenilsililo TOM: triisopropilsiloximetilo TFA: ácido trifluoroacético Procedimiento General para la Síntesis de Oligonucleótidos Quiralmente Controlados -1.
La sintesis de fase sólida automatizada de oligonucleótidos quiralmente controlados se realizó de conformidad con los ciclos mostrados en la Tabla Z-l.
Tabla Z-l. Procedimiento de Síntesis.
Procedimiento general para la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados -2.
La síntesis de fase sólida automatizada de oligonucleótidos quiralmente controlados se realizó de conformidad con los ciclos mostrados en la Tabla Z-2.
Tabla Z-2. de la Tabla Z- 2: El monoéster de Nucleósido-3'-H-fosfonato se secó por coevaporaciones repetidas con tolueno seco y después se disolvió en MeCN seco. Ph3PCl2 se agregó a la solución, y la mezcla se agitó por 5 min. A la mezcla, una solución de reactivo quiral, el cual es repetido con coevaporaciones con tolueno seco y disuelto en MeCN seco, se agregó por goteo mediante jeringa, y la mezcla se agitó por 5 min bajo argón.
Después de la síntesis, la resina se trató con una solución acuosa al 25% de NH3 (1 mL) por 12 h a 55 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y la resina se removió por filtración de membrana. Lo filtrado se concentró a sequedad bajo presión reducida. El residuo se disolvió en H2O (3 mL) y se analizó por RP-UPLC-MS con un gradiente lineal de acetonitrilo (0-50%/30 min) en 0.1 M de amortiguador de acetato de trietilamonio (pH 7.0) a 50 °C a una velocidad de 0.3 mL/min.
Ejemplo Z-l.
(S)-1-Tritilpirrolidin-2-carbaldehido (la). 1a El Compuesto la se sintetizó a partir de L-prolina de conformidad con el procedimiento descrito en la literatura (Guga, P. Curr. Top. Med. Chem. 2007, 7, 695-713.).
R) -l-Tritilpirrolidin-2-carbaldehido Ib . 1b El Compuesto Ib se sintetizó a partir de D-prolina en una manera similar al compuesto la.
(S)-2-(Metildifenilsilil)-1-(( S)-1- tritilpirrolidin-2-il)etanol (2a).
A una solución de cloruro de metildifenilsililmetil magnesio en THF preparada a partir de clorometildifenilmetilsilano (4.02 g, 16.3 mol) y magnesio (402 mg, 16.3 mmol) en THF (14 mL) se agregó la (2.79 g, 8.14 mmol) en solución de THF (30 mL) con enfriamiento en hielo. Después de la agitación por 1.5 h con enfriamiento en hielo, la mezcla se calentó a temperatura ambiente y continuó agitando por 30 in. NH4CI acuoso saturado (100 mL) se agregó a la mezcla de reacción a 0°C, y la extracción se realizó con dietiléter (100 mL) por tres veces. El extracto combinado se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró bajo presión 5 reducida. El residuo se cromatografió en gel de sílice proporcionando 2a como una espuma incolora (3.91 g, 87%).1H NMR (300 MHz, CDC13) d 7.48-7.08 (25H, m) , 4.33-4.23 (1H, m) , 3.16-2.89 ( 3H, m) , 2.84 (1H, brs), 1.70-1.54 (1H, m) , 1.35 (1H, dd, J = 14.7, 6.3Hz) , 1.10 (1H, dd, J = 14.7, 8.1Hz), 1.18-1.05 ( 1H, m) , 1.04-0.90 (1H, m) , 0.34 (3H, s), -0.17- -0.36 ( 1H, m) .
( S) -2- (Metildifenilsilil) -1- ( (S) -l-pirrolidin-2-il ) etanol ( 3a) . 2a (3.91 g, 7.06 mmol) se disolvió en 3% de DCA en DCM (70 mL), y se agitó por 10 min a temperatura ambiente. A la mezcla, se agregó NaOH 1M (200 L), y la extracción se realizó con DCM (100 mL) por tres veces. El extracto combinado se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se cromatografió en gel de sílice proporcionando 3a como un aceite amarillo ligero (1.99 g, 90%). XH NMR (300 MHz, CDC13) d 7.57-7.52 (5H, m), 7.38- 7.33 (5H, m), 3.77 (1H, ddd, J = 8.9, 5.4, 3.5Hz), 3.01 (1H, dt, J = 7.4, 3.6Hz), 2.97-2.79 (2H, m), 2.27 (2H, brs), 1.76- 1.53 (4H, m), 1.38 (1H, dd, J = 15.0, 9.0Hz), 1.24 (1H, dd, J = 15.0, 5.4Hz), 0.65 (3H, s); 13C NMR (100.4 MHz, CDC13) d 137.4, 137.1, 134.6, 134.5, 129.1, 127.8, 69.5, 64.1, 47.0, 25.8, 24.0, 19.6, -3.4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C19H26NOSi [M+H]+ 312.18, encontrado 312.06.
Ejemplo Z-2.
(R) -2-(Metildifenilsilil)-1-( (R) -1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (2b).
El Compuesto 2b se obtuvo usando Ib en lugar de la en una manera similar al compuesto 2a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) 5 7.48-7.12 (25H, m), 4.33-4.24 (1H, m), 3.16-2.89 (3H, m), 2.86 (1H, brs), 1.69-1.52 (1H, ), 1.35 (1H, dd, J = 14.4, 6.0Hz), 1.10 (1H, dd, J = 14.4, 8.4Hz), 1.18-1.05 (1H, m), 1.03-0.89 (1H, m), 0.33 (3H, s), -0.19- -0.39 (1H, m); 13C NMR (75.5 MHz, CDC13) d 144.5, 137.5, 136.8, 134.6, 134.3, 129.8, 129.0, 127.8, 127.7, 127.4, 126.1, 77.9, 71.7, 65.1, 53.5, 25. 0, 24.8 , 19. 6, -4. 0. MAL DI TOF-MS m/z Calculado para C38H40NOSi [M+H ] + 554.29, encontrado 554 .09.
(R) -2-(Metildifenilsilil)-1-(( R)-1-pirrolidin-2- il)etanol (3b).
El Compuesto 3b se obtuvo usando 2b en lugar de 2a en una manera similar al compuesto 3a.
XH NMR (300 MHz, CDC13) 87.58-7.52 (5H, m), 7.38-7.33 (5H, m), 3.78 ( 1H, ddd, J = 9.0, 5.1, 3.6Hz), 3.00 (1H, dt, J = 7.4, 3.3Hz), 2.97-2.78 (2H, m) , 2.19 (2H, brs) , 1.76-1.53 (4H, m) , 1.38 ( 1H, dd, J = 14.6, 9.0Hz), 1.24 (1H, dd, J = 14.6, 5.1Hz) , 0.66 ( 3H, s) ; 13C NMR (75.5 MHz, CDC13) d 137.5, 137.1, 134.5, 134.4, 129.0, 127.7, 69.2, 64.2, 46.9, 25.8, 24.0, 19.7, -3.4. MAL DI TOF-MS m/z Calculado para Ci9H26NOSi [M+H]+ 312.18, encontrado 312.09.
Ejemplo Z-3.
(S) -2-(Trimetilsilil)-1- ((5)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (4a).
El Compuesto 4a se obtuvo usando "clorometiltrimetilsilano" en lugar de "clorometildifenilmetilsilano" en una manera similar al compuesto 2a. CH NMR (300 MHz, CDC13) d 7.58-7.51 (5H, m), 7.31-7.14 (10H, m), 4.13 (1H, dt, J = 7.5, 3.0Hz), 3.39-3.31 (1H, m), 3.20-2.99 (2H, m), 2.84 (1H, s), 1.74-1.57 (1H, m), 1.29-1.10 (2H, m), 0.74 (1H, dd, J = 14.4, 7.2Hz), 0.46 (1H, dd, J = 14.4, 7.2Hz), -0.15 (9H, s). MALDI TOF-MS m/z Calculado para C28H36NOSi [M+H]+ 430.26, encontrado 430.09.
S -2- Trimetilsilil -1- ( S) -l-pirrolidin-2 1)etanol (5a).
El Compuesto 5a se obtuvo usando 4a en lugar de 2a en una manera similar al compuesto 3a.1H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 3.76 (1H, ddd, J = 8.8, 5.7, 3.3Hz), 3.08 (1H, dt, J = 7.8, 3.3Hz), 3.02-2.87 (2H, m), 2.48 (2H, brs), 1.81-1.58 (4H, m), 0.83 (1H, dd, J = 14.7, 8.7Hz), 0.68 (1H, dd, J = 14.7, 6.0Hz), 0.05 (9H, s); 13C NMR (75.5 MHz, CDCI3) d 69.6, 64.3, 46.9, 25.8, 23.9, 22.0, -0.8. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C9H22NOS1 [M+H]+ 188.15, encontrado 188.00.
Ejemplo Z-5.
{R) -2,2-Difenil-l-( (S) -l-tritilpirrolidin-2- il)etanol (6a).
A una solución de difenilmetano (6.7 mL, 40mmol) en THF anhidro (36 mL), n-BuLi (1.67M de solución de Hexano, 24mL, 40mmol) se agregó por goteo a temperatura ambiente y se agitó por 1 h. A la mezcla, la (3.4l , lOm ol), la cual se secó por coevaporaciones repetidas con tolueno, en THF anhidro (40mL) se agregó lentamente a 0 °C, y continuó agitando por 45 min. Una solución aguosa saturada de NH4C1 (lOOmL) y Et20 (lOOmL) se agregaron entonces, y la capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con Et20 (2 * lOOmL). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar 6a (1.41g, 28%) como una espuma blanca.
(R)-2,2-Difenil-1-((S)-pirrolidin-2-il)etanol (7a). 6a (650mg, 1.27mmol) se disolvió en 3% de DCA en DCM (13 mL), y se agitó por 10 min a temperatura ambiente. A la mezcla, 1M NaOH (40 mL) se agregó, y la extracción se realizó con DCM (30 L) por tres veces. El extracto combinado se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se cromatografió en gel de sílice proporcionando 7a como un aceite amarillo ligero (316 mg, 93%).1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.44-7.38 (2H, m), 7.33-7.14 (8H, m), 4.46 (1H, dd, J = 9.9, 3.3Hz), 3.91 (1H, d, J = 9.9Hz), 3.02-2.88 (2H, m), 2.81-2.69 (1H, m), 2.52 (2H, brs), 1.88-1.56 (4H, m); 13C NMR (75.5 MHz, CDC13) d 142.3, 142.0, 128.6, 128.5, 128.4, 128.2, 126.5, 126.4, 73.5, 60.1, 55.8, 46.6, 25.8, 23.4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para CieH22NO [M+H]+ 268.17 encontrado 268.06.
Ejemplo Z-6.
(S)-2,2-Difenil-1-( (R) -l-tritilpirrolidin-2-il)etanol (6b).
El Compuesto 6b se obtuvo usando Ib en lugar de la en una manera similar al compuesto 6a.1H NMR (300 MHz, CDCI3) d 7.44-7.37 (6H, m), 7.30-7.01 (17H, m), 6.66-6.61 (2H, m), 4.80 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.63 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.36-3.28 (1H, m), 3.22-3.09 (1H, ), 3.01-2.89 (1H, m), 2.66 (1H, s), 1.90-1.75 (1H, m), 1.29-1.04 (2H, m), 0.00— 0.19 (1H, m); 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) d 144.2, 142.9, 141.6, 130.0, 128.5, 128.4, 127.9, 127.8, 127.4, 126.4, 126.2, 77.9, 75.9, 61.9, 55.4, 53.4, 24.7, 24.5. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C37H36NO [M+H]+ 510.28, encontrado 510.11.
(S) -2, 2-Difenil-l- ( {R) -pirrolidin-2-il ) etanol (7b) .
El Compuesto 7b se obtuvo usando 6b en lugar de 6a en una manera similar al compuesto 7a. CH NMR (300 MHz, CDC13) d 7.45-7.14 (10H, m) 4.45 (1H, dd, J = 9.9, 3.3Hz), 3.91 (1H, d, J = 9.9Hz) , 3.00 2.89 (2H, m) , 2.82-2.71 (1H, m) , 2.40 (2H, brs) , 1.87-1.55 ( 4H, m) ; 13C NMR (75.5 MHz , CDC13) d 142.3, 142.0, 128.5 128.3, 128.1, 126.3, 126.2, 73.4, 60.1, 55.9, 46.5, 25.8 23.5. MAL DI TOF-MS m/z Calculado para CI8H22NO [M+H]+ 268.17 encontrado 268.03.
Ejemplo Z-7.
( R)-2-(-Nitrofenil)-1- ((S)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (8a). 8a El Compuesto 8a se obtuvo usando "4-nitrobencilchlori.de" en lugar de "difenilmetano" en una manera similar al compuesto 6a. 1H NMR (300 MHz, CDCI3) d 8.09-8.03 (2H, m), 7.49-7.43 (6H, m), 7.28-7.09 (11H, m), 4.23 (1H, ddd, J = 8.3, 5.6, 3.0Hz), 3.43-3.33 (1H, m), 3.23- 3.11 (1H, m), 3.07-2.96 (1H, m), 2.83 (1H, brs), 2.74 (1H, dd, J = 13.8, 8.4Hz), 2.49 (1H, dd, J = 13.8, 5.1Hz), 1.83-1.67 (1H, m), 1.41-1.17 (2H, m), 0.27-0.08 (1H, m); 13C NMR (75.5 MHz, CDCI3) d 147.3, 146.3, 144.3, 129.8, 129.6, 127.5, 126.3, 123.4, 77.9, 74.8, 63.5, 53.2, 39.5, 25.0, 24.9. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C31H31N2O3 [M+H]+ 479.23, encontrado 479.08.
(R)-2-(4-Nitrofenil)-1-((S)-pirrolidin-2-il)etanol ( 9a) . 9a El Compuesto 9a se obtuvo usando 8a en lugar de 6a en una manera similar al compuesto 7a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.15 (2H, d, J = 8.7Hz), 7.42 (2H, d , J = 8.7Hz), 3.86-3.79 (1H, m), 3.16-3.07 (1H, m), 2.99-2.68 (6H, m), 1.84-1.68 (4H, m); 13C NMR (75.5 MHz, CDC13) d 147.4, 146.2, 129.9, 123.2, 72.4, 62.0, 46.6, 40.4, 25.7, 24.4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para Ci2Hi7N2O3 [M+H]+ 237.12, encontrado 237.01.
Ejemplo Z-8.
(S)-2-(4-Nitrofenil)-1-((R)-1-tritilpirrolidin-2-il) etanol (8b) . 8b El Compuesto 8b se obtuvo usando Ib en lugar de la en una manera similar al compuesto 8a.1H NMR (300 MHz, CDC13) d 8.09-8.04 (2H, m), 7.49-7.43 (6H, m), 7.28-7.09 (11H, m), 4.22 (1H, ddd, J = 8.4, 5.6, 3.0Hz), 3.43-3.33 (1H, m), 3.24- 3.10 (1H, m), 3.08-2.94 (1H, m), 2.81 (1H, brs), 2.75 (1H, dd, J = 14.0, 8.1Hz), 2.49 (1H, dd, J = 14.0, 5.1Hz), 1.81-1.67 ( 1H, m) , 1.40-1.16 (2H, m) , 0.26-0.09 (1H, m) ; 13C NMR (75.5 MHz , CDC13) d 147.3, 144.3, 129.8, 129.6, 129.4, 126.3, 123.5, 77.9, 74.8, 63.5, 53.2, 39.5, 25.0, 24.9. MAL DI TOF-MS m/z Calculado para C31H31N2O3 [M+H]+ 479.23, encontrado 479.08.
(S)-2- (4-Nitrofenil)-1-( (R) -pirrolidin-2-il)etanol (9b) . 9b El Compuesto 9b se obtuvo usando 8b en lugar de 8a en una manera similar al compuesto 9a. 1H NMR (300 MHz, CDC13) d 8.19-8.13 (2H, m) , 7.45-7.39 (2H, m) , 3.83 (1H, ddd, J = 7.7, 5.4, 3.9Hz) , 3.14 (1H, dt, J = 7.7, 3.9Hz), 3.01-2.87 (2H, m) , 2.83 (1H, d, J = 3.3Hz), 2.81 (1H, s) , 2.62 (2H, brs) , 1.79-1.72 (4H, m) ; 13C NMR (75.5 MHz, CDC13) d 147.3, 146.5, 130.0, 123.5, 72.7, 61.7, 46.7, 40.1, 25.8, 24.2. MAL DI TOF-MS m/z Calculado para CI2HI7N203 [M+H]+ 237.12, encontrado 237.02.
Ejemplo Z-9.
(R) -(9H-Fluoren-9-il)(( S)-1-tritilpirrolidin-2 il) metanol ( 10a) El Compuesto 10a se obtuvo usando "fluoreno" en lugar de "difenilmetano" en una manera similar al compuesto 6a. lE NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.70 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.66 (1H, d , J = 7.8Hz), 7.55 (2H, d, J = 7.5Hz), 7.44-7.09 (18H, m), 6.87-6.62 (1H, m), 4.55-4.48 (1H, m), 4.06 (1H, d, J = 7.5Hz), 3.43-3.34 (1H, m), 3.18-3.06 (1H, m), 2.98-2.88 (1H, ) , 2.85 (1H, brs), 1.42-1.24 (1H, m), 1.18-1.04 (1H, ), 0.53-0.39 (1H, m), -0.02- -0.20 (1H, m); MALDI TOF-MS m/z Calculado para C37H34NO [M+H]+ 508.26, encontrado 508.12.
(R) -(9H-Fluororen-9-il)(( S) -pirrolidin-2-il)metanol ( Ha) El Compuesto lia se obtuvo usando 10a en lugar de 6a en una manera similar al compuesto 7a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.76 (2H, d , J = 7.5Hz), 7.68 (2H, t, J = 8.0Hz), 7.43-7.35 (2H, m), 7.34-7.25 (2H, m), 4.28 (1H, d, J = 6.3Hz), 4.03 (1H, dd, J = 6.5, 4.2Hz), 3.19-3.11 (1H, m), 2.97-2.88 (1H, m), 2.86-2.76 (1H, m), 2.02 (2H, brs), 1.77-1.53 (3H, m), 1.38-1.23 (1H, m); MALDI TOF-MS m/z Calculado para CI8H20NO [M+H]+ 266.15, encontrado 266.04.
(S) -2-Tosil-1-((S)-l-tritilpirrolidin-2-il)etanol (12a' El Compuesto 12a' se obtuvo usando "clorometil p-tolil sulfona" en lugar de "clorometildifenilmetilsilano" en una manera similar al compuesto 2a.
CH NMR (600 MHz, CDC13) 8 7.66 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.48-7.44 (6H, m) , 7.35 (2H, d, J = 7.2Hz), 7.21-7.13 (9H, m) , 4.39-4.36 (1H, m) , 3.33 (1H, s) , 3.24-3.20 (1H, m) , 3.19-3.10 (2H, m) , 2.98-2.92 (2H, m) , 2.49 (3H, s) , 1.55-1.49 (1H, m) , 1.33-1.26 (1H, m), 1.12-1.04 (1H, m) , 0.22-0.14 (1H, m) ; 13C NMR (150.9 MHz, CDC13) 8 144.6, 144.5, 136.3, 129.9, 129.5, 128.1, 127.5, 126.2, 78.0, 69.1, 63.9, 60.2, 52.6, 25.5, 24.7, 21.7.
(S)-2-Tosil-1-((S)-l-tritilpirrolidin-2-il)etanol (13a' El Compuesto 13a' se obtuvo usando 12a' en lugar de 2a en una manera similar al compuesto 3a. lH NMR (600 MHz, CDCl3) 87.82 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.37 (2H, d, J = 8.4Hz), 4.01 (1H, ddd, J = 12.0, 5.1, 3.0Hz), 3.32 (1H, dd, J = 14.4, 3.0Hz), 3.25 (1H, dd, J = 14.4, 9.0Hz), 3.16 (1H, dt, J = 7.8, 5.1Hz), 2.90-2.82 (2H, m), 2.46 (3H, s), 2.04 (2H, brs), 1.78-1.63 (3H, m), 1.62-1.55 (1H, m); 13C NMR (150.9 MHz, CDC13) 8 144.5, 136.7, 129.7, 127.7, 67.4, 61.8, 60.1, 46.7, 25.7, 21.4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para Ci3H2oN03S [M+H]+ 270.12, encontrado 270.04. (i?)-2-Tosil-l-((i?)-l-tritilpirrolidin-2-il)etanol (12b' El Compuesto 12b' se obtuvo usando Ib en lugar de la en una manera similar al compuesto 12a'. lH NMR (600 MHz, CDC13) 87.66 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.47-7.44 (6H, m), 7.35 (2H, d, J = 7.8Hz), 7.21-7.13 (9H, m), 4.37 ( 1H, dt , J = 8.6, 2.4Hz), 3.33 (1H, s) , 3.23-3.20 (1H, m) , 3.19-3.12 (2H, m) , 2.98-2.92 (2H, m) , 2.49 (3H, s ), 1.56-1.49 ( 1H, m) , 1.32-1.26 (1H, m) , 1.11-1.03 (1H, m) , 0.23-0.15 ( 1H, m) ; 13C NMR (150.9 MHz, CDC13) d 144.6, 144.5, 136.3, 129.9, 129.6, 128.1, 127.6, 126.2, 78.0, 69.1, 63.9, 60.2, 52.6, 25.5, 24.7, 21.7.
( R ) -2-Tosil-l- ( ( R ) -1-trit ilpirrolidin-2-il ) etanol (13b').
El Compuesto 13b' se obtuvo usando 12b'’ en lugar de 12a' en una manera similar al compuesto 13a'. 3H NMR (600 MHz, CDC13) d 7.82 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.37 (2H, d, J = 8.4Hz), 4.01 (1H, ddd, J = 9.0, 5.1, 3.0Hz), 3.32 (1H, dd, J = 14.4, 3.0Hz), 3.25 (1H, dd, J = 14.4, 9.0Hz), 3.17 (1H, dt, J = 7.2, 5.1Hz), 2.89-2.83 (2H, m), 2.46 (3H, s), 2.04 (2H, brs), 1.79-1.64 (3H, m), 1.62-1.55 (1H, m); 13C NMR (150.9 MHz, CDC13) 5 144.8, 136.6, 129.8, 127.9, 67.7, 61.8, 60.1, 46.8, 25.9, 25.8, 21.6. MALDI TOF-MS m/z Calculado para Ci3H2oN03S [M+H] 270.12, encontrado 270.05.
Ejemplo Z—10.
Monómero de oxazafosfolidina 12a.
Ph 12a 3a (560 mg, 1.80 mmol) se secó por coevaporaciones repetidas con tolueno seco y se disolvió en dietiléter seco (0.90 mL) bajo argón. N-Metilmorfolina (400 micro L, 3.60 mmol) se agregó a la solución, y la solución resultante se agregó por goteo a una solución de PCl3 (160 micro L, 1.80 mmol) en dietiléter seco (0.90 mL) a 0 °C bajo argón con agitación. La mezcla entonces se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por 30 min. El clorhidrato de N- metilmorfolina resultante se removió por filtración bajo nitrógeno, y lo filtrado se concentró a sequedad bajo presión reducida para proporcionar el derivado de 2-cloro-l,3,2- oxazafosfolidina crudo. Los materiales crudos se disolvieron en THF recientemente destilado (3.6 mL) para elaborar soluciones de 0.5 M, las cuales son usadas para sintetizar el nucleósido de 3'-O-oxazafosfolidinas sin purificación adicional . 5 5 ' -O- (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-O- (cianoetil)guanosina (636 mg, 0.84 mmol) se secó por coevaporaciones repetidas con tolueno seco, y se disolvió en THF recientemente destilado (2.5 mL) bajo argón. Et3N (0.58 mL, 4.2 m ol) se agregó, y la mezcla se enfrió a -78 °C. A 0.5 M de solución del derivado 2-cloro-l,3,2-oxazafosfolidina crudo correspondiente en THF recientemente destilado (3.6 mL, 1.80 mmol) se agregó por goteo mediante una jeringa, y la mezcla se agitó por 15 min a temperatura ambiente. Una solución acuosa saturada de NaHCO3 (70 mL) y CHCI3 (70 mL) se agregaron entonces, y la capa orgánica se separó y se lavó con soluciones acuosas saturadas de NaHC03 (2 c 70 mL). Las capas acuosas combinadas se extrajeron nuevamente con CHCl3 (70 mL). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar 12a (829 mg, 90%) como una espuma blanca. H NMR (300 MHz, CDCI3) 88.77 (1H, brs), 7.99 (1H, s), 7.54- 6.98 (24H, m), 6.81-6.73 (4H, m), 6.35 (1H, dd, J = 8.0, 6.3Hz), 4.89-4.73 (4H, m), 4.68 (2H, brs), 4.05-3.98 (1H, m), 3.75 (6H, s), 3.62-3.46 (1H, m), 3.41-3.20 (3H, m), 3.18-3.04 (1H, m), 3.08 (2H, t, J = 6.6Hz), 2.58-2.36 (2H, m), 1.94- 1.59 (2H, ), 1.56 (1H, dd, J = 15.0, 8.7Hz), 1.43 (1H, dd, J = 15.0, 5.7Hz), 1.33-1.16 (2H, m), 0.62 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) 5153.5 (1P, s).
Ejemplo Z-ll.
Monómero de oxazafosfolidina 12b. _ El Compuesto 12b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 12a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.80 (1H, brs), 7.96 (1H, s), 7.54-6.96 (24H, m), 6.79-6.71 (4H, m), 6.19 (1H, t, J = 6.6Hz), 4.90-4.73 (4H, m), 4.66 (2H, brs), 4.16-4.08 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.60-3.36 (2H, m), 3.29 (1H, d, J = 3.9Hz), 3.27-3.12 (2H, m), 3.09 (2H, t , J = 6.6Hz), 2.59-2.46 (1H, m), 2.07-1.97 (1H, m), 1.94- 1.41 (5H, m), 1.36-1.18 (1H, m), 0.65 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) d 157.1 (1P, s).
Ejemplo Z-12.
Monó ero de oxazafosfolidina 13a.
El Compuesto 13a se obtuvo usando "5 ' -0- (DMTr)timidina" en lugar de "5 ' -0- (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. CH NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.58-7.23 (21H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.35 (1H, dd, J = 8.1, 5.7Hz), 4.79-4.67 (2H, m), 3.83-3.78 (1H, m), 3.78 (6H, s), 3.59-3.43 (1H, m), 3.34 (1H, dd, J = 10.5, 2.4Hz), 3.35-3.24 (1H, m), 3.20 (1H, dd, J = 10.5, 2.4Hz), 3.16-3.02 (1H, m), 2.36-2.26 (1H, m), 2.15-2.02 (1H, m), 1.92-1.77 (1H, m), 1.74-1.59 (1H, m), 1.52 (1H, dd, J = 14.7, 9.0Hz), 1.40 (3H, s), 1.45-1.15 (3H, m), 0.60 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 153.7 (1P, s).
Ejemplo Z-13.
Monómero de oxazafosfolidina 13b.
El Compuesto 13b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 13a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.46 (1H, brs), 7.59-7.20 (20H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.26 (1H, t, J = 6.8Hz), 4.78-4.65 (2H, m), 4.01-3.95 (1H, m), 3.78 (6H, s), 3.55-3.40 (1H, m), 3.42 (1H, dd, J = 10.5, 2.7Hz), 3.40-3.28 (1H, m), 3.22 (1H, dd, J = 10.5, 3.0Hz), 3.19-3.06 (1H, m), 2.16-1.95 (2H, ), 1.90-1.54 (3H, ), 1.49-1.35 (1H,.m), 1.43 (3H, s), 1.34-1.17 (2H, m), 0.67 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 156.2 (1P, s). Los oligos se sintetizaron usando el compuesto anterior 13b por el método general descrito anteriormente.
Ejemplo Z-14.
Monómero de oxazafosfolidina 14a.
El Compuesto 14a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-4-N- (isobutiril)citidina" en lugar de "5 '-O-(DMTr)-2-Al(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) 58.33 (1H, brs), 8.17 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.52-7.22 (19H, m), 7.07 (1H, d, J = 7.5Hz), 6.88-6.81 (4H, m), 6.20 (1H, t, J = 6.2Hz), 4.81-4.64 (2H, m), 3.93-3.87 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.59-3.43 (1H, m), 3.39-3.29 (3H, m), 3.16-3.02 (1H, m), 2.69-2.52 (2H, m), 2.12-2.00 (1H, m), 1.91-1.50 (3H, m), 1.47-1.32 (2H, m), 1.27-1.16 (7H, m), 0.60 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 154.8 (1P, s).
Ej emplo Z-16.
Monómero de oxazafosf olidina 14b .
El Compuesto 14b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 14a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.33 (1H, d, J = 7.5Hz), 8.23 (1H, brs), 7.57-7.22 (19H, m), 7.12 (1H, d, J = 7.5Hz), 6.88-6.81 (4H, m), 6.15 (1H, dd, J = 6.6, 4.2Hz), 4.82-4.63 (2H, m), 4.03-3.97 (1H, ), 3.80 (6H, s), 3.55-3.26 (4H, m), 3.19-3.05 (1H, m), 2.59 (1H, quintet, J = 6.9Hz), 2.39-2.27 (1H, m), 2.21-2.10 (1H, m), 1.90-1.56 (3H, m), 1.50-1.32 (2H, m), 1.26-1.17 (7H, m), 0.66 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 157.2 (1P, s). 5 Ejemplo Z-17.
Monómero de oxazafosfolidina 15a.
El Compuesto 15a se obtuvo usando "5' -O- (DMTr)-6- - (benzoil)adenosina" en lugar de "5'-O-(DMTr)-2-A7- (fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)uanosina" en una manera similar al compuesto 12a. lE NMR (600 MHz, CDCI3) d 8.71 (1H, s), 8.12 (1H, s), 8.04 (2H, d, J = 7.8Hz), 7.62-7.15 (23H, m), 6.80-6.75 (4H, m), 6.37 (1H, dd, J = 7.8, 6.0Hz), 4.94-4.88 (1H, m), 4.80 (1H, ddd, J = 12.0, 6.0, 5.4Hz), 4.07-4.04 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.58-3.49 (1H, m), 3.41-3.34 (1H, m), 3.33 (1H, dd, J = 10.8, 4.8Hz), 3.25 (1H, dd, J = 10.8, 4.8Hz), 3.13-3.06 (1H, m), 2.66-2.58 (1H, m), 2.40-2.35 (1H, m), 1.91-1.84 (1H, m), 1.73-1.66 (1H, m), 1.56 (1H, dd, J = 15.0, 9.0Hz), 1.44 (1H, dd, J = 15.0, 5.4Hz), 1.47-1.41 (1H, m), 1.30-1.23 (1H, m), 0.63 (3H, s); 31P NMR (243.0 MHz, CDCl3) d 151.8 (1P, s). 5 Ejemplo Z-18.
Monómero de oxazafosfolídina 15b El Compuesto 15b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 15a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.06 (1H, brs), 8.76 (1H, s), 8.12 (1H, s), 8.07- 7.99 (2H, m), 7.64-7.14 (22H, ), 6.83-6.75 (4H, m), 6.25 (1H, t, J = 6.6Hz), 4.86-4.75 (2H, m), 4.20-4.15 (1H, m), 3.77 (6H, s), 3.61-3.38 (2H, m), 3.36 (1H, dd, J = 10.2, 4.2Hz), 3.27 (1H, dd, J = 10.2, 4.2Hz), 3.27-3.13 (1H, m), 2.71-2.59 (1H, m), 2.12-2.01 (1H, m), 1.94-1.42 (5H, m), 1.36-1.20 (1H, m), 0. 67 ( 3H, s ) ) ; 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 157.3 (1P, s).
Ejemplo Z-19.
Monómero de oxazafosfolidina 16a.
— El Compuesto 16a se obtuvo usando 7a en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 13a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.57 (1H, d, J = 0.9Hz), 7.37-6.94 (20H, m), 6.87- 6.78 (4H, m), 6.48 (1H, dd, J = 8.6, 5.7Hz), 5.42 (1H, dd, J = 11.0, 5.1Hz), 4.81-4.71 (1H, m), 4.02 (1H, d, J = 11.0Hz), 3.83 (1H, d, J = 2.1Hz), 3.79 (6H, s), 3.61-3.41 (2H, m), 3.24-3.09 (1H, m), 3.16 (1H, dd, J = 10.8, 2.4Hz), 3.02 (1H, dd, J = 10.8, 2.4Hz), 2.54-2.44 (1H, m), 2.34-2.22 (1H, m), 1.94-1.79 (1H, m), 1.74-1.56 (1H, m), 1.38 (3H, s), 1.38-1.28 (2H, m); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 160.9 (1P, s).
Ejemplo Z-20.
Monómero de oxazafosfolidina 16b.
El Compuesto 16b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 16a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.57 (1H, d, J = 1.5Hz), 7.43-7.11 (20H, m), 6.85-6.78 (H, m), 6.48 (1H, dd, J = 7.5, 5.7Hz), 5.58 (1H, dd, J = 11.4, 5.1Hz), 4.82-4.73 (1H, m), 4.17-4.02 (2H, m), 3.78 (6H, s), 3.56-3.40 (3H, m), 3.32 (1H, dd, J = 10.7, 2.4Hz), 3.22-3.07 (1H, m), 2.26-2.04 (2H, m), 1.95-1.81 (1H,r m), 1.74-1.56 (1H, m), 1.40 (3H, d, J = 1.5Hz), 1.44-1.34 (2H, m); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 162.2 (1P, s).
Ejemplo Z-21.
Monómero de oxazafosfolidina 17a. 17a El Compuesto 17a se obtuvo usando 9a en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 13a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.22 (1H, brs), 8.05-7.99 (2H, m), 7.52 (1H, d, J = 1.2Hz), 7.41-7.19 (11H, m), 6.87-6.79 (4H, m), 6.37 (1H, dd, J = 8.4, 5.7Hz), 4.88-4.75 (2H, m), 3.86-3.80 (1H, m), 2¡.79 (6H, d, J = 1.2Hz), 3.64-3.49 (2H, m), 3.27-3.12 (3H, m), 2.97 (2H, d, J = 6.6Hz), 2.51-2.41 (1H, m), 2.33-2.20 (1H, m), 2.03-1.75 (2H, m), 1.72-1.59 (1H, m), 1.46-1.36 (1H, m), 1.40 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 157.5 (1P, s).
Ejemplo Z-22 Monómero de oxazafosfolidina 17b. 17b El Compuesto 17b se obtuvo usando 9b en lugar de 9a en una manera similar al compuesto 17a. 1H NMR (300 MHz, CDCI3) d 8.67 (1H, brs), 8.18-8.11 (2H, m), 7.57 (1H, d, J = 1.2Hz), 7.47-7.22 (11H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.29 (1H, t, J = 6.6Hz), 4.87 (1H, dt, J = 7.5, 5.7Hz), 4.80-4.72 (1H, m), 4.11-4.05 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.67-3.47 (2H, m), 3.43 (1H, dd, J = 10.8, 2.7Hz), 3.27 (1H, dd, J = 10.8, 2.4Hz), 3.25- 3.13 (1H, m), 3.07-2.99 (2H, m), 2.19-2.12 (2H, m), 2.03-1.62 (3H, m), 1.46-1.30 (1H, m), 1.41 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCl3) d 158.1 (1P, s).
Ej emplo Z-23.
Monómero de oxazafosfolidina 18a.
El Compuesto 18a se obtuvo usando "5 ' -O- (DMTr)-2 0-T0M-6-W-(acetil)adenosina" en lugar de "5'-O-(DMTr}-2-N-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.82 (1H, brs), 8.49 (1H, s), 8.10 (1H, s), 7.58-7.17 (19H, m), 6.83- 6.73 (4H, m), 6.11 (1H, d, J = 6.6Hz), 5.15 (1H, dd, J = 6.6, 5.4Hz), 4.98-4.77 (4H, m), 4.18-4.11 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.59-3.25 (4H, m), 3.16-3.02 (1H, m), 2.62 (3H, s), 1.91-1.53 (3H, m), 1.49-1.18 (3H, m), 0.96-0.80 (3H, m), 0.90 (18H, s), 0.62 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 156.7 (1P, s).
Ejemplo Z-24.
Monómero de oxazafosfolidina 18b.
El Compuesto 18b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 18a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.56 (1H, brs), 8.55 (1H, s), 8.13 (1H, s), 7.57- 7.17 (19H, m), 6.82-6.73 (4H, m), 6.16 (1H, d, J = 5.7Hz), 5.06 (1H, t, J = 5.6Hz), 4.93 (1H, d, J = 5.1Hz), 4.83 (1H, d, J = 5.1Hz), 4.81-4.69 (2H, m), 4.27-4.19 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.55-3.40 (2H, m), 3.33-3.16 (2H, m), 3.12-2.97 (1H, m), 2.63 (3H, s), 1.88-1.52 (3H, m), 1.45-1.16 (3H, m), 0.91-0.79 (3H, m), 0.86 (18H, s), 0.64 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) d 154.8 (1P, s).
Ejemplo Z-25.
Monó ero de oxazafosfolidina 19a.
El Compuesto 19a se obtuvo usando "5’-O-(DMTr)-2'-0-(metil)uridina" en lugar de "5 ' -O- (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.91 (1H, d, J = 7.8Hz), 7.58-7.20 (19H, m), 6.88-6.80 (4H, m), 5.96 (1H, d , J = 3.3Hz), 5.19 (1H, d, J = 7.8Hz), 4.88-4.78 (1H, m), 4.66-4.57 (1H, m), 4.03-3.95 (1H, m), 3.90-3.74 (1H, m), 3.78 (6H, s), 3.77-3.71 (1H, m), 3.58-3.29 (2H, m), 3.45 (3H, s), 3.13-2.82 (2H, m), 1.88-1.53 (3H, m), 1.49-1.16 (3H, m), 0.60 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.3 (1P, s).
Ejemplo Z-26.
Monómero de oxazafosfolidina 19b.
’ El Compuesto 19b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 19a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.10 (1H, d, J = 8.4Hz), 7.58-7.20 (19H, ), 6.87- 6.79 (4H, m), 5.89 (1H, d, J = 1.5Hz), 5.21 (1H, d, J = 8.4Hz), 4.92-4.82 (1H, m), 4.73-4.63 (1H, m), 4.15-4.08 (1H, m), 3.89-3.73 (1H, m), 3.78 (6H, s), 3.66-3.62 (1H, m), 3.57- 3.27 (2H, m), 3.30 (3H, s), 3.17-2.82 (2H, m), 1.89-1.55 (3H, m), 1.55-1.40 (1H, m), 1.35-1.15 (2H, m), 0.66 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCl3) d 157.5 (1P, s). 5 Ejemplo Z-27.
Monómero de oxazafosfolidina 20a.
El Compuesto 20a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-desoxi-2'-fluorouridina" en lugar de "5'-O-(DMTr)-2-N-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.85 (1H, d, J = 8.1Hz), 7.58-7.20 (19H, m), 6.87-6.79 (4H, m), 5.98 (1H, d , J = 16.5Hz), 5.23 (1H, d, J = 8.1Hz), 4.86-4.61 (3H, ), 3.99 (1H, d, J = 6.9Hz), 3.76 (6H, d, J = 3.0Hz), 3.56-3.34 (4H, m), 3.10-2.96 (1H, ), 1.88-1.74 (1H, m), 1.72-1.52 (2H, m), 1.48-1.16 (3H, m), 0.61 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) d 154.3 (1P, d, J = 8.9Hz).
Ejemplo Z-28.
Monómero de oxazafosfolidina 20b.
El Compuesto 20b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 20a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.01 (1H, d, J = 8.4Hz), 7.58-7.20 (19H, m), 6.87-6.79 (4H, m), 6.03 (1H, d, J = 16.2Hz), 5.29 (1H, d, J = 8.4Hz), 4.96 (1H, dd, J = 13.1, 7.5Hz), 4.80-4.54 (2H, m), 4.15 (1H, d, J = 9.0Hz), 3.78 (6H, s), 3.61-3.39 (3H, ), 3.37-3.25 (1H, m), 3.23-3.09 (1H, m), 1.91-1.56 (3H, m), 1.51-1.13 (3H, m), 0.66 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) d 158.9 (1P, d, J = 4.4Hz).
Ej emplo Z-29.
Monómero de oxazafosfolidina 21a El Compuesto 21a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-0-metoxietil-5-metiluridina" en lugar de "5' -O- (DMTr) -2-N-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.62-7.18 (21H, m), 6.84 (4H, d, J = 8.7Hz), 6.07 (1H, d, J = 5.7Hz), 4.86-4.76 (1H, m), 4.63-4.54 (1H, m), 4.20 (1H, t, J = 5.4Hz), 3.95-3.89 (1H, m), 3.78 (6H, s), 3.78-3.71 (2H, m), 3.60-3.48 (2H, m), 3.44-3.02 (5H, m), 3.31 (3H, s), 1.88-1.15 (6H, m), 1.35 (3H, s), 0.58 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 156.3 (1P, s).
Ejemplo Z-30.
Monómero de oxazafosfolidina 21b.
El Compuesto 21b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 21a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.71 (1H, d , J = 1.2Hz), 7.55-7.22 (20H, m), 6.86-6.78 (4H, m), 5.99 (1H, d, J = 3.9Hz), 4.78-4.62 (2H, m), 4.13-4.08 (1H, m), 4.07-4.02 (1H, m), 3.77 (6H, s), 3.77-3.70 (1H, m), 3.65-3.56 (1H, m), 3.52-3.36 (4H, m), 3.33-3.14 (2H, m), 3.29 (3H, s), 3.08-2.94 (1H, m), 1.86-1.72 (1H, m), 1.71-1.55 (2H, m), 1.30 (3H, d, J = 1.2Hz), 1.47-1.16 (3H, ) 0.64 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.6 (1P, s).
Ej emplo Z-31.
Monómero de oxazafosfolidina 22a E1 Compuesto 22a se obtuvo usando "5 ' -O- (DMTr)-2 ' - O-metil-4- -(isobutiril)citidina" en lugar de "5'-O-(DMTr)-2- N- (fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.49 (1H, d, J = 7.2Hz), 7.58-7.20 (19H, m), 6.96 (1H, d, J =7.2Hz), 6.90-6.82 (4H, m), 5.98 (1H, s), 4.84 (1H, dd, J = 13.1, 7.5Hz), 4.59 (1H, dt, J = 8.3, 4.5Hz), 4.19-4.13 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.78-3.72 (1H, m), 3.63-3.40 (3H, m), 3.55 (3H, s), 3.36-3.24 (1H, ), 3.09-2.95 (1H, m), 2.59 (1H, septeto, J = 6.9Hz), 1.85-1.53 (5H, m), 1.48-1.37 (1H, m), 1.24-1.17 (6H, ), 0.59 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.2 (1P, 5 Ejemplo Z-32.
Monómero de oxazafosfolidina 22b.
El Compuesto 22b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 22a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.62 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.57-7.23 (19H, ), 7.02 (1H, d, J =7.5Hz), 6.89-6.81 (4H, m), 5.92 (1H, s), 4.90 (1H, dt, J = 9.0, 5.7Hz), 4.61 (1H, dt, J = 8.7, 4.8Hz), 4.25-4.17 (1H, m), 3.81 (6H, s), 3.67 (1H, d, J = 4.5Hz), 3.62-3.25 (4H, m), 3.38 (3H, s), 3.16-3.02 (1H, m), 2.58 (1H, septeto, J = 6.9Hz), 1.87-1.40 (6H, m), 1.26-1.14 (6H, ), 0.64 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 158.2 (1P, s).
Ejemplo Z-33.
Monómero de oxazafosfolidina 23a.
El Compuesto 23a se obtuvo usando ”5'-O-(DMTr)-2'- O-metil-2-N-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en lugar de "5' -O- (DMTr)-2 -N- (fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.67 (1H, brs), 8.01 (1H, s), 7.56-7.16 (24H, m), 6.83-6.74 (4H, m), 6.08 (1H, d, J = 6.9Hz), 4.85-4.76 (1H, m), 4.84 (2H, t, J = 6.6Hz), 4.65-4.56 (1H, m), 4.59 (2H, brs), 4.48 (1H, dd, J = 6.6, 5.1Hz), 4.09-4.05 (1H, m), 3.75 (6H, s), 3.60-3.42 (2H, m), 3.40-3.26 (2H, m), 3.35 (3H, s), 3.18- 3.05 (1H, m), 3.08 (2H, t, J = 6.6Hz), 1.89-1.49 (3H, m), 1.48-1.16 (3H, ), 0.59 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 156.9 (1P, s). 5 Ejemplo Z-34.
Monómero de oxazafosfolidina 23b.
El Compuesto 23b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 23a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.74 (1H, brs), 8.09 (1H, s), 7.56-6.94 (24H, m), 6.84-6.71 (4H, m), 6.09 (1H, d, J = 4.8Hz), 4.83-4.70 (2H, m), 4.83 (2H, t, J = 6.6Hz), 4.63 (2H, brs), 4.35 (1H, t , J = 5.0Hz), 4.23-4.16 (1H, m), 3.75 (6H, s), 3.58-3.19 (4H, m), 3.32 (3H, s), 3.16-3.04 (1H, m), 3.07 (2H, t, J = 6.6Hz), 1.90-1.55 (3H, m), 1.48-1.15 (3H, m), 0.64 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) 6154.6 (1P, s).
Ejemplo Z-35.
Monómero de oxazafosfolidina 24a.
El Compuesto 24a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-desoxi-2'-fluoro-2-LG-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en lugar de "5 ’-O- (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-0- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.74 (1H, brs), 8.03 (1H, s), 7.55- 6.94 (24H, m), 6.80-6.69 (4H, m), 6.21 (1H, dd, J = 14.9, 3.6Hz), 5.34 (1H, dt, J = 52.3, 3.6Hz), 5.01-4.75 (2H, m), 4.84 (1H, t, J = 6.6Hz), 4.62 (2H, brs), 4.15-4.07 (1H, ), 3.73 (6H, s), 3.59-3.29 (4H, m), 3.15-3.00 (1H, m), 3.07 (2H, t, J = 6.6Hz), 1.90-1.49 (3H, m), 1.47-1.12 (3H, m), 0.58 (3H s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.6 (1P, d, J = 10.9Hz).
Ej emplo Z-36.
Monómero de oxazaf osf olidina 24b .
El Compuesto 24b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 24a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.81 (1H, brs), 8.06 (1H, s), 7.55-6.95 (24H, m), 6.77-6.69 (4H, m), 6.06 (1H, d, J = 17.1Hz), 5.24-5.08 (1H, m), 5.04-4.80 (2H, m), 4.87 (1H, t, J = 6.6Hz), 4.62 (2H, brs), 4.25-4.19 (1H, m), 3.73 (6H, s), 3.58-3.02 (5H, m), 3.10 (2H, t, J = 6.6Hz), 1.90-1.56 (3H, m), 1.50-1.15 (3H, m), 0.63 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 158.0 (1P, d, J = 4 .4Hz).
Ej emplo Z-37 .
Monómero de oxazafosfolidina 25a El Compuesto 25a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'- 0-T0M-4-N- (acetil)citidina" en lugar de "5'-O-(DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-O- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 10.04 (1H, brs), 8.30 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.51-7.21 (19H, m), 6.99 (1H, d, J = 7.5Hz), 6.89-6.81 (4H, m), 6.12 (1H, d, J = 3.3Hz), 5.07 (1H, d, J = 4.8Hz), 5.05 (1H, d, J = 4.8Hz), 4.84-4.75 (1H, m), 4.62-4.52 (1H, m), 4.31-4.25 (1H, m), 4.08-4.01 (1H, m), 3.78 (6H, d, J = 3.0Hz), 3.55-3.23 (4H, m), 3.10-2.96 (1H, m) , 2.24 (3H, s), 1.84-1.49 (3H, m), 1.46-0.96 (24H, m), 0.58 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 156.5 (1P, s). 5 Ej emplo Z-38 .
Monómero de oxazafosfolidina 25b , El Compuesto 25b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 25a. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 10.19 (1H, brs), 8.46 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.54-7.23 (19H, m), 7.01 (1H, d , J = 7.5Hz), 6.88-6.79 (4H, m), 6.19 (1H, d, J = 1.8Hz), 5.11 (1H, d, J = 4.8Hz), 5.07 (1H, d, J = 4.8Hz), 4.81-4.71 (1H, m), 4.60-4.51 (1H, m), 4.26-4.18 (2H, m), 3.79 (6H, s), 3.63-3.55 (1H, m), 3.48-3.28 (2H, m), 3.21- 2.94 (2H, m), 2.26 (3H, s), 1.81-1.49 (3H, m), 1.43-0.96 (24H, m), 0.62 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) 6156.4 (1P, s).
Ej emplo Z-39.
Monómero de oxazafosfolidina 26a El Compuesto 26a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2r- desoxi-2'-fluoro-4-N-(isobutiril)citidina" en lugar de "5'-0- (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.66 (1H, brs), 8.41 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.55-7.20 (19H, m), 7.01 (1H, d, J = 7.5Hz), 6.89-6.81 (4H, m), 6.06 (1H, d, J = 15.9Hz), 4.85 (1H, dd, J = 51.4, 3.9Hz), 4.84 (1H, dd, J = 12.9, 7.5Hz), 4.77-4.59 (1H, m), 4.15-4.08 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.63-3.29 (4H, m), 3.10-2.96 (1H, m), 2.65 (1H, septeto, J = 6.9Hz), 1.85-1.53 (3H, m), 1.48-1.17 (3H, m), 1.21 (3H, d, J = 4.8Hz), 1.19 (3H, d, J = 4.8Hz), 0.59 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.5 (1P, d, J = 6.6Hz). 5 Ejemplo Z-40.
Monómero de oxazafosfolidina 26b.
El Compuesto 26b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 26a. 1H NMR (300 MHz, CDCI3) d 8.53 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.57-7.23 (20H, m), 7.10 (1H, d, J = 7.5Hz), 6.89-6.81 (4H, m), 6.10 (1H, d, J = 15.9Hz), 5.00-4.92 (1H, m), 4.84 (1H, dd, J = 51.5, 3.3Hz), 4.75-4.58 (1H, m), 4.24 (1H, d, J = 9.3Hz), 3.81 (6H , s), 3.65-3.39 (3H, m), 3.32-3.06 (2H, m), 2.59 (1H, septeto , J = 6.9Hz), 1.88-1.53 (4H, m), 1.49-1.34 (2H, m), 1.27-1.18 (6H, m), 0.65 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCl3) d 159.0 (1P, d, J 4.4).
Monómero de oxazafosfolidina 27a El Compuesto 27a se obtuvo usando "5' -O- (DMTr) -2 ' - O-metil-6-N- (benzoil)adenosina" en lugar de "5'- O- ( DMTr ) -2-N- (fenoxiacetil) -6-0- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
CH NMR (300 MHz , CDC13) d 8.66 (1H, s) , 8.13 (1H, s) , 8.03 (2H, d , J = 7.2Hz) , 7.64-7.16 (23H, m) , 6.7 9 ( 4H, d, J = 8.7Hz), 6.08 (1H, d, J = 6.3Hz) , 4.91-4.81 (1H, m) , 4.77-4.69 (1H, m) , 4.64-4.57 (1H, m) , 4.15-4.10 (1H, m) , 3.76 ( 6H, s ) , 3.60-3.23 ( 4H, m) , 3.35 (3H, s) , 3.14-3.00 (1H, m) , 1.90-1.19 ( 6H, m) , 0.62 (3H, s) ; 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.8 (1P s) . 5 Monómero de oxazafosfolidina 27b El Compuesto 27b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 27a. ltt NMR (300 MHz, CDC13) d 9.12 (1H, brs) , 8.73 (1H, s), 8.24 (1H, s), 8.07-8.01 (2H, m) , 7.62-7.17 (22H, m) , 6.83-6.77 ( 4H, m) , 6.12 (1H, d, J = 4.8Hz), 4.84-4.73 (2H, m) , 4.43 (1H, t, J = 4.8Hz), 4.25-4.19 (1H, m) , 3.77 (6H, s) , 3.55-3.20 ( 4H, m) , 3.28 (3H, s) , 3.16-3.03 (1H, m) , 1.90-1.17 (6H, m) , 0.65 (3H, s) ; 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.0 (1P, s ) .
Monómero de oxazaf osf olidina 28a .
- El Compuesto 28a se obtuvo usando "5’-O-(DMTr)- 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro-6-L?-(benzoil)adenosina" en lugar de "5'- O- ( DMTr ) -2 -N- (fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
CH NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.64 (1H, s) , 8. 14 (1H, s ) , .06-8.01 (2H, m), 7.63-7.07 (23H, m), 6.78- 6.70 ( 4H, m) , .12 (1H, dd, J = 18.0, 2.4Hz), 5.24-5.01 (2H, m) , 4 . 94-4. 84 (1H, m), 4.17-4.06 (1H, m), 3.73 (6H, s), 3.55- -3.40 ( 3H, m) , .30-3.22 (1H, m), 3.03-2.88 (1H, m), 1.92-1.19 ( 6H, m) , 0. 62 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 150.5 (1P, d, J = 7.7Hz ) .
Monómero de oxazafosfolidina 28b.
El Compuesto 28b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 28a. 2H NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.07 (1H, brs), 8.80 (1H, s), 8.24 (1H, s), 8.08-8.01 (2H, m), 7.66-7.15 (22H, m), 6.81-6.75 (4H, m), 6.14 (1H, dd, J = 18. 0, 1.8Hz), 5.16-4.91 (3H, ), 4.28-4.21 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.57-3.11 (5H, m), 1.82-1.16 (6H, m), 0.65 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDCI3) d 157.8 (1P, d, J = 5.6Hz).
Monómero de oxazafosfolídina 29a.
· El Compuesto 29a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'- O-?OM-2-N- (acetil)guanosina" en lugar de "5'-( 7- (DMTr) -2 -Ai-(fenoxiacetil)-6-O- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
NMR (300 MHz, CDC13) d 7.70 (1H, s ;) , 7.63-7.13 (21H, m) , 6.84-6.76 (4H, m) , 5.77 (1H, d, J = í !.4Hz), 5.41- 5.33 (1H, m) , 4.90 (2H, s) , 4.78-4.68 (2H, m) , 3 .86 ( 1H, brs) , 3.75 ( 3H, s), 3.74 (3H, s) , 3.56-3.41 (2H, ) , 3.32-2.90 ( 3H, m) , 1.92-1.10 (9H, ) , 0.97-0.87 (21H, m) , 0.52 ( 3H, s) ; 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 158.1 (1P, s) .
Monómero de oxazafosfolidina 29b El Compuesto 29b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 29a.
H NMR (300 MHz, CDC13) d 7.77 (1H, s), 7.56 -7.15 (21H, m) , 6.82-6.75 (4H, m) , 5.86 (1H, d, J = 7.5Hz) , 5.26- 5.17 (1H, m) , 4.95 (1H, d, J =5.4Hz), 4.85 (1H, d, J = 5.4Hz) , 4.78-4.71 (1H, m) , 4.59-4.49 (1H, m) , 4.10-4.05 (1H, m) , 3.74 ( 6H, s), 3.52-3.37 (2H, m) , 3.30-3.18 (1H, m) , 3.11-2.85 ( 2H, m) , 1.85-1.15 (9H, m) , 0.93-0.84 (21H, ) , 0.62 (3H, s ); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 152.3 (1P, s) .
Monómero de oxazafosfolidina 30a.
El Compuesto 30a se obtuvo usando "5'-O- (DMTr)-2'-O-TOM-uridina" en lugar de "5’-O-(DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-O- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
XH NMR (300 MHz, CDC13) d 7.76 (1H, d , J = 8.1Hz), 7.55-7.18 (20H, m) , 6.88-6.80 (4H, m) , 6.11 (1H, d, J = 6.0Hz), 5.32 (1H, d, J = 8.1Hz), 4.99 (1H, d, J = 5.1Hz), 4.93 (1H, d, J = 5.1Hz), 4.84-4.75 (1H, m) , 4.54-4.46 (1H, ) , 4.38 (1H, t, J = 5.7Hz), 3.87-3.83 (1H, m) , 3.78 (3H, s) , 3.77 (3H, s) , 3.56-3.42 (1H, m) , 3.39-3.28 (1H, m) , 3.36 (1H, dd, J = 11.0, 2.7Hz), 3.25 (1H, dd, J = 11.0, 2.7Hz) , 3.16-3.03 (1H, m) , 1.88-1.12 (6H, m) , 1.08-0.97 (21H, ) , 0.59 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 156.6 (1P, s) .
Monómero de oxazafosfolidina 30b.
El Compuesto 30b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 30a.
XH NMR (600 MHz, CDC13) d 7.87 (1H, d, J = 7.8Hz), 7.52-7.48 ( 4H, m) , 7.38-7.21 (16H, m) , 6.83-6.79 (4H, m) , 6.14 (1H, d, J = 4.8Hz ) , 5.33 (1H, d, J = 7.8Hz), 4.99 (1H, d, J = 5.4Hz ) , 4.89 (1H, d, J = 5.4Hz), 4.67 (1H, dd, J = 13.8, 7.2Hz), 4.52 (1H, dt, J = 10.4, 4.8Hz), 4.31 (1H, t, J = 4.8Hz) , 4.06-4.03 (1H, m) , 3.78 (3H, s), 3.77 (3H, s) , 3.47 (1H, dd, J = 10.4, 2.4Hz ) , 3.47-3.39 (1H, m) , 3.22-3.17 (2H, m) , 3.00 (1H, ddd, J = 19.5, 10.4, 4.8Hz) , 1.82-1.74 (1H, m) , 1.68-1.58 (1H, m) , 1.56 (1H, dd, J = 14.4, 8.4Hz), 1.38 (1H, dd, J = 14.4, 7.2Hz), 1.31-1.25 (1H, m) , 1.26-1.17 (1H, m) , 1.08-0.98 (21H, m) , 0.63 (3H, s) ; 31P NMR (243.0 MHz, CDC13) d 154.3 (1P, s) .
Monómero de oxazafosfolidina 31a El Compuesto 31a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'- O, 4'-C-metileno-6-N- (benzoil)adenosina" en lugar de "5 · -Ci (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-O- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 9.10 (1H, brs), 8 .76 (1H, s), 8.32 (1H, s), 8.04 (2H, d, J = 7.2Hz), 7.64-7.18 (22H, m) 6.84 (4H, d, J = 8.7Hz), 6.10 (1H, s), 4.76 (1H, d J = 6.9Hz) 4.58 (1H, s), 4.61-4.51 (1H, m), 3.91 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.77 ( 1H, d, J = 7.8Hz ) , 3.75 (6H, s), 3.50 (1H, s) , 3.47- 3.33 ( 1H, m) , 3.31-3.19 (1H, m) , 3.03-2.88 (1H, m) , 1.84-1.09 ( 6H, m) , 0.51 ( 3H, s) ; 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 152.9 (1P, Monómero de oxazafosfolidina 31b El Compuesto 31b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 31a.
CH NMR (300 MHz , CDC13) d 8.81 (1H, s) , 8.30 (1H, s) , 8.07-8.00 ( 2H, m) , 7.64-7.17 (22H, m) , 6.86- 6.79 (4H, m) , 6.12 (1H, s), 4.81-4.72 (1H, m) , 4.62 (1H, d J = 7.2Hz ) , 4.57 (1H, s) , 3.94 (1H, d , J = 7.8Hz), 3.89 (1H, c i, J = 7.8Hz ) , 3.77 (6H, s), 3.48 (2H, s) , 3.46-3.32 (1H, m) , 3.24-3.13 (1H, m) , 3.10-2.97 (1H, m) , 1.84-1.49 (3H, m) , 1.42 -1.09 ( 3H, m) , 0.58 ( 3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 157.3 (1P, s) .
Monómero de oxazafosfolidina 32a.
El Compuesto 32a se obtuvo usando "5'-O- (DMTr)-2'-0, 4 ' -C-metileno-4- -(isobutiril)-5-metilcitidina" en lugar de "5 ' -O- (DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
CH NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.88 (1H, brs), 7.58-7.18 (20H, m), 6.88-6.80 (4H, m), 5.65 (1H, s), 4.69-4.60 (1H, m), 4.52 (1H, d , J = 6.6Hz), 4.49 (1H, s), 3.81-3.74 (1H, m), 3.75 (3H, s), 3.73 (3H, s), 3.64 (1H, d, J = 8.1Hz), 3.56 (1H, d, J = 11.1Hz), 3.53 (1H, d, J = 8.1Hz), 3.46 (1H, d, J = 11.1Hz) , 3.56-3.40 (1H, m) , 3.32-3.20 (1H, m) , 3.14-3.00 (1H, m) , 1.85-1.12 (6H, m) , 1.60 (3H, s), 1.19 (6H, d, J = 6.9Hz), 0.55 (3H, s) ; 31P NMR (121.5 MHz , CDC13) d 155.9 (1P, s) .
Monómero de oxazaf osf olidina 32b El Compuesto 32bse obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 32a.
CH NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.86 (1H, brs), 7.56-7.19 (20H, m), 6.88-6.79 (4H, ), 5.69 (1H, s), 4.86-4.76 (1H, m), 4.46 (1H, s), 4.45 (1H, d, J = 7.5Hz), 3.80-3.75 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.74 (1H, d, J = 8.1Hz), 3.69 (1H, d, J = 8.1Hz), 3.51 (1H, d, J = 11.1Hz), 3.44-3.30 (1H, m), 3.39 (1H, d, J = 11.1Hz), 3.29-3.17 (1H, m), 3.11-2.97 (1H, m), 1.86- 1.52 (3H, m), 1.64 (3H, s), 1.45-1.10 (3H, m), 1.21 (6H, d, J = 6.6Hz), 0.62 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 158.2 (1P, Monómero de oxazafosfolidina 33a El Compuesto 33a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-0,4'-C-metileno-2-N-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en lugar de "5 '-0-(DMTr) -2-N- (fenoxiacetil)-6-0- (cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a. 2H NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.71 (1H, brs), 8.16 (1H, s), 7.50-7.17 (21H, m), 7.09-7.01 (3H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.03 (1H, s), 4.84 (2H, t, J = 6.6Hz), 4.72 (2H# s), 4.68 (1H, d, J = 7.2Hz), 4.55-4.46 (1H, m), 4.50 (1H, s), 3.90 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.77 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.75 (6H, s), 3.51 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.47 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.45-3.21 (2H, m), 3.08 (2H, t, J =6.6Hz), 3.03-2.89 (1H, m), 1.80-1.08 (6H, m), 0.47 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 153.2 (1P, s).
Monómero de oxazaf osf olidina 33b El Compuesto 33b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 33a.
XH NMR (300 MHz, CDCl3) d 8.86 (1H, brs), 8.13 (1H, s), 7.55-7.17 (21H, m), 7.08-6.98 (3H, m), 6.95-6.78 (4H, ), 6.01 (1H, s), 4.86 (2H, t, J = 6.6Hz), 4.82-4.73 (1H, m), 4.70 (2H, s), 4.64 (1H, d, J = 7.5Hz), 4.49 (1H, s), 3.94 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.89 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.77 (6H, s), 3.46 (2H, s), 3.45-3.30 (1H, m), 3.24-3.12 (1H, m), 3.09 (2H, t, J =6.6Hz), 3.09-2.96 (1H, m), 1.81-1.50 (3H, m), 1.41-1.06 (3H, m), 0.58 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 157.4 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 34a El Compuesto 34a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-0, 4'-C-metileno-5-metiluridina,, en lugar de "5'-O-(DMTr)-2-LG-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" en una manera similar al compuesto 12a.
¾ NMR (300 MHz, CDCl3) 57.71 (1H, d, J = 0.9Hz), 7.50-7.17 (20H, m), 6.87-6.80 (4H, m), 5.61 (1H, s), 4.69-4.60 (1H, ), 4.55 (1H, d, J = 6.9Hz), 4.41 (1H, s), 3.74 (3H, s), 3.73 (3H, s), 3.64 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.55 (1H, d , J = 7.8Hz), 3.53 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.46 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.56-3.42 (1H, m), 3.35-3.24 (1H, m), 3.13-3.00 (1H, m), 1.85-1.45 (3H, m), 1.55 (3H, d , J = 0.9Hz), 1.41-1.12 (3H, m), 0.56 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 155.1 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 34b El Compuesto 34b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 34a.
CH NMR (300 MHz, CDCl3) d 7.69 (1H, s), 7.56-7.19 (20H, m), 6.88-6.79 (4H, m), 5.66 (1H, s), 4.87-4.77 (1H, m), 4.47 (1H, d, J = 7.8Hz), 4.40 (1H, s), 3.78 (6H, s), 3.74 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.68 (1H, d, J = 7.8Hz), 3.50 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.46-3.32 (1H, m), 3.39 (1H, d, J = 10.8Hz), 3.30- 3.19 (1H, m), 3.12-2.98 (1H, m), 1.85-1.56 (3H, m), 1.59 (3H, s), 1.46-1.12 (3H, m), 0.63 (3H, s); 31P NMR (121.5 MHz, CDC13) d 158.1 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 35a El Compuesto 35a se obtuvo usando 13a' en lugar de 3a en una manera similar al compuesto 13a.1H NMR (600 MHz, CDCl3) d 7.76 (2H, d, J = 9.0Hz), 7.62 (1H, d, J = 1.2Hz), 7.40 (2H, d, J = 7.2Hz), 7.32-7.23 (10H, m), 6.85 (4H, d, J = 8.4Hz), 6.41 (1H, dd, J = 8.4, 5.4Hz), 4.94 (1H, dd, J = 12.3, 5.4Hz), 4.84-4.79 (1H, m), 4.03-4.01 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.59-3.53 (1H, m), 3.52-3.44 (2H, m), 3.41 (1H, dd, J = 14.7, 7.2Hz), 3.37-3.30 (2H, m), 3.13 (1H, ddd, J = 19.3, 10.3, 4.1Hz), 2.50-2.44 (1H, m), 2.39 (3H, s), 2.35-2.29 (1H, m), 1.91-1.72 (2H, m), 1.64-1.59 (1H, m), 1.40 (3H, s), 1.12-1.05 (1H, m); 31P NMR (243.0 MHz, CDCI3) d 154.2 (1P, s).
Ejemplo Z-41.
Z-27 El Compuesto anterior Z-27, el cual representa un monómero convencional, se usó para producir oligos. La Figura 70 muestra una carta de productos obtenidos a través del Ejemplo de Comparación Z-l. Como se muestra en las Figuras 69 y 70, los presentes monómeros proporcionan desprotección más completa y menos producto secundario, lo cual hace más fácil el producto de aislamiento y/o purificación.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona monómeros químicamente estables. Ejemplares de tales monómeros se representan en los Ejemplos anteriores. En algunas modalidades, la presente invención proporciona monómeros con alto rendimiento aislado. En algunas modalidades, la presente invención proporciona monómeros con 5 rendimiento aislado superior que con el método convencional.
En algunas modalidades, el rendimiento aislado es más de 80%.
Ejemplares de tales monómeros se representan en los Ejemplos anteriores.
Reactivo de condensación Los reactivos de condensación (CR) útiles de conformidad con métodos de la presente invención son de uno cualquiera de las siguientes fórmulas generales: I - en donde Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, y Z9 son grupos independientemente opcionalmente sustituidos seleccionados a partir de alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, o heteroariloxi, o en donde cualquiera de Z2 y Z3, Z5 y Z6, Z7 y Z8, Z8 y Z9, Z9 y Z7, o Z7 y Z8 y Z9 son tomados en conjunto para formar un anillo heterociclico o alicíclico de 3 a 20 elementos; Q es un contraión; y LG es un grupo colgante.
En algunas modalidades, un contraión de un reactivo de condensación CR es Cl, Br~, BF4~, PF6~, TfO, Tf2N, AsF6, C104, o SbF6, en donde Tf es CF3S02. En algunas modalidades, un grupo colgante de un reactivo de condensación CR es F, Cl, Br, I, 3-nitro-l,2,4-triazol, imidazol, alquiltriazol, tetrazol, pentafluorobenzeno, o 1-hidroxibenzotriazol.
Ejemplos de reactivos de condensación usados de conformidad con métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cloruro de pentafluorobenzoilo, carbonildiimidazol (CDI), 1-mesitilensulfonil-3-nitrotriazol (MSNT), clorhidrato de l-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI-HCl), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (PyBOP), cloruro de N, N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopCl), hexafluorofosfato de 2-(IH-7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), y hexafluorofosfato de 0-benzotriazol-AJ, N, N' ,W'-tetrametiluronio (HBTU), DIPCDI; bromuro de N, N'-bis (2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopBr), hexaf luorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-l,2,4-triazol-l-il)-2-pirrolidin-l-il-l,3,2-diazafosfolidinio (MNTP), hexaf luorofosfato de 3-nitro-l,2,4-triazol-l-il-tris (pirrolidin-l-il)fosfonio (PinTP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP); tetrafluoroborato de 0- (benzotriazol-l-il) -N, N, N',N'-tetrametiluronio (TBTU); y hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio (TFFH). En ciertas modalidades, un contraión del reactivo de condensación CRes Cl, Br, BF4, PF6, TfO, Tf2N-, AsF6_, C104 , o SbF6, en donde Tf es CF3S02.
En algunas modalidades, un reactivo de condensación es 1-(2,4,6-triisopropilbencensulfonil)-5-(piridin-2-il) tetrazolido, cloruro de pivaloilo, hexafluorofosfato de bromotrispirrolidinofosfonio, cloruro de N, N'-bis(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfínico (BopCl), o 2-cloro-5,5-dimetil-2-oxo- 1,3,2-dioxafosfinana. En alguna modalidad, un reactivo de condensación es cloruro N, N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopCl). En algunas modalidades, un reactivo de condensación es seleccionado a partir de aquellos descritos en el documento WO/2006/066260).
En algunas modalidades, un reactivo de condensación es hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-l,2,4-triazol-1-il)-2-pirrolidin-1-il-l,3,2-diazafosfolidinio (MNTP), o hexafluorofosfato de 3-nitro-l,2,4-triazol-l-il-tris (pirrolidin-l-il)fosfonio (PinTP): Selección de base y azúcar del patrón de acoplamiento de nucleósido Como se describe en la presente, nucleósido acoplamiento partners para uso de conformidad con métodos de la presente invención can be the same as one another o can be different de entre si. En algunas modalidades, patrones de acoplamiento de nucleósido para uso en la síntesis de un oligonucleótido proporcionado son de la misma estructura y/o configuración estereoquímica como el otro. En algunas modalidades, cada patrón de acoplamiento de nucleósido para uso en la síntesis de un oligonucleótido proporcionado no es de la misma estructura y/o configuración estereoquímica como ciertos otros patrones de acoplamiento de nucleósido del oligonucleótido. Núcleobases y azúcares ejemplares para uso de conformidad con métodos de la presente invención son descritas en la presente. Uno de habilidad en las téenicas químicas y sintéticas relevantes reconocerá que cualquier combinación de núcleobases y azúcares descrita en la presente están contempladas para uso de conformidad con métodos de la presente invención.
Etapa de acoplamiento Procedimientos de acoplamiento y reactivos quirales y reactivos de condensación ejemplares para uso de conformidad con la presente invención son resumidos en, entre otros, Wada I (JP4348077; W02005/014609; W02005/092909), Wada II (W02010/064146), y Wada III (WO2012/039448). Patrones de acoplamiento de nucleósido quiral para uso de conformidad con la presente invención también son referidos en la presente como "amiditas Wada". En algunas modalidades, un patrón de acoplamiento tiene la estructura de , en donde BPR0 es una núcleobase protegida. En algunas modalidades, un patrón de acoplamiento tiene la estructura en donde BPRO es una núcleobase protegida. Fosforamiditas quirales ejemplares como patrón de acoplamiento son representadas abajo: .
. , Uno de los métodos usados para sintetizar el patrón de acoplamiento se representa en el Esquema de reacción II, below.
Esquema de reacción II. Sintesis ejemplar de patrón de acoplamiento. 1 En algunas modalidades, la etapa de acoplamiento comprende hacer reaccionar un grupo hidroxilo libre de una unidad de nucleótido de un oligonucleótido con un patrón de acoplamiento de nucleósido bajo condiciones adecuadas para efectuar el acoplamiento. En algunas modalidades, la etapa de acoplamiento es precedida por una etapa de desbloqueo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el grupo hidroxilo 5' del oligonucleótido de crecimiento es bloqueado (es decir, protegido) y debe ser desbloqueado con el fin de reaccionar subsecuentemente con un patrón de acoplamiento de nucleósido.
Una vez que el grupo hidroxilo apropiado del oligonucleótido de crecimiento ha sido desbloqueado, el soporte es lavado y secado en preparación para suministro de una solución que comprende un reactivo quiral y una solución que comprende un activator. En algunas modalidades, un reactivo quiral y un activator son suministrados simultáneamente. En algunas modalidades, el co-suministro comprende suministrar una cantidad de un reactivo quiral en solución (por ejemplo, una solución de fosforamidita) y una cantidad de activator en una solución (por ejemplo, una solución de CMPT) en un solvente aprótico polar tal como un solvente de nitrilo (por ejemplo, acetonitrilo).
En algunas modalidades, la etapa de acoplamiento proporciona una composición de producto crudo en la cual el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 95%. En algunas modalidades, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 96%. En algunas modalidades, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 97%. En algunas modalidades, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 98%. En algunas modalidades, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 99%.
Etapa de tapado: Métodos proporcionados para elaborar oligonucleótidos quiralmente controlados comprenden una etapa de tapado. En algunas modalidades, una etapa de tapado es una estapa única. En algunas modalidades, una etapa de tapado es de dos etapas. En algunas modalidades, una etapa de tapado es de más de dos etapas.
En algunas modalidades, una etapa de tapado comprende las etapas de tapado de la amina libre del auxiliar quiral y tapado de cualquiera de los grupos hidroxilo 5' sin reaccionar residuales. En algunas modalidades, la amina libre del auxiliar quiral y los grupos hidroxilo 5' sin reaccionar son tapados con el mismo grupo de tapado. En algunas modalidades, la amina libre del auxiliar quiral y los grupos hidroxilo 5' sin reaccionar son tapados con diferentes grupos de tapado. En ciertas modalidades, tapado con diferentes grupos de tapado permitiendo la remoción selectiva de un grupo tapado sobre el otro durante la síntesis del oligonucleótido. En algunas modalidades, el tapado de ambos grupos ocurre simultáneamente. En algunas modalidades, el tapado de ambos grupos ocurre iterativamente.
En ciertas modalidades, el tapado ocurre iterativamente y comprende una primera etapa de tapado de la amina libre seguido por una segunda etapa de tapado del grupo hidroxilo 5' libre, en donde tanto la amina libre como el grupo hidroxilo 5' son tapados con el mismo grupo de tapado. Por ejemplo, en algunas modalidades, la amina libre del auxiliar quiral es tapada usando un anhídrido (por ejemplo, anhídrido fenoxiacético, es decir, Pac2Ü) previo al tapado del grupo hidroxilo 5' con el mismo anhídrido. En ciertas modalidades, el tapado del grupo hidroxilo 5' con el mismo anhídrido ocurre bajo diferentes condiciones (por ejemplo, en la presencia de uno o más reactivos adicionales). En algunas modalidades, el tapado del grupo hidroxilo 5' ocurre en la presencia de una base amina en un solvente étereo (por ejemplo, NMI (N-metilimidazol) en THF). La frase "grupo tapado" se usa intercambiablemente en la presente con las frases "grupo protector" y "grupo de bloqueo".
En algunas modalidades, un grupo amina tapado se caracteriza porque efectivamente tapa la amina de manera que previene el reacomodo y/o descomposición de las especies de fosfito intermediarias. En algunas modalidades, un grupo tapado se selecciona por su capacidad para proteger la amina del auxiliar quiral con el fin de prevenir el desdoblamiento intramolecular del fósforo de enlace del internucleótido.
En algunas modalidades, un grupo 5' hidroxilo tapado se caracteriza porque tapa efectivamente el grupo hidroxilo de manera que previene la aparición de "shortmeros", por ejemplo, las impurezas "n-m" (m y n son números enteror y m<n; n es el número de bases en el oligonucleótido de objetivo) que ocurren a partir de la reacción de una cadena de oligonucleótido que falla para reaccionar en un primer ciclo pero después reacciona en uno o más ciclos subsecuentes. La presencia de tales shortmeros, especialmente "n-1", tiene un efecto deletéreo sobre la pureza del oligonucleótido puro y hace la purificación final del oligonucleótido tediosa y en general de bajo rendimiento.
En algunas modalidades, una tapa particular se selecciona con base en su tendencia para facilitar un tipo particular de reacción bajo condiciones particulares. Por ejemplo, en algunas modalidades, un grupo tapado se selecciona por su capacidad para facilitar una reacción de eliminación El, en la cual la reacción desdobla la tapa y/o auxiliar a partir del oligonucleótido de crecimiento. En algunas modalidades, un grupo tapado se selecciona por su capacidad para facilitar una reacción de eliminación E2, en la cual la reacción desdobla la tapa y/o auxiliar a partir del oligonucleótido de crecimiento. En algunas modalidades, un grupo tapado se selecciona por su capacidad para facilitar una reacción de b-eliminación, en la cual la reacción desdobla la tapa y/o auxiliar a partir deloligonucleótido de crecimiento.
Etapa de modificación : Como se usa en la presente, la frase "etapa modificante", "etapa de modificación" y "etapa de modificación-P" son usados intercambiablemente y se refieren en general a cualquiera o más etapas usadas para instalar un enlace internucleotídico modificado. En algunas modalidades, el enlace internucleotídico modificado que tiene la estructura de fórmula I. Una etapa de modificación-P de la presente invención ocurre durante el ensamble de un oligonucleótido proporcionado preferiblemente después que un ensamble de un oligonucleótido proporcionado se completa. De este modo, cada unidad de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado puede ser individualmente modificada en el enlace de fósforo durante el ciclo dentro del cual la unidad de nucleótido es instalada.
En algunas modalidades, un reactivo de modificación-P adecuado es un electrófilo de azufre, electrófilo de selenio, electrófilo de oxigeno, agente de boración, o un reactivo de azida.
Por ejemplo, en algunas modalidades, un reactivo de selenio es selenio elemental, una sal de selenio, o un diselenuro sustituido. En algunas modalidades, un electrófilo de oxigeno es oxigeno elemental, peróxido, o un peróxido sustituido. En algunas modalidades, un agente de boración es un borano-amina (por ejemplo, N, N-diisopropiletilamina (BH3·DIPEA), borano-piridina (BH3-Py), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-anilina (BH3-An)), un reactivo de borano- éter (por ejemplo, borano-tetrahidrofurano (BH3-THF)), un reactivo de borano-dialquilsulfuro (por ejemplo, BH3-Me2S), anilina-cianoborano, o un trifenilfosfina-carboalcoxiborano. En algunas modalidades, un reactivo de azida está comprendido de un grupo azida capaz de sufrir reducción subsecuente para proporcionar un grupo amina.
En algunas modalidades, a P-modification reagent es un sulfurization reagent como se describe en la presente. En algunas modalidades, una etapa de modificación comprende sulfurization of fósforo para proporcionar un fosforotioato linkage o enlace de fosforotioato triéste. En algunas modalidades, una etapa de modificación proporciona un oligonucleótido que tiene un enlace internucleotidico de fórmula I.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona reactivos de sulfurización, y métodos para elaborar, y usar los mismos.
En algunas modalidades, tales reactivos de sulfurización son reactivos de tiosulfonato. En algunas modalidades, un reactivo de tiosulfonato tiene una estructura de fórmula S-I: en donde: O Rs1-S II-S-L-R1 O S-I Rsl es R; y cada uno de R, L y R1 es independientemente como se define y describe anteriormente y en la presente.
En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización es un reactivo de bis(tiosulfonato). En algunas modalidades, el reactivo de bis(tiosulfonato) tiene la estructura de fórmula S-II: O O Rs1-S II-S-L-S-SII-Rs1 O O S-II en donde cada uno de Rsl y L es independientemente como se define y describe anteriormente y en la presente.
Como se define en general anteriormente, Rsl es R, en donde R es como se define y describe anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, Rsl es heteroarilo o heterocielilo, arilo, alifático, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Rsl es alguilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Rsl es alquilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R sl es metilo. En algunas modalidades, R sl es cianometilo. En algunas modalidades, R sl es nitrometilo. En algunas modalidades, Rsl es arilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Rsl es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Rsl es fenilo. En algunas modalidades, Rsl es p-nitrofenilo. En algunas modalidades, Rsl es p-metilfenilo. En algunas modalidades, Rsl es p-clorofenilo. En algunas modalidades, Rsl es o-clorofenilo. En algunas modalidades, Rsl es 2,4,6-triclorofenilo. En algunas modalidades, Rsl es pentafluorofenilo. En algunas modalidades, Rsl es heterociclilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, Rsl es heteroarilo opcionalmente sustituido.
O -f-S-S-CH3 En algunas modalidades, Rsl-S(O)2S- es O - (N02PheTS) . En algunas modalidades, Rsl-S (0) 2S- es - - - ; - modalidades, Rsl-S(0)2S- es (a-CNMTS ) . En algunas modalidades, Rsl-S(0)2S- es (a-N02MTS) En algunas modalidades, Rsl-S(0)2S- es (a- CF3MTS). En algunas modalidades, Rsl-S(O)2S- es - - En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es -S-RL3- O -S-C (0)-RL3-. En algunas modalidades, L es -S~RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno Ci~C6, opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, L es -S-RL3-o -S-C (0)-RL3-, en donde RL3 es un alquenileno Ci-C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, L es -S-RL3-o -S-C(0)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno Ci~C6 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente reemplazadas por un alquenileno, arileno o heteroarileno Ci~C6 opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, En algunas modalidades, RL3 es un-S-(alquenileno Ci-C6)-, -S-(alquileno Ci-C6)-, -S-(alquileno Ci-C6)-arileno-(alquileno Ci-C6)-, -S- C0-arileno- (alquileno Ci-C6)-, o -S-C0-(alquileno Ci~C6)-arileno- (alquileno Ci-C6)- opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3—, y el átomo de azufre está conectado a R1.
En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es alquileno, alquenileno, arileno o heteroarileno.
En algunas modalidades, el reactivo de donde L En algunas modalidades, L es - ufre está conectado a R1.
En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde·R1 en donde el átomo de azufre está conectado a L.
En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L en donde el átomo de azufre está conectado a R1; y R1 es ' - tado a L.
En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde R1 es -S-RL2, en donde RL2 es como se define y describe anteriormente y en la presente. En algunas modalidades, RL2 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de - S-(alquileno Oi-Ob)-heterocielilo, -S-(alquenileno Ci-C6)- heterociclilo, -S-(alquileno Ci-C6)-N(R')2, -S-(alquileno C1-C6)-N(R')3, en donde cada R' es como se define anteriormente y describe en la presente.
En algunas modalidades, -L-R1 es -RL3-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se define 5 anteriormente y describe en la presente. En algunas modalidades, -L-R1 es -RL3-C(0)-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente.
Reactivos ejemplares de bis(tiosulfonatos) de fórmula S-II son representados abajo: _ En algunas modalidades, el reactivo de sulfurización es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas : S0, RS2-S-S-RS3, O RS2-S-XS-RS3, en donde: cada uno de Rs2 y Rs3 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático, aminoalquilo, carbocielilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida, o tiocarbonilo; o Rs2 y Rs3 son tomados en conjunto con el átomos a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido; Xs es —S(O)2—, -O-, o -N(R')-; y R' es como se define y describe anteriormente y en la presente.
En algunas modalidades, el reactivo de , O g , ivo de sulfurización es Reactivos de sulfurización ejemplares se representan en la Tabla 5 abajo.
Tabla 5. Reactivos de sulfurización ejemplares.
- - - - - FmocHN FmocHN l En algunas modalidades, un reactivo de sulfurización proporcionado es usado para modificar un H~ fosfonato. Por ejemplo, en algunas modalidades, un oligonucleótido de H-fosfonato es sintetizado usando, por ejemplo, un método de Wada I o Wada II, y es modificado usando un reactivo de sulfurización de fórmula S-I o S-II: en donde cada uno de Rsl, L, y R1 son como se describen y del En^l Oqiunas od^lida^es oU la presen ote ^vención proporc :iiona ui Rs —S II—S—L—R R S II S L S S II R O O O S-l S-l i) hacer reaccionar un H-fosfonato de la estructura : W II -Y-Pi*-Z-{ H en donde cada uno de W, Y, y Z son como se describen y definen anteriormente y en la presente, con un reactivo de sililación para proporcionar un sililoxifosfonato; y ii) hacer reaccionar el sililoxifosfonato con un reactivo de sulfurización de la estructura S-I o S-II: S-l S-ll r para proporcionar un fosforotiotriester.
En algunas modalidades, un electrófilo de selenio se usa en lugar de un reactivo de sulfurización para introducir la modificación al enlace internucleotidico. En algunas modalidades, un electrófilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas: Se, Rs2-Se-Se- Rs3, o Rs2-Se-Xs-Rs3, en donde: cada uno de Rs2 y Rs3 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático, aminoalquilo, carbocielilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida, o tiocarbonil; o Rs2 y Rs3 son tomados en conjunto con los átomos a los cuales están unidos para formar un anillo heteroarilo o heterociclico opcionalmente sustituido; Xs es -S(O)2-, -O-, o -N(R')-; y R' es como se define y describe anteriormente y en la presente En otras modalidades, el electrófilo de selenio es - un compuesto de Se, KSeCN, o NC Se-Se CN . En algunas modalidades, el electrófilo de selenio es Se o - En algunas modalidades, un reactivo de sulfurización para uso de conformidad con la presente invención se caracteriza porque la porción transferida a fósforo durante la sulfurización es un azufre sustituido (por ejemplo, -SR) contrario a un átomo de azufre único (por ejemplo, -S o =S).
En algunas modalidades, un reactivo de sulfurización para uso de conformidad con la presente invención se caracteriza porque la actividad del reactivo es cambiable por modificación del reactivo con un cierto electrón atrayente o grupo donante.
En algunas modalidades, un reactivo de sulfurización para uso de conformidad con la presente invención se caracteriza porque es cristalino. En algunas modalidades, un reactivo de sulfurización para uso de conformidad con la presente invención se caracteriza porque tiene un alto grado de cristalinidad. En ciertas modalidades, un reactivo de sulfurización para uso de conformidad con la 5 presente invención se caracteriza por facilidad de purificación del reactivo mediante, por ejemplo, recristalización. En ciertas modalidades, un reactivo de sulfurización para uso de conformidad con la presente invención se caracteriza porque está sustancialmente libre de impurezas que contienen azufre. En alqunas modalidades, los reactivos de sulfurización los cuales están sustancialmente libres de impurezas que contienen azufre muestran eficiencia incrementada.
En algunas modalidades, el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende uno o más enlaces de fosfato diéster. Para sintetizar tales oligonucleótidos quiralmente controlados, una o más etapas de modificación son opcionalmente reemplazadas con una etapa de oxidación para instalar los enlaces de fosfato diéster correspondientes. En algunas modalidades, la etapa de oxidación se realiza en una forma similar a la síntesis ordinaria de oligonucleótido. En algunas modalidades, una etapa de oxidación comprende el uso de I2. En algunas modalidades, una etapa de oxidación comprende el uso de I2 y piridina. En algunas modalidades, una etapa de oxidación comprende el uso de 0.02 M I2 en un sistema de co-solvente de THF/piridina/agua (70:20:10 - v/v/v). Un ciclo ejemplar es representado en el Esquema de reacción I-c.
En algunas modalidades, un precursor de fosforotioato se usa para sintetizar oligonucleótidos quiral ente controlados que comprenden enlaces de fosforotioato. En algunas modalidades, tal precursor de fosforotioato es En algunas modalidades, se convierte en enlaces de fosforotioato diéster durante el procedimiento estándar de desprotección/liberación después de la salida del ciclo. Los ejemplos son además representados abajo.
En algunas modalidades, el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende uno o más enlaces de fosfato diéster y uno o más enlaces de fosforotioato diéster. En algunas modalidades, el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende uno o más enlaces de fosfato diéster y uno o más enlaces de fosforotioato diéster, en donde al menos un enlace de fosfato diéster es instalado después de todos los enlaces de fosforotioato diéster cuando se sintetizan de 3' a 5'.
Para sintetizar tales oligonucleótidos quiralmente controlados, en algunas modalidades, una o más etapas de 5 modificación son opcionalmente reemplazadas con una etapa de oxidación para instalar los enlaces de fosfato diéster correspondientes, y un precursor de fosforotioato es instalado para cada uno de los enlaces de fosforotioato diéster. En algunas modalidades, un precursor de fosforotioato es convertido a un enlace de fosforotioato diéster después de que se logra la longitud deseada del oligonucleótido. En algunas modalidades, la etapa de desprotección/liberación durante o después de la salida del ciclo convierta a los precursores de fosforotioato en enlaces de fosforotioato diéster. En algunas modalidades, un precursor de fosforotioato se caracteriza porque tiene la capacidad para ser removido por una trayectoria de beta-eliminación. En algunas modalidades, un precursor de fosforotioato es . Como se entiende por uno de habilidad ordinaria en la téenica, uno de los beneficios de usar un precursor de fosforotioato, por ejemplo, durante la síntesis es que más estable que el fosforotioato en ciertas condiciones.
En algunas modalidades, un precursor de fosforotioato es un fósforo grupo protector como se describe en la presente, por ejemplo, 2-cianoetilo (CE o Cne), 2- trimetilsililetilo, 2-nitroetilo, 2-sulfoniletilo, metilo, bencilo, o-nitrobencilo, 2-(p-nitrofenil)etilo (NPE o Npe), 2-feniletilo, 3-(N-terc-butilcarboxamido)-1-propilo, 4- oxopentilo, 4-metiltio-1-butilo, 2-ciano-l,1-dimetiletilo, 4-N-metilaminobutilo, 3-(2-piridil)-1-propilo, 2-[N-metil-N-(2-piridil)]aminoetilo, 2- (W-formilo,W-metil)aminoetilo, 4-[N-metil-N-(2,2,2-trifluoroacetil)amino]butilo. Los Ejemplos son además representados abajo.
Los métodos para sintetizar un reactivo de sulfurización deseado son descritos en la presente y en la sección de ejemplos.
Como se indica anteriormente, en algunas modalidades, la sulfurización ocurre bajo condiciones las cuales desdoblan el reactivo quiral del oligonucleótido de crecimiento. En algunas modalidades, la sulfurización ocurre bajo condiciones las cuales no desdoblan el reactivo quiral del oligonucleótido de crecimiento.
En algunas modalidades, un reactivo de sulfurización es disuelto en un solvente adecuado y suministrado a la columna. En ciertas modalidades, el solvente es un solvente aprótico polar tal como un solvente de nitrilo. En algunas modalidades, el solvente es acetonitrilo. En algunas modalidades, una solución del reactivo de sulfurización se prepara mezclando un reactivo de sulfurización (por ejemplo, un derivado de tiosulfonato como se describe en la presente) con BSTFA (N,O-bis-trimetilsilil- trifluoroacetamida) en un solvente de nitrilo (por ejemplo, acetonitrilo). En algunas modalidades, BSTFA no está incluido. Por ejemplo, los presentes inventores han encontrado que reactivos de sulfurización relativamente más reactivos de la fórmula general Rs2-S-S(O)2-Rs3 pueden a menudo participar exitosamente en las reacciones de sulfurización en la ausencia de BSTFA. Para dar un ejemplo, los inventores han demostrado que donde Rs2 es p-nitrofenilo y Rs3 es metilo entonces no se requiere BSTFA. En vista de esta descripción, aquellos expertos en la téenica serán fácilmente capaces de determinar otras situaciones y/o reactivos de sulfurización que no requieren BSTFA.
En algunas modalidades, la etapa de sulfurización se realiza a temperatura ambiente. En algunas modalidades, la etapa de sulfurización se realiza a temperaturas inferiores tales como aproximadamente 0 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 10 °C, o aproximadamente 15 °C. En algunas modalidades, la etapa de sulfurización se realiza a temperaturas elevadas mayores de aproximadamente 20 °C.
En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 120 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 90 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 60 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 30 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 25 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 20 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 15 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 10 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 5 minuto hasta aproximadamente 60 minutos.
En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 5 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 10 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 15 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 20 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 25 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 30 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 35 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 40 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 45 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 50 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 55 minutos. En algunas modalidades, una reacción de sulfurización se corre por aproximadamente 60 minutos .
Se encontró de manera inesperada que ciertos de los productos de modificación de sulfurización elaborados de conformidad con métodos de la presente invención son inesperadamente estables. En algunas modalidades, los productos inesperadamente estables son fosforotioato triésteres. En algunas modalidades, los productos inesperadamente estables son oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces internucleotidicos que tienen la estructura de fórmula I-c.
Uno de habilidad en las téenicas relevantes reconocerá que los métodos de sulfurización descritos en la presente y reactivos de sulfurización descritos en la presente también son útiles en el contexto de la modifcación de oligonucleótidos de H-fosfonato tales como aquellos descritos en Wada II (W02010/064146).
En algunas modalidades, la reacción de sulfurización tiene una eficiencia de sulfurización por etapas que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, o 98%. En algunas modalidades, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de dinucleótido crudo que es al menos 98% puro. En algunas modalidades, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de tetranucleótido crudo que es al menos 90% puro. En algunas modalidades, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de dodecanucleótido crudo que es al menos 70% puro. En algunas modalidades, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de icosanucleótido crudo que es al menos 50% puro.
Una vez que la etapa de modificación del fósforo de enlace está completa, el oligonucleótido sufre otra etapa de desbloqueo en la preparación para reingresar al ciclo. En algunas modalidades, un auxiliar quiral permanece intacto después de la sulfurización y es desbloqueado durante la etapa de desbloqueo subsecuente, la cual ocurre necesariamente previo al re-ingreso al ciclo. Los procesos de desbloqueo, acoplamiento, tapado, y modificación, son repetidos hasta que el oligonucleótido de crecimiento alcanza una longitud deseada, en tal punto el oligonucleótido puede ya sea ser inmediatamente desdoblado a partir del soporte sólido o dejado unir al soporte para propósitos de purificación y después se desdobla. En algunas modalidades, uno o más grupos protectores están presentes en una o más de las bases de nucleótidos, y el desdoblamente del oligonucleótido a partir del soporte y desprotección de las bases ocurre en una etapa única. En algunas modalidades, uno o más grupo protectores están presentes en una o más de las bases de nucleótidos, y el desdoblamiento del oligonucleótido a partir del soporte y desprotección de las bases ocurre en más de una etapa. En algunas modalidades, la desprotección y desdoblamiento a partir del soporte ocurre bajo condiciones básicas usando, por ejemplo, una o más bases de amina. En ciertas modalidades, una o más bases de amina comprenden propilamina. En ciertas modalidades, una o más bases de amina comprenden piridina.
En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte y/o desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 90 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte y/o desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 80 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte y/o desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 70 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte y/o desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 60 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte y/o desprotección ocurre a temperaturas ambientales.
Procedimientos de purificación ejemplares son descritos en la presente y/o se conocen en general en las artes relevantes.
Notable es que la remoción del auxiliar quiral a partir del oligonucleótido de crecimiento durante cada ciclo es benéfico por al menos las razones que (1) el auxiliar no tendrá que ser removido en una etapa separada al final de la síntesis de oligonucleótido cuando grupos funcionales potencialmente sensibles son instalados en el fósforo; y (2) intermediarios auxiliares de fósforo inestables propensos a sufrir reacciones secundarias y/o interferir con la química subsecuente son evitados. De este modo, la remoción del auxiliar quiral durante cada ciclo hace a la síntesis total más eficiente.
Mientras la etapa de desbloqueo en el contexto del ciclo es descrita anteriormente, los métodos generales adicionales se incluyen abajo.
Etapa de Desbloqueo En algunas modalidades, la etapa de acoplamiento es precedida por una etapa de desbloqueo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el grupo hidroxilo 5' del oligonucleótido de crecimiento es bloqueado (es decir, protegido) y debe ser desbloqueado con el fin de reaccionar subsecuentemente con un patrón de acoplamiento de nucleósido.
En algunas modalidades, la acidificación se usa para remover un grupo de bloqueo. En algunas modalidades, el ácido es un ácido Bronsted o ácido Lewis. Los ácidos Bronsted útiles son ácidos carboxílicos, ácidos alquilsulfónico, ácidos arilsulfónico, ácido fosfórico y sus derivados, ácido fosfónico y sus derivados, ácidos alquilfosfónico y sus derivados, ácidos arilfosfónico y sus derivados, ácido fosfinico, ácidos dialquilfosfinico, y ácido diarilfosfónico los cuales tienen un valor pKa de (25 °C en agua) de -0.6 (ácido trifluoroacético) a 4.76 (ácido acético) en un solvente orgánico o agua (en el caso de 80% de ácido acético). La concentración del ácido (1 hasta 80%) usado en la etapa de acidificación depende de la acidez del ácido. La consideración de la intensidad del ácido debe tomarse en cuenta ya que condiciones de ácido fuerte resultarán en despurinación/despirimidinación, en donde las baser purinilo o pirimidinilo son desdobladas a partir del anillo ribosa y/u otros de tales anillos azúcar. En algunas modalidades, un ácido es seleccionado a partir de RalCOOH, RalS03H, Ra3S03H, O O O Ra10-p-oH Ra1—P-OH Ra1—P-OH ORa2 , ORa2 ; o Ra2 ,en donde cada uno de Ral y Ra2 es independientemente hidrógeno o un alquilo o arilo opcionalmente sustituido, y Ra3 es un alquilo o arilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, la acidificación se realiza por un ácido Lewis en un solvente orgánico. Ejemplares de tales ácidos Lewis útiles son Zn(Xa)2 en donde Xa es Cl, Br, I, o CF3SO3.
En algunas modalidades, la etapa de acidificación comprende agregar una cantidad de un ácido Bronsted o Lewis efectiva para remover un grupo de bloqueo sin remover la sporciones de purina a partir del intermediario condensado.
Los ácidos que son útiles en la etapa de acidificación también incluyen, pero no se limitan a 10% de ácido fosfórico en un solvente orgánico, 10% de ácido clorhídrico en un solvente orgánico, 1% de ácido trifluoroacético en un solvente orgánico, 3% de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un solvente orgánico u 80% de ácido acético en agua. La concentración de cualquier ácido Bronsted o Lewis usada en esta etapa es seleccionada de manera que la concentración del ácido no excede una concentración que causa desdoblamiento de una núcleobase a partir de una porción de azúcar.
En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar 1% de ácido trifluoroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 8% de ácido trifluoroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar 3% de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 10% de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar 3% de ácido tricloroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 10% de ácido tricloroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar 80% de ácido acético en agua. En algunas modalidades, la acidificación comprende agregar aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90%, o aproximadamente 50% hasta aproximadamente 80%, aproximadamente 50% hasta aproximadamente 70%, aproximadamente 50% hasta aproximadamente 60%, aproximadamente 70% hasta aproximadamente 90% de ácido acético en agua. En algunas modalidades, la acidificación comprende la adición adicional de depuradores catiónicos a un solvente acidico. En ciertas modalidades, los depuradores catiónicos pueden ser trietilsilano o triisopropilsilano. En algunas modalidades, un grupo de bloqueo es desbloqueado por acidificación, la cual comprende agregar 1% de ácido trifluoroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, un grupo de bloqueo es desbloqueado por acidificación, el cual comprende agregar 3% de ácido dicloroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, un grupo de bloqueo es desbloqueado por acidificación, el cual comprende agregar 3% de ácido tricloroacético en un solvente orgánico. En algunas modalidades, un grupo de bloqueo es desbloqueado por acidificación, el cual comprende agregar 3% de ácido tricloroacético in diclorometano.
En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención son contemplados en un sintetizador y la etapa de desbloqueo del grupo hidroxilo del oligonucleótido de crecimiento comprende suministrar una cantidad de solvente a la columna del sintetizador, en la cual la columna contiene un soporte sólido al cual el oligonucleótido está unido. En algunas modalidades, el solvente es un solvente halogenado (por ejemplo, diclorometano). En ciertas modalidades, el solvente comprende una cantidad de un ácido. En algunas modalidades, el solvente comprende una cantidad de un ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido trifluoroacético. En ciertas modalidades, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20% en p/v. En ciertas modalidades, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% en p/v. En ciertas modalidades, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 5% en p/v. En ciertas modalidades, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3% en p/v. En ciertas modalidades, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 3% en p/v. Los métodos para el desbloqueo de un grupo hidroxilo se describen además en la presente. En algunas modalidades, el ácido que está presente en 3% en p/v es diclorometano.
En algunas modalidades, el auxiliar quiral es removido antes de la etapa de desbloqueo. En algunas modalidades, el auxiliar quiral es removido durante la etapa de desbloqueo.
En algunas modalidades, la salida del ciclo se realiza antes de la etapa de desbloqueo. En algunas modalidades, la salida del ciclo exit se realiza después de la etapa de desbloqueo.
Condiciones generales para la remoción del grupo de bloqueo/grupo protector Los grupos funcionales tales como porciones hidroxilo o amino las cuales están localizadas en núcleobases o porciones de azúcar son rutinariamente bloqueados con grupos (porciones) de bloqueo (protección) durante la síntesis y subsecuentemente desbloqueados. En general, un grupo de bloqueo proporciona una funcionalidad química de una molécula inerte a condiciones de reacción específicas y puede después ser removido a partir de tal funcionalidad en una molécula sin dañar sustancialmente el resto de la molécula (véase por ejemplo, Green and Wuts, Protective Grupos in Organic Synthesis, 2nd Ed., John ilcy & Sons, New York, 1991). Por ejemplo, grupos amino pueden ser bloqueados con grupo de bloqueo de nitrógeno tales como ftalimido, 9- fludrenilmetoxicarbonilo (FMOC), trifenilmetilsulfenilo, t- BOC, 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr), 4-metoxitritilo (MMTr), 9- fenilxantin-9-ilo (Pixil), tritilo (Tr), o 9-(p- metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX). Grupos carboxilo pueden ser protegidos como grupos acetilos. Grupos hidroxi pueden ser protegidos tales como tetrahidropiranilo (THP), t-butildimetilsililo (TBDMS), 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (Ct p), 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo (Fpmp), 1-(2-cloroetoxi)etilo, 3-metoxi-1 ,5-dicarbometoxipentan-3-ilo (MDP), bis(2-acetoxietoxi)metilo (ACE), triisopropilsililoximetilo (TOM), 1- (2-cianoetoxi)etilo (CEE), 2-cianoetoximetilo (CEM), [4-(-dicloroacetil-N-metilamino)benciloxi]etilo, 2-cianoetilo (CN), pivaloiloximetilo (PivOM), levuniloximetilo (ALE). Se han descrito otros grupos de bloqueo de hidroxilo representativos (véase por ejemplo, Beaucage et ai., Tetrahedron, 1992, 46, 2223). En algunas modalidades, grupos de bloqueo hidroxilo son grupos de ácido lábil, tales como el tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixil) y 9- (p- metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX). Grupos funcionales químicos también pueden ser bloqueados incluyéndolos en una forma precursora. De este modo, un grupo azido puede ser considerado una forma bloqueada de una amina ya que el grupo azido es fácilmente convertido a la amina. Se conocen grupos protectores representativos adicionales utilizados en la síntesis de ácido nucleico (véase por ejemplo, Agrawal et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds., Humana Press, New Jerscy, 1994, Vol.26, pp.1-72).
Se conocen varios métodos y se usan para remoción de los grupos de bloqueo de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, todos los grupos de bloqueo son removidos. En algunas modalidades, una porción de grupos de bloqueo es removida. En algunas modalidades, las condiciones de reacción pueden ser ajustadas para remover selectivamente ciertos grupos de bloqueo.
En algunas modalidades, grupos de bloqueo de núcleobases, si están presentes, son desdoblables con un reactivo acidico después del ensamble de un oligonucleótido proporcionado. En alguna modalidad, grupos de bloqueo de núcleobases, si están presentes, son desdoblables bajo condiciones no acidicas ni básicas, por ejemplo, desdoblables con sales de fluoruro o complejos de ácido fluorhídrico. En algunas modalidades, grupos de bloqueo de núcleobases, si están presentes, son desdoblables en la presencia de una base o un solvente básico después del ensamble de un oligonucleótido proporcionado. En ciertas modalidades, uno o más de los grupos de bloqueo de núcleobases son caracteriados porque son desdoblables en la presencia de una base o un solvente básico después del ensamble de un oligonucleótido proporcionado pero son estables a las condiciones particulares de una o más etapas de desprotección temprana que ocurren durante el ensamble del oligonucleótido proporcionado.
En algunas modalidades, los grupos de bloqueo para núcleobases no son requeridos. En algunas modalidades, los grupos de bloqueo para núcleobases son requeridos. En algunas modalidades, ciertas núcleobases requieren uno o más grupos de bloqueo mientras otras núcleobases no requieren uno o más grupos de bloqueo.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es desdoblado a partir del soporte sólido después de la síntesis. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso de propilamina. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso de propilamina en piridina. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso de 20% propilamina en piridina. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso de propilamina en piridina anhidra. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso de 20% propilamina en piridina anhidra. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso de un solvente aprótico polar tal como acetonitrilo, NMP, DMSO, sulfona, y/o lutidina. En algunas modalidades, el desdoblamiento a partir del soporte sólido comprende el uso del solvente, por ejemplo, un solvente aprótico polar, y uno o más aminas primarias (por ejemplo, una amina Ci_io), y/o uno o más de metoxilamina, hidrazina, y amoníaco anhidro puro.
En algunas modalidades, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina. En algunas modalidades, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina en piridina. En algunas modalidades, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de 20% de propilamina en piridina. En algunas modalidades la desprotección de oligonucleótido comprende el uso de propilamina en piridina anhidra. En algunas modalidades, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de 20% de propilamina en piridina anhidra.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es desprotegido durante el desdoblamiento.
En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente temperatura ambiente. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura elevada. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a arriba de aproximadamente 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70°C, 80 °C 90 °C o 100 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70°C, 80 °C 90 °C o 100 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 40-80 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 50-70 °C. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 60 °C.
En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por más de 0.1 hr, 1 hr, 2 hrs, 5 hrs, 10 hrs, 15 hrs, 20 hrs, 24 hrs, 30 hrs, o 40 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 0.1-5 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 3-10 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 5-15 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 10-20 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 15-25 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 20-40 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 2 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 5 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 10 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 15 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 18 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza por aproximadamente 24 hrs.
En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente por más de 0.1 hr, 1 hr, 2 hrs, 5 hrs, 10 hrs, 15 hrs, 20 hrs, 24 hrs, 30 hrs, o 40 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente por aproximadamente 5-48 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente por aproximadamente 10-24 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente por aproximadamente 18 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura elevada por más de 0.1 hr, 1 hr, 2 hrs, 5 hrs, 10 hrs, 15 hrs, 20 hrs, 24 hrs, 30 hrs, o 40 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura elevada por aproximadamente 0.5-5 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 60 °C por aproximadamente 0.5-5 hrs. En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 60 °C por aproximadamente 2 hrs.
En algunas modalidades, el desdoblamiento de oligonucleótido a partir del soporte sólido, o desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina y se realiza a temperatura ambiente o temperatura elevada por más de 0.1 hr, 1 hr, 2 hrs, 5 hrs, 10 hrs, 15 hrs, 20 hrs, 24 hrs, 30 hrs, o 40 hrs. Condiciones ejemplares son 20% de propilamina en piridina a temperatura ambiente por aproximadamente 18 hrs, y 20% de propilamina en piridina a 60 °C por aproximadamente 18 hrs.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapador- (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de fosforotioato diéster o al menos un enlace internucleotidico que tiene la estructura de fórmula I-c.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: al menos un ciclo de (1) a (4) forma un enlace de fosforotioato diéster.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: al menos un ciclo de (1) a (4) forma un enlace internucleotidico que tiene la estructura de fórmula I-c.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4 ) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde; la etapa de acoplamiento comprende el uso de un grupo de activación y en donde BPRO es una núcleobase protegida; la etapa de tapado que comprende tapado del grupo amino en el auxiliar quiral y el tapado del 5'-OH sin reaccionar; la etapa de modificación que comprende instalación del grupo -S-L-R1 al fósforo de enlace, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente; la etapa de desbloqueo que comprende el uso de un ácido .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: la etapa de acoplamiento comprende el uso de CMPT y - — - en donde B PRO es una núcleobase protegida; la etapa de tapado que comprende tapado del grupo amino en el auxiliar quiral y el tapado del 5'-OH sin reaccionar; la etapa de modificación que comprende instalación de grupo -S-L-R1 al fósforo de enlace, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se define anteriormente y describe en la presente; la etapa de desbloqueo que comprende el uso de un ácido .
En algunas modalidades, un activador es un activador "Wada", es decir, el activador es a partir de cualquiera de los documentos de Wada I, II, o III citados anteriormente.
Grupos de activación ejemplares son representados abajo: Un ciclo ejemplar se representa en el Esquema de reacción I-b.
Esquema de reacción I-b. Instalación de enlaces de fosforotioato.
OMiru- ) = gPRO DMTrO· g#>RQ 2. Tapado f^NPac T - ' I ^ > ctivos de StdfñrizadÓB Q DMTrO-. t'° o.V ° L Acopiamiento Ciclo B 3. StifirizacióB |^e.g. R«!-Í-S-L-«^ BSTFA i .
O ügonucieátido Qdraknente Controlado Inactivación de Auxiliar Qtriral En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: ( 1 ) acoplamiento; (2 ) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de fosforotioato diéster o al menos un enlace internucleotídico de fórmula I-c, y al menos un enlace internucleotídico de fosfato diéster; y al menos una etapa de modificación es reemplazada por una etapa de oxidación.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de fosforotioato diéster o al menos un enlace internucleotídico de fórmula I-c, y al menos un enlace internucleotídico de fosfato diéster; y al menos una etapa de modificación es reemplazada por una etapa de oxidación que comprende el uso de I2.
Un ciclo ejemplar se ilustra en el Esquema de reacción I-c.
Esquema de reacción I-c. Instalación de tanto enlaces fosfate diester como internucleotidicos modificados en un oligonucleótido quiralmente controlado.
- , · . — En el Esquema de reacción I-c, el oligonucleótido (o nucleótido, u oligonucleótido con enlace internucleotidico modificado) en soporte sólido (C—1) es acoplado con fosforamidita C-2. Después del acoplamiento y tapado, se realiza una etapa de oxidación. Después del desbloqueo, se forma un enlace de fosfato diéster. El producto del ciclo C-3 puede ya sea re-ingresar al ciclo C para instalar más enlace de fosfato diéster, o entras a otros ciclos para instalar otros tipos de enlaces internucleotidicos, o ir a la salida del ciclo.
En algunas modalidades, la fosfora idita no quiralmente pura puede ser usada en lugar de C-2 en el Esquema de reacción I-c. En algunas modalidades, se usa b-cianoetilfosforamiditas protegidas con DMTr. En algunas modalidades, la fosforamidita siendo usada tiene la estructura de - En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: el oligonucleótido quiralmente controlado comprende uno o más enlaces de fosforotioato diéster; y uno o más precursores de fosforotioato diéster se forman para cada uno de los enlaces de fosforotioato diéster correspondientes.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de fosforotioato diéster; uno o más precursores de fosforotioato diéster se forman para cada uno de los enlaces de fosforotioato diéster correspondientes; y cada fosforotioato diéster precursor se convierte a un enlace de fosforotioato diéster después que se logra la longitud deseada.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) etapas de repetición (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada; en donde: el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de fosforotioato diéster y al menos un enlace internucleotidico de fosfato diéster; al menos una etapa de modificación es reemplazada por una etapa de oxidación; y al menos una etapa de modificación se realiza para instalar un precursor de fosforotioato diéster para cada uno de los enlaces de fosforotioato diéster; y cada precursor de fosforotioato diéster se convierte a un enlace de fosforotioato diéster después que se logra la longitud deseada.
En algunas modalidades, el uso de un precursor de fosforotioato diéster incrementa la estabilidad del oligonucleótido durante la síntesis. En algunas modalidades, el uso de un precursor de fosforotioato diéster mejora la eficiencia de la síntesis del oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, el uso de un precursor de fosforotioato diéster mejora el rendimiento de la síntesis del oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, el uso de un precursor de fosforotioato diéster mejora la pureza del producto de la síntesis del oligonucleótido quiralmente controlado.
En algunas modalidades, el precursor de fosforotioato diéster en los métodos mencionados anteriormente En algunas modalidades se convierte a un enlace de fosforotioato diéster durante la desprotección/liberación. Un ciclo ejemplar se representa en el Esquema de reacción 1-d. Más ejemplos son representados abajo.
Esquema de reacción I-d. Precursor de fosforotioato diéster en la síntesis de oligonucleótido quiralmente controlado. . ¡ - . . - i .
Como se ilustra en el Esquema de reacción I-d, ambos enlaces de fosforotioato y de fosfato diéster pueden ser incorporados en el mismo oligonucleótido quiralmente controlado. Como se entiende por una persona de habilidad 5 ordinaria en la téenica, los métodos proporcionados no requieren que el fosforotioato diéster y el fosfato diéster sean consecutivos otros enlaces internucleotidicos pueden formarse entre ellos usando un ciclo como se describe anteriormente. En el Esquema de reacción I-d, precursores de fosforotioato diéster, , son instalados en lugar de los enlaces de fosforotioato diéster. En algunas modalidades, tal reemplazo proporciona eficacia de síntesis incrementada durante ciertas etapas, por ejemplo, la etapa de oxidación. En algunas modalidades, el uso de precursores de fosforotioato diéster en general mejora la estabilidad de oligonucleótidos quiralmente controlados durante la síntesis y/o almacenamiento. Después de la salida del ciclo, durante la desprotección/liberación, el precursor de fosforotioato diéster se convierte a enlace de fosforotioato diéster. En algunas modalidades, es benéfico usar el precursor de fosforotioato diéster aún cuando ningún enlace de fosfato diéster está presente en el oligonucleótido quiralmente controlado, o no se requiere etapa de oxidación durante la síntesis.
Como en el Esquema de reacción I-c, en algunas modalidades, la fosforamidita no quiralmente pura puede ser usada para ciclos que comprenden etapas de oxidación. En algunas modalidades, se usan b-cianoetilfosforamiditas protegidas con DMTr. En algunas modalidades, la fosforamidita siendo usada tiene la estructura de En algunas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que son enriquecida en un tipo de oligonucleótido particular.
En algunas modalidades, al menos aproximadamente 10% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 20% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 30% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 40% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 60% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 70% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 80% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular, En algunas modalidades, al menos aproximadamente 90% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 95% de una composición cruda proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular.
En algunas modalidades, al menos aproximadamente 1% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 2% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 3% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 4% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 5% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 10% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 20% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 30% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 40% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 60% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 70% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 80% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 90% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 95% de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular .
Aplicaciones biológicas Como se discute en detalle en la presente, la presente invención proporciona, entre otras cosas, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, significando que la composición contiene una pluralidad de oligonucleótidos de al menos un tipo. Cada molécula de oligonucleótido de un "tipo" particular está comprendida de elementos estructurales preseleccionados (por ejemplo, predeterminados) con respecto a: (1) secuencia base; (2) patrón de enlaces de armazón; (3) patrón de centros quirales de armazón; y (4) patrón de porciones de modificación-P del armazón. En algunas modalidades, composiciones de oligonucleótidos proporcionados contienen oligonucleótidos que son preparados en un proceso de síntesis única. En algunas modalidades, composiciones proporcionadas contienen oligonucloetides que tienen más de una configuración quiral dentro de una molécula de oligonucleótido única (por ejemplo, donde diferentes residuos a lo largo del oligonucleótido tienen diferente estereoquímica); en algunas de tales modalidades, tales oligonucleótidos se pueden obtener en un proceso de síntesis única, sin la necesidad de etapas de conjugación secundarias para generar moléculas de oligonucleótidos individuales con más de una configuración quiral .
Composiciones de oligonucleótidos como se proporcionan en la presente, pueden ser usadas como agentes para modular un número de procesos y maquinarias celulares, que incluyen pero no se limitan a, transcripción, traducción, respuestas inmunes, epigenéticas, etc. Además, las composiciones de oligonucleótidos como se proporcionan en la presente pueden ser usadas como reactivos para propósitos de búsqueda y/o diagnóstico. Uno de habilidad ordinaria en la téenica reconocerá fácilmente que la descripción de la presente invención aquí no está limitada al uso particular, sino es aplicable a cualquiera de las situaciones donde el uso de oligonucleótidos sintéticos es deseable. Entre otras cosas, las composiciones proporcionadas son útiles en una variedad de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, agrícolas y/o de investigación.
En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos proporcionados comprenden oligonucleótidos y/o residues de los mismos que incluyen una o más modificaciones estructurales como se describe en detalle en la presente. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos comprenden oligonucleoties que contienen uno o más análogos de ácido nucleico. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos comprenden oligonucleótidos que contienen uno o más ácidos nucleicos o residuos artificiales, que incluyen pero no se limitan a: ácidos nucleicos peptídicos (PNA), morfolino y ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos glicón nucleicos (GNA), ácidos treosa nucleicos (TNA), ácidos xeno nucleicos (ZNA), y cualquier combinación de os mismos.
En cualquiera de las modalidades, la invención es útil para modulación a base de oligonucleótido de la expresión del gen, respuesta inmune, etc. Por consiguiente, composiciones de oligonucleótidos de la invención, estereodefinidas, las cuales contienen oligonucleótidos de tipo predeterminado (es decir, los cuales son quiralmente controlados, y opcionalmente quiralmente puro), pueden ser usadas en lugar de contrapartes quiralmente impuras o estereo-aleatorias convencionales. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas muestran efectos propuestos mejorados y/o efectos secundarios indeseados reducidos. Ciertas modalidades de aplicaciones biológicas y clinicas/terapéuticas de la invención se discuten explícitamente abajo.
Varios régimenes de dosificaciones pueden ser utilizados para administras composiciones proporcionadas de oligonucleótidos quiralmente controlados. En algunas modalidades, se administran dosis unitarias múltiples, separadas por periodos de tiempo. En algunas modalidades, una composición dada tiene un régimen de dosificación recomendado, el cual puede involucrar una o más dosis. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis cada una de las cuales son separadas de entre sí por un periodo de tiempo de la misma longitud; en algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y al menos dos diferentes periodos de tiempo separando dosis individuales. En algunas modalidades, todas las dosis dentro de un régimen de dosificación son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas modalidades, dosis diferentes dentro de un régimen de dosificación son de diferentes cantidades. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una cantidad de primera dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una cantidad de primera dosis, seguida por uno o más dosis adicionales en una segunda (o subsecuente) cantidad de dosis que es la misma cantidad o diferente de la primera dosis (u otra dosis previa). En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administering al menos una dosis unitaria por al menos un día. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar más de una dosis durante un periodo de tiempo de al menos un día, y algunas veces más de un dia. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar dosis múltiples durante un periodo de tiempo de al menos una semana. En algunas modalidades, el periodo de tiempo es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2324, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (por ejemplo, aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por semana por más de una semana. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por semana por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (por ejemplo, aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis cada dos semanas por más de un periodo de dos semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis cada dos semanas durante un periodo de tiempo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (por ejemplo, aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por mes por un mes. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por mes por más de un mes. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por mes por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más meses.
En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por semana por aproximadamente 10 semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por semana por aproximadamente 20 semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por semana por aproximadamente 30 semanas. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende administrar una dosis por semana por 26 semanas. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado es administrada de conformidad con un régimen de dosificación que difiere de aquel utilizado para una composición de oligonucleótido quiralmente no controlado (por ejemplo, estereoaleatorio) de la misma secuencia, .y/o de una composición de oligonucleótido quiralente controlado diferente de la misma secuencia. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado se administra de conformidad con un régimen de dosificación que se reduce comparado con aquel de una composición de oligonucleótido quiralmente no controlado (por ejemplo, estereoaleatorio) de la misma secuencia en que logra un nivel inferior de exposición total sobre una unidad de tiempo dada, involucra una o más dosis unitarias inferiores, y/o incluye un número más pequeño de dosis durante una unidad de tiempo dada. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado se administra de conformidad con un régimen de dosificación que se extiende por un periodo de tiempo más largo que aquel de una composición de olugonucleótido quiralmente no controlado (por ejemplo, estereoaleatorio) de la misma secuencia. Sin desear ser limitado por teoría, el Solicitante observa que en algunas modalidades, el régimen de dosificación más corto, y/o periodos de tiempo más largos entre dosis, puede ser debido a la estabilidad, biodisponibilidad y/o eficacia mejorada de una composición de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado tiene un régimen de dosificación más largo comparado con la composición de oligonucleótido quiralmente no controlado correspondiente. En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido quiralmente controlado tiene un periodo de tiempo más corto entre al menos dos dosis comparado con la composición de oligonucleótido quiralmente no controlado correspondiente. Sin desear ser limitado por teoría, el Solicitante observa que en algunas modalidades régimen de dosificación más largo, y/o periodos de tiempo más cortos entre dosis, pueden ser debido a la seguridad mejorada de una composición de oligonucleótido quiralmente controlado.
Una dosis única puede contener varias cantidades de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado, como se desea adecuado por la solicitud. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 o más (por ejemplo, aproximadamente 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más) mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 1 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 5 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 10 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 15 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 20 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 50 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 100 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 150 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 200 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 250 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, una dosis única contiene aproximadamente 300 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad inferior en una dosis única, y/o en una dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad inferior en una dosis única, y/o en una dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado debido a la eficacia mejorada. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad superior en una dosis única, y/o en una dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado. En algunas modalidades, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad superior en una dosis única, y/o en una dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado debido a la seguridad mejorada.
Oligonucleótidos biológicamente activos Una composición de oligonculeótido proporcionado como se usa en la presente puede comprender oligonucleótidos de hebra única y/o de hebras múltiples. En algunas modalidades, los oligonucleótidos de hebra única contienen porciones auto-complementarias que pueden hibridizar bajo condiciones relevantes de manera que, como se usa, aún oligonucleótidos de hebra única pueden tener al menos carácter parcialmente de doble hebra. En algunas modalidades, un oligonucleótido incluido en una composición proporcionada es de hebra única, doble hebra o triple hebra. En algunas modalidades, un oligonucleótido incluido en una composición proporcionada comprende una porción de hebra única y una porción de hebra múltiple dentro del oligonucleótido. En algunas modalidades, como se indica anteriormente, oligonucleótidos de hebra única individuales pueden tener regiones de hebra doble y regiones de hebra única.
En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos 5 completamente o parcialmente complementarios a la hebra de: genes estructurales, control de genes y/o regiones de terminación y/o sistemas de auto-replicación tales como ADN plásmido o viral. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como siARNs o otros reactivos de interferencia de ARN (agentes ARNi agents o agentes iARN), ARNsh, oligonucleótidos antisentido, ARNs de auto-desdoblamiento, ribozimas, fragmentos de los mismos y/o variantes de los mismos (tales como Peptidil transferasa 23S rARN, RNase P, intrones de Grupo I y Grupo II, ribozimas de ramificación GIR1, Leadzima, ribozimas de Hairpina, ribozimas de Cabeza de martillo, ribozimas de HDV, ribozima CPEB3 de Mamífero, ribozimas VS, ribozimas glmS, ribozima CoTC, etc.), microARNs, mimétidos de microARN, supermirs, aptámeros, antimirs, antagomirs, adaptadores de Ul, oligonucleótidos que forman triplex, activadores de ARN, ARNs no codificantes largos, ARNs no codificantes cortos (por ejemplo, piARNs), oligonucleótidos inmunomoduladores (tales como oligonucleótidos in unoestimuladores, oligonucleótidos inmunoinhibidores), GNA, LNA, ENA, PNA, TNA, morfolinos, G-cuadrúplex (ARN y ADN), oligonucleótidos antivirales, y oligonucleótidos señuelos.
En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos híbridos (por ejemplo, quiméricos). En el contexto de la presente descripción, el término "híbrido" se refiere ampliamente a componentes estructurales mezclados de oligonucleótidos.
Oligonucleótidos híbridos pueden referirse a, por ejemplo, (1) un molécula de oligonucleótido que tiene clases mezcladas de nucleótidos, por ejemplo, partes de ADN y partes de ARN dentro de la molécula única (por ejemplo, ADN-ARN); (2) pares complementarios de ácidos nucleicos de diferentes clases, de manera que ocurre el apareamiento de bases de ADN:ARN ya sea intramolecularmente o intermolecularmente; o ambos; (3) un oligonucleótido con dos o más tipos del armazón o enlaces de internucleótidos .
En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótios que comprenden más de una clase de residuos de ácido nucleico dentro de una molécula única. Por ejemplo, en cualquiera de las modalidades descritas en la presente, un oligonucleótido puede comprender una porción de ADN y una porción de ARN. En algunas modalidades, un oligonucleótido puede comprender una porción no modificada y una porción modificada.
Composiciones proporcionadas de oligonucleótidos pueden incluir oligonucleótidos que contienen cualquiera de una variedad de modificaciones, por ejemplo, como se describe en la presente. En algunas modalidades, se seleccionan modificaciones particulares, por ejemplo, en vista del uso propuesto. En algunas modalidades, es deseable modificar una o ambas hebras de un oligonucleótido de doble hebra (o una porción de doble hebra de un oligonucleótido de hebra única). En algunas modalidades, las dos hebras (o porciones) incluyen modificaciones diferentes. En algunas modalidades, las dos hebras incluyen las mismas modificaciones. Uno de habilidad en la teenica apreciará que el grado y tipo de modificaciones permitidas por los métodos de la presente invención permiten hacer numerosas permutaciones de modificaciones. Ejemplares de tales modifications se describen en la presente y no están significando ser limitantes.
Interferencia de ARN Las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos son útiles, entre otras cosas, para aplicaciones en interferencia de ARN.
Interferencia de ARN (ARNi) se refiere a la inhibición de la expresión del gen por moléculas de ARN. Típicamente, estas son moléculas de ARN de doble hebra, pequeñas. Puesto que la expresión del gen controla la mayoría de los procesos celulares, la capacidad para inhibir la expresión del gen proporciona una herramienta potencialmente poderosa para modular las condiciones biológicas, que incluyen tratamiento de enfermedades humanas y/o animales (por ejemplo, ganado o mascotas). Se han conducido un número de estudios para demostrar el uso del ARNi en la regulación o control de la expresión del gen asociado con la enfermedad. Véase, por ejemplo: Cullen, K.A., Hall, M.J. & Golosinskiy, A. Ambulatory surgery in the United States, 2006. Nati Health Stat Report 2009; 1-25; Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs medíate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001; 411: 494-498; Fire A, Xu S, Montgomery MR, Rostas SA, Driveri SE & Mello C. Potent and specific RNA interference by double-stranded RNA in Caenorhadbditis elegans. Nature 1998; 391 (6669):806-811; Gauglitz, G.G., Kortin, H.C., Pavicic, T., Ruzicka, T., & Jeschke, M.G. Hypertrophic scarring and keloids: pathomechanisms and current emerging treat ent strategies. Mol Med 2011; 17(1-2): 113-125; Li-Tsang, C.W., Lau, J.C. & Chan, C.C. Prevalence of hypertrophic scar formation and its characteristics among the Chínese population. Burns 2005; 31, 610-616; Wang H, Ghosh A, Baigude H, Yang C, Qui L, Xia L, et al. Therapeutic gene silencing delivered by a chemically modified siRNA against mutant S0D1 slows ALS progression. JBC 2008; 283 (23):15845-15852; Weiser, T.G., Regenbogen, S.E., Thompson, K.D., Haynes, A.B., Lipsitz, S.R., Berry, W.R. & Gawande, A.A. An estimation of the global volume of surgery: a modeling strategy based on available data. Lancet 2008; 372(9633):139-44.
El fenómeno de interferencia de ARN fue inicialmente demostrado en C. elegans, en las cuales la inyección de moléculas de dsARN inhibe la expresión del gen complementario. A pesar que el uso de siARN ha llegado a ser una herramienta ampliamente usada para la expresión del gen de regulación descendente, la existencia de una trayecotria que se origina naturalmente en eucariotas ha sido bien descrita. El origen de siARN endógeno (o miARN) puede ser transposons, virus, secuencias repetitivas y genes. El proceso para producir siARN endógeno efectivo es regulado por res enzimas. La pimerasa de ARN dependiente del ARN convierte el ARN de hebra única en ARN de hebra doble.
Alternativamente, polimerasas de ARN dependientes de ADN producen dsARN transcribiendo repeticiones de ADN invertidas. Las moléculas de ARN grandes resultantes son sometidas a digestión por ribonucleasa III (Dicer) para producir moléculas de siARN de doble hebra cortas. Las proteínas Argonautas son entonces requeridas para unir moléculas de siARN para formar un complejo conocido como RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). RISC reconoce fragmentos de ARN de doble hebra y divide las hebras dobles aparte, reteniendo una hebra en el complejo de RISC. Los RISCs pueden entonces promover el silenciamiento epigénico a través de la metilación de ADN dirigida por ARN o por desdoblamiento de ARN objetivo. Aunque la traducción de proteina puede ser eliminada considerablemente, el siARN no elimina normalmente la expresión de un gen objetivo completamente. El RISC puede por lo tanto, ayudar a la hebra guia del ARN a unirse y destruir su ARN objetivo mensajero celular correspondiente. De este modo, el ARNi proporciona un método para bloquear potencialmente la creación de las proteínas que causan la enfermedad.
La teenología de siARN representa una herramienta molecular útil. El uso de interferencia de ARN para manipular artificialmente la expresión del gen fue inicialmente limitado por la activación de mecanismos antivirales celulares. La exposición de células a secuencias más largas de 30 nucleótidos ha sido mostrada para inducir la expresión del gen interferón resultando en degradación de ARN no especifica y síntesis de proteína reducida. Sin embargo, este problema puede ser eludido diseñando secuencias de siARN cortas (por ejemplo, 19 a 22 nucleótidos). Los métodos para suministro de siARN en células incluyen, sin limitación, adición a base de liposoma de ribonucleótidos purificados a la media o transfección de vectores de plásmido diseñados para expresar moléculas de siARN. Los vectores de plásmido dependen del uso de dos promotores de Polimerasa III de ARN (U6 y Hl) para accionar la transcripción de la molécula de siARN. La secuencia objetivo (19 a 29 nucleótidos) es colocada en una orientación sentido y antisentido con un grupo espaciador pequeño entre (ARN o ARNsh de hairpina corta). Una vez transcrita, se forma una estructura de hairpina que puede ser reconocida y desdoblada por Dicer. Alternativamente, los dúplex de ARN pueden ser transcritos sin estructuras de hairpina y directamente procesados por el RISC. Actualmente, existe una variedad de vectores plásmidos y virales que utilizan conceptos similares para producir moléculas de siARN, ARNsh, o siARN de hebra única (ss-siARN) (Véase, por ejemplo, 2012 Cell-150-883 Walt Lima et al. ssRNAi actívate RNAi in animals).
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado o composición de oligonucleótido es útil como ss-siARN o siARN conjugado con GalNAc.
La téenica es familiar con ciertas características estructurales que afectan el siARN como una herramienta. Después del descubrimiento de siARN, varios estudios intentan identificar las características óptimas requeridas para eldiseño de siARN. Algunos de los requerimientos incluyen usar secuencias más cortas de 30 nucleótidos para evitar la activación de PKR, estabilidad de secuencia en el extremo 5' de la hebra antisentido con relación al término 3' e insertar un TT sobresaliente. Con base en estudios similares a estos, un número de algoritmos han sido desarrollados por etiquetas académicas e industriales para predecir las secuencias objetivo más efectivas para un gen dado. Aunque la mayoría de estos programas no son perfectos, la probabilidad de obtener una secuencia pronosticada es superior a diseñar secuencias sin consideración de las características recomendadas. La síntesis y prueba de secuencias múltiples puede ser requerida. El diseño de experimentos de siARN puede contener algunos escollos potenciales, de este modo el diseño debe hacerse para incluir controles apropiados y puntos finales medibles. Un control negativo puede incluir una secuencia no complementaria con propiedades termodimámicamente similares como la secuencia siARN efectiva. Cuando se transfecta un vector plásmido para introducir siARN o ARNsh, la relación de lipido a ácido nucleico puede ser igual y el vector de control puede contener una secuencia que es transcrita y procesada intracelularmente. La validación del efecto de siARN puede también llevarse a cabo midiendo tanto ARN como expresión de proteina.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado como se usa en la presente es de doble hebra. Típicamente, oligonucleótidos de doble hebra que comprenden una estructura dúplex de entre 20 y 23, pero específicamente de 21 pares base han sido aclamadas como particularmente efectivas en inducir interferencia de ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han encontrado que oligonucleótidos de doble hebra más largos o más cortos pueden ser también efectivos.
En algunas modalidades, un oligonucleótido de doble hebra utilizado de conformidad con la presente invención comprende dos hebras de oligonucleótidos que son suficientemente complementarias para hibridizarse para formar una estructura dúplex. En algunas modalidades, una estructura dúplex es entre aproximadamente 12 hasta aproximadamente 45 pares base de longitud. En algunas modalidades, una estructura dúplex es entre aproximadamente 18 hasta aproximadamente 25 pares base de longitud. En algunas modalidades, una estructura dúplex es entre aproximadamente 19 hasta aproximadamente 24 pares base de longitud. En algunas modalidades, una estructura dúplex es entre aproximadamente 19 hasta aproximadamente 21 pares base de longitud. En algunas modalidades, una estructura dúplex es un oligonucleótido de doble hebra de entre aproximadamente 25 hasta aproximadamente 30 pares base de longitud. En algunas modalidades, una estructura dúplex es un oligonucleótido de doble hebra de entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15 pares base de longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido de doble hebra es al menos aproximadamente 21 nucleótidos de largo.
En algunas modalidades, un oligonucleótido de doble hebra utilizado de conformidad con la presente invención comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en donde la hebra de ARN antisentido tiene una región de complementariedad la cual es complementaria con al menos una parte de una secuencia objetivo, y la región dúplex es aproximadamente 14 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una región de complementariedad con la secuencia objetivo es entre aproximadamente 14 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una región de complementariedad con la secuencia objetivo es entre aproximadamente 18 hasta aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una región de complementariedad con la secuencia objetivo es entre aproximadamente 19 hasta aproximadamente 24 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una región de complementariedad con la secuencia objetivo es aproximadamente 19 hasta aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
La frase "hebra antisentido" como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que es sustancialmente o 100% complementaria con una secuencia objetivo de interés. La frase "hebra antisentido" incluye la región antisentido de ambos oligonucleótidos que son formados a partir de dos hebras separadas, asi como también oligonucleótidos unimoleculares que son capaces de formar estructuras de tipo hairpina o mancuerna. Los términos "hebra antisentido" y "hebra guia" son usados intercambiablemente en la presente.
La frase "hebra sentido" se refiere a un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de nucleósido, en toda o en parte, como una secuencia objetivo tal como un ARN mensajero o una secuencia de ADN. Los términos "hebra sentido" y "hebra pasajera" son usados intercambiablemente en la presente.
Por "secuencia objetivo" significa cualquier secuencia de ácido nucleico cuya expresión o actividad está siendo modulada. El ácido nucleico objetivo puede ser ADN o ARN, tal como ADN o ARN endógeno, ADN viral o ARN viral, u otro ARN codificado por un gen, virus, bacteria, hongo, mamífero, o planta. En algunas modalidades, una secuencia objetivo está asociada con una enfermedad o trastorno.
Por "específicamente hibridizable" y "complementariedad" significa que un ácido nucleico puede formar enlace(s) de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico por ya sea Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Con referencia a las moléculas nucleicas de la presente invención, la energía libre de enlace para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que proceda la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, actividad de ARNi. La determinación de energías libres de enlace para moléculas de ácido nucleico es bien conocida en la téenica (véase, por ejemplo, Turner et al, 1987, CSH Symp. Quant. Biol . LIT pp. 123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat . Acad. Sci . USA83 :9373-9377; Turner et al·., 1987, /. Ain . Chem. Soc. 109:3783-3785).
Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento base de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9,10 de 10 siendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100% complementarios). "Perfectamente complementario" o 100% complementariedad significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico unirán el hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. Menos de la complementariedad perfecta se refiere a la situación en la cual algunas, pero no todas, las unidades de nucleósido de dos hebras pueden unir hidrógeno entre si. "Complementariedad sustancial" se refiere a hebras de polinucleótido que presentan 90% o mayor complementariedad, excluyendo regiones de las hebras de polinucleótido, tales como sobresalientes, que son seleccionados por ser no complementarias. El enlace especifico requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no especifica del compuesto oligomérico con secuencias no objetivo bajo condiciones en las cuales se desea el enlace especifico, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las cuales se realizan los ensayos. En algunas modalidades, secuencias no objetivo difieren de las secuencias objetivo correspondientes por al menos 5 nucleótidos.
Oliqonucleótidos de doble hebra En algunas modalidades, un oligonucleótido de doble hebra utilizado de conformidad con la presente invención es suficientemente grande que puede ser desdoblado por una molécula endógena, por ejemplo, por Dicer, para producir oligonucleótidos de doble hebra más pequeños, por ejemplo, agentes ARNi. En algunas modalidades, un oligonucleótido de doble hebra proporcionado modula la expresión de un ge objetivo mediante desdoblamiento mediado por RISC de la secuencia objetivo.
En algunas modalidades, una región de doble hebra de un oligonucleótido de doble hebra es igual a o al menos, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 pares de nucleótido en longitud.
En algunas modalidades, una hebra antisentido de un oligonucleótido de doble hebra es igual a o al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, una hebra sentido de un oligonucleótido de doble hebra es igual a o al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, una hebra tiene al menos un estiramiento de 1-5 nucleótidos de hebra única en la región de doble hebra. Por "estiramiento de nucleótidos de hebra única en la región de doble hebra" significa que está presente al menos un par base de nucleótidos en ambos extremos del estiramiento de hebra única. En algunas modalidades, ambas hebras tienen al menos un estiramiento de 1-5 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5) nucleótidos de hebra única en la región de doble hebra. Cuando ambas hebras tienen un estiramiento de 1-5 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5) nucleótidos de hebra única en la región de doble hebra, tales nucleótidos de hebra única pueden ser opuestos entre si (por ejemplo, un estiramiento de desapareamientos) o pueden ser localizados de manera que la segunda hebra no tiene nucleótidos de hebra única opuestos a los oligonucleótidos de hebra única de la primera hebra y vice versa (por ejemplo, un bucle de hebra única). En algunas modalidades, los nucleótidos de hebra única están presentes dentro de 8 nucleótidos desde culquier extremo, por ejemplo 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 nucleótidos de cualquiera del extremo 5' o 3' de la región de complementariedad entre las dos hebras.
En algunas modalidades, cada hebra de un oligonucleótido de doble hebra utilizado de conformidad con la presente invención tiene una estructura ZXY, tal como se describe en la Solicitud Internacional No. PCT/US2004/07070 presentada el 8 de Marzo de 2004, los contenidos de las cuales están de este modo incorporados en sus totalidades.
Hairpinas y mancuernas En algunas modalidades, un oligonucleótido de doble hebra utilizado de conformidad con la presente invención es una molécula única que comprende regiones de auto- complementariedad; de este modo las dos "hebras" de regiones de dobles hebras son en efecto covalentemente ligadas entre si. Tales dos hebras pueden ser ligadas entre si en ambos extremos. Tales dos hebras pueden ser ligadas entre si en ambos extremos, o en un extremo solamente. Por enlazar en un extremo significa que el extremo-5' de la primera hebra está ligado al extremo 3' de la segunda hebra o el extremo-3' de la primera hebra está ligado al extremo-5' de la segunda hebra. Cuando las dos hebras están ligadas entre si en ambos extremos, el extremo-5' de la primera hebra está ligado al extremo-3' de la segunda hebra y el extremo-3' de la primera hebra está ligado al extremo-5' de la segunda hebra. En algunas modalidades, dos hebras están ligadas en conjunto por un oligonucleótido enlazador que incluye, pero no se limita a, (N)n; en donde N es independientemente un nucleótido modificado o no modificado y n es 3-23. En algunas modalidades, n es 3- 10, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. En algunas modalidades, un oligonucleótido enlazador es seleccionado a partir del grupo que consiste de GNRA, (G)4, (U)4, y (dT)4, en donde N es un nucleótido modificado o no modificado y R es un nucleótido de purina modificado o no modificado. En algunas modalidades, algunos de los nucleótidos en el enlazador están involucrados en las interacciones pares-base con otros nucleótidos en el enlazador. En algunas modalidades, las dos hebras están ligadas en conjunto por un enlazador no nucleosidico, por ejemplo.
En algunas modalidades, agentes de ARNi de tipo hairpina y mancuerna tienen una región dúplex igual a o al menos 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, o 25 pares de nucleótidos. En algunas modalidades, la región dúplex es igual a o menos de 200, 100, o 50, pares de nucleótido en longitud. En algunas modalidades, intervalos para la región dúplex son aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30, aproximadamente 17 hasta aproximadamente 23, aproximadamente 19 hasta aproximadamente 23, y aproximadamente 19 hasta aproximadamente 21 nucleótidos pares de longitud. En algunas modalidades, los oligonucleótidos de hairpina imitan los precursores naturales de microARNs.
En algunas modalidades, agentes ARNi de hairpina pueden tener una región no apareada terminal o colgante de hebra única, por ejemplo, en el extremo 3' en el lado antisentido de la hairpina, etc. En algunas modalidades, los colgantes son aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los colgantes son aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de hairpina se caracteriza porque el extremo-3' de una hebra antisentido está ligado al extremo-5' de una hebra sentido. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hairpina se caracteriza porque el extremo-5' de una hebra antisentido está ligado al extremo-3' de una hebra sentido. Los oligonucleótidos de hairpina proporcionados también son referidos en la presente como "ARNsh".
Oligonucleótidos de hebra única En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única utilizado de conformidad con la presente invención comprende una secuencia de nucleótido que es sustancialmente complementaria con un ácido nucleico "sentido" que codifica un producto de expresión del gen, por ejemplo, complementario con la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementario con una secuencia de ARN, por ejemplo, una pre-ARNm, ARNm, ARNmi, o ARNpremi. Oligonucleótidos de hebra única proporcionados incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos antisentido y agentes de ARNi de hebra única. En algunas modalidades, la región de complementariedad es menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región de complementariedad es al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado es aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 nucleótidos de longitud). En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado es aproximadamente 25 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado es aproximadamente 15 hasta aproximadamente 29 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado se caracteriza ya que tiene menos de 100% de complementariedad con ARNm, ARN o ADN are. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado tiene una estructura ZXY, tal como se describe en la Solicitud Internacional No. PCT/US2004/07070 presentada el 8 de Marzo de 2004.
En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única utilizado puede hibridizar a un ARN complementario, por ejemplo, ARNm, pre-mARN, y prevenir acceso de la maquinaria de traducción al transcripto de ARN objetivo, de este modo previniendo la síntesis de la proteína. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado puede hibridizar a un ARN complementario y el ARN objetivo puede ser subsecuentemente desdoblado por una enzima tal como RNasc H, de este modo previneindo la traducción del ARN objetivo. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única proporcionado modula la expresión de un gen objetivo mediante desdoblamiento mediado por RISC de la secuencia objetivo .
Un "agente de ARNi de hebra única" como se usa en la presente, es un agente de ARNi el cual se elabora de una molécula única. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única incluye una región de dúplex, formada por apareamiento intra-hebra, por ejemplo, es o incluye una estructura de hairpina o mango de sartén. En algunas modalidades, agentes de ARNi de hebra única son antisentido con respecto a la molécula objetivo. En algunas modalidades, agentes de ARNi de hebra única son suficientemente largos de manera que son capaces de entrar al RISC y participar en el desdoblamiento mediado por RISC de un ARNm objetivo. siARNs de hebra única ejemplares (ss siARNs) se conocen y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente Estadounidense No.2006/0166901, los contenidos de la cual se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 29 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es menos de 200 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es menos de 100 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es menos de 60 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única es fosforilado en 5'. En algunas modalidades, un agente de ARNi de hebra única incluye un análogo de fosforilo en el término principal al 5'. En ciertas modalidades, un agente de ARNi de hebra única tiene una longitud desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 29 nucleótidos de longitud.
Los oligonucleótidos de hebra única, que incluyen aquellos descritos y/o identificados como siARNs, microARNs o irs de hebra única los cuales pueden ser usados como objetivos o pueden servir como una plantilla para el diseño de oligonucleótidos de la invención se muestran en, por ejemplo, Esau, et al . Publicación Estadounidense #20050261218 (USSN: 10/909125) titulada "Oligonucleotides and compositions for use in modulation small non-coding RNAs" los contenidos completos de las cuales se incorporan en la presente por referencia.
La presente invención abarca reactivos de investigación y/o diagnóstico que comprenden oligonucleótidos de hebra única. En algunas modalidades, un oligonucleótido de hebra única utilizado de conformidad con la presente invención es y/o actúa como un cebador. En algunas modalidades, los cebadores son usdaso en reacciones de cadena a base de polimerasa (es decir, PCR) para amplificar ácidos nucleicos. Estas aplicaciones incluyen cualquiera de las variaciones conocidas de PCR, tales como PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y PCR en tiempo real.
MicroARNs En algunas modalidades composiciones proporcionadas comprenden uno o más oligonucleótidos que son o actúan como MicroARNs.
Los MicroARNs (miARNs o mirs) son una clase altamente conservada de moléculas de ARN pequeñas que son transcritas a partir del ADN en los genomas de plantas y animales, pero no son traducidas en la proteina. Los pre-microARNs son procesados en miARNs. Los microARNs procesados son moléculas de ARN de nucleótidos (nt) de 17-25 hebras únicas que han sido incorporados en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y han sido identificados como reguladores clave del desarrollo, proliferación, apoptosis, y diferenciación celular. Se cree juegan un papel en la regulación de la expresión del gen por unión a la región no traducida-3' de mARNs específicos. El RISC media la regulación descendente de la expresión del gen a través de la inhibición de la traducción, desdoblamiento del transcripto, o ambos. El RISC también está implicado en el silencio transcripcional en el núcleo de un amplio intervalo de eucariotas.
Los microRNAs también han sido implicados en la modulación de patógenos en hospederos. Por ejemplo, véase Jopling, C.L., et al., Science (2005) vol.309, pp 1577-1581.
Sin desear ser ligado por teoría, la administración de un oligonucleótidos de microARN, mimético microARN, y/o anti microARN, conduce a la modulación de la viabilidad del patógeno, crecimiento, desarrollo y/o replicación. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un microARN, mimético de microARN, y/o anti microARN, en donde el microARN es un microARN hospedero. El número de secuencias de miARN identificadas a la fecha es grande y en crecimiento, ejemplos ilustrativos de los cuales se pueden encontrar, por ejemplo, en: "miRBase : microRIVA sequences , targets and gene nomenclature" Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-0144; "The microRNA Registry" Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Database Issue, D109-D111. Ejemplos no limitantes de secuencias de miARN útiles también son proporcionados en el Apéndice (C) acompañante.
Ribozimas En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como ribozimas.
Las ribozimas son oligonucleótidos que tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad de endonucleasa (Kim and Cech, Proc Nati Acad Sci U S A.1987 Dec;84(24):8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20). Al menos seis variedades básicas de ARNs enzimáticos que se originan naturalmente son actualmente conocidas. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan uniéndose primero a un ARN objetivo. Tal enlace ocurre a través de la porción de unión objetivo de un ácido nucleico enzimático el cual se mantiene en proximidad cercana a una porción enzimática de la molécula que actúa para desdoblar el ARN objetivo. De este modo, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y después se une a un ARN objetivo a través del apareamiento base complementario, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN objetivo. El desdoblamiento estratégico de tal ARN objetivo destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después que un ácido nucleico enzimático ha unido y desoblado su ARN objetivo, es liberado a partir de tal ARN para buscar otro objetivo y puede unirse repetidamente y desdoblar nuevos objetivos.
Los métodos para producir una ribozima objetivo a cualquier secuencia objetivo se conocen en la téenica. Las ribozimas pueden ser diseñadas como se describe, entre otros, Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 93/23569 y Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/02595, cada una específicamente incorporada en la presente por referencia, y sintetizada para ser probada in vitro e in vivo , como se describe en esta.
Aptámeros En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como aptámeros.
Los aptámeros son moléculas peptídicas o ácidos nucleicos que se unen a una molécula particular de interés con alta afinidad y especificidad (Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990)). Los aptámeros de ADN o ARN han sido exitosamente producidos los cuales unen muchas entidades diferentes a partir de proteínas grandes a moléculas orgánicas pequeñas Véase Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol.1:10-16 (1997), Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol.9:324-9(1999), y Hermann and Patel, Science 287:820-5 (2000) los aptámeros pueden ser a base de ARN o ADN. En general, los aptámeros son diseñados por ingeniería a través de rondas repetidas de selección in vitro o equivalentemente, SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para unirse a varias moléculas objetivos tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, y aún células, tejidos y organismos. El procedimiento SELEX es un protocolo en el cual los oligonucleótidos de hebra única son seleccionados a partir de bibliotecas vastas de secuencias, con base en la afinidad de unión en una proteína objetivo u otra molécula (C. Tuerk, L. Gold, Science, 249 (1990), pp. 505-510; R. Green, A.D.
Ellington, D.P. Bartel, J.W. Szostak, Methods Enzymol., 2 (1991), pp. 75 - 86; L. Gold, B. Polisky, O. Uhlenbeck, M.
Yarus, Annu. Rev. Biochem., 64 (1995), pp. 763 - 797). E1 procedimiento SELEX es usualmente iniciado con una biblioteca de ARN o ADN que consiste de algunas secuencias de oligonucleótido aleatorias 1014-1015. En una biblioteca de oligonucleótido completamente aleatoria, cada molécula presentará una estructura terciaria única la cual será dependiente de la secuencia de nucleótido de tal molécula. La afinidad de unión del oligonucleótido para la proteina objetivo será determinada por el ajuste entre porciones en la superficie del oligonucleótido y epitopes en la proteina objetivo. Como una consecuencia de iniciar a partir de una biblioteca de diversidad vasta, es a menudo posible identificar aptá eros de afinidad nM o sub-nM para la proteina objetivo y con selectividad para tal proteina objetivo sobre otra sproteinas con un alto grado de homología estructural (K.. Uphoff, S.D. Bell, A.D. Ellington, Curr. Opin. Struct. Biol., 6 (1996), pp. 281-288). Usando metodología SELEX los aptámeros de ARN o ADN han sido generados a muchas proteínas, péptidos y moléculas pequeñas que incluyen dopamina ((C. Mannironi, A. Di Nardo, P. Fruscoloni, G.P. Tocchini-Valentini, Biochemistry, 36 (1997), pp. 9726-9734), sustancia P (D. Nieuwlandt, M. Wecker, Biochemistry, 34 (1995), pp. 5651-5659), subtilisina (H.
Takeno, S. Yamamoto, T. Tanaka, Y. Sakano, Y. Kikuchi, J. Biochem., 125 (1999), pp.1115-1119), factor de crecimiento derivado de plaquetas (L.S. Green, D. Jellinek, R. Jenison, A. Ostman, C-H. Heldin, N. Janjic Biochemistry, 35 (1996), pp. 14413-14424), factor de crecimiento endotelial vascular (L.S. Green, D. Jellinek, C. Bell, L.A. Bebe, B.D. Feistner, S.C. Gilí, F.M. Jucker, N. Janjic Chem. Biol., 2 (1995), pp. 683-695), trombina (L.C. Bock, L.C. Griffen, J.A. Latham, E.H. Vermaas, J.J. Toole, Nature, 355 (1992), pp.564-566), y L-selectina (D. O'Connell, A. Koenig, S. Jennings, B. Hicke, H.L. Han, T. Fitzwater, Y.F. Chang, N. Varki, D. Pariría Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93 (1996), pp.5883-5887).
Como se revisa en Dua et al. (2008) Recent Patents on DNA & Gene Sequences, 2: 172-186 (incorporada en la presente por referencia) en más detalle, durante los años, un número de protocolos SELEX modificados han sido desarrollados. Ejemplos no limitantes de métodos SELEX modificados se describen en las siguientes publicaciones: SELEX Contador (US5580737), SELEX de flujo celular (W09833941), SELEX de Truncación (W00056930), SELEX Mezclado (US5683867), SELEX libre de transcripción (US20026387620), SELEX de Solución (US5567588), SELEX Quimérico (W09604403), SELEX de Tejido (US20026376474), SELEX de Fotografía (US6001577), SELEX de Palanca (US20077312325), SELEX Covalente/Quimi SELEX (US5763595), SELEX Genómico (US20016261774), SELEX sin proteína purificada (WO0224954), CE-SELEX (W003102212), SELEX de Imagen de Espejo Spiegelmeros (EP1386972) y SELEX Láser, DeSELEX (O07035532), cada uno de los cuales está incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Los oligonucleótidos estereodefinidos abarcados por la presente invención pueden ser usados en cualquiera o más de las variaciones de los métodos SELEX.
Un aptámero puede ser preparado por cualquier método conocido, que incluye métodos sintéticos, recombinantes, y de purificación, y puede ser usado solo o en combinación con otros aptámeros específicos para el mismo objetivo. Además, como se describe más completamente en la presente, el término "apta ero" incluye específicamente "aptámeros secundarios" que contienen una secuencia consenso derivada a partir de comparar dos o más aptámeros conocidos a un objetivo dado. Los aptámeros poseen varias características que los hace agentes terapéuticos atractivos. Ambos aptámeros de ADN y ARN han sido mostrados por unirse a sus objetivos con constantes de disociación (Kd) en el intervalo de picomolar bajo a nanomolar bajo. La unión de un aptámero es una interacción altamente especifica que puede aún discriminar entre las proteínas relacionadas que portan dominios estructurales comunes. Aunque la afinidad de unión de ambos aptámeros y anticuerpos está en el mismo intervalo, los aptámeros tienen muchas características adicionales las cuales domina a sus rivales en muchos casos. Distinto de los anticuerpos, los aptámeros pueden ser dirigidos aún contra objetivos no inmunogénicos. Durante la síntesis pueden ser fácilmente sometidos a una modificación química que mejora su estabilidad y farmacocinéticas. Presentan niveles nulos a significanes de inmunogenicidad a dosis terapéuticas debido a su semejanza a moléculas endógenas.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son útiles como agentes anti-patogénicos, por ejemplo, agentes antivirales, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, y asi sucesivamente. Objetivos adecuados para una variedad de agentes infecciosos tales como virus y bacterias han sido reportados. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 5726017, Patente Estadounidense 5654151, Patente Estadounidense 5496938, Patente Estadounidense 5503978, Patente Estadounidense 5587468, Patente Estadounidense 5527894, US2005233317, Patente Estadounidense 5496938, documento WO08 066231, documento JP2002165594, documento W002081494, Patente Estadounidense 5861501, documento WO9720072, Patente Estadounidense 5475096, Patente Estadounidense 6569630, documento CN101109013, y documento W003106476, cada uno de los cuales está incorporado en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son o actúan como agentes anticancerígenos. Cualquiera de los factores asociados con el tumor o cáncer conocidos, tales como proteínas involucradas en la regulación de la división o proliferación celular, progreso del ciclo celular, apoptosis, migración celular, reparación de ADN, etc., que incluyen proteínas estructurales y moléculas de transducción de señal, pueden ser dirigidas por un aptámero. Ejemplos incluyen, sin limitación. Véase, por ejemplo, Patente AU 775412, Patente Estadounidense 6232071, documento WO 08/028534, Patente Estadounidense 6933114, documento WO 04/081574, Patente AU 242462, Patente Estadounidense 6995249, Patente Estadounidense 5668264, Patente Estadounidense 6699843, documento WO 04/094614, y Patente Estadounidense 5846713, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son o actúan como agentes antiangiogénicos. Ejemplos no limitantes de objetivos antiangiogénicos incluyen VEGF y receptores asociados, así como también moléculas de adhesión o matriz extracelular. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 6051698, US 2003175703, documento WO 95/21853 y Patente Estadounidense 7094535, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son o actúan como agentes anticoagulantes. Se sabe mucho acerca de los factores de coagulación sanguínea y su función así como también de la regulación de proteínas de tales procesos. Los aptámeros son útiles en el objetivo de uno o más de tales factores en el tratamiento de condiciones tales como enfermedades cardiovasculares y trastornos de coagulación de sangre. Véase por ejemplo, documento WO 06/033854, Patente Estadounidense 5543293, documento WO 07/025049, Patente Estadounidense 6774118, documento WO 07/140000, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son o actúan como agentes inmunomoduladores. Los aptámeros han sido generados para dirigir moléculas inmunomoduladoras involucradas en trastornos autoinmunes. La presente invención puede ser útil para dirigir moléculas expresadas en células inmunes, tales como células T y antigenos que presentan células (APCs). Véase por ejemplo, Patente Estadounidense 5869641, documento WO 01/09160, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, las moléculas involucradas en el sistema de complemento tal como Cl, C4, C2, C3 y C5 pueden ser dirigidas por un aptámero. El sistema de complemento ha sido implicado en numerosas enfermedades renales, reumatológicas, neurológicas, dermatológicas, hematológicas, alérgicas, infecciosas y otras. Véase por ejemplo, el documento WO 97/28178 y WO 07/103549, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Otros objetivos inmunes relacionados incluyen, sin limitación, IL- 12, IL-23 y IL-28 (véase, por ejemplo, documento WO 07/035922, el cual se incorpora en la presente por referencia), IgE (véase, por ejemplo, documento WO 05/113813, el cual se incorpora en la presente por referencia), Sp-1 y Spl-, CD28, IL-2, GMCSF (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 6994959, el cual se incorpora en la presente por referencia), SDF-1, CXCR4 (véase, por ejemplo, documento WO 08/009437, el cual se incorpora en la presente por referencia), IL-6, IL-12, IFN gamma (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 6589940 y US2003125279, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia), y TLR. Los aptámeros estereo-definidos pueden provocar eficacia mejorada contra tales enfermedades.
En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son o actúan como agentes anti-inflamatorios. La enfermedad inflamatoria tal como síndrome de diéstres respiratorio (ARDS), choque séptico, enfisema pulmonar, fibrosis quística, artritis reumatoide y bronquitis crónica, han involucrado elastasas de neutrófilos en sus patogénesis. La elastasa humana es por lo tanto un objetivo para tratar tales trastornos usando un aptámero que regula la inflamación. Otros objetivos adecuaods incluyen, sin limitación, fosfolipase A2, tal como PLA2 secretora no pancreática (véase, por ejemplo, documento WO 96/27604, el cual se incorpora por referencia), selectinas, E-, P- y L- (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 5780228, la cual se incorpora por referencia), tres lectinas homologas tipo-C, otras moléculas de adhesión celular expresadas en células tales como leucocitos, células endoteliales y plaquetas; MCP-1 (véase, por ejemplo, documento WO 07/093409, el cual se incorpora por referencia), NF-kappa B y NF-IL6 (véase, por ejemplo, documento WO 00/24404, el cual se incorpora por referencia). Aptámeros estereo-definidos pueden provocar eficacia mejorada contra tales enfermedades.
En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención son útiles para tratar ciertas enfermedades cerebrales, que incluyen pero no se limitan a: Encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) y enfermedad de Alzheimer. Objetivos conocidos se describen en las publicaciones que incluyen WO 2006/138676 y DE19916417, y WO 08/008884, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia. Aptámeros estereo- definidos pueden provocar eficacia mejorada contra tales enfermedades.
Oligonucleótidos señuelo En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como oligonucleótidos señuelo.
Debido a que los factores de transcripción reconocen sus secuencias de unión relativamente cortas, aún en la ausencia de ADN genómico circundante los oligonucleótidos cortos queportan la secuencia de unión consenso de un factor de transcripción especifico pueden se rusadas como herramientas para manipulación de la expresión del gen en células vivas. Esta estrategia involucra el suministro intracelular de tales "oligonucleótidos señuelos", los cuales son entonces reconocidos y unidos por el factor de objetivo. La ocupación del sitio de unión de ADN del factor de transcripción por el señuelo proporciona el factor de transcripción incapaz de unirse subsecuentemente a las regiones promotoras de los genes objetivos. Los señuelos pueden ser usados como agentes terapéuticos, ya sea para inhibir la expresión de genes que son activados por un factor de transcripción, o para regular ascendentemente genes que son suprimidos por la unión de un factor de transcripción. Ejemplos de la utilización de oligonucleótidos señuelo se pueden encontrar en Mann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106: 1071-1075, el cual está expresamente incorporado por referencia en la presente, en su totalidad.
Miméticos de miARN En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como miméticos de ARNmi.
Miméticos de miARN representan una clase de moléculas que pueden ser usadas para imitar la actividad de modulación del gen de uno o más miARNs. De este modo, el término "mimético de microARN" se refiere a ARNs no codificantes sintéticos (es decir, el miARN no se obtiene por purificación de una fuente del miARN endógeno) que son capaces de entrar a la trayectoria de ARNi y regular la expresión del gen. Miméticos de miARN pueden ser diseñados como moléculas maduras (por ejemplo, de hebra única) o precursores miméticos (por ejemplo, pri- o pre-miARNs).
En algunas modalidades, los miméticos de miARN son moléculas de doble hebra (por ejemplo, con una región dúplex de entre aproximadamente 16 y aproximadamente 31 nucleótidos de longitud) y que contienen una o más secuencias que tienen identidad con la hebra madura de un miARN dado.
En algunas modalidades, un mimético de miARN comprende una región dúplex de entre aproximadamente 16 y aproximadamente 31 nucleótidos. En algunas modalidades, el mimético de miARN proporcionado puede contener uno o más de los siguientes patrones de modificación química: la hebra sentido contiene modificaciones 2'-O-metilo de nucleótidos 1 y 2 (contando a partir del extremo 5' del oligonucleótido sentido), y todos los Cs y Us; las modificaciones de la hebra antisentido pueden comprender modificación 2' F de todos los Cs y Us, fosforilación del extremo 5' del oligonucleótido, y enlaces de internucleótidos estabilizados asociados con un sobresaliente 3' del nucleótido 2.
Supermirs En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como supermirs.
Un supermir se refiere a un oligonucleótido, por ejemplo, de hebra única, deoble hebra o parcialmente de doble hebra, el cual tiene una secuencia de nucleótido que es sustancialmente idéntica con un miARN y que es antisentido con respecto a su objetivo. Este término incluye oligonucleótidos los cuales comprenden al menos una porción que no se origina naturalmente la cual funciona de manera similar. En algunas modalidades, el supermir no incluye una hebra sentido. En algunas modalidades, el supermir no se auto-hibridiza en una extensión significante. En algunas modalidades, un supermir tiene una estructura secundaria pero es sustancialmente de hebra única bajo condiciones fisiológicas. Un supermir que es sustancialmente de hebra única es de hebra única en la medida que menos de aproximadamente 50% (por ejemplo, menos de aproximadamente 40%, 30%, 20%, 10%, o 5%) del supermir es duplicado con el mismo. Un supermir puede incluir un segmento de hairpina, por ejemplo, secuencia, preferiblemente en el extremo 3' puede el mismo hibridizar y formar una región dúplex, por ejemplo, una región dúplex de al menos 1, 2, 3, o 4 y preferiblemente menos de 8, 7, 6, o 5 nucleótidos, por ejemplo, 5 nucleótidos. La reacción duplicada puede ser conectada por un enlazador, por ejemplo, un nucleótido enlazador, por ejemplo, 3, 4, 5, o 6 dTs, por ejemplo, dTs modificados. En algunas modalidades, un supermir es duplicado con un oligonucleótido más corto, por ejemplo, de 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo, en uno o ambos de los extremos 3' y 5' o en un extremo y en la mitad no terminal del supermir.
Antímeros o inhibidores de miARN En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como antimeros o inhibidores de miARN.
Los términos "antimir" "inhibidor de raicroARN" o "inhibidor de miR" son sinónimos y se refieren a oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados que interfieren con la actividad de miARNs específicos. Los inhibidores pueden adoptar una variedad de configuraciones que incluyen diseños de hebra única, doble hebra (duplos de ARN/ARN o ARN/ADN), y hairpina. En algunas modalidades, inhibidores de microARN comprenden una o más secuencias o porciones de secuencias que son complementarias o parcialmente complementarias con la hebra madura (o hebras) del miARN a ser objetivo. En algunas modalidades, inhibidores de miARN comprenden secuencias adicionales localizadas 5' y 3' a la secuencia que es el complemento reverso del miARN maduro. Las secuencias adicionales pueden ser los complementos reversos de las secuencias que son adyacentes al miARN maduro en el primiARN a partir del cual el miARN maduro se deriva, o las secuencias adicionales pueden ser secuencias arbitrarias (que tienen una mezcla de A, G, C, U, o dT). En algunas modalidades, una o ambas de las secuencias adicionales son secuencias arbitrarias capaces de formar hairpinas. De este modo, en algunas modalidades, la secuencia que es el complemento reverso del miARN es flanqueada en el lado 5' y en el lado 3' por estructuras de hairpina. En algunas modalidades, inhibidores de microARN son de doble hebra. En algunas modalidades, inhibidores de microARN son de doble hebra e incluyen desapareamientos entre nucleótidos en hebras opuestas. En algunas modalidades, inhibidores de microARN están ligados a porciones conjugadas con el fin de facilitar la absorción del inhibidor en una célula.
Inhibidores de microARN, que incluyen inhibidores de hairpina de miARN, se describen en detalle en Ver eulen et al., "Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function, " R A 13: 723-730 (2007) y en los documentos W02007/095387 y WO 2008/036825 cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Una aplicación ejemplar de terapia a base de miARN se describe en Pan et al. (2007) World J Gastroenterol 13(33): 4431-36, "New therapeutic opportunities for Hepatitis C based on small RNA," los contenidos de los cuales se incorporan por referencia. Brevemente, los autores describen 22 nucleótidos maduros miR-122, derivados a partir de un transcripto de ARN poliadenilado no codificante del gen _hcr, el cual es un regulador del desarrollo específico del hígado. Debido a que el miR-122 es un miARN que está involucrado en la replicación viral del HCV, el silenciamiento del miR-122 puede ser útil para el tratamiento del HCV.
Antagomirs En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como antagomirs.
Los antagomirs son oligonucleótidos similares a ARN que albergan varias modificaciones para protección de ARNse y propiedades farmacológicas, tales como absorción celular y tejido mejorado. Difieren del ARN normal mediante, por ejemplo, metilación 2'-0-completa de azúcar, enalce interazúcar de fosforotioático y, por ejemplo, una porción de colesterol en el extremo-3'. En algunas modalidades, un antagomir comprende un 2'-O-metilmodificación en todos los nucleótidos, una porción de colesterol en el extremo-3', dos enlaces interazúcar de fosforotioato en las primeras dos posiciones en el extremo-5' y cuatro enlaces de fosforotioato en el extremo-3' de la molécula. Los antagomirs pueden ser útiles por ser miARNs endógenos eficientemente silentes formando dúplos que comprenden el miARN endógeno y anagomir, de este modo previniendo el silenciamiento del gen inducido por miARN. Un ejemplo de silenciamiento de miARN mediado por antagomir de miR-122, se describe en Krutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689, el cual se incorpora por referencia herein en su totalidad.
Variaciones de oligonucleotido único modificado Típicamente, se percibe que se requieren dos componentes para activar la maquinaria de iARN -porción de ácido nucleico de doble hebra, la cual se requiere para el reconoc iento por proteínas asociadas al ARNi y la hebra quía la cual sirve como el co-factor de unión al ARN en la proteína catalítica Argonauta de RISC. Más recientemente, un nuevo tipo de moléculas de ARNi compuesto de un oligo único, corto (25-28 nt) capaz de auto-dimerizarse en un duplo parcialmente complementario ha sido desarrollado. Estas moléculas se demostraron por activar eficientemente el RISC y para producir silenciamiento del ARNm objetivo comparable con aquel obtenido con moléculas de ARNi convencionales potentes. Véase: Lapierre·et al., "Potent and systematic RNAi mediated silencing with single oligonucleotide compounds. " RNA 2011; 17:00, los contenidos de la cual se incorporan de este modo por referencia. Véase también: document WO 2010/090762 "RNA DUPLEXES WITH SINGLE STRANDED PHOSPHOROTHIOATE NUCLEOTIDE REGIONS FOR ADDITIONAL FUNCTIONALITY" (PCT/US2010/00348), los contenidos de la cual se incorporan en este modo por referncia.
De este modo, la presente invención incluye constructos de ARNi que contienen regiones de hebra única de nucleótidos de fosforotioato modificados, y el uso de tales constructos en el silenciamiento del gen.
En algunas modalidades, la invención utiliza moléculas de ácido nucleico de doble hebra aisladas que incluyen una hebra guia y una hebra pasajera, en donde la hebra pasajera está conectada a través de un enlazador desdoblable a una región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados. En algunas modalidades, la invención es una molécula de ácido nucleico aislado de doble hebra que tiene una hebra guia y una hebra pasajera, en donde al menos una de la hebra guia y hebra pasajera está conectada a través de un enlazador desdoblable a una región de hebra única de al menos seis nucleótidos de fosforotioato modificados.
En algunas modalidades, la invención utiliza una molécula de ácido nucleico de doble hebra aislado que tiene una hebra guia y una hebra pasajera, en donde al menos una de la hebra guia y hebra pasajera está conectada a través de un enlazador desdoblable a una región de hebra única de al menos tres nucleótidos de fosforotioato modificados. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico de doble hebra incluye al menos una de las siguientes propiedades. La hebra pasajera puede ser de 8-18 nucleótidos de longitud. El ácido nucleico puede tener al menos una modificación 2' O metilo o 2' fluoro. El enlace desdoblable puede ser distinto de un enlace nucleotidico. El ácido nucleico puede incluir un grupo lipofílico. La hebra guia puede ser de 16-18 nucleótidos o 26-28 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades la región de hebra única está conectada a la hebra guía.
En algunas modalidades, el enlazador desdobladle incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras modalidades, el enlazador desdoblable es un enlace de fosfodiéster . En ciertas modalidades, el enlazador desdoblable es S-S. En algunas modalidades el enlazador desdoblable es ADN o ARN. La región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados puede estar en ya sea el extremo 3' o 5' de la hebra pasajera. En algunas modalidades, la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados es ADN, mientras en otras modalidades es ARN.
En algunas modalidades la región de doble hebra de la molécula de ácido nucleico es un dúplex perfecto x. En otras modalidades la región de doble hebra contiene al menos una región de protuberancia. En algunas modalidades la hebra pasajera comprende una muesca dentro de la región de doble hebra de la molécula. La región de doble hebra puede contener al menos un nucleótido que es modificado de fosforotioato.
Las moléculas de ácido nucleico utilizadas de conformidad con la invención pueden ser químicamente modificadas. En ciertas modalidades la modificación química es 2Ometilo y/o 2'Fluoro. En algunas modalidades más de una modificación química está presente en la misma molécula. En algunas modalidades la modificación química incrementa la estabilidad, incrementa la evasión de la regulación inmune, y/o previene el silenciamiento del gen objetivo desactivado. La modificación química puede estar presente en la hebra pasajera y/o la hebra guia. En algunas modalidades la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados es desdoblada de la región de doble hebra de la molécula de ácido nucleico en una célula. En algunas modalidades la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados tiene complementariedad con un gen de mamífero. En ciertas modalidades la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados functiona como una molécula antisentido. La región de doble hebra puede ser al menos de 19 nucleótidos de largo. En algunas modalidades la región de hebra única es al menos 12 nucleótidos de largo.
En algunas modalidades, la invención utiliza moléculas de ácido nucleico bifuncionales que incluyen una región de doble hebra que funciona en interferencia de ARN y una región de hebra única que funciona en antisentido, en donde la región de doble hebra comprende una hebra guía y una hebra pasajera, y en donde la región de doble hebra y la región de hebra única se conectan a través de un enlazador desdoblable. En algunas modalidades, el enlazador desdobladle incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras modalidades, el enlazador desdoblable es un enlace de fosfodiéster. En ciertas modalidades, el enlazador desdoblable es S-S. En algunas modalidades el enlazador desdoblable es ADN o ARN.
En algunas modalidades, la invención se refiere a métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula de mamífero, que incluye poner en contacto la célula de mamífero con una molécula de ácido nucleico de doble hebra aislado que comprende una hebra guía y una hebra pasajera, en donde la hebra pasajera está conectada a través de un enlazador desdoblable a una región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados. En algunas modalidades, el enlazador desdoblable incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras modalidades, el enlazador desdoblable es un enlace de fosfodiéster. En ciertas modalidades, el enlazador desdoblable es S-S. En algunas modalidades el enlazador desdoblable es ADN o ARN.
En algunas modalidades, la región de hebra única comprende al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados y puede estar en ya sea el extremo 3' o 5' de la hebra pasajera. En algunas modalidades, la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados es ADN, mientras en otras modalidades es ARN. En algunas modalidades la región de doble hebra de la molécula de ácido nucleico es un dúplex perfecto x. En otras modalidades la región de doble hebra contiene al menos una región de protuberancia. En algunas modalidades la hebra pasajera comprende una muesca dentro de la región de doble hebra de la molécula. La región de doble hebra puede contener al menos un nucleótido que es modificado de fosforotioato.
Las moléculas de ácido nucleico utilizadas de conformidad con la invención pueden ser químicamente modificadas. En ciertas modalidades la modificación química es 2'Ometil y/o 2'Fluoro. En algunas modalidades más de una modificación química está presente en la misma molécula. En algunas modalidades la modificación química incrementa la estabilidad, incrementa la evasión de regulación inmune, y/o previene el silenciamiento del gen objetivo desactivado. La modificación química puede estar presente en la hebra pasajera y/o la hebra guía.
En algunas modalidades la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados es desdoblada a partir de la región de doble hebra de la molécula de ácido nucleico en una célula. En algunas modalidades la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados tiene complementariedad con un gen de mamífero. En ciertas modalidades la región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados funcionan como una molécula antisentido. La región de doble hebra puede ser de al menos 19 nucleótidos de largo. En algunas modalidades la región de hebra única es de al menos 12 nucleótidos de largo.
En algunas modalidades, la invención se refiere a métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula de mamífero, que comprende poner en contacto la célula de mamífero con una molécula de ácido nucleico de doble hebra aislado que comprende una hebra guía y una hebra pasajera, en donde la hebra guía está conectada a través de un enlazador desdoblable a una región de hebra única de al menos ocho nucleótidos de fosforotioatos modificados. En algunas modalidades, el enlazador desdoblable incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras modalidades, el enlazador desdoblable es un enlace de fosfodiéster. En ciertas modalidades, el enlazador desdoblable es S-S. En algunas modalidades el enlazador desdoblable es ADN o ARN.
En algunas modalidades, la invención se refiere a métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula de mamífero, que incluye poner en contacto la célula de mamífero con moléculas de ácido nucleico bifuncionales que incluyen una región de doble hebra que funciona en interferencia de ARN y una región de hebra única que funciona en antisentido, en donde la región de doble hebra incluye una hebra guía y una hebra pasajera, y en donde la región de doble hebra y la región de hebra única se conectan a través de un enlazador desdoblable. En otros aspectos, se proporciona un método para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula de mamífero. El método involucra poner en contacto la célula de mamífero con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de doble hebra aisladas descritas en la presente.
En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble hebra aisladas utilizadas de conformidad con la presente invención incluyen una modificación química que incrementa la estabilidad. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble hebra aisladas incluyen una modificación química que incrementa la evación de la regulación inmune. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de doble hebra aisladas incluyen una modificación química que previene el silenciamiento del gen objetivo desactivado.
En algunas modalidades, como se discute en la presente, oligonucleótidos utilizados son moléculas de oligonucleótidos únicos capaces de auto-dimerización en un dúplex x parcialmente complementario. En algunas modalidades, tales oligonucleótidos únicos son de aproximadamente 23-30 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, y 30. En algunas modalidades, oligonucleótidos únicos capaces de auto-dimerización en un dúplex x parcialmente complementario contienen aproximadamente 14-18 nucleótidos de la región de objetivo de ARNm, por ejemplo 14, 15, 16, 17, y 18. En algunas modalidades, oligonucleótidos únicos capaces de auto-dimerización en un dúplex x parcialmente complementario contienen 7-11, por ejemplo, 7, 8, 9, 10, y 11 nucleótidos adicionales para permitir auto-dimerización en un dúplex x parcialmente complementario. En algunas modalidades, oligonucleótidos únicos capaces de auto-dimerización en un dúplex x parcialmente complementario pueden entrar eficientemente y activar el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC).
Adaptadores Ul En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como adaptadores Ul.
Los adaptadores de Ul inhiben sitios poliA y son oligonucleótidos bifuncionales con un dominio objetivo complementario a un sitio en el exón terminal del gen objetivo y un "dominio Ul" que se une al componente de ARN nuclear pequeño Ul del Ul snRNP. Véase por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. W02008/121963 y Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263, cada uno de los cuales se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. Ul snRNP es un complejo de ribonucleoproteina que funciona primcipalmente para dirigir etapas tempranas en la formación del espliceosoma por enlace al limite del exón-intrón pre- ARN, Brown and Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:77-95.
En algunas modalidades, un oligonucleótido utilizado es un adaptador Ul, en donde el oligonucleótido comprende al menos un dominio de templado (dominio objetivo) ligado con al menos un dominio efector (dominio Ul), en donde del dominio de templado hibridiza a una secuencia objetivo del gen y el dominio efector hibridiza al ARNsn Ul de ARNPsn Ul. En algunas modalidades, el adaptador Ul comprende un dominio de templado. En algunas modalidades, el adaptador Ul comprende un dominio efector.
Sin desear ser ligado por teoría, el dominio de templado típicamente será desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más típicamente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 nucleótidos o aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 nucleótidos. En algunas modalidades, el dominio de templado es 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 nucleótidos de longitud. El dominio de templado puede ser al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, o al menos aproximadamente 100% complementario con el gen objetivo. En algunas modalidades, el dominio de templado hibridiza con un sitio objetivo dentro del exón terminal Y de un pre-ARNM, el cual incluye la región codificante terminal y la 3'UTR y secuencias de señal de poliadenilación (por ejemplo, a través del sitio de poliadenilación). En algunas modalidades, la secuencia objetivo está dentro de aproximadamente 500 pares base, aproximadamente 250 pares base, aproximadamente 100 pares base, o aproximadamente 50 pares base de la secuencia de señal poli (A) del prem-ARN. En algunas modalidades, el dominio de templado comprende 1, 2, 3, o 4, desapareamientos con la secuencia del gen objetivo.
En algunas modalidades, el dominio efector es desde aproximadamente 8 nucleótidos hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el dominio efector es desde aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el dominio efector es desde aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. El dominio U1 puede hibridizar con UI snARN, particularmente el extremo 5' y más específicamente los nucleótidos 2-11. En algunas modalidades, el dominio U1 es perfectamente complementario con los nucleótidos 2-11 del U1 snARN endógeno. En algunas modalidades, el dominio U1 comprende una secuencia de nucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de la SEC ID NO: 1 (5’- GCCAGGIL1AAGUAU-3'), SEC ID NO: 2 (5"-CCAGGLIAA.GUAI1-3"), SEC ID NO: 4 (5"- CAGGUAAGUAU- 3'), SEC ID NO: 5 (52-CAGGLIAAGU-3'), SEC ID NO: 6 (5'— C .16ITAAC1-3'), y SEC ID NO: 7 (5'-CAGG1IA2=',3'). En algunas modalidades, el dominio III comprende una secuencia de nucleótido, SEC ID NO: 8 (5"-CAGGUAAGUA-3"). Sin desear ser ligado por teoría, incrementar la longitud del dominio U1 para incluir apareamiento de base en el tronco 1 y/o apareamiento de base a la posición 1 de U1 snARN mejora la afinidad del adaptador U1 a U1 snARN.
Los dominios de templado y efectores del adaptador U1 pueden ser ligados de manera que el dominio efector está en el extremo 5' y/o el extremo 3' del dominio de templado. Los dos dominios pueden ser ligados de manera que entonces el extremo 3' de un dominio está ligado al extremo 5' del otro dominio, o el extremo 3' de un dominio está ligado al extremo 3' del otro dominio, o el extremo 5' de un dominio está ligado al extremo 5' del otro dominio. Los dominios de templado y efectores pueden ser ligados directamente entre si o por un enlazador a base de nucleótido o no a base de nucleótido. En algunas modalidades, el enlazador es un nucleótido base y comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, hasta 15, hasta 20, o hasta 25 nucleótidos.
En algunas modalidades, un enlazador entre un dominio de templado y un dominio efector es multivalente, por ejemplo, trivalente, tetravalente, pentavalente. Sin desear ser ligado por teoría, un enlazador multivalente puede ser usado para ligar en conjunto un dominio de templado único con una pluralidad de dominios adaptadores.
En algunas modalidades, un adaptador U1 comprende cualquier modificación de oligonucleótido descrita en la presente. Ejemplares de tales modificaciones incluyen aquellas que incrementan la afinidad de templado, especificidad, biodisponibilidad en la célula y organismo, transporte celular y/o nuclear, estabilidad, y/o resistencia a la degradación. En algunas modalidades, el adaptador U1 puede ser administrado en combinación con al menos otro agente de ARNi.
Activadores de ARN En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como activadores de ARN.
Estudios recientes han encontrado que el dsARN puede también activar la expresión del gen, un mecanismo que ha sido llamado "activación del gen inducida por ARN pequeño" o ARNa. Véase por ejemplo Li, L.C. et al. Proc Nati Auld Sci U S A. (2006), 103(46):17337-42 and Li L.C. (2008). "Small RNAMediated Gene Activation". RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Co plexity. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-25-7. Se ha mostrado que los promotores del gen de objetivo a dsARNs inducen activación transcripcional potente de genes asociados. El miARN endógeno que causa que el ARNa también se encuentre en humanos. Check E. Nature (2007).
Otra observación es que la activación por ARNa es de larga duración. La inducción de la expresión del gen ha sido duradera por más de diez dias. El efecto prolongado de ARNa podría ser atribuido a los cambios epigenéticos de sitios de objetivo de dsARN.
En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado es un activador de ARN, en donde un oligonucleótido proporcionado incrementa la expresión de un gen. En algunas modalidades, la expresión incrementada del gen inhibe su viabilidad, desarrollo de crecimiento, y/o reproducción.
ARNs no codificantes ( ncARNs ) La presente invención abarca ARNs no codificantes, tales como ARN no codificantes largos (IncARNs) y ARNs no codificantes cortos (sricARNs).
Por consiguiente, las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos de la presente invención pueden ser útiles para modular ARN no codificante largo asociado con la enfermedad. En algunas modalidades, los oligonucleótidos sintetizados de conformidad con los métodos proporcionados en la presente son usados para bloquear específicamente la unión de los complejos represores transcripcionales a regiones de IncARN objetivo, de este modo induciendo la expresión del gen objetivo asociado. En algunas modalidades, el complejo represor transcripcional es un factor de silenciamiento. En algunas modalidades, el complejo represor transcripcional tiene actividad de metiltransferasa de Histona. En algunas modalidades, el complejo represor transcripcional media la histona H3. En algunas modalidades, el complejo represor transcripcional es PRC2 (Complejo Represivo Policomb 2).
Ciertos IncRNAs asociados a PRC-2 han sido reportados por ser objetivos terapéuticos potenciales y/o bio arcadores (Zhao et al., 2010. "Genome-wide Identification of Policomb-Associated RNAs by RIP-seq" Molelcular Cell 40: 939-53). La sobreexpresión de proteínas PCR2 ha sido ligado a varios tipos de cáncer, que incluyen cáncer de mama y próstata metastásico, y cánceres del colon, mama e hígado. La inhibición farmacológica de la regresión del gen mediado por PCR2 se encontró por inducir la apoptosis en varias líneas de células de cáncer in vitro, pero no en varios tipos de células normales. La inducción de apoptosis en el sistema es dependiente de la reactivación de genes que han sido reprimidos por PRC2. Existe también evidencia que la expresión del gen mediada por PRC2 puede estar ligada al mantenimiento de las propiedades de las células troncales de células troncales de cáncer. Estos resultados sugieren que al menos en algunos casos, la inhibición de la represión del gen mediada por PRC2 incluyendo mediante IncRNAs de objetivo que recluta a PCR2 a genes críticos- es una estrategia potencial para tratar varios tipos de cáncer. Secuencias no limitantes de ácidos nucleicos, las cuales pueden ser preparadas de conformidad con los métodos proporcionados en la presente, se pueden encontrar en, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional WO 2012/065143 titulada "ARNs no codificantes asociados con Policomb" (PCT/US2011/60493), los contenidos de las cuales se incorporan por referencia en la presente.
Las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos de la presente invención pueden ser o actuar como ARNs no codificantes pequeños, tales como ARNs de interacción piwi (piARNs). Los piARNs representan las clases más grandes de moléculas de ARN no codificantes pequeñas que son expresadas en células animales y se encuentran en agrupamientos a través del genoma. Los piRNAs se conocen por formar complejos de proteina-ARN a través de interacciones con proteínas piwi. Los complejos de piARN han sido implicados en tanto silencia iento del en epigenético como post-transcripcional de retrotransposones y otros elementos genéticos en células germinales, que incluyen espermatogénesis. Típicamente, los piARNs son de 26-31 nucleótidos de longitud, y, comparados con iARNs típicos, carecen de la conservación de secuencia y presentan complejidad superior. En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención comprenden 5' uridina. En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención comprenden 5' monofosfoato y una modificación 3' que actúa para bloquear ya sea el oxígeno 2' o 3'. En algunas modalidades, la modificación 3' es una 2 ' -O-metilación.
Oligonucleótidos que forman triplex En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como oligonucleótidos que forman triplex.
Estudios recientes han mostrado que oligonucleótidos que forma triplex (TFO) pueden ser diseñados los cuales pueden reconocer y unirse a regiones de polipurina/polipiri idina en ADN helicoidal de doble hebra en una manera especifica de la secuencia. Estas reglas de reconocimiento son resumidas por Maher III, L.J., et al., Science (1989) vol.245, pp 725-730; Moser, H. E., et al., Science (1987) vol. 238, pp 645- 630; Beal, P.A., et al., Science (1992) vol.251, pp 1360-1363; Conncy, M., et al., Science (1988) vol.241, pp 456-459 y Hogan, M.E., et al., Públicación EP 375408. La modificación de oligonucleótidos, tales como la introducción de intercaladores y sustituciones de enlace interazúcar, y optimización de condiciones de unión (pH y concentración catiónica) han ayudado a superar obstáculos inherentes a la actividad de TFO tal como repulsión de carga e inestabilidad, y se mostró recientemente que los oligonucleótidos pueden ser dirigidos a secuencias especificas (para una revición reciente véase Seidman and Glazer, Clin Invest 2003 2.:487-94). En general el oligonucleótido que forma triplex tiene la secuencia correspondiente: oligo 3'-A G G T dúplex x 5'-A G C T dúplex x 3’-T C G A Sin embargo, se ha mostrado que los tripletes A-AT y G-GC tienen la más grande estabilidad helicoidal triple (Reither and Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Septl2, Epub). Los mismos autores han demostrado que los TFOs diseñados de conformidad con las reglas A-AT y G-GC no forman triplexos no específicos, indicando que la formación del triplex es sin embargo específica de la secuencia. De este modo para cualquier secuencia dada, se puede contemplar una secuencia que forma triplex. En algunas modalidades, los oligonucleótidos que forman triplex son al menos aproximadamente 15, aproximadamente 25, o aproximadamente 30 o más nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los oligonucleótidos que forman triplex son hasta aproximadamente 50 o aproximadamente 100 nucleótidos de longitud.
La formación de la estructura helicoidal triple con el ADN objetivo induce cambios estéricos y funcionales, bloqueando la iniciación de la transcripción y elongación, permitiendo la introducción de los cambios de secuencia deseados en el ADN endógeno y resultando en la regulación descendente específica de la expresión del gen. Ejemplos de tal supresión de la expresión del gen en células tratadas con TFOs incluyen agénicos de genes supFGI episomal y HPRT endógenos en células de mamífero (Vasquez et al., Nucí Acids Res. 1999;27: 1176-81, y Puri, et al, J Biol Chem, 2001;276:28991-98), y la regulación descendente específica del objetivo y secuencia de la expresión del factor de transcripción Ets2, importante en la etiología del cáncer de próstata (Carbone, et al, Nucí Acid Res.2003 ;31:833-43), y el gen ICAM-I pro-inflamatorio (Besch et al, J Biol Chem, 2002;277:32473-79). Además Vuyisich y Beal han mostrado recientemetne que la secuencia especifica de TFOs puede unirse a dsARN, inhibir la actividad de las enzimas dependientes de dsARN tales como cinasas dependientes de ARN (Vuyisich and Beal, Nuc, Acids Res 2000;28:2369-74).
Adicionalmente, TFOs diseñados de conformidad con los principios mencionados anteriormente pueden inducir mutagénesis dirigida capaz de efectuar la reparación del ADN, de este modo proporcionando tanto regulación descendente como regulación ascendente de la expresión de los genes endógenos (Seidman and Glazer, JInvest 2003; 112:487-94). La descripción detallada del diseño, síntesis y administración de los TFOs efectivos se puede encontrar en S. Pat. App. Nos. 2003 017068 y 20030096980 to Froehier et at y 2002012821/8 y 2002 0123476 to Emanude et aE, y U.S. Pat. No.5,721,138 to Lawn, the contents of which are herein incorporated in their entireties.
Conjugados /enlazadores La invención también contempla que oligonucleótidos utilziados, en algunas modalidades, son optimizados para absorción celular. En cualquiera de los oligonucleótidos utilizados abaracados por la presente invención, las hebras guia y/o pasajeras pueden ser unidas a un conjugado. En algunas modalidades el conjugado es hidrofóbico. El conjugado hidrofóbico puede ser una molécula pequeña con un coeficiente de división que es superior de 10. El conjugado puede ser una molécula de tipo esterol tal como colesterol, o una molécula con una cadena de policarbono de longitud incrementada unida a C17, y la presencia de un conjugado puede influenciar la capacidad de una molécula de ARN para ser tomada en una célula con o sin un reactivo de transfección lipido. El conjugado puede ser unido a la hebra pasajera o guia a través de un enlazador hidrofóbico. En algunas modalidades, un enlazador hidrofóbico es 5-12C en longitud, y/o es a base de hidroxipirrolidina . En algunas modalidades, un conjugado hidrofóbico está unido al hebra pasajera y los residuos CU de ya sea la hebra pasajera y/o guia son modificados. En algunas modalidades, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de los residuos CU en la hebra pasajera y/o la hebra guia son modificados. El algunos aspectos, las moléculas asociadas con la invención son de auto-suministro (sd). Como se usa en la presente, "auto-suministro" se refiere a la capacidad de una molécula a ser suministrada en una célula sin la necesidad de un vehículo de suministro adicional, tal como un reactivo de transfección. Aspectos de la invención se refieren a seleccionar moléculas para uso en ARNi.
En cualquiera de las modalidades abarcadas en la presente, los oligonucleótidos utilizados pueden ser asociados con una porción hidrofóbica para objetivo y/o suministro de la molécula a una célula. En algunas modalidades, la porción hidrofóbica está asociada con la molécula de ácido nucleico a través de un enlazador. En algunas modalidades, la asociación es a través de interacciones no covalentes. En algunas otras, la asociación es através de un enlace covalente. Cualquier enlazador conocido en la téenica puede ser usado para asociar el ácido nucleico con la porción hidrofóbica. Los enlazadores conocidos en la técnica se describen en las solicitudes de PCT internacionales publicadas, el documento WO 92/03464, el documento WO 95/23162, el documento WO 2008/021157, el documento WO 2009/021157, el documento WO 2009/134487, el documento WO 2009/126933, Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2005/0107325, Patente Estadounidense 5,414,077, Patente Estadounidense 5,419,966, Patente Estadounidense 5,512,667, Patente Estadounidense 5,646, 126, y Patente Estadounidense 5,652,359, las cuales se incorporan en la presente por referencia. El enlazador puede ser tan simple como un enlace covalente a un enlazador de multiátomo. El enlazador puede ser cíclico o acíclico. El enlazador puede ser opcionamente sustituido. En algunas modalidades, el enlazador es capaz de ser desdoblado a partir del ácido nucleico. En ciertas modalidades, el enlazador es capaz de ser hidrolizado bajo condiciones fisiológicas. En algunas modalidades, el enlazador es capaz de ser desdoblado por una enzima (por ejemplo, una esterasa o fosfodiésterasa). En algunas modalidades, el enlazador comprende un elemento espaciador para separar el ácido nucleico a partir de la porción hidrofóbica. El elemento espaciador puede incluir uno a treinta carbonos o heteroátomos. En ciertas modalidades, el enlazador y/o elemento espaciador comprende grupos funcionales protonables. Tales grupos funcionales protonables pueden promover el escape endosomal de la molécula de ácido nucleico. Los grupos funcionales protonables también pueden ayudar en el suministro del ácido nucleico a una célula, por ejemplo, neutralizando la carga total de la molécula. En algunas modalidades, el enlazador y/o elemento espaciador es biológicamente inerte (es decir, no imparte la actividad o función biológica a la molécula de ácido nucleico resultante) .
La molécula hidrofóbica pude ser conectada al polinucleótido por una porción enlazadora. Opcionalmente la porción enlazadora es una porción enlazadora no nucleotidica. Los enlazadores no nucleotidicos son por ejemplo, residuos abásicos (dEspaciador), oligoetilenglicol, tal como trietileneglicol (espaciador 9) o hexaetilenegilcol (espaciador 18), o alcan-diol, tal como butandiol. Las unidades espad adoras son preferiblemente ligadas por enlaces fosfodiéster o fosforotioato. Las unidades enlazadoras pueden aparecer solamente una vez en la molécula o pueden ser incorporadas varias veces, por ejemplo, mediante enlaces fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato, o amida.
Los protocolos de conjugación típica involucran la síntesis de polinucleótidos que portan un aminoenlazador en una o más posiciones de la secuencia, sin embargo, no se requiere un enlazador. El grupo amino entonces se hace reaccioanr con la molécula a ser conjugada usando reactivos de activación o acoplamiento apropiado. La reacción de conjugación puede ser realizada ya sea con el polinucleótido todavía unido a un soporte sólido o después del desdoblamiento del polinucleótido en fase de solución. La purificación del polinucleótido moficado por HPLC típicamente resulta en un material puro.
En algunas modalidades, un grupo enlazante puede ser unido a un nucleomonómero y el péptido de transportación puede ser covalentemente unido al enlazador. En algunas modalidades, un enlazador puede funcionar como tanto un sitio de unión para un péptido de transportación y puede proporcionar estabilidad contra las nucleasas. Ejemplos de enlazadores adecuados incluyen cadenas alquilo C!-C2o sustituidas o no sustituidas, cadenas alquenilo C2-C20, cadenas alquinilo C2-C2o, péptidos, y heteroátomos (por ejemplo, S, 0, NH, etc.). Otros enlazadores ejemplares incluyen agentes de reticulación bifuncionales tales como sulfosuccinimidil-4-(maleimidofenil)-butirato (SMPB) (véase, por ejemplo, Smith et al. Biochem J 1991.276: 417-2).
En algunas modalidades, oligonucleótidos proporcionados de la invención son sintetizados como conjugados moleculares los cuales utilizan mecanismos endocitóticos mediados por el receptor para suministrar genes en las células (véase, por ejemplo, Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559, y las referencias citadas en estos).
Agentes de objetivo En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más agentes de objetivo, asociados con la composición y/o con oligonucleótidos individuales en estos. Ejemplares de tales agentes de objetivo se describen anteriormente y adicionalmente en la presente. Las frases "agente de objetivo" y "porción de objetivo" son usadas intercambiablemente.
El suministro de oligonucleótidos y/o composiciones de los mismos puede a menudo ser mejorada por el objetivo de los oligonucleótidos a un receptor celular. Las porciones de objetivo pueden ser conjugadas a los oligonucleótidos o unidas a un grupo portador (es decir, poli(L-lisina) o liposomas) ligado a los oligonucleótidos. Este método es bien adecuado a las células que presentan endocitosis mediada por el receptor especifica.
Por ejemplo, oligonucleótidos conjugados a proteínas 6-fosfomanosiladas son internalizados 20-veces más eficientemente por las células que expresan receptores 5 específicos de mañosa 6-fosfato que los oligonucleótidos libres. Los oligonucleótidos también pueden ser acoplados a un ligando para un receptor celular usando un enlazador biodegradable. En otro ejemplo, el constructo de suministro es estreptaviden manosilado el cual forma un complejo hermético con oligonucleótidos biotinilados. La estreptavidina manosilada se encontró por incrementar 20-veces la internalización de oligonucleótidos biotinilados. (Vlassov et al.1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108) .
El campo de interferencia de ARN ha revolucionado el estudio de los procesos biológicos. Estas herramientas incluyen ARN inhibidores pequeños (siARN), ARN hairpina pequeños (ARNsh) y ribozimas. Como la teenología de interferencia de ARN ha crecido, también lo ha hecho la lista de obejtivos de secuencia de ARN validados y reactivos para uso. Las composiciones proporcionadas y métodos abarcados por la presente solicitud pueden ser fácilmente aplicados a cada una de tales secuencias objetivo. Para una base de datos de secuencias objetivo de siARN validadas y enlaces a kits y reactivos que pueden ser usados para experimentos de interferencia de ARN, véase, por ejemplo, http://www.rnainferierence.org/Índex.html. Secuencias objetivo de siARN ejemplares útiles por la presente invención se proporcionan en el Apéndice (A) acompañante.
Oligonucleótidos Inmunomoduladores En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan como oligonucleótidos inmunomoduladores.
Oligonucleótidos utilizados de conformidad con la invención pueden ser agentes inmunomoduladores, es decir, agentes que son capaces de modular o regular una respuesta inmune cuando se administran a un sujeto. Las respuestas inmunes estimuladas por tal agente pueden ser una respuesta innata y/o una inmune adaptiva. El sistema inmune se divide en un sistema inmune más innato, y el sistema inmune adaptivo adquirido de invertebrados, el último de los cuales además se divide en componentes celulares humorales. En algunas modalidades, la respuesta inmune puede ser mucosal. Porciones inmunomoduladoras descritas en la presente pueden ser usadas en el contexto de las clases descritas previamente de oligonucleótidos inmunomoduladores que incluyen clases ODN tales como clase A, clase B, clase C, clase E, clase T, y clase P.
En algunas modalidades de la invención oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados de conformidad con la presente invención incluyen una o más porciones inmunomoduladoras. En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención incluyen uno o más "dinucleótidos CpG". Un dinucleótido CpG puede ser metilado o no metilado. Un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es un molécula de oligonucleótido la cual contiene una secuencia de dinucleótido citosina-guanina no metilado (es decir, una citidina 5' no metilada seguida por guanosina 3' y ligada por un enlace fosfato) y el cual activa el sistema inmune; tal como un oligonucleótido inmunoestimulador es un oligonucleótido CpG. Oligonucleótidos CpG han sido descritos en un número de patentes publicadas, solicitudes de patente publicadas, y otras publicaciones, que incluyen: Patente Estadounidense Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371 ; 6,239,116; y 6,339,068, los contenidos de las cuales son incorporados en la presente por referencia. En algunas modalidades, oligonucleótidos utlizados son o actúan como un agonista para un receptor similar a Toll. En algunas modalidades, los oligonucleótidos utilizados son o actúan como un agonista para el receptor 9 similar a Toll (TLR9). En algunas modalidades, los oligonucleótidos utilizados son o actúan como un antagonista para un receptor similar a Toll. En algunas modalidades, los oligonucleótidos utilizados son o actúan como un antagonista para un receptor 9 similar a Toll (TLR9). En algunas modalidades, oligonucleótidos estereodefinidos abarcados por la invención presentan mayor afinidad para el receptor/objetivo respectivo, comparado con la contraparte estereo-aleatoria. En algunas modalidades, oligonucleótidos estereo-definidos abaracados por la invención provocan una o más respuestas inmunes, cuando se administran a sujetos que cubren ciertos criterios clínicos, con menos grados de variables entre las poblaciones, comparados con las contrapartes estereo-aleatorias. En algunas modalidades, oligonucleótidos estereo-def inidos abarcados por la invención causan menos grado de efectos secundarios tóxicos o algunos efectos secundarios, cuando se administran a sujetos que cubren ciertos criterios clínicos, comparados con las contrapartes estero-aleatorias.
En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención están libres de porciones de dinucleótido CpG. Estos oligonucleótidos los cuales están libres de dinucleótidos CpG son referidos como oligonucleótidos no CpG, y tienen porciones inmunomoduladoras no CpG. En algunas modalidades, estos son inmunoestimuladores de oligonucleótidos ricos en T, tales como oligonucleótidos que tienen al menos 80% de T.
En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores Clase B.
ODN "clase B" son potentes en la activación de células B pero son relativamente débiles para inducir activación de células IFN-a y NK. Los oligonucleótidos CpG clase B típicamente son completamente estabilizados e incluyen un dinucleótido CpG no metilado dentro de ciertos contextos base preferidos. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371 ; 6,239,116; y 6,339,068.
Otra clase es potente para inducir activación de células IFN-a y NK pero es relativamente débil en la estimulación de células B; esta clase ha sido llamada la "clase A". En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores clase A. Los oligonucleótidos CpG clase A típicamente tienen secuencias poli-G estabilizadas en los extremos 5' y 3' y una secuencia que contiene dinucleótido CpG de fosfodiéster palindró ico de al menos 6 nucleótidos. Véase, por ejemplo, solicitud de patente publicada PCT/US00/26527 (WO 01/22990).
Aún otra clase de oligonucleótidos CpG activa las células B y células NK e induce IFN-a; esta clase ha sido llamada la clase-C. En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores clase C. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores "clase C" que contienen al menos dos distintas porciones, tienen efectos estimuladores únicos y deseables en las células del sistema inmune. Algunos de estos ODN tienen tanto una secuencia CpG "estimuladora" tradicional como una porción "rica en GC" o "neutralizante de células-B". Estos oligonucleótidos de porción de combinación tienen efectos estimulantes inmunes que caen alguno entre aguellos efectos asociados con los ODN CpG "clase B" tradicionales, los cuales son inducotres fuertes de la activación de células B y activación de células dendríticas (DC), y aquellos efectos asociados con una clase más recientemente descrita de oligonucleótidos estimuladores inmunes (ODN CpG "clase A") los cuales son inductores fuertes de la activación de células asesinas naturales (NK) e IFN-a pero inductores relativamente pobres de la activación de células-B y DC. Krieg ?M et al. (1995) Nature 374:546-9; Bailas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 48:4072-6. Mientras los ODN de CpG de clase B preferidos a menudo tienen armazones de fosforotioato y ODN CpG de clase A preferidos tienen armazones quiméricos o mezclados, la clase C de oligonucleótidos estimuladores inmunes de la porción de combinación puede tener estabilizada, por ejemplo, armazones de fosforotioato, quiméricas, o fosfodiésteres, y en algunas modalidades preferidas, tienen armazones semi-blandas. Esta clase ha sido descrita en la Solicitud de Patente Estadounidense USI 0/224,523 presentada el 19 de Agosto de 2002, los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente por referencia.
En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores clase E. Los oligonucleótidos "clase E" tienen una capacidad mejorada para inducir la seceeción de IFN-alpha. Estos ODN tienen un análogo de nucleótido lipofilico sustituido al 5' y/o 3' de una porción YGZ. El compuesto de la fórmula de clase E puede ser, por ejemplo, cualquiera de los análogos de nucleótido lipofilicos sutituidos siguientes: una pirimidina sustituida, un uracilo sustituido, un análogo T hidrofóbico, un tolueno sustituido, un imidazol o pirazol sustituido, un triazol sustituido, 5-cloro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-yodo-uracilo, 5-etil-uracilo, 5-propil-uracilo, 5-propinil-uracilo, (E)-5-(2-bromovinil)-uracilo, o 2,4-difluoro-tolueno. Los oligonucleótidos clase E se describen al menos en la solicitud de patente provisional Estadounidense 60/847,811.
En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores clase T. Los oligonucleótidos "clase T" inducen la secreción de niveles inferiores de IFN-alfa cuando no se modifican como en los ODNs de la invención y citocinas y quimiocinas relacionadas con IFN que los oligonucleótidos clase B o clase C, mientras retienen la capacidad para inducir los niveles de IL-10 similares a oligonucleótidos clase B. Los oligonucleótidos clase T se describen al menos en la Solicitud de Patente Estadounidense No.11/099,683, los contenidos completos de la cual se incorporan de este modo por referencia.
En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores clase P. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores "clase P" tienen varios dominios, incluyendo el dominio de activación 5TRL, 2 regiones que forma dúplex, y un espaciador opcional y la cola 3' . Esta clase de oligonucleótidos tiene la capacidad en algunos casos de inducir niveles muy superiores de secreción de IFN-a que la clase-C. Los oligonucleótidos Clase-P tienen la capacidad de auto-esnamblarse espontáneamente en concatámeros ya sea in vitro y/o in vivo. Sin ser ligado por cualquier teoría particular por el método de acción de estas moléculas, una hipótesis potencial es que esta propiedad dota a los oligonucleótidos clase-P con la capacidad para más altamente reticular TLR9 dentro de ciertas células inmunes, induciendo un patrón de activación inmune distinto comparado con las clases descritas previamente de oligonucleótidos CpG. La reticulación de receptores TLR9 puede inducir la activación de secreción IFN-a más fuerte a través del bucle de retroalimentación de IFNR tipo I en células dendríticas plasmacitoides . Los oligonucleótidos clase P se describen al menos en la Solicitud Estadounidense Número de Serie 11/706,561.
En algunas modalidades, oligonucleótidos inmunoestimuladores utilizados de conformidad con la presente invención son oligonucleótidos inmunomoduladores clase S. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la presente invención pueden ser oligonucleótidos inmunosupresivos. Las porciones inmunomoduladoras descritas anteriormente pueden ser usadas en el contexto de clases de oligonucleótidos inmunosupresivos descritos anteriormente que incluyen clases ODN tales como la "clase S". ODN de clases S o inhibidoras, son útiles siempre que sea deseable inhibir la inmunoestimulación. Los ODN inhibidores pueden ser usados para prevenir y tratar choque séptico, inflamación, alergia, asma, rechazo al injerto, enfermedad de injerto contra hospedero (GvHD), enfermedades autoinmunes, enfermedades mediadas por Thl- o Th2-, infecciones bacterianas, infecciones parasíticas, abortos espontáneos y tumores. El ODN inhibidor puede ser usado en general para inhibir la activación de todas las células que expresan los TLRs relevantes, y más específicamente para inhibir la activación de células que presentan antígeno, células B, células dendríticas plasmacitoides (pDCs), monocitos, células derivadas de monocitos, eosinófilos y nuetrófilos. Los ODN clase S son además descritos al menos en la Solicitud de Patente Serie No.10/977,560.
De conformidad con la invención, oligonucleótidos inmunomoduladores pueden tener un armazón de enlaces de internucleótidos estabilizados en adición al (los) nucleótido(s) de purina FANA estabilizantes o tienen un armazón quimérico de enlaces de nucleótido de fosfodiéster y estabilizados. Un "enlace de internucleótido estabilizado" debe sgnificar un enlace de internucleótido que es relativamente resistente a la degradación ín vivo (por ejemplo, mediante una exo- o endo-nucleasa), comparado con un enlace internucleótido fosfodiéster. En algunas modalidades, enlaces de internucleótidos estabilizados incluyen, sin limitación, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosfonoacetato, Rp-fosforotioato, Sp-fosforotioato, boranofosfato, o 3'-tioformacetal, o combinaciones de los mismos. Otros oligonucleótidos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos, tales como alquil- y aril-fosfatos (en las cuales el oxigeno de fosfonato cargado es reemplazado por un grupo alquilo o arilo) , fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en los cuales la porción de oxigeno cargada es alquilada. Oligonucleótidos los cuales contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetileneglicol , en cualquiera o ambos términos también han sido mostrados por ser sustancialmente resistentes a la degradación de nucleasa.
Como se describe en más detalle en la presente, de conformidad con la invención, estas y otras modificaciones pueden ser selectivamente introducidas en una posición(es)/patrón(es) predeterminados dentro de un oligonucleótido para asi obtener una molécula de oligonucleótido estereoespecifica. Además, de conformidad con la invención, se puede obtener una composición que comprende una pluralidad de tales oligonucleótidos en un grado extremadamente alto de pureza (por ejemplo, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, esencialmente 100%). De este modo, composiciones proporcionadas de oligonucleótidos que comprenden oligonucleótidos de uno o más tipos predeterminados son adecuadas para administración in vivo. Se contempla que, debido al alto grado de pureza estrucutral de oligonucleótidos en una composición (de manera que una composición comprende un tipo único especificado de oligonucleótidos), composiciones proporcionadas pueden estimular las actividades biológicas mejoradas, eficacia incrementada, vairables reducidas en respuesta, y/o efectos secundarios indeseados, cuando se administran a sujetos.
Por consiguiente, los oligonucleótidos utilizados de la invención son particularmente útiles como un agente terapéutico cuando se formulan en una composición farmacéutica. En algunas modalidades, tal agente terapéutico es un agente inmunomodulador. En algunas modalidades, los agentes inmunomoduladores proporcionados son agentes inmunoestimuladores . En algunas modalidades, los agentes inmnunomoduladores proporcionados son agentes inmunoinhibidores (o inmunosupresores). En algunas modalidades, agentes inmunomoduladores proporcionados actúan como un adyuvante. En algunas modalidades, agentes inmunomoduladores proporcionados pueden cambiar una respuesta inmune tipo Th2 a una respuesta inmune tipo Thl induciendo citocinas de tipo Thl que pueden suprimir la respuesta Th2 inflamatoria. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos son útiles como un agente que regula la expresión del gen. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos son útiles como un agente capaz de silenciar un gen de interés, por ejemplo, genes asociados con la enfermedad o trastorno. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas de oligonucleótidos son útiles como un agente para regular el empalme de ARN.
Por ejemplo, algunas modalidades de tales oligonucleótidos incluyen aquellas que comprenden al menos una porción de oligonucleótido CpG. En algunas modalidades, tales oligonucleótidos comprenden al menos una porción de dinucleótido CpG no metilada. En algunas modalidades, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente invención son categorizados como oligonucleótidos Clase A (tipo D). En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente invención son categorizados como oligonucleótidos Clase B (tipo K). En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles por la presente invención son categorizados como oligonucleótidos Clase C. En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles por la presente invención son categorizados como oligonucleótidos Clase P. En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles por la presente invención contienen al menos una secuencia palindrómica . En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles por la presente invención pueden formar una estructura "similar a mancuerna". En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles por la presente invención pueden formar una estructura en forma de "Y", o multímeros de los mismos. En algunas modalidades, oligonucleótidos que contienen CpG útiles por la presente invención pueden formar una estructura tetrahédrica, Para revisiones, véase por ejemplo: Bode et al. (2011) Expert Rev. Vaccines 10(4): 499-511; Hanagata (2012) Int. J.
Nanomedicine 7:2181-95.
En algunas modalidades, oligonucleótidos utilizados de conformidad con la presente invención estimulan efectos inmunomoduladores en células que expresan receptor(es) similares a Toll. En algunas modalidades, células objetivo que responden a tales oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, células que presentan antigenos (APCs), células T y B especificas del antigeno, lingocitos T citotóxicos (CTLs), células asesinas naturales (NK), y células dendriticas (DCs). En algunas modalidades, efectos inmunomoduladores son los efectos dirigidos estimulados por células que expresan un receptor o receptores que reconocen tal oligonucleótido. En algunas modalidades, tales oligonucleótidos estimulan efectos inmunomoduladores en células que expresan el receptor 9 similar a Toll (TLR9) como ligandos. Por ejemplo, algunas modalidades de la invención incluyen oligonucleótidos CpG que actúan como agonistas de uno o más receptores similares a Toll. Algunas modalidades de la invención incluyen oligonucleótidos CpG que actúan como antagonistas de uno o más receptores similares a Toll. En algunas modalidades, los efectos inmunomoduladores son efectos indirectos que ocurren corriente abajo, involucrando células que no responden necesariamente a tales oligonucleótidos o expresan tales receptores.
En algunas modalidades, oligonucleótidos CpG útiles por la presente invención se caracterizan en que activan directamente las células B humanas y células dendriticas plasmacitoides mediante TLR-9. En algunas modalidades, oligodesoxinucleótidos CpG útiles por la presente invención son caracterizados porque indirectamente soportan la maduración y proliferación de células asesinas naturales, células T y monocitos/macrófagos.
En algunas modalidades, oligonucleótidos CpG útiles por la presente invención activan una respuesta inmune, la cual se caracteriza por la producción de citocinas proinflamatorias de tipo Thl, quimiocinas e IgM pol irreactivo.
En algunas modalidades, oligonucleótidos CpG útiles por la presente invención son caracterizados porque la inmunogenicidad de los antigenos de proteina convencional y vacunas a base de péptidos se mejora por tales oligonucleótidos. Sin desear seer ligado por una teoría particular, se cree que tal efecto adyuvante es mediado a través de la función mejorada de células que presentan antígeno profesionales y la generación resultante de respuestas inmunes específicas de la vacuna celulares y humorales.
En algunas modalidades, oligonucleótidos CpG útiles por la presente invención son caracterizados porque oligonucleótidos CpG incrementan la magnitud y aceleran el desarrollo de respuestas inducidas por la vacuna. También mejoran la inducción de la memoria, de este modo extendiendo la duración de la inmunidad humoral y celular.
En algunas modalidades, oligonucleótidos CpG útiles por la presente invención son caracterizados porque refuerzan tanto la inmunidad en grupos de sujetos (por ejemplo, poblaciones de pacientes) con función inmune reducida, tal como la anterior y aquellos con sistema inmune suprimido. Son efectivos cuando se administran ya sea sistémicamente o mucosalmente . Los ensayos preclinicos y clínicos usando oligonucleótidos CpG de quiralidad mezclada (por ejemplo, no quiralmente puro) demonstran que los oligonucleótidos CpG pueden reforzar la inmunoge cidad de las vacunas dirigidas a enfermedades infecciosas y cáncer. Además, los ensayos clínicos indican que los oligonucleótidos CpG son razonablemente seguros cuando se administran como adyuvanres de vacunas.
Oligonucleótidos inmunomoduladores preparados de conformidad con la presente descripción son útiles para un número de aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas adecuadas. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser administradas a un sujeto en una cantidad efectiva para tratar una enfermedad, trastorno o condición, como se describen en detalle adicional en la presente por rutas adecuadas de administración. De conformidad con la invención, una cantidad efectiva de oligonucleótidos inmunoestimuladores puede ser administrada a un sujeto quién probablemente está beneficiándose del refuerzo del sistema inmune (por ejemplo, respuesta inmune mejorada). En algunas modalidades, beneficios clínicos son conferidos directamente por un oligonucleótido inmunomodulador que actúa sobre sus células inmune objetivo, por ejemplo, mediante unión del ligando a sus proteínas del receptor similar a Toll. En algunas modalidades, los beneficios clínicos se logran al menos en parte indirectamente por reforzamiento total del sistema inmune del sujeto.
Como se usa en la presente, los términos "cantidad efectiva" y "dosis efectiva" se refieren a cualquier cantidad o dosis de un compuesto o composición que es suficiente para cubrir completamente su propósito(s) propuesto, es decir, una respuesta medicional o biológica deseada en un tejido o sujeto en una relación de riesgo/beneficio aceptable. El propósito propuesto relevante puede ser objetivo (es decir, mesurable por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de una sensación de un efecto). En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que, cuando se administra a una población de sujetos que cubren ciertos criterios clínicos para una enfermedad o trastorno (por ejemplo, como se determina por los síntomas manifestados, progreso/etapa de la enfermedad, perfil genético, etc . ) , se obtiene una respuesta terapéutica estadísticamente significante entre la población. Una cantidad terapéuticamente efectiva es comúnmente administrada en un régimen de dosificación que puede comprender dosis unitarias múltiples. Para cualquier agentefarmacéutico particular, una cantidad terapéuticamente efectiva (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno a ser tratado y la severidad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición especifica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, ruta de administración, y/o velocidad de excreción o metabolismo del agente farmacéutico específico empleado; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las artes médicas. Aquellos de habilidad ordinaria en la téenica apreciarán que en algunas modalidades de la invención, una dosificación unitaria puede ser considerada por contener una cantidad efectiva si contiene una cantidad apropiada para administración en el contexto de un régimen de dosificación correlacionado con un resultado positivo. En algunas modalidades, oligodesoxinucleótidos CpG preparados de conformidad con la presente invención por lo tanto pueden ejercer efectos inmunomoduladores y eficacia mejorada debido a su pureza quiral. En algunas modalidades, una cantidad efectiva de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados es menos de aquella de la contraparte menos pura.
En algunas modalidades, una composición de oligonucleótido inmunomodulador se administra a un sujeto sano. En algunas modalidades, una composición inmunoestimuladora de oligonucleótido se administra a un sujeto como parte de una vacuna, en la cual el oligonucleótido inmunoestimulador actúa como un adyuvante. En algunas modalidades, una composición inmunoestimuladora de oligonucleótido se administra a un sujeto con un sistema inmune suprimido (por ejemplo, comprometido). En algunas modalidades, un sujeto, cuyo sistema inmune es suprimido y no responde suficientemente a una vacuna convencional, responde a una vacuna que comprende un oligonucleótido inmunoestimulador abarcado por la presente invención. En algunas modalidades, quién puede beneficiarse de tal vacuna tiene un sistema inmune suprimido asociado con una infección, tal como infección viral, por ejemplo, HIV, HBV, HCV, etc.
La invención abarca el uso de oligonucleótidos inmunomoduladores contemplados en la presente para el tratamiento de un sujeto que tiene una condición que puede ser tratada por estimulación o supresión de la respuesta inmune. De este modo, composiciones de oligonucléotidos inmunomoduladoras proporcionadas son útiles para el tratamiento de enfermedades o condiciones, que incluyen, sin limitación, infección, cáncer, alergia, asma, una condición inflamatoria, una enfermedad autoinmune, y cualquier combinación de los mismos.
En algunas modalidades, composiciones de oligonucléotidos inmunomoduladoras proporcionadas son útiles en algunos aspectos de la invención para el tratamiento de un sujeto en riesgo de desarrollar una condición clínica. Condiciones clínicas no limitantes incluyen alergia, asma, una infección con un organismo infeccioso, cáncer, inflamación, y enfermedad autoinmune. Un sujeot en riesgo como se usa en la presente es un sujeto quien tiene cualquier riesgo de exposición a una infección que causa un patógeno o un cáncer o un alérgeno o un riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, un sujeot en riesgo puede ser un sujeto quién está planeando viajar a un área donde un tipo de agente infeccioso particular se encuentra, o puede ser un sujeto quién a través de procedimientos médicos o estilo de vida está expuesto a fluidos corporales los cuales puede contener organismos infecciosos o directamente al organismo, o aún cualquier sujeto vivo en un área donde un organimo o un alérgeno ha sido identificados. Sujetos en riesgo de desarrollar infección también incluyen poblaciones generales a las cuales una agencia médica recomienda bacunación con un antigeno de organismo infeccioso particular. Si el antigeno es un alérgeno y el sujeto desarrolla respuestas alérgicas a tal antigeno particular y el sujeto puede ser expuesto al antigeno, es decir, durante la estación de polen, entonces tal sujeto está en riesgo de exposición al angigeno. Un sujeto en riesgo de desarrollar alergia o asma incluye aquellos sujetos que han sido identificados por tener una alergia o asma pero que no tienen la enfermedad activa durante los tratamientos de oligonucléotidos in unomoduladores asi como también sujetos que son considerados por estar en riesgo de desarrollar estas enfermedades debido a los factores ambientales o genéticos. Un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer es un quién tiene una alta probabilidad de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anormalidad genética, la presencia de la cual se ha demostrado por tener una relación correlativa a una probabilidad superior de desarrollar un cáncer y sujetos expuestos a agentes que causan cáncer tales como tabaco, asbestos, u otras toxinas químicas, o un sujeto quien ha sido previamente tratado por cáncer y está en remisión aparente.
Cuando un sujeto está en riesgo de desarrollar un cáncer se trata con un antígeno específico para el tipo de cáncer al cual el sujeto está en riesgo de desarrollar y un oligonucleótido inmunoestimulador CpG, el sujeto puede ser capaz de eliminar las células cancerosas conforme se desarrolla. Si un tumor comienza a formarse en el sujeto, el sujeto desarrollará una respuesta inmune específica contra el antígeno tumoral.
En algunas modalidades, composiciones de oligonucleótidos in unomoduladoras proporcionadas son útiles para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno inmune, que incluye asma, alergia, y condiciones relacionadas.
Un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alérgeno. Una alergia se refiere a hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alérgeno). Las condiciones alérgicas incluyen pero no se limitan a eczema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (urticaria) y alergias a los alimentos, y otras condiciones atópicas.
Las alergias son en general causadas por una generación del anticuerpo IgE contra alérgeneos inofensivos. Las citocinas que son inducidas por administración sistémica o mucosal de los oligonucleótidos inmuno oduladores son predominantemente de una clase llamada Thl (ejemplos son IL- 12 IP-10, IFN-a y IFN-g) y estas inducen tanto las respuestas inmunes celulares como humorales. El otro tipo principal de respuesta inmune, el cual está asociado con la producción de citocinas IL-4 y IL-5, es llamado una respuesta inmune Th2. En general, parece que las enfermedades alérgicas son mediadas por las respuestas inmunes de tipo Th2. Con base en la capacidad del oligonucleótido inmunomodulador para cambiar la respuesta inmune en un sujeto a partir de un Th2 predominante (lo cual está asociado con la producción de anticuerpos IgE y alergia) a una respuesta equilibrada Th2/Th2 (la cual es protectora contra reacciones alérgicas), una dosis efectiva para inducir una respuesta inmune de un oligonucleótido inmunomodulador puede ser administrada a un sujeto para tratar o prevenir el asma y alergia.
De este modo, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladoras proporcionadas tienen utilidad terapéutica significante en el tratamiento de condiciones alérgicas y no alérgicas tales como asma. Las citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5 son elevadas en las vías respiratorias de sujetos asmáticos. Estas citocinas promueven aspectos importantes de la respuesta implamatoria asmática, incluyendo cambio de isótopo IgE, qui iotaxis de eosinófilo y activación y crecimiento de células mástil. Las citocinas Thl, especialmente IFN-g y IL-12, pueden suprimir la formación de clones Th2 y la producción de citocinas Th2. El asma se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y actividad incrementada de las vías respiratorias a los agentes inhalados. El asma es frecuentemente, aunque no exclusivamente asociado con síntomas alérgicos o atópicos.
Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas también pueden ser administradas en conjunto con una terapia anti-alergia. Métodos convencionales para tratar o prevenir la alergia han involucrado el uso de medicamentos para alergia o terapias de desensibilización. Algunos que engloban terapias para tratar o prevenir la alergia incluyen el uso de anticuerpos anti-IgE neutralizantes. Las anti-histaminas y otros fármacos lo cuales bloquean los efectos de los mediadores químicos de la reacción alérgica, ayudan a regular la severidad de los síntomas alérgicos pero no previenen la reacción alérgica y no tienen efectos en las respuestas alérgicas subsecuentes. Las terapias de desensibilización son realizadas proporcionando dosis pequñas de un alérgeno, usualmente por inyección bajo la piel, con el fin de inducir una respuesta de tipo IgG contra el alérgeno. La presencia del anticuerpo IgG, se cree ayuda a neutralizar la producción de mediadores que resultan de la inducción de anticuerpos IgE.
Inicialmente, el sujeto se trata con una dosis muy baja del alérgeno para evitar inducir una reacción severa y la dosis se incrementa lentamente. Este tipo de terapia es nociva debido a que el sujeto está actualmente administrándose los cuales causan la respuesta alérgica y pueden resultar reacciones alérgicas severas.
Medicamentos anti-alergias incluyen, pero no se limitan a, anti-histaminas, corticoesteroides, e inductores de prostaglandina. Las anti-histaminas son compuestos los cuales contrarrestan la histamina liberada por células mástil o basifilos. Estos compuestos son bien conocidos en la téenica y comúnmente usados para el tratamiento de alergia. Las anti-histaminas incluyen, pero no se limitan a, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratidina, metscopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina, y tranilast. Los corticosteroids incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, beclometasona, budesónido, dexametasona, flunisolido, propionato de fluticasona, y triamcinolona . Aunque la dexametasona es un corticoesteroide que tiene acción antiinflamatoria, no es usado regularmente para el tratamiento de alergia o asma en una forma inhalada debido a que es altamente absorbido y tiene efectos secundarios supresores de largo plazo a una dosis efectiva. La dexametasona, sin embargo, puede ser usada de conformidad con la invención para tratar alergia o asma debido a que cuando se administra en combinación con una composición de la invención puede ser administrada a una dosis baja para reducir los efectos secundarios. Algunos de los efectos secundarios asociados con el uso de corticoesteroides incluyen tos, disfonía, afta oral (candidiasis), y en dosis superiores, efectos sistémicos, necrosis séptica del hueso, formación de cataratas, supresión del crecimiento, hipertensión, debilidad muscular, adelgazamiento de la piel y moretones con facilidad. Barnes & Peterson (1993) A Rev Respir Dis 148:S1-S26; y Ramada AK et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48.
Composiciones proporcionadas de oligonucleótidos y métodos de conformidad con la invención pueden ser usadas solas o en conjunto con otros agentes y métodos útiles para el tratamiento de asma. En un aspecto la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene asma. El método de conformidad con este aspecto de la invención incluye la etapa de administrar a un sujeto que tiene astma una cantidad efectiva de una composición de la invención para tratar el sujeto.
En algunas modalidades, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene astma. El método de conformidad con este aspecto de la invención incluye la etapa de administrar a un sujeto que tiene astma una cantidad efectiva de la composición de la invención y una terapia anti-asma para tratar el sujeto.
"Asma" como se usa en la presente se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación y estrechamiento de las vías respiratorias, y reactividad incrementada de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma es frecuentemente, aunque no exclusivamente, asociado con una condición atópica o alérgica. Los síntomas del asma incluyen episodios recurrentes de silbilancias, dificultad para respirar, opresión en el pecho, y tos, que resultan de la obstrucción de las vías respiratorias. La inflamación de las vías respiratorias asociadas con el asma puede ser detectada a través de la observación de un número de cambios fisiológicos, tales como, desnudación del epitelio de las vías respiratorias, membrana de basamento detrás de la deposición del colágeno, edema, activación de células mástil, infiltración de células inflamatorias, que incluyen neutrófilos, eosinófilos y linfocitos. Como un resultado de la inflamación de las vías respiratorias, los pacientes con asma a menudo experimentan hipersensibilidad de las vías respiratorias, limitación del flujo de aire, síntomas respiratorios, y cronicidad de la enfermedad. Las limitaciones del flujo de aire inclyen broncoconstricción aguda, edema de las vías respiratorias, formación de tapón de moco, y remodelación de las vías respiratorias, características las cuales a menudo conducen a obstrucción bronquial. En algunos casos de asma, puede ocurrir fibrosis de la membrana del sub-basamente, conduciendo a anormalidades persistentes en la función pulmonar.
La búsqueda durante los pasados varis años ha revelado que el asma resulta probablemente de interacciones complejas entre las células inflamatorias, mediadores, y otras células y tejidos residentes en las vías respiratorias. Células mástil, eosinófilos, células epiteliales, macrófagos, y células T activadas todas juegan un papel importante en los procesos inflamatorios asociados con el asma. Djukanovic R et al. (1990) A Rev Respir Dis 142:434-457. Se cree que estas células pueden tener influencia en la función de las vías respiratorias a través de la secreción de mediadores recientemente sintetizados y realizados, los cuales pueden actuar indirectamente o directamente en el tejido local. También se ha reconocido que las subpoblaciones de linfocitos T (Th2) juegan un papel importante en la regulación de la inflamación alérgica en las vías respiratorias liberando las citocinas selectivas y estableciendo la cronicidad de la enfermedad. Robinson DS et al. (1992) N Engl J Med 326:298- 304.
El asma es un trastorno complejo el cual se origina en diferentes etapas en el desarrollo y puede ser clasificada con base en el grado de síntomas como aguda, subaguda o crónica. Una respuesta inflamatoria aguda está asociada con un reclutamiento temprano de las células en las vías respiratorias. La respuesta inflamatoria subaguda involucra el reclutamiento de células asi como también la activación de las células residentes causando un patrón de inflamación más persistente. La respuesta inflamatoria crónica se caracteriza por un nivel persistente de daño celular y en un proceso de reparación en curso, el cual puede resultar en anormalidades permanentes en las vías respiratorias.
Un "sujeto que tiene asma" es un sujeto que tiene un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por una inflamación y estrechamiento de las vías respiratorias y reactividad incrementada de las vías respiratorias a agentes inhalados. Los factores asociados con la iniación del asma incluyen, pero no se limitan a, alérgenos, temperatura fría, ejercicio, infecciones virales y SO2.
Como se mencionó anteriormente, el asma puede estar asociada con un tipo Th2 de la respuesta inmune, que se caracteriza, al menos en parte por citocinas Th2 IL-4 e IL-5, asi como isotipo de anticuerpo que cambia a IgE. Las respuestas inmunitarias Thl y Th2 son mutuamente contra reguladoras, de modo que el sesgo de la respuesta inmune hacia un tipo Thl de la respuesta inmune puede prevenir o mejorar un tipo Th2 de la respuesta inmune, incluyendo alergia. Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores previstas de la invención son por lo tanto útiles por si mismas para tratar a un sujeto que tiene el asma debido a que los análogos pueden sesgar la respuesta inmune hacia un tipo de respuesta inmunitaria Thl.
Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladoras disponibles de la invención también pueden administrarse en combinación con una terapia del asma. Los métodos convencionales para tratar o prevenir el asma han implicado el uso de las terapias contra la alergia (descrito anteriormente) y un número de otros agentes, incluyendo agentes inhalados.
Los medicamentos para el tratamiento del asma están generalmente separados en dos categorías, los medicamentos de alivio rápido y medicamentos de control a largo plazo. Los pacientes de asma toman los medicamentos de control a largo plazo sobre una base diaria para lograr y mantener el control del asma persistente. Los medicamentos de control a largo plazo incluyen agentes anti-inflamatorios como los corticosteroides, sodio chromolyn y nedocromil; broncodilatadores de acción prolongada, como la de acción prolongada 2-agonistas y metilxantinas; y modificadores de los leucotrienos. Los medicamentos de alivio rápido incluyen agonistas de acción corta b2, anticolinérgicos y corticosteroides sistémicos. Hay muchos efectos secundarios asociados con cada uno de estos medicamentos y ninguno de solas o en combinación es capaz de prevenir o tratar el asma completamente las drogas.
Los medicamentos contra el asma incluyen, pero no se limitan a, la PDE-4 inhibidores, broncodilatador/beta-2 agonistas, abridores de canales de K +, VLA 4-antagonistas, antagonistas neurokin, tromboxano A2 (TXA2) inhibidores de la síntesis, xantinas, antagonistas del ácido araquidónico, inhibidores de la 5 lipoxigenasa, antagonistas del receptor de TXA2, antagonistas de TXA2, inhibidores de proteínas de activación 5-lipox, y los inhibidores de la proteasa.
Los broncodilatadores/agonistas b2 son una clase de compuestos que causan broncodilatación o la relajación del músculo liso. Broncodilatadores/agonistas b2 incluyen, pero no se limitan a, salmeterol, salbutamol, albuterol, terbutalina, D2522/for oterol, fenoterol, bitolterol, metilxantinas pirbuerol y orciprenalina. Agonistas de acción prolongada b2 y broncodilatadores son compuestos que se utilizan para la prevención a largo plazo de los síntomas, además de las terapias anti-inflamatorias. De acción prolongada agonistas b2 incluyen, pero no están limitados a, salmeterol y salbutamol. Estos compuestos se utilizan generalmente en combinación con corticosteroides y generalmente no se utilizan sin ninguna terapia inflamatoria. Ellos se han asociado con efectos secundarios tales como taquicardia, temblor muscular esquelético, hipocalemia, y prolongación del intervalo QTc en caso de sobredosis.
Las metilxantinas, incluyendo, por ejemplo teofilina, han sido utilizados para el control a largo plazo y la prevención de los síntomas. Estos compuestos producen broncodilatación resultante de la inhibición de la fosfodiesterasa y es probable que el antagonismo de adenosina. Toxicidades agudas relacionadas con la dosis son un problema particular con este tipo de compuestos. Como resultado, la concentración de suero de rutina debe ser controlada con el fin de tener en cuenta la toxicidad y estrecho rango terapéutico que surge de las diferencias individuales en el aclaramiento metabólico. Los efectos secundarios incluyen taquicardia, taquiarritmias, náuseas y vómitos, la estimulación del sistema nervioso central, dolor de cabeza, convulsiones, hematemesis, hiperglucemia e hipopotasemia . Los agonistas b2 de acción corta incluyen, pero no están limitados a, albuterol, bitolterol, pirbuterol y terbutalina. Algunos de los efectos adversos asociados con la administración de agonistas b2 de acción corta incluyen taquicardia, temblor muscular esquelético, hipopotasemia, aumento de ácido láctico, dolor de cabeza, y la hiperglucemia.
El cromolin sodio y el nedocromil son utilizados como medicamentos de control a largo plazo para la prevención de los síntomas del asma principalmente procedentes de la aplicación o síntomas alérgicos derivados de alérgenos. Estos compuestos se cree que bloquear reacciones tempranas y tardías a los alérgenos al interferir con la función del canal de cloruro. Ellos también estabilizan las membranas de mastocitos e inhiben la activación y liberación de mediadores de inosineófilos y células epiteliales. Se requiere generalmente un periodo de cuatro a seis semanas de la administración para lograr un beneficio máximo.
Los anticolinérgicos se utilizan generalmente para el alivio del broncoespasmo agudo. Estos compuestos se cree que funcionan por inhibición competitiva de receptores colinérgicos muscarinicos . Los anticolinérgicos incluyen, pero no se limitan a, bromuro de ipratropio. Estos compuestos invierten sólo broncoespasmo colinérgicamente mediada y no modifican ninguna reacción al antigeno. Los efectos secundarios incluyen sequedad de la boca y las secreciones respiratorias, aumento de las sibilancias en algunos individuos, y visión borrosa si se rocían en los ojos.
En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados también puede ser útil para el tratamiento de la remodelación de la vía aérea. De las vías respiratorias remodelación de los resultados de la proliferación de células del músculo liso y / o engrosamiento de la submucosa en las vías respiratorias, y en última instancia provoca el estrechamiento de las vías aéreas que conduce a un flujo de aire restringido. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención pueden prevenir la remodelación y posiblemente incluso reducir la acumulación de tejido resultante del proceso de remodelación.
En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados son útiles para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno inflamatorio. Tal como se utiliza aquí, el término "trastorno inflamatorio" se refiere a una condición asociada con una reacción antígeno-específica del sistema inmune innato que implica la acumulación y activación de los leucocitos y las proteínas plasmáticas en un sitio de la infección, exposición a toxinas, o lesión de la célula. Las citoquinas que son característicos de la inflamación incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina 1 (IL-1), IL-6, IL-12, interferón alfa (IFN-a), beta interferón (IFN-b), y quimiocinas. Por lo tanto, ciertos tipos de asma, alergia, y los trastornos autoinmunes pueden tener características de un trastorno inflamatorio. Los trastornos inflamatorios incluyen también, por ejemplo, enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquiectasias, colecistitis crónica, tuberculosis, la tiroiditis de Hashimoto, sepsis, sarcoidosis, silicosis y otras neumoconiosis , y un cuerpo extraño implantado en una herida, pero no son tan limitado. Tal como se utiliza aquí, el término "sepsis" se refiere a un síndrome clínico bien reconocido asociado con la respuesta inflamatoria sistémica del hospederoa la invasión microbiana. El término "sepsis" como se usa aquí, se refiere a una condición que normalmente se señaliza con fiebre o hipotermia, taquicardia y taquipnea, y en casos severos puede progresar a la hipotensión, disfunción de órganos, e incluso la muerte.
En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados son útiles para el tratamiento de un sujeto que tiene una infección. En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados son útiles para el tratamiento de un sujeto que es susceptible a una infección, incluyendo aquellos que pueden tener la exposición a un patógeno o patógenos. Los oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados de acuerdo con la invención pueden, en algunos aspectos también se pueden usar para tratar o prevenir las infecciones por virus, bacterias, hongos o parásitos. Un sujeto que tiene una infección es un tema que ha sido expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo. Los oligonucleótidos inmunomoduladores pueden ser usados con o sin un antigeno para montar un antigeno respuesta sistémica o mucosal inmune especifica que es capaz de reducir el nivel de o la erradicación del patógeno infeccioso. Una enfermedad infecciosa, según se usa aquí, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo. Es particularmente importante desarrollar estrategias de vacunas y tratamientos eficaces para proteger las superficies mucosas del cuerpo, que son el sitio principal de entrada de patógenos.
Los virus son pequeños agentes infecciosos que generalmente contienen un núcleo de ácido nucleico y una capa de proteína, pero no son organismos viven de forma independiente. Los virus también pueden tomar la forma de ácidos nucleicos infecciosos que carecen de una proteina. Un virus no puede sobrevivir en ausencia de una célula viva dentro del cual puede ‘replicar. Los virus entran en las células vivas especificas, ya sea por endocitosis o la inyección directa de ADN (fago) y se multiplican, causante de la enfermedad. El virus multiplicado puede entonces ser liberado e infectar células adicionales. Algunos virus son virus que contienen ADN y otros son los virus que contienen ARN. Virus de ADN incluyen viruela, Herpes, adeno, Papova, parvo, y Hepadna. Virus ARN incluyen Picorna, Calici, Astro.Toga, Flavi, Corona, paramixo, Orthomyxo, Bunya, Arena, Rhabdo, FiiO, Borna, Reo, y retro. En algunos aspectos, la invención también tiene la intención de tratar enfermedades en las que los priones están implicados en la progresión de la enfermedad, como por ejemplo la encefalopatía espongiforme bovina (es decir, la enfermedad de las vacas locas, la EEB) o la tembladera en animales, o la enfermedad de Creutzfeldt- Jakob en humanos.
Los virus incluyen, pero no se limitan a, los enterovirus (incluyendo, pero no limitado a, virus Picornaviridae que la familia, tales como virus de la polio, virus Coxsackie, virus ECHO), rotavirus, adenovirus, y virus de la hepatitis, tal como hepatitis a, B, CD y E. específicos ejemplos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, como el V1H-1 (también conocidos como HTLV-III, LAV o HTLV -III / LAV, o V1H-III; y otros aislados, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis ); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, la encefalitis de virus, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, artimañas coronavi); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, bunyavirus, flebovirus y virus Nairo); (Virus de la fiebre hemorrágica) Arenaviridae; Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbiviurses y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridos (parvovirus); Papovavihdae (virus del papiloma, virus de polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus herpes simplex (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus variólico, virus vaccinia, virus de la viruela); Iridoviridae (por ejemplo, el virus de la fiebre porcina africana); y otros virus virus laringotraqueobronquitis aguda, Alphavirus, asociado al sarcoma de Kaposi herpesvirus, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de Nipah, el virus de Norwalk, virus del papiloma, virus parainfluenza, influenza aviar, el virus del SARS, el virus del Nilo Occidental. Los virus que infectan plantas incluyen, por ejemplo, virus de los géneros y/o familias de Alfamoviruses: Bromoviridae, Alphacryptoviruses: Partitiviridae, badnavirus, Betacryptoviruses: Partitiviridae, Bigeminiviruses: Geminiviridae, bromovirus: Bromoviridae, Bymoviruses: Potyviridae, Capilloviruses, Carlaviruses , Carmoviruses: Tombusviridae, caulimovirus, closterovirus, comovirus: Comoviridae, cucumovirus: Bromoviridae, Cytorhabdoviruses: Rhabdoviridae, Dianthoviruses, Enamoviruses, Fabaviruses: Comoviridae, fijivirus: Reoviridae, Furoviruses, Hordeiviruses, Hybrigeminiviruses: Geminiviridae, Idaeoviruses, Ilarviruses: Bromoviridae, Ipomoviruses: Potyviridae, Luteovirus, Machlomoviruses, acluraviruses, Marafiviruses, Monogeminiviruses: Geminiviridae, Nanaviruses, Necroviruses, nepovirus: Comoviridae, Nucleorhabdoviruses: Rhabdoviridae, Oryzaviruses: Reoviridae, Ourmiaviruses, Phytoreoviruses : Reoviridae, potexvirus, potyvirus: Potyviridae, Rymoviruses: Potyviridae, ARN satélite, Satelliviruses, Sequiviruses : Sequiviridae , Sobemoviruses, Tenuiviruses, tobamovirus, Tobraviruses, tombusvirus: Tombusviridae, Tospovirus: Bunyaviridae, Trichoviruses, Tymoviruses, Umbraviruses , potyvirus no asignados: Potyviridae, rabdovirus no asignados: Rhabdoviridae, Varicosaviruses, Waikaviruses: Sequiviridae, virus Ungrouped, Bromoviridae Potyviridae y Tymoviridae; los virus de plantas relevantes particulares incluyen, por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco (TMV), Virus del bronceado del tomate, virus del amarillamiento de las hojas del tomate, el virus del mosaico del pepino, el virus Y de la papa, el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico de la yuca africana, virus Plum pox o virus de la ciruela, virus del mosaico de la cebadilla, el virus X de la papa, el virus de la tristeza de los cítricos, el virus del enanismo amarillo de la cebada, el virus del enrollamiento de la patata y tomate Virus del enanismo arbustivo.
La hepatitis viral es una inflamación del hígado que puede producir hinchazón, sensibilidad, y los daños a veces permanentes en el hígado. Si la inflamación del hígado continúa por lo menos seis meses o más, es referido como la hepatitis crónica. Hay por lo menos cinco virus diferentes conocidos por causar hepatitis viral, incluyen la hepatitis A i B, CD y E. La hepatitis A se transmite en general a través de alimentos o beber agua contaminada con heces humanas. La hepatitis B generalmente se transmite a través de fluidos corporales como sangre. Por ejemplo, puede transmitirse de madre a hijo en el nacimiento, a través del contacto sexual, las transfusiones de sangre y agujas contaminadas. La hepatitis C es bastante común y como la hepatitis B a menudo se propaga a través de transfusiones de sangre y agujas contaminadas. La hepatitis D se encuentra con mayor frecuencia en los usuarios de drogas intravenosas que son portadores del virus de la hepatitis B con el que coasociados. La hepatitis E es similar a la hepatitis viral A y generalmente se asocia con el saneamiento deficiente.
Tanto las bacterias gram positivas como gra negativas sirven como antigenos en animales vertebrados. Las bacterias gram positivas tales incluyen, pero no se limitan a, las especies Pasteurella, especies de estafilococos, y especies de Streptococcus. Las bacterias gram negativas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracelular, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo A.), Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (sps anaeróbicas.), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium pen'ringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasteurella multocida, Bacteroides sp., Stomatococcus Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue, israelii Leptospira, Rickettsia, y Actinomyces.
Los ejemplos de hongos incluyen neofor ans Cryptococcus, capsulatum Histoplasma, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans .
Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen Plasmodium spp. tales como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Parásitos transmitidos por la sangre y/o tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania trópica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas) y Toxoplasma gondii.
Otros microorganismos médicamente relevantes han sido ampliamente descritos en la literatura, por ejemplo, véase CGA Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983, todo el contenido de las cuales se incorpora aquí por referencia. Agrícolamente microorganismos pertinentes (por ejemplo, los que infectan cultivos y/o ganado) se conocen también, por ejemplo, pero no limitado a los descritos en, por ejemplo, George N. Agrios, Fitopatología, Elsevier Academic Press, 5a edición, 2005; John Lucas, Fitopatología y patógenos de plantas, Wilcy-Blackwell; Tercera edición, 1998; Dwight C. Hirsh, N. James MacLachlan, Richard L. Walker, Microbiología Veterinaria, Wiley-Blackwell; Edición 2, 2004; y PJ Quinn, et al, Microbiología Veterinaria y enfermedades microbianas, Wiley-Blackwell; Edición 2, 2011.
Las composiciones de oligonucleótidos disponibles de la invención se pueden administrar a un sujeto (incluyendo, por ejemplo, un sujeto humano o, en algunas modalidades un animal [por ejemplo, animales de granja o animal de compañía] o de la planta [por ejemplo, cultivo] sujeto) con una agente anti-microbiano. Un agente anti microbiano, tal como se utiliza aquí, se refiere a un compuesto sintético o que se presenta naturalmente que es capaz de matar o inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente anti-microbiana útil según la invención dependerá del tipo de microorganismo con el que el sujeto está infectado o en riesgo de infectarse. Los agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a agentes anti bacterianos, agentes anti-virales, agentes anti-hongos y agentes anti-parasitarias. Frases tales como "agente anti infeccioso", "agente anti-bacteriano", "agente anti-viral", "agente anti-fúngico", "agente antiparasitario" y "parasiticida" tienen significados bien establecidos para los expertos en la téenica y se define en los textos médicos estándar. Brevemente, los agentes anti-bacterianos matan o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos, asi como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que se producen como metabolitos secundarios por las células, tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más funciones o estructuras que son específicos para el microorganismo y que no están presentes en las células hospederas bacterianas. Los agentes anti-virales pueden ser aislados de fuentes naturales o sintetizados y son útiles para matar o inhibir los virus. Los agentes anti-hongos se utilizan para tratar infecciones fúngicas superficiales, así como las infecciones fúngicas sistémicas oportunistas y primaria. Los agentes anti parásitos matan o inhiben parásitos.
Los ejemplos de agentes anti-parasitarias, también conocidos como antiparasitarios útiles para la administración humana incluyen pero no se limitan a albendazol, anfotericina B, el benznidazol, bitionol, cloroquina HCI, fosfato de cloroquina, clindamicina, dehidroemetina, dietilcarbamazina, furoato diloxanida, eflornitina, furazolidaone, glucocorticoides, halofantrina, yodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomícina, isetionato de pentamidina, piperazina, praziquantel, fosfato de primaquina, proguanil, pirantel, sulfonamidas pyrimethanmine- , pyrimethanmine-sulfadoxina, quinacrina HCI, sulfato de quinina, quinidina gluconato, espiramicina , sodio estibogluconato (antimonio gluconato de sodio), suramina, tetracielina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfa etoxazol, y triparsa ida algunos de los cuales se utilizan solos o en combinación con otros.
Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o la función de las bacterias. Una gran clase de agentes antibacterianos son los antibióticos. Los antibióticos, que son eficaces para matar o inhibir una amplia gama de bacterias, están referidos como antibióticos de espectro amplio. Otros tipos de antibióticos son predominantemente eficaces contra las bacterias de la clase gram-positiva o gram-negativa. Estos tipos de antibióticos están referidos como los antibióticos de espectro como estrechos. Otros antibióticos que son eficaces contra un único organismo o enfermedad y no contra otros tipos de bacterias, se denominan como antibióticos de espectro limitado. Los agentes antibacterianos a veces se clasifican en función de su principal modo de acción. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la pared celular, inhibidores de la sintesis de la membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteínas, síntesis de ácidos nucleicos o inhibidores funcionales, y los inhibidores competitivos.
Los agentes antivirales son compuestos que previenen la infección de células por virus o la replicación del virus dentro de la célula. Hay muchos menos fármacos antivirales que los fármacos antibacterianos debido a que el proceso de replicación viral está tan estrechamente relacionados con la replicación del ADN dentro de la célula hospedera, que los agentes antivirales no específicos solían ser tóxicos para el hospedero. Hay varias etapas en el proceso de la infección viral que puede ser bloqueada o inhibida por agentes antivirales. Estas etapas incluyen, la unión del virus a la célula hospedera (inmunoglobulina o péptidos de unión), quitar el revestimiento del virus (por ejemplo amantadina), la síntesis o la traducción del ARNm viral (por ejemplo, interferón), la replicación del ARN viral o ADN (por ejemplo, análogos de nucleótidos), la maduración de nuevas proteínas de virus (por ejemplo, inhibidores de la proteasa) , y en ciernes y la liberación del virus.
Análogos de nucleótidos son compuestos sintéticos que son similares a los nucleótidos, pero que tienen una desoxirribosa incompleta o anormal o grupo ribosa. Una vez que los análogos de nucleótidos están en la célula, que son fosforilados, produciendo el trifosfato formado que compite con los nucleótidos normales para su incorporación en el ADN o ARN viral. Una vez que la forma trifosfato del análogo de nucleótido se incorpora en la cadena de ácido nucleico en crecimiento, que causa asociación irreversible con la polimerasa viral y por lo tanto terminación de la cadena. Análogos de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, aciclovir (utilizado para el tratamiento del virus del herpes simple y el virus de varicela-zoster), ganciclovir (útil para el tratamiento de citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento del virus sincitial respiratorio), dideoxiinosina, dideoxicitidina, zidovudina (azidotimidina), imiquimod, y resimiquimod.
Los interferones son citocinas que son secretadas por las células infectadas por virus, asi como células inmunes. La función de los interferones mediante la unión a receptores específicos en las células adyacentes a las células infectadas, haciendo que el cambio en la célula que 10 protege de la infección por el virus, a y b-interferón también induce la expresión de moléculas de Clase I y Clase 11 MHC en la superficie de las células infectadas, lo que resulta en un aumento de la presentación de antígenos para el reconocimiento de células inmune del hospedero, a y b- interferones están disponibles como formas recombinantes y se han utilizado para el tratamiento de la hepatitis B crónica y la infección C. En las dosificaciones que son eficaces para la terapia anti-viral, los interferones tienen efectos secundarios graves, tales como fiebre, malestar y pérdida de peso.
Los agentes anti-virales útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a inmunoglobulinas, amantadina, interferones, análogos de nucleótidos, y los inhibidores de la proteasa. Los ejemplos específicos de antivirales incluyen, pero no se limitan a Acemannan; El aciclovir; Acyclovir de sodio; El adefovir; alovudina; Alvircept Sudotox; Clorhidrato de amantadina; Aranotin; arildona; Atevirdine Mesylate; avridina; El cidofovir; cipamfilina; Clorhidrato de citarabina; Delavirdine Mesylate; desciclovir; Didanosina; Disoxaril; Edoxudine; Enviradene; enviroxima; El famciclovir; Clorhidrato Famotine; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilate; Foscarnet sodio; Sodio Fosfonet; El ganciclovir; Sodio El ganciclovir; idoxuridina; Kethoxal; Lamivudina; lobucavir; Clorhidrato Me otine; etisazona; La nevirapina; El penciclovir; pirodavir; La ribavirina; Clorhidrato de rimantadina; Mesilato de saquinavir; Clorhidrato de Somantadine; sorivudina; Statolon; La estavudina; Clorhidrato de Tilorone; trifluridina; Clorhidrato de valaciclovir; vidarabina; Vidarabina fosfato; Vidarabina fosfato de sodio; Viroxime; zalcitabina; La zidovudina; y Zinviroxime.
Los agentes anti-fúngicos son útiles para el tratamiento y prevención de hongos infecciosos. Los agentes anti-fúngicos se clasifican a veces por su mecanismo de acción. Algunos agentes anti-fúngicos funcionan como inhibidores de la pared celular mediante la inhibición de la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero no están limitados a, basiungin/ECB. Otros agentes anti-fúngicos funcionan mediante la desestabilización de integridad de la membrana. Estos incluyen, pero no se limitan a, immidazoles, tales como clotrifnazol, sertaconzole, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, y voriconacole, asi como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina, y terbinafina. Otros agentes anti-hongos funcionan por romper la quitina (por ejemplo, quitinasa) o inmunosupresión (501 crema).
En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados son útiles para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer. Un sujeto que tiene un cáncer es un tema que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero no se limitan a cáncer del tracto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasias intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (de células, por ejemplo, de células pequeñas y no pequeñas); melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es la leucemia de células pilosas, leucemia mielógena crónica, leucemia de células T cutáneo, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de vejiga, o carcinoma de colon.
Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados pueden ser administrados solos o en combinación con una terapia anti-cáncer. Las terapias contra el cáncer incluyen, pero no se limitan a la terapia de radiación, quimioterapia, inmunoterapia, una vacuna contra el cáncer, la terapia hormonal, un modificador de la respuesta biológica, y los procedimientos quirúrgicos. Un medicamento de cáncer se refiere a un agente que se administra a un sujeto para el propósito de tratar un cáncer. Como se usa en el presente documento, "tratamiento del cáncer" incluye la prevención del desarrollo de un cáncer, reducir los síntomas de cáncer, y / o inhibir el crecimiento de un cáncer establecido. En otros aspectos, el medicamento cáncer se administra a un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer con el fin de reducir el riesgo de desarrollar el cáncer. Varios tipos de medicamentos para el tratamiento de cáncer se describen en el presente documento. Para el propósito de esta especificación, los medicamentos de cáncer se clasifican como agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas contra el cáncer, la terapia hormonal, y modificadores de la respuesta biológica.
Además, los métodos de la invención están destinados a incluir el uso de uno o más medicamentos contra el cáncer junto con composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados. Como un ejemplo, donde las composiciones apropiadas, siempre inmunomoduladores de oligonucleótidos pueden administrarse tanto con un agente guimioterapéutico y un agente inmunoterapéutico . Alternativamente, el medicamento cáncer puede abrazar a un agente inmunoterapéutico y una vacuna contra el cáncer, o un agente quimioterapéutico y una vacuna contra el cáncer, o un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico y una vacuna contra el cáncer de todo administrarse a un sujeto con el propósito de tratar a un sujeto que tiene una cáncer o en riesgo de desarrollar un cáncer.
El agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, no contienen azúcar cloroetilnitrosoureas, 5-fluorouracilo, itomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragyline, meglamina GLA, valrubicina, carmustaine y poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, RAS farnesil transferasa inhibidor, el inhibidor de transferasa de farnesilo, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/topotecan, PKC412, valspodar/PSC833, Novantrone/Mitroxantrone, Metaret/Suramin, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, lncel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, el Picibanil/OK-432, AD 32/valrubicina, derivado Me t as t ron /estroncio, Temodal/temozolomida, Evacet/liposomal doxorrubíciña Yewtaxan/paclitaxel, Taxol/paclitaxel, Xeload / capecitabina, Furtulon/doxifluridina, Ciclopax/paclitaxel oral, Oral taxoide, SPU-077/cisplatino, HMR 1275/flavopiridol, /EGFR, (754)/inhibidor oncogén RAS CP-609 CP-358 (774), BMS 182751/platino oral, UFT (Tegafur/uracilo), Ergamisol/levamisol, potenciador eniluracilo/776C85/5FU, Campto/levamisol, Camptosar®/lrinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/cladribina, Paxex/paclitaxel, doxorrubicina Doxil/liposomal, Caelyx/doxorrubicina liposomal, Fludara/fludarabina, Pharmarubicin/epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-naftalimida, LU 103793/Dolastain, doxorrubicina Caetyx/liposomal, Gemzar/gemcitabina, ZD 0473/AnorMED, YM 116, semillas de yodo, CDK4 e inhibidores de CDK2, inhibidores de PARP, D4809/Dexifosamide, IFES/Mesnex®/lfosamide, Vumon/tenipósido, Paraplatin/carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepeside/etopósido, ZD 9331, Taxótero/Docetaxel, profármaco de arabinosida guanina, taxano analógica, nitrosoureas, alquilante agentes tales como melphelan y ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginasa, busulfán, carboplatino, clorambucilo, citarabina HCI, dactinomicina, daunorrubicina HCI, estra ustina fosfato de sodio, etopósido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón Alfa-2a, Alfa-2b, acetato de leuprolide (LHRH liberadora análogo de los factores), lomustina (CCNU), mecloretamina HCI (mostaza nitrogenada), mercaptopurina, Mesna, mitotano (o.p'-DDD), mitoxantrona HCI, octreotida, plicamicina, procarbazina HCI, estreptozocina, El citrato de tamoxifeno, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de vinblastina, Amsacrine (m-AMSA), azacitidina, Ertropoietina, Hexametilmelamina (HMM), lnterleucin 2, mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal-bis guanilhidrazona; MGBG) , Pentostatina (2'desoxicoformicina), Semustina (metil-CCNU) , tenipósido (VM-26) y vindesina sulfato, pero no es tan limitado.
El agente inmunoterapéutico puede ser seleccionado del grupo que consiste de Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, OvaRex, Bexxar, LDP-03, ior ?b, MDX-210 , MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, el INB -250, EMD- 72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK- 2, MDX- 260, ANA Ab, SMART 1 DIO Ab, SMART ABL 364 Ab y ImmuRAIT-CEA, pero no es tan limitado.
La vacuna contra el cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste de EGF, vacunas contra el cáncer anti- idiotípicos, antigeno gp75, vacuna contra el melanoma GMK, vacuna conjugada gangliósido MGV, Her2/neu, OvaRex, M-Vax, 0- Vax, L-Vax , STN-KHL Theratope, BLP25 (MUC-1), la vacuna idiotipica liposomal, Melacine, vacunas antigeno peptidico, vacunas toxina/antigeno, basada en la vacuna MVA, PACIS, BCG vacine, TA-VPH, TA-NIC, DISC-virus y ImmuCyst/THERACYS, pero no es tan limitado.
Tal como se utiliza aquí, los términos "antigeno cáncer" y "antigeno tumoral" se utilizan indistintamente para referirse a antigenos que se expresan diferencialmente por las células cancerosas y por lo tanto pueden ser explotados con el fin de dirigirse a las células cancerosas. Antigenos del cáncer son antigenos que potencialmente pueden estimular respuestas inmunes aparentemente específicos de tumores. Algunos de estos antigenos están codificados, aunque no necesariamente expresado, por las células normales. Estos antígenos pueden ser caracterizados como aquellos que son normalmente silenciosa (es decir, no se expresa) en las células normales, las que se expresan sólo en ciertas etapas de la diferenciación y aquellos que se expresan temporal tales como antigenos embrionarios y fetales. Otros antigenos del cáncer son codificados por genes mutantes celulares, tales como oncogenes (por ejemplo, oncogen ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de supresiones internas o translocaciones cromosómicas. Sin embargo, otros antígenos de cáncer pueden ser codificados por genes virales como las llevadas sobre los virus de ARN y ADN tumoral.
En algunas modalidades, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas pueden también ser útiles para el tratamiento y la prevención de la enfermedad autoinmune. Enfermedad autoinmune es una clase de enfermedades en las que los propios anticuerpos de un sujeto reaccionan con tejido del hospederoo en las que las células T efectoras inmunes son autorreactivas a péptidos endógenos y auto causan la destrucción del tejido. Por lo tanto una respuesta inmune se monta contra antígenos propios de un sujeto, denominados antigenos propios. Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a la alopecia areata, la hemofilia adquirida, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, la infertilidad autoinmune asociada, la encefalomielitis autoinmune, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, diabetes mellitus autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, síndrome de Behget, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, fatiga crónica, síndrome de disfunción inmune (SFC), la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg- Strauss, penfigoide cicatricial, el síndrome de CREST, enfermedad por crioaglutininas, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, la fibromialgia, fibromiositis, síndrome de Guillain-Barre, la tiroiditis de Hashimoto, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis, glomerulonefritis proliferativa), enfermedad de grave, enfermedad injerto contra hospedero, síndrome de Goodpasture, el pénfigo (por ejemplo, pénfigo vulgaris), fibrosis pulmonar idiopática, púrpura tro bocitopénica idiopática, resistencia a la insulina, enfermedad de Addison idiopática, la nefropatia por IgA, inflamatoria enfermedad del intestino (incluyendo la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), artritis juvenil, liquen plano, miastenia gravis, esclerosis múltiple, enfermedad mixta del tejido conectivo, polimiositis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reite, juvenil y adultos con artritis reumatoide, síndrome de Sjorgen, esclerodermia con anticuerpos anti-colágeno, sarcoidosis, síndrome del hombre rígido, el lupus eritematoso sistémico (LES), Takayasu artritis, el rechazo del órgano trasplantado, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, uveitis, colitis ulcerosa, vasculitis, y el vitÍligo .
Un "auto-antígeno" como se usa aquí se refiere a un antígeno de un tejido hospedero normal. Tejido hospedero normal no incluye las células cancerosas. Por lo tanto una respuesta inmune montada contra un auto-antígeno, en el contexto de una enfermedad autoinmune, es una respuesta inmunitaria indeseable y contribuye a la destrucción y el daño de tejido normal, mientras que una respuesta inmune montada contra un antígeno de cáncer es una respuesta inmune y contribuye deseable a la destrucción del tumor o cáncer. Por lo tanto, en algunos aspectos de la invención destinada a tratar los trastornos autoinmunes no se recomienda que los oligonucleótidos inmuno oduladores pueden administrar con antigenos propios, particularmente los que son el blanco de la enfermedad autoinmune.
En otros casos, los oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados en acuerdo con la presente invención se pueden suministrar con bajas dosis de antigenos propios. Un número de estudios en animales han demostrado que la administración mucosal de dosis bajas de antigeno puede resultar en un estado de hiporreactividad inmune o "tolerancia". El mecanismo activo parece ser un citoquinas mediada por la desviación inmune de distancia de una Thl hacia una respuesta predominantemente Th2 y Th3 (es decir, TGF-b dominados). La supresión activa con la entrega de baja dosis de antigeno también puede suprimir una respuesta inmunitaria no relacionada (supresión del espectador) que es de considerable interés en la terapia de enfermedades autoinmunes, por ejemplo, la artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico. Supresión del espectador implica la secreción de Thl - contra-reguladoras, supresores de citoquinas en el entorno local donde proinflamatorias y citoquinas Thl se liberan en cualquiera-antigeno especifico de un antigeno o de manera no especifica. "Tolerancia" como se usa en la presente memoria se utiliza para referirse a este fenómeno En efecto, la tolerancia oral ha sido eficaz en el tratamiento de una serie de enfermedades autoinmunes en animales incluyendo: Encefalomielitis autoin une experimental (EAE), la miastenia gravis autoinmune experimental, artritis inducida por colágeno (CIA), y la diabetes mellitus dependiente de insulina. En estos modelos, la prevención y supresión de enfermedad autoinmune se asocia con un cambio en las respuestas humorales y celulares especificas de antigeno a partir de una respuesta Th2 a Thl/Th3 Los ejemplos no limitantes de oligonucleótidos inmunomoduladores útiles que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención se proporcionan en el Apéndice adjunto (B).
RIPtidos En algunas modalidades, los oligonucleótidos utilizados de acuerdo con la presente invención son o actúan como polinucleótidos que interaccionan con ARN ("RIPtidos"). Los Riptidos son una clase de productos terapéuticos destinados a abrir el espacio de objetivos "a los que no puede llegar el fármaco" inactivando RNAs estructurales implicados en la enfermedad. Los Riptidos son típicamente tramos pequeños de nucleótidos (alrededor de 8 nucleótidos) que se unen e interrumpen la acción de ARN estructurado. Debido a su tamaño, estas moléculas pueden pasar fácilmente a través de la membrana celular. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU.6,080,585.
Los RIPtidos pueden ser útiles para un número de aplicaciones clínicas. En el contexto de la terapia del cáncer, al menos un objetivo es la telomerasa, que está presente en aproximadamente el 90% de las células cancerosas. Por lo tanto, en algunas modalidades, oligonucloetides estéreo-definidos de la invención se pueden utilizar para orientar la telomerasa para el tratamiento de diversos cánceres. Además, los RIPtidos pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Los virus, como el V1H y la hepatitis C, debe ser capaz de hacerse cargo de una célula hospedera para replicarse; Por lo tanto, el ARN estructural puede desempeñar un papel importante en la maduración y la replicación de muchos virus. Por consiguiente, en algunas modalidades, oligonucloetides estéreo-definido de la invención se pueden utilizar para orientar porciones de ADN o ARN implicada en la maduración y/o la replicación viral.
Por lo tanto, la invención es útil para el tratamiento de diversas infecciones virales. Los virus incluyen, pero no se limitan a, los enterovirus (incluyendo, pero no limitado a, virus Picornaviridae que la familia, tales como virus de la polio, virus Coxsackie, virus ECHO), rotavirus, adenovirus, y virus de la hepatitis, tal como hepatitis A, B , CD y E. específicos ejemplos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, como el V1H-1 (también conocidos como HTLV-III, LAV o HTLV-III / LAV, o V1H-III; y otros aislados, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, la encefalitis de virus, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, artimañas coronavi) ; Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, bunyavirus, flebovirus y virus Nairo); (Virus de la fiebre hemorrágica) Arenaviridae; Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbiviurses y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridos (parvovirus); Papovavihdae (virus del papiloma, virus de polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus herpes simplex (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus variólico, virus vaccinia, virus de la viruela); Iridoviridae (por ejemplo, el virus de la fiebre porcina africana); y otros virus virus laringotraqueobronquitis aguda, Alphavirus, asociado al sarcoma de Kaposi herpesvirus, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de Nipah, el virus de Norwalk, virus del papiloma, virus parainfluenza, influenza aviar, el virus del SARS, el virus del Nilo Occidental.
Fármacos antisentido La presente invención también abarca una variedad de terapias basadas en antisentido. Por lo general, los fármacos antisentido son pequeños compuestos (12-21 nucleótidos) similares a ADN o ARN que son modificados químicamente para diseñar drogas con propiedades favorables. Algunos de los agentes antisentido disponibles en la téenica incluyen fosforotioato o desoxioligonucleótidos, y en esta situación se intercambia un grupo de azufre por un oxigeno no forma puente en la cadena principal de fosfato. Esto aumenta la resistencia a la degradación RNasa y mejora la estabilidad farmacológica. Sin embargo, en otros agentes, la llamada "la siguiente generación de moléculas antisentido", los oligonucleótidos La modificación 2'-O-metoxietilo a la columna vertebral, lo que puede aumentar la afinidad de estos oligonucleótidos para el ARN diana. Sin embargo, en algunos casos, muchos de estos agentes están asociados con efectos secundarios, tales como las respuestas inmunes no deseadas. Al menos en algunas situaciones, tales propiedades no deseables de estos agentes son atribuibles al menos en parte a su naturaleza estereoaleatorios. La presente invención proporciona contrapartes estereodefinidas que tienen propiedades preferidas, como la mejora y aumento de la lipofilia ARN vinculante.
Una serie de terapias basadas en antisentido se han desarrollado o en desarrollo. Los ejemplos no limitantes de terapias antisentido se proporcionan a continuación. Estereo-definido (por ejemplo, quiralmente puro) oligonucleótidos como se describe en la presente memoria se pueden preparar para la consecución de una eficacia mejorada, una mayor afinidad para apuntar, efectos secundarios reducidos, far acocinética mejorada, estabilidad mejorada y/o aumento de la biodisponibilidad, con relación a los fármacos antisentido actualmente disponibles en el arte. En algunas modalidades, la terapéutica antisentido incluye drogas o fármacos de morfolino. Véase, por ejemplo: Morcos, PA (2007). "El logro de objetivo y cuantificable alteración de mRNA de empalme con oligos Morpholino". Biochem Biophys Res Commun 358 (2): 521- 7.
La retinitis por citomegalovirus: Fomivirsen (comercializado como Vitravene), fue aprobado por los EE.UU. FDA en agosto de 1998 como un tratamiento para la retinitis por citomegalovirus.
Virus de la fiebre hemorrágica: A principios de 2006, los científicos que estudian el virus de la fiebre hemorrágica del Ebola en USAMRIID anunció una tasa de recuperación del 75% después de infectar cuatro monos rhesus y luego tratarlas con un fármaco de Morfolino antisentido desarrollado por AVI BioPharma, una empresa de bioteenología estadounidense. [US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Fort Detrick, Maryland. Comunicado de prensa:-gen especifico del Ebola Terapias Proteger los primates no humanos de enfermedad letal.13 de enero 2006] La tasa de mortalidad usual para los monos infectados con el virus de Ébola es 100%. A finales de 2008, AVI BioPharma presentó con éxito nuevo fármaco en investigación (IND) aplicaciones con la FDA para sus dos productos principales del virus de Marburg y Ebola. Estos medicamentos, AVI-6002 (Lu, X; Yu, Q; Binder, GK; Chen, Z; Slepushkina, T; Rossi, J; . Dropulic, B (2004) "antisentido mediada por inhibición de Virus de Inmunodeficiencia Humana (V1H) replicación por uso de un vector resultados V1H tipo 1 basados en severamente atenuada mutantes incapaces de desarrollar resistencia "Journal of Virology 78 (13): 7079-88) y AVI-6003 son nuevos análogos basa en la química PMO antisentido de AVI en el que lucha potencia -viral se ve reforzada por la adición de componentes cargados positivamente a la cadena de oligómero de morfolino. Los resultados preclínicos de AVI-6002 y AVI- 6003 demostraron tasas reproducibles y altas de supervivencia en los primates no humanos expuestos a una infección letal de los virus Ébola y Marburg, respectivamente (Noticias médicas hoy. AVI BioPharma anuncia FDA Borra Aplicaciones IND para ensayos clínicos de ARN terapéutico Agentes para el tratamiento de los virus Ébola y Marburg. 30 de diciembre 2008).
Cáncer: También en 2006, los médicos alemanes informó sobre un estudio de escalada de dosis para el compuesto AP 12009 (un fosforotioato antisentido oligodeoxinucleótido específica para el ARNm del factor de crecimiento transformante de TGF-beta 2 humana) en pacientes con gliomas de alto grado. En el momento del informe, no se había obtenido la mediana de supervivencia global y los autores insinuado una posible cura (Resultados de G004, una fase Ilb controlan activamente ensayo clínico con el compuesto específico de TGF-b2 AP 12009 para el astrocitoma anaplásico recurrente - Hau et al 24 (18 Suplemento): 1566 -ASCO Reunión Abstracts).
Por ejemplo, trabedersén (AP 12009-P001) se desarrolla como onoterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer avanzado de páncreas, melanoma maligno, tumores cerebrales, astrocitoma anaplásico y el carcinoma colorrectal. AP 12009-P001 se ha evaluado en un estudio abierto, multicéntrico, la escalada de dosis de fase I/II para evaluar la seguridad y tolerabilidad de iv administración de trabedersén en 61 pacientes con tumores sólidos avanzados conocidos por producir un exceso de TGF-b2, que, o bien no o ya no susceptible a las formas establecidas de terapias.
Otros ejemplos de fármacos antisentido que se dirigen a proteínas sobreexpresados en el cáncer incluyen: Clusterin (OGX-Oll/TVOlOll), que regula la transición epitelio-mesénquima inducida por el factor de crecimiento TGF beta y la TWIST1 factor de transcripción en células de cáncer de próstata; ATL1101 (un inhibidor de segunda generación antisentido de la insulina como factor de crecimiento I receptor (IGF-IR)) en el tratamiento del cáncer de próstata; oblimersen (nombre comercial: genasense) para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica; G4460 y LR3001 (inhibidores de c-myb) para el tratamiento de CML, melanoma, neuroblastoma, y los cánceres de mama, páncreas y colon; MG98 (inhibidor de la ADN metiltransferasa I) para el tratamiento de carcinoma de células renales; ISIS 5132 (c-Raf antisentido); LY900003 (proteina quinasa C-alfa antisentido); G3139 (Bcl-2 antisentido), etc.
V1H/SIDA: A partir de 2004, los investigadores de los EE.UU. han llevado a cabo investigaciones sobre el uso de la teenología antisentido para combatir el V1H. Se sabe que la inhibición mediada por antisentido de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) mediante el uso de un vector da como resultado VIH tipo 1 basados en mutantes gravemente atenuadas incapaces de desarrollar resistencia. En febrero de 2010 los investigadores reportaron el éxito en la reducción de la carga viral del VIH usando paciente células T que habían sido cosechados, modificados con una cadena de ARN antisentido para la proteina de la envoltura viral del V1H, y re-infunden en el paciente durante un lapso previsto en la terapia con medicamentos retrovirales.
El colesterol alto: En 2010 Mipomersen (anteriormente ISIS 301012, nombre comercial Kynamro) completado con éxito ensayos de fase 3 para algunos tipos de colesterol alto. Mipomersen es un candidato a fármaco para reducir el colesterol. Se trata de una terapéutica antisentido que se dirige a la ARN mensajero para la apolipoproteina B. Véase: Merki E, Graham MJ, Mullick AE, et al. (Agosto de 2008). "Oligonucleótido antisentido dirigidos a apolipoproteina B-100 humana reduce la lipoproteina (a) los niveles y fosfolipidos oxidados en la apolipoproteina B-100 humana en partículas de lipoproteina (a) ratones transgénicos". Circulación 118 (7): 743-53; El Harchaoui K, Akdim F, Stroes ES, viaje MD, Kastelein JJ (2008). "Opciones farmacológicas actuales y futuras para el manejo de pacientes que no pueden alcanzar los objetivos de baja densidad de lipoproteínas de colesterol con estatinas". Am J Cardiovasc Drogas 8 (4): 233-42; Athyros VG, Kakafika AI, Tziomalos K, Karagiannis A, Mikhailidis DP (julio de 2008). "La teenología antisentido para la prevención o el tratamiento de la enfermedad cardiovascular: el siguiente éxito de taquilla?". Expert Opin Investig Drugs 17 (7): 969-72. Se administra como una inyección semanal. El compuesto es un oligonucleótido antisentido 'segunda generación'; los nucleótidos están unidos con enlaces fosforotioato en lugar de los enlaces fosfodiéster de ARN y ADN, y las partes de azúcar son desoxirribosa en la parte media de la molécula de ribosa y 2'-O-metoxietil-modificado en los dos extremos. Estas modificaciones hacen que el fármaco resistente a la degradación por nucleasas, lo que le permite ser administrado semanalmente. El fármaco se acumula en el hígado, que es conveniente ya que la apolipoproteína B predominantemente actúa allí. La secuencia completa es G*-C*-C*-U*-C*~dA-dG-dT-dC-dT-dG-dmC-dT-dT-dmC-G*-C*-A*-C*-C* [d = 2'-desoxi, * = de 2'-O- (2-metoxietil)] con enlaces 3 ' 5' fosforotioato. Los estudios de fase 3 fueron en pacientes con hipercolesterolemia familiar (HF), ambos homocigotos (ho) y heterocigotos (él). La HF es un trastorno genético que causa niveles excepcionalmente altos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad. Ambos ensayos mostraron un rendimiento excepcional con la eficacia más alto visto hasta ahora en esas dos poblaciones de pacientes, y con relativamente bajas tasas de abandono en comparación con otros medicamentos inyectables.
Distrofia muscular de Duchenne: En la distrofia muscular de Duchenne (DMD), las células musculares del paciente a descomponer y se pierden, lo que lleva a la debilidad muscular progresiva y muerte. AVI-4658 es una terapia antisentido dirigidos a restaurar la expresión de distrofina, una proteína clave que los pacientes con Duchenne falta distrofia muscular. Reesults de un estudio abierto, fase 2, el estudio de escalada de dosis con 19 pacientes mostraron que cuando se completó el tratamiento, una biopsia muscular fue tomada de cada paciente. El equipo descubrió que 'capacidad de producir ARNm funcional a través de "la omisión del exón' los pacientes fue reparado con el uso de AVI-4658, con el tiempo lo que les permite fabricar la proteina distrofina funcional.
La distrofia miotónica: La distrofia miotónica es la enfermedad muscular más común en adultos, que afecta principalmente a los músculos esqueléticos, el corazón y el sistema nervioso central. Ocurre debido a una mutación que causa numerosas repeticiones de tres letras del código genético (CTG) en un gen llamado DMPK. El ARN mensajero que se produce a partir del gen mutado también contiene las repeticiones largas anormales que hacen que el ARN se acumule en el núcleo de la célula. Hay que secuestra y bloquea la función de una proteina llamada muscleblind como 1 y activa otra proteina llamada CELF1. Estas proteínas antagonizan entre sí y el resultado es la expresión anormal de proteínas a partir de muchos otros genes en los tejidos adultos, lo que resulta en la enfermedad. Para contrarrestar esto, Cooper y sus colegas crearon oligonucleótidos antisentido que son simplemente hebras de material genético que buscan partes de las repeticiones de ARN anormales y objetivo RNasa H a la ARN tóxico causando su degradación. También se informó de que la combinación de los oligonucleótidos antisentido con otros oligonucleótidos antisentido que ayudan liberan el muscleblind-likel secuestrado puede potenciar el efecto.
Diabetes: SGLT2 (ISIS 388626) es un fármaco antisentido para lograr la reducción en el tipo de glucosa dependiente de sodio co-transportador 2 (SGLT2) niveles que resultaron en una reducción significativa en los niveles de glucosa en sangre en pacientes diabéticos.
Hepatitis: Persistent hepatitis C vius (VHC) es una causa principal de enfermedad hepática. Los oligonucloetidos antisentido representan una clase prometedora de agentes antivirales. Tales fármacos en desarrollo incluyen ISIS 14803, que es un oligodesoxinucleótido de fosforotioato de 20 unidades que inhibe la replicación del VHC y expresión de proteínas .
Métodos de tratamiento Los oligonucleótidos y composiciones proporcionados en los mismos, descritos en el presente documento, son útiles como agentes terapéuticos contra diversos estados de enfermedad, incluyendo el uso como agentes antivirales. En algunas modalidades, proporcionadas oligonucleótidos pueden ser utilizados como agentes para el tratamiento de enfermedades mediante la modulación de ADN y/o actividad de ARN. En algunas modalidades, proporcionadas oligonucloetides se pueden utilizar para inhibir la expresión de genes específicos. Por ejemplo, un oligonucloetide proporcionado puede ser complementario a una secuencia de ARN mensajero diana específica (ARNm). Se puede utilizar para inhibir la replicación viral de virus innumerables. Familias de virus ejemplares incluyen ortomixovirus, virus de viruela, virus del herpes, virus del papiloma, picornavirus, flavivirus, retrovirus, virus de la hepatitis, paramixovirus, reovirus, parvovirus, coronavirus, filovirus, arenavirus, rabdovirus y adenovirus. Familias adicionales de virus son conocidos y también se contemplan en el presente documento. Otros ejemplos incluyen usos como compuestos antisentido contra ARN de V1H u otra RNA retroviral o para hibridar con el ARNm que codifica la proteína del V1H TAT, o a la región TAR del ARNm de VIH. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos imitan la estructura secundaria de la región TAR del ARNm de VIH, y al hacerlo se unen la proteína tat. En algunas modalidades, una oligonucloetide proporcionado se utiliza para inhibir la expresión de una proteína diana por contacto una célula con un oligonucleótido proporcionado, en el que la expresión de otras proteínas en la célula no se inhibió o se inhibió mínimamente. En alguna forma de realización, la inhibición de proteína diana se produce in vivo en un mamífero. En algunas modalidades, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido proporcionado para inhibir la expresión de una proteína diana.
Otros ejemplos de proteínas donde la expresión puede ser modulada incluyen proteínas jun cinasa N-terminal (JNK) proteínas, diacilglicerol aciltransferasa I, la apolipoproteína B, receptor de glucagón, Aurora B, acil CoA colesterol aciltransferasa-2, la proteína c-reactiva, STAT (transductores de señal y activadores de transcripción) la familia de proteínas y MDR P-glicoproteína. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado puede ser utilizado para inhibir la expresión de la proteína fosfatasa IB (PTP1B), la ARN polimerasa viral RNA-dependiente. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado puede ser utilizado para inducir eventos tales como la apoptosis en las células cancerosas o para hacer una célula más susceptible a la apoptosis. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado se puede utilizar para modular las actividades de las proteínas. En algunas modalidades, un oligonucleótido proporcionado puede ayudar a modular la actividad de RNasa H focalización resistencia a múltiples fármacos (MDR) moléculas de ARN.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar una enfermedad mediada por la expresión del gen no deseado en un sujeto (por ejemplo, mamíferos, tales como seres humanos) en necesidad de tal tratamiento. Por "enfermedades" se entiende las enfermedades, o síntomas de la enfermedad. Los métodos incluyen, por ejemplo, administrar al sujeto una cantidad eficaz de un oligonucleótido proporcionado.
Ejemplos de enfermedades mediadas por la expresión génica no deseada incluyen el cáncer (por ejemplo, leucemia, tumores y metástasis), alergia, asma, obesidad, inflamación (por ejemplo, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias), hipercolesterolemia, trastornos hematológicos, agudo severo síndrome respiratorio (SARS), enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, el asma, las enfermedades autoinmunes, enfermedades retrovirales, tales como el SIDA o el V1H, otras infecciones virales, infecciones intrauterinas, enfermedades metabólicas, infección (por ejemplo, bacteriana, viral, de levadura, fúngicas), enfermedades del sistema nervioso central, el cerebro tumores, enfermedades degenerativas neuronales, enfermedades cardiovasculares, y enfermedades asociadas con la angiogénesis, la neovascularización, y la vasculogénesis .
En algunas modalidades, proporcionadas oligonucleótidos son útiles para el tratamiento de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas, y otras enfermedades o trastornos que implican la proliferación celular anormal.
Situado en la parte superior del abdomen (en el retroperitoneo), el páncreas es una glándula de doble función del sistema digestivo y endocrino. En ciertos casos, las funciones del páncreas como una glándula endocrina (por ejemplo, la producción de varias hormonas importantes). En ciertos casos, las funciones del páncreas como una glándula exocrina (por ejemplo, la secreción de fluidos que contienen enzimas digestivas que pasan al intestino delgado).
El cáncer de páncreas es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los EE.UU. (después de pulmón, de colon y de mama), que comprende 6% de todas las muertes relacionadas con el cáncer. En 2008, un estimado de 37,680 nuevos casos de cáncer de páncreas se han diagnosticado en los EE.UU., con 34.290 muertes. La incidencia de la enfermedad, aumenta linealmente después de 50 años de edad, con el único factor de riesgo es el tabaquismo definitiva (los fumadores son cuatro veces más propensos a desarrollar la enfermedad que los no fumadores). Cáncer de páncreas invasiva es casi siempre mortal. El tiempo medio de supervivencia colectiva de todos los pacientes es de 4-6 meses. Relativa de supervivencia a 1 año es del 24%; la tasa de supervivencia global a 5 años <5%.
El cáncer de páncreas es asintomático en su etapa temprana y con frecuencia no se diagnostica durante varios meses (menos de un tercio de los pacientes que son diagnosticados dentro de los 2 meses de los síntomas de aparición). En ciertos casos, los resultados del diagnóstico con retraso de (parcial o totalmente) la metástasis de las células cancerosas a los nodos de hígado o de los ganglios.
Actualmente, la cirugía (resección del páncreas) es la terapia curativa primaria y sólo para el cáncer pancreático. Sin embargo, sólo el 15-25% de los tumores son retirables en el momento del diagnóstico y sólo el 10-20% de los pacientes sometidos a cirugía sobreviven más de dos años. Una vez que se produce la infiltración tumoral y otros tejidos se han visto afectados, la cirugía ya no es posible.
En ciertos casos, la diabetes mellitus o pancreatitis predispone a un individuo a desarrollar un trastorno proliferativo de una pluralidad de células pancreáticas. En ciertos casos, los individuos tienen un mayor riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo de una pluralidad de células pancreáticas debido a un síndrome hereditario seleccionado de entre el grupo que consiste en cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) y la poliposis adenomatosa familiar (FAP). En ciertos casos, los individuos tienen un mayor riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo de una pluralidad de células pancreáticas debido a una mutación en un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en MSH2, MSH6, MLH1 y APC.
Idealmente, el tratamiento eficaz del cáncer de páncreas debe (i) controlar la masa tumoral primaria, tanto inicialmente como posteriormente, y (ii) tratar las células tumorales metastásicas. La quimioprevención (la administración de agentes tales como fármacos, productos biológicos, nutrientes y similares) retrasa la progresión de, invierte, o inhibe la carcinogénesis, lo que reduce el riesgo de desarrollar la enfermedad invasiva o clínicamente significativa.
Descritos en este documento, en ciertas modalidades, están los métodos de tratamiento de cáncer de páncreas. Según se usa aquí, "el cáncer de páncreas" incluye las formas de cáncer de páncreas. En algunas modalidades, un cáncer de páncreas es el cáncer de páncreas metastásico. En algunas modalidades, un cáncer de páncreas es un carcinoma, sarcoma, cáncer, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un cáncer pancreático a tratar incluye los cánceres de páncreas esporádicos y hereditarios. En algunas modalidades, un cáncer de páncreas es carcinoma de los conductos de células, carcinoma de células acinares, carcinoma mucinoso papilar, carcinoma de anillo de sello, carcinoma adenoescamoso, carcinoma indiferenciado, carcinoma mucinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células pequeñas, cystcancer, cystcancer seroso, cystcancer mucinoso, no clasificados cáncer de páncreas, pancreatoblastoma, o combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, un individuo en necesidad de tratamiento para el cáncer pancreático presenta con un tumor localizado del páncreas. En algunas modalidades, un individuo en necesidad de tratamiento para el cáncer pancreático presenta con una biopsia de ganglio linfático regional negativo. En algunas modalidades, un individuo en necesidad de tratamiento para el cáncer pancreático presenta con una biopsia de ganglio linfático regional positivo. En algunas modalidades, un individuo en necesidad de tratamiento para el cáncer pancreático se presenta con un tumor pancreático nodal negativa (por ejemplo, nodo-negativo). En algunas modalidades, un individuo en necesidad de tratamiento para el cáncer pancreático presenta con un tumor nodal positivo (por ejemplo, nodo-positivo).
En algunas modalidades, un cáncer de páncreas en un individuo que necesita tratamiento para el cáncer de páncreas se ha diseminado a otras partes del cuerpo. En algunas modalidades, un cáncer de páncreas se ha esparcido a una ubicación seleccionada de entre el grupo que consiste en ganglio linfático, estómago, conducto biliar, hígado, hueso, ovario, el peritoneo y el cerebro.
En algunas modalidades, las células cancerosas o células precancerosas se identifican mediante la tipificación histológica o clasificación de una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de biopsia). En algunas modalidades, las células cancerosas o células precancerosas se identifican mediante el uso de marcadores moleculares apropiados.
En algunas modalidades, un cáncer de páncreas en un individuo que necesita tratamiento para el cáncer de páncreas se celebra de acuerdo con el Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) sistema de clasificación TNM, donde el tumor (T) se ha asignado una etapa de Tx, TI, T2, T3, T4; y donde los ganglios linfáticos regionales (N) se han asignado una etapa de NX, NO, NI; y donde la metástasis distante (M) se ha asignado una etapa de MX, MO, o MI. En algunas modalidades, un cáncer de páncreas en un individuo que necesita tratamiento para el cáncer de páncreas se clasifica en etapa 0, I, el cáncer de páncreas IA, IB, II, IID, IIB, III, y IV. En algunas modalidades, un cáncer de páncreas en un individuo que necesita tratamiento para el cáncer de páncreas se escenifica como Grado GX (por ejemplo, el grado no puede ser evaluado), grado 1, grado 2, grado 3 ó 4.
Ejemplos más específicos de los cánceres tratados con proporcionadas oligonucleótidos incluyen cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de células escamosas, glioblastoma, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple y leucemia.
Evaluación y Tratamiento del Cáncer El término "antígeno de célula tumoral" se define aquí como un antígeno que está presente en mayores cantidades en una célula tumoral o en los fluidos corporales que las células tumorales no relacionadas, las células normales, o en fluido corporal normal. La presencia de antígeno puede ser probada por cualquier número de ensayos conocidos para los expertos en la téenica e incluyen, sin limitación negativa y/o la selección positiva con anticuerpos, tales como un ensayo ELISA, un radioinmunoensayo, o por manchado Western.
El "agente inductor de la apoptosis" se define en el presente documento para inducir la apoptosis/muerte celular programada, e incluyen, por ejemplo, agentes contra el cáncer y tratamientos en el que las células (por ejemplo, células tumorales) se inducen para someterse a la muerte celular programada. Ejemplar agentes inductores de apoptosis se describen con más detalle a continuación.
Los términos "apoptosis" o "muerte celular programada", se refiere al proceso fisiológico mediante el cual las células no deseadas o inútiles se eliminan durante otros procesos biológicos normales y de desarrollo. La apoptosis es una forma de muerte celular que se produce en condiciones fisiológicas normales y la célula es un participante activo en su propia muerte ("suicidio celular"). Es más a menudo se encuentra durante el recambio celular normal y la homeostasis del tejido, la embriogénesis, la inducción y el mantenimiento de la tolerancia inmune, desarrollo del sistema nervioso y la atrofia del tejido endocrino dependiente. Las células que sufren apoptosis muestran características morfológicas y bioquímicas características. Estas características incluyen la agregación de la cromatina, la condensación nuclear y citoplásmica, la partición del citoplasma y el núcleo en vesículas unidas a la membrana (cuerpos apoptóticos), que contienen ribosomas, mitocondrias morfológicamente intactas y el material nuclear. In vivo, estos cuerpos apoptóticos son reconocidos y fagocitados por los macrófagos, células dendríticas o células epiteliales adyacentes rápidamente. Debido a este mecanismo eficiente para la eliminación de células apoptóticas in vivo se provoca ninguna respuesta inflamatoria. In vitro, los cuerpos apoptóticos asi como los fragmentos de células restantes en última instancia, se hinchan y, finalmente, se lisan. Esta fase terminal de la muerte celular in vitro se ha denominado "necrosis secundaria". La apoptosis se puede medir por métodos conocidos por los expertos en la téenica como la fragmentación del ADN, la exposición de la anexina V, la activación de caspasas, la liberación de citocromo c, etc. A célula que ha sido inducida a morir se denomina en este documento como una "célula apoptótica. " La apoptosis también se puede probar usando un Anexina V Apoptosis ensayo estándar: N1H: OVCAR-3 células se cultivan en placas de 6 pocilios (Nunc) y se irradiaron o tratados con un antagonista (o en combinación con otro fármaco anti-cáncer) con ácido 4- 48 horas, se lavaron y se tiñeron con Anexina V-FITC (BD- Pharmingen) durante 1 hora. Las células se analizaron por citometria de flujo (Becton-Dickinson, CellQuest), contrastadas con yoduro de propidio y se analizaron de nuevo en el citómetro de flujo.
Los pacientes pueden ser evaluados con respecto a los síntomas en una o más múltiples puntos de tiempo entre ellos, antes, durante y después de los regímenes de tratamiento. El tratamiento puede resultar en la mejora de la condición del sujeto y puede ser evaluado mediante la determinación de si se ha producido uno o más de los siguientes factores: disminución del tamaño del tumor, disminución de la proliferación celular, disminución del número de células, disminución de -la neovascularización, aumento de la apoptosis, o disminución de la supervivencia de al menos una porción de las células tumorales. Uno o más de estos sucesos puede, en algunos casos, dar lugar a la eliminación parcial o total del cáncer y prolongación de la supervivencia del paciente. Alternativamente, para los cánceres en fase terminal, el tratamiento puede resultar en la estasis de la enfermedad, una mejor calidad de vida y / o prolongación de la supervivencia.
Métodos de Migración Celular en el Ensayo Los ensayos para la migración de células se han descrito en la literatura, por ejemplo, Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99: 1390-1398 y métodos para medir la migración de células son conocidos por los expertos en la téenica. En un método para la medición de la migración celular descrito en este documento, las membranas de cámaras de migración trans ell se recubren con el sustrato, los cultivos polarizados se lavan, y los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA. Las células tumorales a partir de cultivos sub-confluentes se recogieron, se lavaron y se resuspendieron en tampón de migración en presencia o ausencia de anticuerpos de ensayo. Después de que a las células tumorales se les permite migrar a la parte inferior de las membranas Transwell revestidos, las células restantes en el lado superior de la membrana se retiran y las células que migran a la cara inferior se tiñeron con cristal violeta. La migración celular se cuantifica luego por recuento directo de células por campo microscópico.
Métodos del crecimiento del tumor Dosificación El crecimiento del tumor se puede analizar por métodos conocidos por los expertos en la téenica, por ejemplo, el modelo de ratón SCID, el modelo de ratón desnudo, y los ratones BALB/c con tumores singénicos. Modelos de ratón SCID para el crecimiento del tumor se llevan a cabo como sigue: las células de elanoma M21 humanos subconfluentes (o cualquier tipo de célula tumoral deseada) se recogieron, se lavaron y se resuspendieron en PBS estéril (20 x 106 por mi). Ratones SCID se inyectan por vía subcutánea con 1001 de M21 de células de melanoma humano (2 x 106) de suspensión. Tres dias después de la inyección de células tumorales, los ratones son o bien no tratados o tratados por via intraperitoneal con un antagonista en los rangos de dosis deseada. Los ratones se trataron diariamente durante 24 dias. El tamaño del tumor se mide con calibres y el volumen estimado usando la fórmula V=(LxW2)/2, donde V es igual al volumen, L es igual a la longitud, y W es igual a la anchura.
Alternativamente, modelos de ratones desnudos, modelos de ratones SCID y/o modelos de ratones singeneicos BALB/c también pueden ser utilizados para evaluar el crecimiento e inhibición del tumor del mismo por los anticuerpos anti-endoglina humanizados o fragmentos de unión al antigeno descritos en la presente.
Métodos para Ensayar la Proliferación Celular La proliferación celular puede ser ensayada por métodos conocidos por aquellos expertos en la téenica. Como se describe en la presente, células endoteliales humanas subconfluentes (HUVECs) pueden ser resuspendidas en amortiguador de proliferación que contiene bajo suero (5.0%) en la presencia o ausencia de CM (25 pL) a partir de células ECV o ECVL, y célula sendoteliales permitidas para proliferar por 24 horas. La proliferación puede ser cuantificada midiendo la actividad de deshidrogenasa mitocondrial usando un kit de ensayo WST-1 comercialmente disponible (Che icon). También, como se describe en la presente, la proliferación puede ser cuantificada midiendo la incorporación de 3H usando métodos estándares. (She et al., Int. J. Cáncer, 108: 251-257 (2004)).
Otros métodos para evaluar la proliferación celular se conocen en la técnica y están contemplados en la presente. Además ejemplos no limitantes se describen en más detalle en los ejemplos.
Se podría entender que la clasificación y sistemas de andamiaje descritos en la presente representan un medio para evaluar los tratamientos de cáncer descritos en la presente; adicionalmente, otros esquemas de reacción escalonados se conocen en la téenica y pueden ser usados en conjunto con los métodos descritos en la presente. Por medio de ejemplo solamente, la clasificación TNM de tumores malignos puede ser usada como un sistema de andamiaje para describir la extensión del cáncer en un cuerpo del paciente.
T describe el tamaño del tumor y si éste ha invadido el tejido cercano, N describe los nodos linfáticos regionales que están involucrados, y M describe la metástasis distante. TNM se mantiene por la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC) y se usa por el Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC) y la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO). Se podría entender que no todos los tumores tienen clasificaciones TNM tales como, por ejemplo, tumores cerebrales. En general, T (a, es (0), 1-4) se mide como el tamaño o extensión directa del tumor primario. N (0- 3) se refiere al grado de dispersión a los nodos linfáticos regionales: NO significa que las células tumorales están ausentes a partir de los nodos linfáticos regionales, NI significa que las células tumorales se dispersan a los números más cercanos o pequeños de nodos linfáticos regionales, N2 significa que las células tumorales se dispersan a una extensión entre NI y N3; N3 significa que las células tumorales se dispersan a más distantes o números de nodos linfáticos regionales. M (0/1) se refiere a la presencia de metástasis: MO significa que no está presente metástasis distante; MI significa que la metástasis ha ocurrido en órganos distantes (más allá de los nodos linfáticos regionales). Otros parámetros también pueden ser evaluados. G (1-4) se refiere al grado de células de cáncer (es decir, son de bajo grado si parecen similares a células normales, y alto grado si parecen escasamente diferenciadas). R (0/1/2) se refiere a la terminación de una operación (es decir, libre de resección-limites de células de cáncer o no). L (0/1) se refiere a invasión en vasos linfáticos. V (0/1) se refiere a invasión en la vena. C (1-4) se refiere a un modificador de la certeza (calidad) de V.
Proporcionados en la presente están métodos para degradas, inhibir el crecimiento de o eliminar células de cáncer que comprende poner en contacto las células con una cantidad de un compuesto descrito en la presente efectiva para degradar, inhibir el crecimiento de o eliminar células de cáncer.
Proporcionados en la presente están métodos para inhibir el incremento del tamaño del tumor, reducir el tamaño de un tumor, reducir la proliferación del tumor o prevenir la proliferación del tumor en un individuo que comprende administrar a tal individuo una cantidad efectiva de un compuesto descrito en la presente para inhibir el incremento del tamaño del tumor, reducir el tamaño de un tumor, reducir la proliferación del tumor o prevenir la proliferación del tumor. Los tratamientos de tumores en algunos casos incluyen estasis de sintomas, es decir, por tratamiento del paciente, el cáncer no empeora y la supervivencia del paciente se prolonga.
Los pacientes pueden ser evaluados con respecto a síntomas que uno o más puntos de tiempo múltiple incluyen previo a, durante y después de los régimenes de tratamiento. El tratamiento puede resultar en mejoramiento de la condición del sujeto y puede ser evaluado determinando si uno o más de los siguientes eventos ha ocurrido: tamaño del tumor disminuido, proliferación celular del tumor disminuida, números disminuidos de células, neovascularízación disminuida y/o apoptosis incrementada. Una o más de estas apariciones puede, en algunos casos, resultar en eliminación total o parcial del cáncer y prolongación de la supervivencia del paciente. Alternativamente, para cánceres de etapa terminal, el tratamiento puede resultar en estasis de la enfermedad, mejor calidad de vida y/o prolongación de la supervivencia.
Otros métodos para evaluación de tratamiento se conocen en la téenica y se contemplan en la presente. En una modalidad ejemplar, los compuestos de pro-oligonucleótidos de la invención son administrados a un sujeto tal como un mamífero (por ejemplo, un humano), que sufre de un trastorno médico, por ejemplo, un cáncer, o condiciones no malignas caracterizadas por la presencia de una clase de células indeseadas.
Las medidas de resultados primarios pueden ser evaluadas para pacientes tratados usando los métodos descritos en la presente e incluyen, por ejemplo, supervivencia libre de progreso. En una modalidad, un incremento en la supervivencia libre de progreso se observa en una cantidad de por aproximadamente 2-veces, 5-veces, 10-veces, 20 veces, 50 veces o más comparada con la carencia de tratamiento. En otra modalidad, un incremento en la supervivencia libre de progreso es supervivencia incrementada por aproximadamente 3 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años o más comparado con una carencia de tratamiento .
Las medidas de resultados secundarios también pueden ser evaluadas e incluyen duración de respuesta, tiempo al progreso del tumor, supervivencia total, eventos adversos serios y no serios. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir el progreso de la enfermedad (es decir, estasis) o puede resultar en un mejoramiento. Alternativamente, o además, otras metas pueden ser medidas con respecto a uno o más de los siguientes: carga del tumor disminuida, neovascularización disminuida, efectos secundarios reducidos, reacciones adversas disminuidas, y/o complimiento del paciente incrementado.
Otros ejemplos específicos de enfermedaes o trastornos para los cuales el tratamiento por los compuestos o composiciones de la invención son útiles para tratamiento o prevención incluyen, pero no se limitan un rechazo al transplante (por ejemplo, riñón, hígado, corazón, pulmón, células isletas, páncreas, médula ósea, córnea, intestino delgado, aloinjertos de piel, o injertos heterólogos y otros transplantes), injerto contra enfermedad del hospedero, osteoartritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, retinopatía diabética, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, y otras enfermedades intestinales), enfermedad renal, caquexia, choque séptico, lupus, miastenia gravis, psoriasis, dermatitis, eczema, seborrea, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, protección de células troncales durante quimioterapia, selección ex vivo o purga ex vivo para transplante de médula ósea autólogo o alogénico, enfermedad ocular, retinopatías (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética, y otras retinopatías), enfermedad corneal, glaucoma, infecciones (por ejemplo, bacteriana, viral, o fúngica), enfermedad cardíaca, que incluye pero no se limita a, restenosis.
Activación de ARnse L La trayecotira de 2'-5' oligoadenilato (2-5A)/RNase L es una de las trayectorias enzimáticas inducidas por el interferón. El Rnase L es activado después de la unión a fragmentos 5'-fosforilados de ácido 2'-5' adenilico. Estos fragmentos de ácido 2'-5'adenilico (2-5A) se producen bajo el control de 2' -5' oligo(A) sintetasa. Esta trayectoria es parte del sistema inmune innato y tiene un papel importante en la prevención de la infección viral. El desdoblamiento inducido por 2-5A- de ARN de hebra única resulta en apoptosis. Los análogos de fosforotioato bioestables de 2-5A han sido mostrados por ser activadores potentes de Rnase L (Xianh et al., Cáncer Research (2003), 63:6795-6801). En este estudio, los análogos de 2-5A inducen actividad de Rnase L y causan apoptosis en cultivos de lineas de células de cáncer de próstata humano metastásico de etapa tardía DU145, PC3 y LNCaP.
La activación sostenida de RNase L activa una trayectoria mitocondrial de apoptosis que elimina las células infectadas con virus así como también células de tumor/cancerosas. El RNase L puede inhibir el crecimento del fibrosarcoma, crecimiento de cáncer de próstata, crecimiento de cáncer colorrectal y crecimiento de células pancreáticas. Dado el papel común de RNase L en diferentes cánceres, se contempla que la invención descrita en la presente puede ser usada para tratamiento de cualquier tipo de cáncer. Silverman, RH, Cytokine Growth Factor Rev, 18(5-6): 381-388 (2007); Bisbal, C. and Silverman, RH, Biochimie. 89(6-7): 789-798 (2007). Por medio de ejemplo, la regulación descendente de RNase L se refiere a cualquier reducción en los niveles de expresión del gen o genes que codifican a RNase L, silenciamiento del gen o genes que codifican a RNase L, reducción en los niveles de expresión/traducción de la sproteinas que comprenden RNase L, reducción en la cantidad de RNase L presente dentro de una célula, y/o cualquier reducción en la actividad de RNase L comparada con un nivel predeterminado de RNase L en una población sana ejemplar. Alternativamente, cualquier reducción en los niveles de RNase como se describe en la presente puede ser indicativa de la regulación descendente de RNase L.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos proporcionados son útiles para el tratamiento de enfermedades que tienen RNase L regulado descendentemente. En alguna modalidad, una enfermedad asociada con RNase L regulada descendentemente es cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de próstata, o cáncer colorrectal. Alternativamente, oligonucleótidos proporcionados descritos en la presente son útiles para el tratamiento de enfermedades que tienen RNse L regulado ascedentemente. En algunas modalidades, la enfermedad que tiene RNase L regulada ascendentemente es el síndrome de fatiga crónica. Enfermedades adicionales que tienen RNase L regulado ascendentemente se conocen en la téenica y se contemplan en la presente.
Cuando se usa como terapéutico, un oligonucleótido proporcionado es administrado como una composición farmacéutica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido proporcionado que comprende, o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable, y al menos un ingrediente inactivo farmacéuticamente aceptable seleccionado a partir de diluyentes farmacéuticamente aceptables, excipientes farmacéuticamente aceptables, y portadores farmacéuticamente aceptables. En otra modalidad, la composición farmacéutica es fórmulated para inyección intravenosa, administración oral, administración bucal, inhalación, administración nasal, administración tópica, administración oftálmica o administración ótica. En modalidades adicionales, la composición farmacéutica es una tableta, una pildora, una cápsula, un liquido, un inhalador, una solución atomizadora nasal, un supositorio, una suspensión, un gel, un coloide, una dispersión, una suspensión, una solución, una emulsión, un ungüento, una loción, una gota para los ojos o una gota para los oidos.
Composiciones farmacéuticas Cuando se usa como terapéutico, un oligonucleótido proporcionado o composición de oligonucleótido descrito en la presente se administra como una composición farmacéutica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido proporcionado, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y al menos un ingrediente inactivo farmacéuticamente aceptable seleccionado a partir de diluyentes farmacéuticamente aceptables, excipientes farmacéuticamente aceptables, y portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es formulada para inyección intravenosa, administración oral, administración bucal, inhalación, administración nasal, administración tópica, administración oftálmica o administración ótica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es una tableta, una pildora, una cápsula, un liquido, un inhalante, una solución atomizadora nasal, un supositorio, una suspensión, un gel, un coloide, una dispersión, una suspensión, una solución, una emulsión, un ungüento, una loción, una gota para los ojos o una gota para los oidos.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende oligonucleótido quiralmente controlado, o composición del mismo, en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Uno de habilidad en la téenica reconocerá que las composiciones farmacéuticas incluyen las sales farmacéuticamente aceptables del oligonucleótido quiralmente controlado, o composición del mismo, descrito anteriormente.
Compuestos para mejoramiento y suministro de objetivo Un oligonucleótido proporcionado como se describe en la presente puede ser suministrado usando una variedad de estrategias de suministro, que incluyen conjugados de ácidos nucleicos con varios ligandos, asi como también el uso de procedimientos de nanoportadores. Cualquiera de las estrategias de suministro de ácido nucleico están contempladas para uso con oligonucleótidos proporcionados descritos en la presente. La elección entre estrategias de suministro ejemplares que incluye pero no se limita a, conjugados químicos, vesículas de transferencia liposomal/lípidas catiónicas y nanoportadores supramoleculares depende del contexto terapéutico, y los métodos para determinar la modalidad de suministro óptimo se conocen en la téenica y además se contemplan en la presente.
Compuestos de Penetración Celular ("CPCs") Se conocen numerosos compuestos para actuar como portadores para cargos tales como ácidos nucleicos y facilitar la entrada del ácido nucleico en una célula en una instalación in vivo. Portadores ejemplares se describen en Dietz et al., Molecular & Cellular Neuroscience, 27(2): 85- 131 (2004) el cual se incorpora en la presente por referencia. Los CPCs prototípicos derivados a partir de reguladores transcripcionales de antenepedia y Tat han sido unidos por un gran número de nuevas porciones. Como un ejemplo, CPCs que son péptidos pueden ser péptidos catiónicos relativamente cortos (9-30 aminoácidos) ricos en arginina y lisina, o secuencias hidrofóbicas interactivas de la membrana. Los CPCs pueden ser ligados por téenicas de ADN recombinante o químicamente acoplados a péptidos, oligonucleótidos o nanoportadores, los cuales entonces comprenden el "cargo" para el CPC.
Ligandos de Obej tivo Celular ("CTLs") Otra estrategia es suministrar oligonucleótidos por el uso de un CTL que se une con alta afinidad a un receptor de la superficie celular que es capaz de sufrir internalización eficiente. Los ligandos potenciales incluyen anticuerpos, polipéptidos derivados de bibliotecas de despliegue de fago, y moléculas orgánicas pequeñas. Los lignados de objetivo celular adicionales se conocen en la técnica, o serán desarrollado, y están contemplados para uso con la invención descría en la presente (para siARN conjugado por ASGPR - GalNAc y oligonucleótidos, por ejemplo, documento WO2012037254A1). Debido a que varios receptores son a menudo preferencialmente expresados en tipos de células particulares, este procedimiento ofrece la posibilidad de selectividad mejorada para los reactivos de oligonucleótidos. Los objetivos del receptor ejemplar incluyen, pero no se limitan a, receptores de lipoproteina (tales como aquellos en el hígado), integrinas, tirosinas cinasas del receptor, y la superfamilia del receptor acoplado a la proteína-G (GPCR).
Nanoportadores Una variedad de nanoportadores supramoleculares puede ser usada para suministrar ácidos nucleicos. Nanoportadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a liposomas, complejos poliméricos catiónicos y varios poliméricos. La complejación de ácidos nucleicos con varias poblaciones es otro procedimiento para el suministro intracelular; este incluye el uso de policatione PEGiladas, complejos de polietilenamina (PEI), copolimeros de bloque catiónico, y dendrimeros. Varios nanoportadores catiónicos que incluyen PEI y dendrimeros de polia idoamina ayudan a liberar los contenidos de endosomas. Otros procedimientos incluyen el uso de nanoparticulas poliméricas, micelos poliméricos, puntos cuánticos y lipoplexos.
Las estrategias de suministro de ácido nucleico adicional se conocen en adición a las estrategias de suministro ejemplar descritas en la presente.
En aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico, los compuestos de la invención pueden ser formulados para una variedad de modos de administración, que incluyen administración sistémica y tópica o localizada. Las téenicas y formulaciones en general se pueden encontrar en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.2000).
Los oligonucleótidos proporcionados, y composiciones de los mismos son efectivos sobre un amplio intervalo de dosificaciones. Por ejemplo, en el tratamiento de humanos adultos, las dosificaciones desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1000 mg, desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 100 mg, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mg por dia, y desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 mg por dia son ejemplos de dosificaciones que puden ser usadas. La dosificación exacta dependerá de la ruta de administración, la forma en las cuales se administra el compuesto, el sujeto a ser tratado, el peso corporal del sujeto a ser tratado, y la preferencia y experiencia del especialista que atiende.
Sales farmacéuticamente aceptables son en general bien conocida por aquellos de de habilidad ordinaria en la téenica, y pueden incluir, por medio del ejemplo pero sin limitation, acetato, bencensulfonato, besilato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, bromuro, edetato de calcio, carnsilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartrato, o teoclato. Otras sales farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. 2000). Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas incluyen, por ejemplo, acetato, benzoato, bromuro, carbonato, citrato, gluconato, bromhidrato, clorhidrato, maleato, mesilato, napsilato, pa oato (embonato), fosfato, salicilato, succinato, sulfato, o tartrato.
Dependiendo de las condiciones especificas a ser tratadas, tales agentes pueden ser formulados en forma de dosificación liquida o sólida y administradas sistémicamente o localmente. Los agentes pueden ser suministrados, por ejemplo, en forma de baja liberación sostenida o en tiempo, como se conoce por aquellos expertos en la téenica. Las técnicas para formulación y administración se pueden encontrar en Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. 2000). Las rutas adecuadas pueden incluir administración oral, bucal, por atomización por inhalación, sublingual, rectal, transdermal, vaginal, transmucosal, nasal o intestinal; suministro parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedularmente, asi como también inyección intratecal, intraventricular directo, intravenoso, intra-articular, intra-esternal, intra-sinovial, intra-hepático, intralesional, intracraneal, intraperitoneal, intranasal, o intraocular, u otros modos de suministro.
Por inyección, los agentes de la invención pueden ser formulados y diluidos en soluciones acuosas tal como en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador de salina fisiológica. Para tal administración transmucosal, los penetradores apropiados a la barrera a ser permeada son usados en la formulación. Tales penetradores son en general conocidos en la téenica.
El uso de portadores inertes farmacéuticamente aceptables para formularlos compuestos descritos en la presente para la práctica de a invención en dosificaciones adecuadas para administración sistémica está dentro del alcance de la invención. Con la elección apropiada de portador y práctica de manuf acturación adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular, aquellas formuladas como soluciones, pueden ser parenteralmente administradas, tales como por inyección intravenosa .
Los compuestos pueden ser formulados fácilmente usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para administración oral. Tales portadores permiten a los compuestos de la invención ser formulados como tabletas, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas aguadas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto (por ejemplo, paciente) a ser tratado.
Para suministro nasal o por inhalación, los agentes de la invención también pueden ser formulados por métodos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, per no se limitan a, ejemplos de solubilización, dilución, o sustancias de dispersión tales como, salina, preservativos, tales como alcohol bencílico, promotores de la absorción, y fluorocarburos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr su uso propuesto. La determinación de las cantidades efectivas está también dentro de la capacidad de aquellos expertos en la téenica, especialmente en vista de la descripción detalla proporcionada en la presente.
Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliarles los cuales facilitan el procesameinto de los compuestos activos en preparaciones las cuales pueden ser usadas farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para administración oral pueden estar en la forma de tabletas, grageas, cápsulas o soluciones.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa, por ejemplo, almidón de maiz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetil-celulosa de sodio (CMC), y/o polivinilpirrolidona (PVP: povidona). Si se desea, los agentes de desintegración pueden ser agregados, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido alginico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas son proporcionados con recubrimientos adecuados. Para este propósitos, soluciones de azúcar concentradas pueden ser usadas, las cuales pueden contener opcionalmente goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol (PEG), y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Tintes o pigmentos también pueden ser agregados a las tabletas o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combianciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser usadas oralmente incluyen cápsulas duras elaboradas de gelatina, asi como también cápsulas selladas, blandas elaboradas de gelatina, y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con un rellenador tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos (PEGs). Además, los estabilizadores pueden ser agregados.
Dependiendo de la condición particular, o estado de la enfermedad, para ser tratada o prevenida, los agentes terapéuticos adicionales, los cuales son normalmente administrados para tratar o prevenir tal condición, pueden ser administrados en conjunto con los inhibidores de esta invención. Por ejemplo, agentes quimioterapéuticos u otros anti-proliferativos pueden ser combinados con los inhibidores de esta invención para tratar enfermedades prolierativas y cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos conocidos incluyen, pero no se limitan a, adriamicina, dexametasona, vincristina, ciclofosfamida, fluorouracilo, topotecano, taxol, interferones, y derivados de platino.
Otros ejemplos de agentes pro-oligonucleótidos no racémicos de esta invención también pueden ser combinados incluyendo, sin limitación, agentes anti-inflamatorios tlaes como corticoesteroides, bloqueadores TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida, y sulfasalazina; agentes inmunomoduladores e inmunosupresores tales como ciclosporina, tacrólimo, rapamicina, mofetil micofenato, interferonas, corticoesteroides, ciflofosfamida, azatioprina, y sulfasalazina; factores neurotróficos tales como inhibidores de acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones, anti-convulsionantes, bloqueadores del canal iónico, riluzol, y agentes anti-Parkinsonianos; agentes para tratar enfermedades cardiovasculares tales como bloqueadores-beta, inhibidores ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores del canal de calcio, y estatinas; agentes para tratar la enfermedad hepática tales como corticoesteroides, clestiramina, interferones , y agentes anti-virales; agentes para tratar trastornos de la sangre tales como corticoesteroides, agentes anti-leucémicos, y factores de crecimiento; agentes para tratar diabetes tales como insulina, análogos de insulina, inhibidores de alfaglucosidasa, biguanidas, y sensibilizadores de insulina; y agentes para tratar trastornos de inmunodeficiencia tales como gamma globulina.
Estos agentes adicionales pueden ser administrado separadamente, como parte de régimen de dosificación múltiple, a partir de oligonucleótidos proporcionados quiralmente controlados, y composiciones de los mismos. Alternativamente, estos agentes pueden ser parte de una forma de dosificación única, mezclados en conjunto con los oligonucleótidos proporcionados quiralmente controlados, y composiciones de los mismos, en una composición única.
Los ejemplos y preparaciones proporcionados abajo, ilustran y ejemplifican además oligonucleótidos proporcionados y composiciones de los mismos, y métodos para preparar los mismos. Se entiende que el campo de la presente invención no está limitado en cualquir forma por el alcance de los siguientes ejemplos y preparaciones.
La función y ventaja de estas y otras modalidades de la presente invención serán además completamente entendidas a partir de los ejemplos descritos posteriormente. Los siguientes ejemplos están propuestos para ilustrar los beneficios de la presente invención, pero no ejemplificar el campo completo de la invención.
Método para Analizar Composiciones de Oligonucleótidos : En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para analizar composiciones de oligonucleótidos. En algunas modalidades, un método proporcionado detecta, determina, y/o cuantifica, por ejemplo, la identidad, pureza, cantidad y/o calidad de uno o más oligonucleótidos. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método que comprende las etapas de: a) realizar un primer análisis de una primera composición, en el cual la primera composición comprende una pluralidad de diferentes tipos de un oligonucleótido; y b) comparar el primer análisis realizado con un segundo análisis, bajo condiciones comparables como el primer análisis, de una segunda composición, en el cual la segunda composición es una composición quiralmente controlada del oligonucleótido, donde diferencias entre el primero y segundo análisis reflejan diferencias en la presencia o nivel de al menos un tipo de oligonucleótido en el primero comparado con la segunda composición.
En algunas modalidades, una segunda composición contiene solamente un tipo único de oligonucleótido. En algunas modalidades, una segunda composición contiene más de un tipo de oligonucleótido. En algunas modalidades, un método proporcionado se usa para control de calidad de las composiciones de oligonucleótidos, por ejemplo, como se ilustra en los Ejemplos 17 y 48. Como se apreciará por aquellos expertos en la téenica, los datos presentados en el Ejemplo 48 confirman que los análisis representados comparando las composiciones muestran que la composición de oligonucleótido aleatoria (la primera composición), como se prepara por síntesis de oligonucléotido quiralmente no controlado, comprende un nivel extremadamente bajo de ciertos tipos de oligonucleótidos, tales como el tipo Rp o Sp lleno de la composición quiralmente controlada (la segunda composición).
Ejamplificación Lo anterior ha sido una descripción de ciertas modalidades no limitantes de la invención. Por consiguiente, se entiende que las modalidades de la presente invención descritas son solamente ilustrativas de la solicitud de los principios de la invención. La referencia en la presente a detalles de las modalidades ilustradas no está propuesta para limitar el alcance de las reivindicaciones.
Descripción General de la Síntesis de oligonucleótido Como se describe anteriormente y en la presente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos y los métodos para preparar los mismos. En algunas modalidades, la síntesis de oligonucleótidos se realiza usando soporte sólido. En algunas modalidades, la síntesis de oligonucleótidos se realiza en solución. En algunas modalidades, la síntesis de oligonucleótido comprende estapas que usan un soporte sólido y etapas en fase de solución. En algunas modalidades, las etapas que usan un soporte sólido se realizan en un sintetizador deoligonucleótido .
Preparación del soporte sólido: El soporte (Poliestireno Altamente Reticulado (HCP) o Vidrio de Poro Controlado (CPG)) se usó para cargar el primer nucleósido 5'- 0-DMTr protegido contenido en la secuencia de oligonucleótido. En algunas modalidades, un grupo oxalilo se usó para ligar el grupo 3'-0H del primer nucleósido a un grupo amina en el soporte sólido, como se describe en Alul et al . , Oxalyl-CPG: a labile support for synthesis of sensitive oligonucleotide derivatives, Nucleic Acids Research 1991, 19 (7) , 1527. En algunas modalidades, el grupo succinilo estándar se usó como el enlazador.
Destritilación del Nucleótido en el Soporte Sólido Una solución de 3% de TCA (ácido trifluoroacético) en diclorometano (DCM, CH2CI2) se suministró a la columna que contiene el soporte el cual se instaló en un sintetizador para desbloquear el 5'-O-DMTr.
Acoplamiento de Fsoforamidita Quiral Mediado pro CMPT: Después del lavado del soporte sólido con acetonitrilo anhidro (ACN) y secado por lavado a chorro inverso con argón seco, el 5'-OH libre se acopló en el siguiente nucleótido en la secuencia de oligonucleótido, creciendo del extremo 3' al 5'. Este co-suministro vincula el soporte sólido de una solución de la fosforamidita quiral en conjunto con CMPT (abajo), lo cual resulta en acoplamiento altamente eficiente con excelente exceso diastereomérico (típicamente >99%) para dar un producto fosfita diéster quiral, como se describe por Wada et al . J. Am. Chem. Soc. , 2008, 130, 16031-1603; Angew. Chem. Intern . Ed. 2009, 48, 496-499. El solvente normalmente fue acetonitrilo (ACN), pero otros solventes podrían también ser usados.
Fosforamiditas Quirales Empleadas en Estos Estudios ' , .
- . ' I 1 . ' . , - . _ | , — . . ’ . l l | — Fosforamiditas Adicionales: .
. . · Tapado: En algunas modalidades, la etapa de tapado se llevó a cabo en dos etapas. En algunas modalidades, las dos etapas de tapado mencionadas anteriormente se combinaron en una y se realizaron en un crisol. A menos que se especifique de otro modo, las dos etapas de tapado se usaron en la síntesis de ejemplos descritos en la presente.
Para las dos etapas de tapado, después del lavado 5 del soporte sólido con ACN anhidro y secado por lavado a chorro inverso con argón seco, el reactivo "Tapa A", típicamente que comprende 5% de solución de Pac20 en 2,6-lutidina/THF - 1:4 (v/v) se introdujo primero al soporte sólido. Sin la intención de ser limitado por teoría, Tapa A fue suficientemente reactiva para tapar efectivamente (acilar) la amina libre del auxiliar quiral. En algunas modalidades, tal protección previene el reacomodo/descomposición del intermediario fosftita. Inmediatamente después de este tratamiento, una mezcla 1:1 de reactivos "Tapa A" y "Tapa B" se envió a la columna que contiene el soporte sólido. La "Tapa B" fue una solución de 16% de W-metilimidazol (NMI) en THF la cual, cuando se mezcla con "Tapa A" efectúa el tapado de, por ejemplo, el oligonucleótido 5'-OH sin reaccionar unido al soporte sólido. Sin desear ser limitado por teoría, la etapa de tapado fue extremadamente importante en que, sin el tapado del grupo amino del auxiliar quiral la siguiente etapa de sulfurización dentro del ciclo induce el desdoblamiento del enlace internucleotídico y descomposición del oligonucleótido, por ejemplo, debido a un ataque nucleofílico intermolecular indeseado de la amina libre del auxiliar en el átomo de fósforo. Sin embargo, el tapado de los grupos 5'-OH de los shortmeros soportados por sólido no acoplados de corrida desactivada es crucial con respecto a obtener alta pureza del oligonucléotido de longitud completa crudo, evitando bajos rendimientos debido a la acumulación de secuencias fallidas extendidas y tediosas y dificulta, sino hace imposible las purificaciones finales.
Sulfurazación: Después del lavado del soporte sólido con ACN anhidro y secado por lavado a chorro inverso con argón seco, el intermediario de fosfito triéster tapado resultante se sometió a sulfurización oxidativa. Una solución del reactivo de sulfurización se preparó mezclando el reactivo de sulfurización, por ejemplo, un derivado de tiosulfonato de alquilo (300 M), con N, 0-bis (trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (100 mM) en ACN. Este entonces se suministró a la columna que contiene el soporte sólido y se dejó reaccionar por una cierta cantidad de tiempo (usualmente 5-60 minutos). En algunas modalidades, el reactivo de tiosulfonato de sulfurización se usó como una solución de 300 nM en ACN anhidro, sin adición de BSTFA. En algunas modalidades, las soluciones de reactivo con y sin BSTFA producen resultados similares.
Oxidación: En algunas modalidades, la xodiación al fosfodiéster se realizó en lugar de la etapa de sulfurización. La oxidación se logró suministrando una solución de 0.02 M I2 en un sistema de co-solvente de THF/piridina/agua (70:20:10 - v/v/v), formando un enlace de fosfodiéster no quiral.
Desbloqueo 5'- del grupo DMTr: La remoción de DMTr se efectuó usando 3% de TCA en DCM. Después del desbloqueo, el ciclo entonces se llevó delanteramente para rondas iterativas adicionales de acoplamiento, tapado, sulfurization/oxidación (ya sea sulfurización con el mismo agente sulfurizante, o sulfurización con un agente de sulfurización diferente, u oxidación en lugar de sulfurization, para cada uno de los siguientes ciclos) y desbloqueo. Alternativamente, si la longitud prediseñada se alcanza, el oligonucleótido se somete a salida de ciclo y, opcionalmente, a tratamiento post-sintético. En algunas modalidades, el oligonucleótido se remueve antes del desbloqueo del grupo 5'-O-DMTr terminal.
Remoción Espontánea del Auxiliar Quiral: La remoción espontánea del auxiliar quiral se logró durante la sulfurización, oxidación, desbloqueo del grupo DMTr, o la combinación de los mismos. No fueron necesarias etapas especificas para remover el auxiliar quiral.
Desdoblamiento y Desprotección: La longitud deseada del oligonucleótido se removió a partir de su soporte sólido por desdoblamiento del enlazador correspondiente (HCP o CPG ligado a oxalilo o succinilo) mientras al mismo tiempo, los grupos protectores en el oligonucleótido fueron desprotegidos. En algunas modalidades, el oligonucleótido de soporte sólido se trató primero con 1M de solución anhidra de 1,5-diazabiciclo(4.3.0)non-5-eno (DBN) o 1,8- diazabicicloundec-7-eno (DBU) en cloruro de ACN- trimetilsililo seco - 16:1 (v/v) por 10 min a t.a. y después se lavó con ACN seco, como se describe por Reese and Yan, J. Chem. Soc. , Perkin Trans . 1 , 2002, 2619. En algunas modalidades, el material se trató con soluciones de propilamina seca en piridina seca (típicamente en una relación 1:4) por un periodo de 18h a t.a. o a 60 °C por 2 h. En algunas modalidades, cualquier condición proporciona el compuesto crudo con calidad similar. En algunas modalidades, los oligonucleótidos crudos se desdoblaron del soporte y desprotegieron por tratamiento con 28% de amoniaco acuoso por un periodo de 18h a t.a. o a 60 °C por 5 h. En algunas modalidades, cualquier condición proporciona el compuesto crudo con calidad similar. Los solventes fueron entonces evaporados y el residuo se trató con solución acuosa a ~pH 1.5 (el pH puede ser alterado si se desea) con 0-50% de DMSO, y el producto crudo se sometió a análisis por una combinación de HPLC y UPLC/MS. El producto se purificó por una de una combinación de HPLC de fase inversa (RP-HPLC), HPLC de fase normal, HPLC de intercambio iónico (IE-HPLC) o cromatografía de exclusión de tamaño. En algunas modalidades, el oligonucleótido se removió a partir del soporte sólido, se desprotegió y se purificó antes del desbloqueo del grupo DMTr.
Ejemplo 1: Síntesis de Reactivos Sulfurizantes y Síntesis de Fosforamidi as En algunas modalidades, la presente invención proporciona Reactivos Sulfurizantes, y métodos de elaboración de los mismos. En algunas modalidades, los Reactivos Sulfurizantes proporcionados se usan en la síntesis de oligonucleótidos descrito en la presente solicitud. Reactivos Sulfurizantes ejemplares y su síntesis se ilustran en el Esquema de reacciónE-1 Esquema de reacción E-l. Síntesis de Reactivos Sulfurizantes. — — — - ¡ . . ¡ _ HJ f i) HN I - i I i i ~ - · .
- ( I : : , : , : , _ ; : ; : - - i . , : i HCl 119 120 | , , l (i) MsCl, NEt3; (ii) NaMTS; (iii) PivCl, NEt3; (iv) NaMTS, Nal; (v) compuesto 4; (vi) TMSC1, NEt3; (vii) compuesto 35, DEAD, PPh3; (viii) TBAF; (ix) TsCl, piridina; (x) AC20, piridina; (xi) KTTS; (xii) (COCl)2; (xiii) Fmoc-OSu, Py; (xiv) NaOH (aq); (xv) Na-p-ClPheTS ; 4-nitrobencensulfinato de sodio, Br2; (xvii) H2O2, Nal Síntesis del Compuesto 5 - Compuesto 2: Una solución de ( D-but-2-en-l,4-diol (0.93 mi, 11.3 mmol) y trietilamina (3.3 mi, 24 m ol) en diclorometano (DCM, 50 mL) se agregó en una forma de goteo a una solución enfriada con hielo agitada de cloruro de metansulfonilo (1.9 mi, 24 mmol) en DCM (50 mL). Después de la agitación por 0.5h a t.a., la mezcla se vertió en hielo y se extrajo. La capa orgánica se recolectó, se secó (MgSO4) y se filtró. Después de se removió el solvente, se obtuvo 2.66 g del compuesto 2 (96%), el cual se juzgo por NMR por ser suficientemente puro para uso directo en la siguiente etapa de la reacción.1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 5.94 (ddd, J = 5.4, 4.1, 1.3 Hz, 2H), 4.83 (dd, J = 4.1, 1.3 Hz, 4H), 3.04 (s, 6H); 13C NMR 128.34, 64.38, 38.27; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 262.04, encontrado: 262.05; Rf = 0.3 (1:1 EtOAc/hexano).
Compuesto 3: Una solución de metansulfonotioato de sodio (1.51 g, 11.3 mmol) en MeOH (20 mi) se trató con dimetansulfonato de ( Z) -but-2-en-l,4-diilo puro (1.25 g, 5.12 mmol) a temperatura ambiente. Después de 5 min, se observó que se produce precipitación. Después de 36 h, la mezcla se dividió entre agua y DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgS04), y se filtró. Se removió el solvente proporcionando aceite incoloro. La cromatografía en columna (ISCO) dio el compuesto 3 puro (0.89 g, 63%) como un aceite incoloro. 1H NMR (399 MHz, CDC13) d 5.84 (ddd, J = 6.6, 5.1, 1.5 Hz, 2H), 3.92 (dd, J = 5.1, 1.5 HZ, 4H), 3.33 (s, 6H); 13C NMR 128.1, 51.47, 33.13; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 294.00, encontrado: 294.04; Rf = 0.4 (1:1 EtOAc/hexano).
Compuesto 4: Bajo atmósfera de argón, se agregó morfolina (10 g, 115 mmol) a sulfuro de etileno (15 g, 250 inmol) en un matraz de fondo redondo. La reacción se agitó por 7 hrs y se cargó directamente en una columna de gel de sílice. La columna se lavó con DCM primero y después se usó 2% de MeOH/DCM para obtener el compuesto 4 (15.3 g, 91%) como aceite incoloro. 1H NMR (399MHz, CDCI3) d 3.67-3.59 (m, 4H), 2.63-2.52 (m, 2H), 2.51-2.45 (m, 2H), 2.44-2.34 (m, 4H); MS (ESI tve): cale (M+H)+ = 148.07, encontrado: 148.1.
Compuesto 5: Una solución DCM (1 mL) de 2-morfolinetanetiol (0.21 g, 1.44 mmol) se agregó por goteo mediante una jeringa a una solución agitada del compuesto 3 (0.40 g, 1.44 mmol) en DCM (10 mL) a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la adición, la reacción se verificó por TLC, mostrando formación rápida del producto y algunos dímeros. Después de 0.5 h, la mezcla se dividió por adición de agua. En la extracción, la capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró. Después se removió el solvente in vacuo, la cromatografía en columna dio el compuesto 5 (0.29 g, 58%) como aceite incoloro. *H NMR (399 MHz, CDCl3) d 5.78 (m, 2H), 3.92 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 3.46 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 2.84 (dd, J = 7.8, 6.7 Hz, 2H), 2.66 (dd, J = 7.8, 6.7, 2H), 2.48 (t, J = 4.6 Hz, 4H); 13C NMR 130.35, 126.27, 66.97, 58.20, 53.67, 51.52, 36.22, 35.16, 33.67; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 344.05, encontrado: 344.06; Rf = 0.3 (EtOAc) Compuesto 5b: Una solución DCM (1 mL) del compuesto 4b (395 mg, 1.085 mmol) se agregó por goteo mediante una jeringaa una solución DCM agitada (15 mL) del compuesto 3 (300 mg, 1.085 mmol) a t.a. Después de lh, la solución resultante se dividió por adición de agua. En la extracción, la capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró. Después de remdurante el solvente in vacuo, la cromatografía en columna dio el compuesto 5b como un aceite incoloro (0.35 g, 58%). 3H NMR (399 MHz, CDCI3) d 5.83 - 5.70 (m, 2H), 5.35 - 5.21 (dt, J = 26.0, 9.3 Hz, 2H), 5.16 - 5.07 (m, 1H), 4.59 - 4.54 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.29 - 4.23 (m, 1H), 4.23 - 4.18 (m, 1H), 3.99 - 3.88 (dd, J = 6.7, 1.2 Hz, 2H), 3.80 - 3.72 (ddd, J = 10.1, 4.6, 2.6 Hz, 1H), 3.64 - 3.56 (m, 1H), 3.50 - 3.43 (m, 1H), 3.31 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.03 (s, 6H), 2.00 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 170.68, 170.30, 169.51, 169.30, 129.43, 127.14, 87.73, 76.49, 73.89, 69.16, 67.99, 61.99, 51.64, 35.89, 33.58, 20.95, 20.80, 20.74, 20.71; MS (ESI +ve) : cale (M+NH4)+: 578.07, encontrado: 577.96; Rf = 0.5 (1:1 EtOAc/hexano).
Sintesis del Compuesto 7 j Compuesto 6: Una solución enfriada con hielo de ( D-but-2-en-l,4-diol (0.93 ml, 11.3 ramol) y trietilamina (1.6 mL, 11.5 inmol) en DCM (50 ml) se trató por goteo mediante una jeringa con cloruro de pivaloilo (1.4 ml, 11.4 mmol) durante 2 min. Después de 1 h, la TLC mostró resultados de buena reacción. La mezcla resultante se dividió por adición de agua. En la extracción, la capa orgánica se separó, se secó (MgSC>4), y se concentró in vacuo. Este compuesto crudo fue encontrado: por TLC (Rf = 0.6, 1:1 EtOAc/hexano) por no contener diol de partida y se usó crudo para preparar el mesilato. El material crudo se recuperó en DCM (50 ml) que contiene trietilamina (1.7 mL, 12 mmol) y se enfrió en un baño de hielo. Se agregó por goteo cloruro de metansulfonilo (0.98 ml, 12.66 mmol) mediante una jeringa durante 2 min. La TLC inmediatamente después de la adición indicó consumo completo del material de partida. La mezcla resultante se dividió por adición de agua. En la extracción, la capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna dio el compuesto 6 puro, 1.48 g, 52%, como un aceite incoloro. 1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 5.89 - 5.75 (m, 2H), 4.89 - 4.84 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.68 - 4.63 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.03 (s, 3H), 1.19 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d 178.28, 130.61, 126.11, 65.08, 59.65, 38.84, 38.21, 27.25; MS (ESI +ve): calc (M+NH4)+: 268.12, encontrado: 268.20; Rf = 0.3 (20% EtOAc/hexano).
Compuesto 7: Una solución MeOH (10 mi) de metansulfonotioato de sodio (0.63 g, 4.70 m ol) y pivalato de ( D-4-(metilsulfoniloxi)but-2-enilo (1.00 g, 4.00 mmol) se agitó a t.a., por 18 h con formación de un precipitado blanco (después de 10 min). La mezcla resultante se dividió por adición de agua y DCM. En la extracción en DCM, la capa orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna dio el compuesto 7, 0.83 g, 78% como un aceite incoloro. XH NMR (399 MHz, CDCI3) d 5.82 - 5.73 (m, 2H), 4.73 - 4.66 (m, 2H), 3.95 - 3.87 (m, 2H) , 3.32 (s, 3H), 1.19 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 178.35, 129.37, 127.32, 59.50, 51.44, 38.84, 33.61, 27.28; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 284.10, encontrado: 284.19; Rf = 0.4 (20% EtOAc/hexano).
Síntesis del Compuesto 9 Compuesto 9 : Cloruro de pivaloilo (0. 60 g, 5. 0 ranol) se agregó en una forma de goteo a una solución agitada de metansulfonotioato de S-2-hidroxietilo (0.65 g, 4.16 mmol) en DCM (20 mi). Después de 2 h a t.a., la mezcla resultante con precipitado blanco se dividió con agua. La capa orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se filtró se concentró a un aceite. La cromatografía en columna dio el compuesto 9 como un aceite incoloro (0.45 g, 45%). XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 4.39 - 4.34 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.44 - 3.39 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.36 (s, 3H), 1.20 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 62.10, 51.11, 38.96, 35.19, 27.24; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 158.08, encontrado: 158.04; Rf = 0.3 (20% EtOAc/hexano).
Síntesis del Compuesto 12 Compuesto 11: Cloruro de pivaloilo (4.96 mi, 40.3 mmol) se agregó por goteo mediante una jeringa a una solución DCM enfriada con hielo (50 mL) de 2-(hidroximeti1)fenol (5 g, 40.3 mmol) y trietilamina (5.61 mi, 40.3 mmol). Una solución enfriada con hielo del éster de pivalato crudo tratado con trietilamina (6.74 mi, 48.4 mmol) y 50 mL DCM. Después se agregó lentamente cloruro de metansulfonilo (3.43 mi, 44.3 mmol) (5 min) mediante una jeringa y la mezcla resultante se calentó a t.a. La mezcla se vertió en hielo y la capa orgánica se separó después lavó con NaHCO3 saturado (ac), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para proporcionar 10.5 g aceite amarillo pálido crudo. La cromatografía en columna (ISCO) dio 5.45 g, 47% de 11 puro. aH NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.53 - 7.46 (dd, 7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.46 - 7.40 (dt, 7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.32 - 7.24 (t, 7.7 Hz, 1H), 7.13 - 7.06 (d, 7.7 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 2.79 (s, 3H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 177.05, 150.06, 131.18, 131.07, 126.35, 125.94, 123.21, 66.88, 39.48, 38.82, 27.30, 27.26. MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 304.12, encontrado: 303.99; Rf = 0.4 (20% EtOAc/hexano) .
Compuesto 12: Una solución MeOH (20 mL) de metansulfonotioato de sodio (0.825 g, 6.15 mmol) se trató con pivalato de 2-((metilsulfoniloxi)metil)fenilo (1.76 g, 6.15 mmol) a t.a., y se dejó agitar por 18 h. La mezcla se dividió entre agua y DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y se concentró para proporcionar un aceite incoloro. La cromatografía en columna dio compuesto puro 12 como un pale aceite incoloro, 0.754 g, 41%. H NMR (399 MHz, CDCI3) d 7.48 - 7.44 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.39 - 7.34 (td, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.25 - 7.20 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.10 - 7.06 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 4.29 (s, 2H), 2.90 (s, 3H), 1.39 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 176.69, 149.59, 131.17, 129.85, 127.41, 126.18, 123.40, 51.43, 39.47, 36.01, 27.30; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 320.10, encontrado: 320.09; Rf = 0.4 (20% EtOAc/hexano).
Síntesis del Compuesto 14 Compuesto 14: Pivalato de clorometilo (0.478 mi, 3.32 mmol) se agregó a una mezcla agitada de yoduro de sodio (0.050 g, 0.33 mmol) y metansulfonotioato de sodio (0.445 g, 3.32 mmol) en acetona (7 mi) a t.a. Después de 24 h, la TLC mostró buena conversión para el producto. El solvente se removió, y el residuo se dividió entre agua y DCM. La capa orgánica se separó y se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para proporcionar un aceite incoloro. La cromatografía en columna dio 14 puro como un sólido ligeramente rosa, 0.41 g, 55%.1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 5.67 (s, 2H), 3.39 (s, 3H), 1.24 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 177.35, 67.84, 52.20, 38.93, 27.05; Rf = 0.5 (20% EtOAc/hexano) .
Síntesis del Compuesto 16 Compuesto 16: Preparado de 15 y NaMTS como se describe previamente en OS 3,484,473.1H NMR (399 MHz, CDC13) d 4.86 (s, 2H), 3.45 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 52.15, 41.50.
Sintesis del compuestos 18 y 19 Compuesto 18: Preparado de 17 y NaMTS como se describe previamente: Chem. Pharm. Bull. Vol.12(11) p. 1271, 1964. CH NMR (399 MHz, CDCl3) d 3.55 (s, 4H), 3.40 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 50.67, 35.96.
Compuesto 19: Una solución DCM (1 mL) de 2-morfolinetanetiol (0.17 g, 1.2 mol) se agregó por goteo mediante una jeringa a una solución agitada del compuesto 18 (300 mg, 1.2 mmol) en DCM (10 mL) a t.a. Inmediatamente después de la adición, la TLC mostró formación rápida de producto y algunos dimeros. Después de 0.5 h, la mezcla se dividió por adición de solución de NaHCO3. En la extracción, la capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna dio 19 puro (0.20 g, 53%) como un aceite incoloro.1H NMR (399 MHz, CDC13) d 3.73 - 3.67 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 3.51 - 3.46 (m, 2H), 3.35(s, 3H), 3.07 - 3.01 (m, 2H), 2.88 - 2.83 (m, 2H), 2.69 - 2.63 (m, 2H), 2.52 - 2.43 (t, J = 4.6 Hz, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 66.96, 57.91, 53.58, 50.79, 37.66, 36.10, 35.52; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 318.03, encontrado: 318.04; Rf = 0.3 (EtOAc).
Síntesis del Compuesto 22 Compuesto 21: El Compuesto 20 se convirtió al compuesto 21 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 11. XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.45 - 7.36 (m, 4H), 5.37 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 2.93 (s, 3H), 1.21 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 178.20, 135.65, 131.92, 130.48, 129.98, 129.78, 128.88, 69.05, 63.39, 38.94, 38.36, 27.27; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 318.24, encontrado: 318.14; Rf = 0.4 (20% EtOAc/hexano).
Compuesto 22: El Compuesto 21 se convirtió al compuesto 22 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 12.
NMR (399 MHz, CDC13) d 7.46 - 7.32, (m, 4H), 5.21 (s, 2H), 4.50 (s, 2H), 3.03 (s, 3H), 1.21 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 178.24, 135.10, 133.15, 130.93, 130.32, 129.05, 129.00, 63.61, 51.07, 38.97, 38.03, 27.30; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 334.11, encontrado: 334.13; Rf = 0.4 (20% EtOAc/hexano).
Síntesis del Compuesto 25 Compuesto 23: El Compuesto 23 se preparó de conformidad con un método de la literatura (Journal of Medicinal Chemistry, 50(23), 5568-5570, 2007).
Compuesto 24: Una solución de piridina enfriada con hielo (10 mL) del compuesto 23 (1 mmol) se trató sucesivamente, en una forma de goteo con cloruro de acetilo (1 mmol), después de 5 min con MsCl (1.1 mmol). La solución se calentó a temperatura ambiente después el solvente se removió. El residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con agua, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La purificación por cromatografía en columna proporcionó el compuesto 24 puro.
Compuesto 25: El Compuesto 24 se conviertió al compuesto 25 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 12.
Síntesis del Compuesto 27 Compuesto 27: El Compuesto 26 se convirtió al compuesto 27 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 14. CH NMR (399 MHz , CDC13) d 3.97 (s, 2H) , 3.79 (s, 3H) , 3.48 (s, 3H) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 168.84, 53.35, 51.53, 37.83; MS (ESI +ve) : cale (M+NH4)+: 202.02, encontrado: 201.96; Rf = 0.2 (20% EtOAc/hexano) .
Síntesis del Compuesto 29 Compuesto 29: El Compuesto 28 se convirtió al compuesto 29 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 14. XH NMR (399 MHz, CDC13) d 3.72 (s, 3H), 3.39 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.34 (s, 3H), 2.85 (t, J = 6.8 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 171.53, 52.29, 50.66, 34.51, 31.20; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 216.10, encontrado: 216.04; Rf = 0.2 (20% EtOAc/hexano).
Síntesis del Compuesto 31 Compuesto 30: El Compuesto 30 se preparó de conformidad con un método de la literatura (Tetrahedron, 42 (2), 601-607; 1986).
Compuesto 31: El Compuesto 31 se preparó del compuesto 30 de conformidad con un procedimiento de patente (US 20090181444).
Síntesis del Compuesto 33 Compuesto 33: El Compuesto 33 se preparó del compuesto 32 de conformidad con un procedimiento de patente (US 20090181444).
Sintesis del Compuesto 38 Compuesto 36: Una solución DCM enfriada en hielo (20 mL) del compuesto 34 (1 ol) se trató con NEt3 (1 mmol) seguido por la adición por goteo de TMS-C1 (1.1 mmol). Después de 1 h, la solución se lavó con agua, se secó (MgSCh), se filtró y se concentró in vacuo. El material protegido TMS crudo se disolvió nuevamente en THF (10 mL), sobre el cual PPh3 (1.2 mmol), compuesto 35 (1.2 mmol), después DEAD (1.2 mmol, por goteo) se agregaron en sucesión. Después de la agitación a temperatura ambiente por 18 h, el solvente se removió bajo vacio, el residuo se disolvió nuevamente en DCM, la solución la cual se lavó con agua, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La purificación por cromatografía en columna proporcionó el compuesto 36 puro.
Compuesto 37: Una solución THF (10 mL) del compuesto 36 (0.5 mmol) se trató con TBAF (1 mol de una solución 1M en THF), con monitoreo por TLC. Al termino del desdoblamiento de TMS, el solvente se removió bajo vacio, y el residuo se disolvió nuevamente en DCM, la solución la cual se lavó con agua, se secó (MgSO4), se filtró y se redujo in vacuo. El alcohol crudo se disolvió nuevamente en piridina (5 mL), y se agregó TsCl (0.55 mmol). Después de 18 h a temperatura ambiente, el solvente se removió, y el residuo se disolvió nuevamente en DCM, la solución la cual se lavó con agua, se secó (MgS04), se filtró y se redujo in vacuo. La purificación por cromatografía en columna proporcionó el compuesto 37 puro.
Compuesto 38: El Compuesto 37 se conviertió a compuesto 38 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 12.
Síntesis del Compuesto 41 Compuesto 40: Una solución DCM enfriada en hielo (20 mL) del compuesto 39 (1 mmol) se trató con NEt3 (1 mmol) seguido por la adición por goteo de TMS-C1 (1.1 mmol). Después de 1 h, la solución se lavó con agua, se secó (MgS04), se filtró y se concentró in vacuo. El material protegido TMS crudo se disolvió nuevamente en THF (10 mL), sobre el cual PPh3 (1.2 ol), p-toluentiosulf onato de potasio (KTTS, 1.2 mmol), ZnCl2 anhidro (1 mmol) después DEAD (1.2 mmol, por goteo) se agregaron en sucesión. Después de la agitación a t.a., por 18 h, el solvente se removió bajo vacio, y el residuo se disolvió nuevamente en DCM, la solución la cual se lavó con agua, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La purificación por cromatografía en columna proporcionó el compuesto puro 40.
Compuesto 41: Una solución THF (10 mL) del compuesto 40 (0.5 mmol) se trató con TBAF (1 mmol de una solución 1M en THF), con monitoreo por TLC. Al termino del desdoblamiento de TMS, el solvente se removió bajo vacío, y el residuo se disolvió nuevamente en DCM, la solución la cual se lavó con agua, se secó (MgS04), se filtró y se concentró in vacuo. El alcohol crudo se disolvió nuevamente en THF (10 mL) , sobre el cual PPh3 (1.2 mmol), el compuesto 35 (1.2 mmol), después DEAD (1.2 mmol, por goteo) se agregaron en sucesión. Después de la agitación a t.a., por 18 h, el solvente se removió bajo vacío, y el residuo se disolvió nuevamente en DCM, la solución la cual se lavó con agua, se secó (MgS04), se filtró y se concentró in vacuo. La purificación por cromatografía en columna proporcionó el compuesto 41 puro.
Síntesis del Compuesto 43 Compuesto 43: El Compuesto 42 se conviertió a compuesto 43 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 14.
Síntesis del Compuesto 45a, 45b, 47a y 47b ! Compuesto 45a: Una mezcla de clorhidrato de 4—(2— cloroetil)moríolina (compuesto 44) (50 g, 269 mmol), yoduro de sodio (4.03 g, 26.9 mmol) y 4-metilbencensulfonotioato de potasio (73.0 g, 322 mmol) se agitó en MeOH (200 mi) y se calentó a 60°C durante 72 h. La mezcla amarillo pálido se enfrió y diluyó con 200 mL agua, se agitó por 0.5 h después lo sólido blanco se recolectó por filtración, se lavó con agua (100 mL), IPA (200 mL), EtOAc (200 mL) y éter (200 mL). Masa seca = 68 g. Este polvo microcristalino se recristalizó de agua a 90°C (200 mL) y la masa cristalina se recolectó por filtración después de permanecer a t.a., durante la noche (64 g, 71%). XH NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.67 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 3.16 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.41 (t, J = 4.4 Hz, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d 144.82, 141.99, 129.95, 127.14, 66.85, 56.54, 53.18, 33.44, 21.78; MS (ESI +ve); cale (M+H)+: 302.08, encontrado: 302.22.
Compuesto 45b: Reemplazando 4-metilbencensulfonotioato de potasio con 4-clorobencensulfonotioato de potasio, el compuesto 45b se sintetizó por un método análogo al descrito para el compuesto 45a. (ESI +ve): cale (M+H)+: 324.03, 322.04, encontrado: 324.22, 322.20 (patrón de isotipo 37C1, 35C1).
Compuesto 47a: Reemplazando clorhidrato de 4—(2— cloroetil)moríolina con bromhidrato de 4-(2-bromooetil)-A7-metilpiperazina (compuesto 46), el compuesto 47a se sintetizó por un método análogo al descrito para el compuesto 45a. MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 315.12, encontrado: 315.07.
Compuesto 47b: Reemplazando clorhidrato de 4-(2-cloroetil )morfolina con bromhidrato de 4-(2-bromooetil) -N-metilpiperazina y 4-metilbencensulfonotioato de potasio con 4-clorobencensulfonotioato de potasio, el compuesto 47b se sintetizó por un método análogo al descrito para el compuesto 45a.
Síntesis del Compuesto 50 Compuesto 49: Una mezcla del compuesto 48, (500 mg, 1.894 mmol) y metansulfonotioato de sodio (534 mg, 3.98 m ol) se disolvió en acetona (10 mi) y se agitó a t.a., por 4 h. La TLC indicó una reacción completa. El solvente se removió, después la mezcla se dividió por adición de agua y DCM. En la extracción, la capa orgánica se separó, después se secó (MgSCL), se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna proporcionó el producto puro como un sólido incoloro (0.60 g, 97%). XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.47 (dd, J = 5.5, 3.5 Hz, 2H), 7.38 (dd, J = 5.5, 3.5 Hz, 2H), 4.55 (s, 4H), 3.13 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 133.41, 131.75, 129.51, 51.02, 37.09; MS (ESI +ve): cale (M+NH4)+: 344.01, encontrado: 344.01; Rf = 0.5 (1:1 EtOAc/hexano).
Compuesto 50: Una solución DCM (2 mL) del compuesto 4, (180 mg, 1.225 mmol) se agregó por goteo mediante una jeringa a una solución agitada del compuesto 49 (400 mg, 1.225 mmol) en DCM (20 mL) a t.a. Después de 0.5 h, la mezcla se dividió por adición de NaHCO3. En la extracción, la capa orgánica se separó después se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna dio el producto (170 mg, 35%) como un aceite incoloro.1H NMR (399 MHz, CDC13) d 7.43 - 7.39 (m, 1H), 7.35 - 7.27 (m, 3H), 4.54 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.67 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.05 (s, 3H), 2.58 - 2.50 (m, 4H), 2.38 (t, J = 4.6 Hz, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 136.09, 133.20, 131.87, 131.21, 128.86, 28.54, 66.95, 57.95, 53.52, 51.04, 40.81, 38.18, 35.82; MS (ESI +ve) : cale (M+H) : 394.06, encontrado: 394.23; Rf = 0.5 (EtOAc) .
Síntesis del Compuesto 55 Compuesto 54: Se agregó bromo (0.246 i, 4.78 ol) en DCM (50 mL) en una forma de goteo durante 0.5 h a una mezcla agitada de 4-nitrobencensulfinato de sodio (2 g, 9.56 mmol) y disulfuro de 2-hidroxietilo (0.585 mi, 4.78 mmol) en DCM (50 mL) a t.a. Después de 2 h a t.a., la mezcla se filtró para remdurante la sal. El solvente se removió después la purificación en columna por cromatografía en columna dio el producto (2.1 g, 83%) como un aceite incoloro. Rf = 0.4 (1:1 EA/hexano .1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 8.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.13 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.89 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.23 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.02 - 1.94 (s, br, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 149.73, 128.40, 124.82, 60.94, 39.28.
Compuesto 55: El Compuesto 51 (1 g, 3.07 mmol) en DCM (50 mL) se trató por goteo con dicloruro de oxalilo (0.527 mi, 6.15 mmol) y se agitó a t.a. Durante la reacción se formó una solución homogénea incolora. Después de lh a t.a., el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo blanco (cloruro del ácido crudo, compuesto 52) se disolvió nuevamente en DCM (20 mL) y se agregó a una solución agitada del compuesto 54 (0.48 g, 3.1 mmol) en piridina (20 mL). Después de 18 h, se juzgó que la reacción se completó. Los solventes se removieron. El residuo se disolvió nuevamente en tolueno y se dividió con agua. Los extractos de tolueno se recolectaron, se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La cromatografía en columna proporcionó el compuesto 55 puro (0.86 g, 60%) como un sólido incoloro.1H NMR (399 MHz, CDCI3) d 8.31 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.7 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.32 (dt, J = 7.5, 1.2 Hz, 2H), 5.22 (s, br, 1H), 4.34 (s, br, 4H), 4.19 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.23 (t, 6.0 Hz, 2H), 4.17 (s, br, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 173.91, 155.10, 150.60, 149.53, 143.85, 141.42, 128.27, 128.20, 127.91, 127.22, 127.18, 125.12, 124.84, 120.17, 66.81, 62.60, 56.40, 47.25, 34.76, 25.37; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 571.11, encontrado: 571.00; Rf = 0.5 (EtOAc).
Síntesis del Compuesto 59 Compuesto 57: El Compuesto 57 se preparó del compuesto 56 (1 m ol) por reacción con 1.5 eq de Fmoc-OSu en piridina a t.a., por 18 h. El desarrolló acuoso después la cromatografía en columna proporcionó el compuesto 57 puro.
Compuesto 59: El Compuesto 59 se preparó del compuesto 57 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 55.
Sintesis del Compuesto 63 .
Compuesto 61: El Compuesto 61 se preparó del compuesto 60 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 57.
Compuesto 63: El Compuesto 63 se preparó del compuesto 61 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 55.
Síntesis del Compuesto 69 Comp t7 -t- LOA Morfolina f/vN'^ /*v O’^ (xiv) >—CO;>Et B ' CQjEí * 64 0.5 66 Compuesto 65: Se agregó isobutirato de etilo, (11.6 g, 100 iranol) durante 0.5 h a una solución enfriada (-78°C) de LDA en THF (53 mL, 2M). La mezcla anaranjada después se calentó a 0°C brevemente antes de ser enfriada nuevamente a -78°C. Después se agregó 1,2-dibromoetano (20 g, 106 mmol) durante 0.5 h a la solución la cual se calentó gradualmente a t.a. y se agitó durante la noche. La mezcla resultante se dividió por adición de agua y EA. En la extracción en EA y lavado con salmuera, la capa orgánica se separó después se secó (MgSO4), se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna dio el producto puro como un aceite incoloro (6.0 g, 25%). XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 4.15 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.16 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.22 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 176.78, 60.83, 43.83, 42.89, 28.45, 25.20, 14.32; Rf = 0.5 (5% EtOAc/hexano).
Compuesto 66: Una mezcla del compuesto 65 (3.4 g, 15.24 mmol) y morfolina (13.28 g, 152 mmol) en THF (20 ml) se calentó a 50°C en una botella de virdio a presión durante 72 h. Se observó que se formó un precipitado blanco. La mezcla se separó entre agua y EA. Los extractos E? se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La cromatografía en columna dio el producto como un líquido incoloro (3.5 g, 100%). XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 4.11 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.67 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 2.41 (t, br, J = 4.0 Hz, 4H), 2.30 - 2.26 (m, 2H), 1.74 - 1.70 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.17 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 177.69, 67.11, 55.15, 54.02, 41.10, 37.04, 25.49, 14.35; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 230.18, encontrado: 230.33; Rf = 0.5 (5% EtOAc/hexano) .
Compuesto 67: El Compuesto 66 (120 mg, 0.523 mmol) e hidróxido de sodio (120 mg, 3.00 mmol) se agitaron juntos en 1:1 Et0H/H2O (10 mL). Después de 36 h, el pH de la solución se ajustó a ca.2 por adición de HCl c., después se agregó NEt3 hasta que el pH reached ca.10. Se agregó Si02 (2 g) y los solventes/agua se evaporaron. La cromatografía en columna con carga en seco (MeOH/DCM, con 2% de NEt3 en el DCM), dio el producto como una (aprox 1/3 mol eq) sal HNEt3 parcial. El rendimiento ajustado fue 103 mg, 84%.1R NMR (399 MHz, CDC13 más 3 gotas de DMSO-d6) d 3.62 (t, J = 4.7 Hz, 4H), 2.51 - 2.46 (br, 4H), 2.40 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.62 (J = 7.1 Hz, 2H), 1.08 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 179.91, 65.91, 54.29, 52.87, 45.44, 41.37, 35.09, 25.93, 8.56; MS (ESI -ve): cale (M-H)~: 200.13, encontrado: 200.16; Rf = 0.5 (2% NEt3/10% MeOH/DCM).
Compuesto 69a: Una suspensión del compuesto 67 (11 g, 54.9 rnmol) en DCM (200 L) se trató con cloruro de oxalilo (9.42 mi, 110 iranol) y se agitó a t.a. Durante la reacción, se formó una solución homogénea incolora. Después de lh a t.a., el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo amarillo se suspendió en una mezcla de DCM (200 mL) y Py (100 mL) después se agregó S-2-hidroxietilo del compuesto 54 (15.91 g, 60.4 mmol) (DB-7-5) todo a la vez y la reacción se monitoreó por HPLC/MS. Después de 18 h, se juzgó por MS y TLC que la reacción es virtualmente completa. Los solventes se removieron, después el residuo se disolvió nuevamente en DCM/bicarbonato . Los orgánicos combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y redujeron. La purificación por cromatografía en columna dio 12.5 g, 51% del compuesto 69a como un aceite amarillo el cual se cristalizó en reposo.1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 8.41 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.13 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.27 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.28 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.40 (s, br, 4H), 2.27 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.71 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.14 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 177.11, 150.71, 149.69, 128.34, 124.92, 66.96, 61.66, 54.95, 53.92, 41.25, 46.81, 35.11, 25.36; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 447.12, encontrado: 446.98.
Compuesto 69b: Una suspensión del compuesto 67 (128 g, 0.636 mmol) en DCM (12 mL) se trató por goteo con cloruro de oxalilo (545 ml, 6.36 mmol) y se agitó a t.a. Durante la reacción se formó una solución homogenea incolora la cual desarrolló pronto un precipitado incoloro. La HPLC/MS indicó buena conversión para cloruro del ácido (compuesto 68) como se muestra por conversión a la N-propil amida. El solvente se removió bajo presión reducida. El residuo blanco se enfrió en un baño de hielo y se trató con una solución DCM (12 mL) de metansulfonotioato de S-2-hidroxietilo (compuesto 54) (99 mg, 0.636 mmol), seguido por adición por goteo de Base de Hunig (0.34 g, 2.6 mmol, 4 eg) con agitación. Después de 1.5 h, la solución se lavó con NaHCO3 diluido (ac). Los extractos combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La cromatografía en columna dio el producto como un aceite incoloro (84 mg, 39%).1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 4.40 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.44 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.39 (s, 3H), 2.47 - 2.43 (br, 4H), 2.32 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.77 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.64 - 1.58 (br, 4H), 1.22 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 177.30, 67.08, 62.27, 55.03, 54.01, 51.07, 41.32, 36.99, 35.14, 25.44; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 340.13, encontrado: 340.27; Rf = 0.2 (EtOAc).
Sintesis del Compuesto 73 - Compuesto 70: El Compuesto 70 se preparó por reacción de N-metil piperazina con el compuesto 65 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 66. XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 4.10 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.3 - 2.6 (br, 8H), 2.28 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.26 (s, 3H), 1.72 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.15 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 177.71, 60.44, 55.27, 54.64, 53.50, 46.18, 41.15, 37.36, 25.47, 14.34; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 243.20, encontrado: 243.31.
Compuesto 71: El Compuesto 71 se preparó por hidrólisis del compuesto 70 usando un procedimiento análogo a aquel descrito para el compuesto 67. XH NMR (399 MHz, CDC13) d 12 - 10 (vbr, 1H), 3.2 - 2.2 (vbr, 8H), 2.44 (t, J = 8.0 Hz, 2H) , 2.36 (s, 3H), 1.71 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.17 (s, 6H), 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 181.36, 55.18, 53.51, 52.18, 44.31, 41.57, 37.19, 26.28; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 215.17, encontrado: 215.19.
El Compuesto 83: Se agregó bromo (2.58 mi, 50.0 m ol) en DCM (50 mL) en una forma de goteo durante 0.5 h a una mezcla agitada de bencensulfinato de sodio (16.4 g, 100 mmol) y disulfuro de 2-hidroxietilo (6.11 mi, 49.9 mmol) en DCM (50 L) a t.a. Despues de 2 h a t.a., la TLC mostró buena reacción (Rf = 0.4 (1:1 EA/hexano), asi la mezcla se filtró para remdurante la sal. El solvente se removió, después la cromatografía en columna dio el producto (17.4 g, 80%) como un aceite incoloro.
Compuesto 73: El Compuesto 71 (1.342 g, 6.29 mmol), en DCM (20 mL) se trató con cloruro de oxalilo (1.079 mi, 12.58 m ol) y se agitó a t.a. Durante la reacción se observó que se formó un precipitado amarillo pálido. Después de 0.5h a t.a., el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo amarillo pálido se suspendió en una mezcla de DCM (20 mL) y Py (20 mL), después se agregó el compuesto 83 (2.060 g, 9.44 mmol) todo a la vez. Después de 18 h, se juzgó por TLC que la reacción se completó. Los solventes se removieron después que el residuo se disolvió nuevamente en agua y se lavó con éter. La capa acuosa se redujo a un sólido marrón. Recristalización de EtOH en ebullición (10 L) dio una sal HCl ligeramente impura la cual después fue libre en base (NEt3 en DCM) a cargarla directamente el gel de sílice. La cromatografia en columna dio 0.95 g, 36% del compuesto 73 puro. 1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.68 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 1.7 Hz, 2H), 4.25 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.8 - 2.3 (vbr, 8H), 2.36 (s, 3H), 2.33 (t, 7.7 Hz, 2H), 1.74 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.16 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 177.13, 144.68, 134.09, 129.59, 127.09, 61.99, 54.86, 54.35, 52.84, 45.95, 45.71, 41.26, 37.05, 34.66, 25.39; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 415.17, encontrado: 415.09.
Síntesis del Compuesto 76 Compuesto 75: El Compuesto 74 se convirtió al compuesto 75 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 2.3H NMR (500 MHz, CDCl3) d 6.49 - 6.41 (br, d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.91 (dt, J = 6.3, 2.7 Hz, 1H), 4.59 (ddd, J = 31.4, 10.6, 3.0 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 2.09 (s, 3H); 170.27, 169.05, 68.90, 53.33, 52.03, 37.63, 23.16; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 240.06, encontrado: 240.24.
Compuesto 76: El Compuesto 75 se convirtió al compuesto 76 por un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 3.1H NMR (500 MHz, CDCI3) d 6.56 - 6.40 (br, d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.93 (q, J = 5.9 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 43.74 (dd, J = 14.6, 4.8 Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 14.6, 5.6 Hz, 1H), 3.38 (s, 3H), 2.07 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 170.44, 170.19, 53.23, 52.02, 50.73, 37.77, 23.12; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 256.03, encontrado: 256.21.
Síntesis del Compuesto 78 Una mezcla del compuesto 77, (2.49 mi, 32.8 mmol), y metansulfonotioato de sodio (4.4 g, 32.8 mmol) se agitó en acetona (80 mi) durante 6h. La acetona se removió por evaporación rotatoria y la mezcla se trituró con DCM. Después de la filtración, se removió DCM por evaporación (5 g rendimiento crudo) y la mezcla se sometió a purificación por cromatografía en columna. El rendimiento del compuesto 78 puro fue 2.8 g, 55%, aceite incoloro, Rf = 0.3 (20% EA/hexano). XH NMR (500 MHz, CDCl3) d 5.30 (s, 2H), 3.48 (s, 3H), 3.38 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 80.07, 57.40, 22.71.
Síntesis del Compuesto 80 Una solución enfriada con hielo del compuesto 79 (5 g, 65.7 mmol) y trietilamina (11 mi, 79 ol) en DCM (150 mL) se trató con cloruro de metansulfonílo (5.59 mi, 72.3 mmol) durante 2 min. Después de 1 h, la reacción se juzgó estar completa por TLC. Se agregó agua y los extractos orgánicos se lavaron secuencialmente con HCl diluido, bicarbonato de sodio saturado, salmuera, después se secó (MgSO4), se filtró y redujó. El producto mesilato (9.4 g, 61 mmol, 96%) se recuperó en acetona (200 i), después la sal de potasio del ácido de toluen tiosufínico (61 mmol) se agregó y la solución se agitó a 50°C durante 18 h. Se observó que se formó un precipitado blanco espeso. La mezcla se filtró, se redujo a un aceite después se extrajo en DCM/agua. Los extractos orgánicos se secaron (MgS04), se filtraron y redujeron. La cromatografía en columna dio el compuesto 80 puro como un aceite incoloro, el cual se cristalizó en reposo Rf = 0.3 (20% EA/hexano) Síntesis del Compuesto 82 Una mezcla de clorhidrato de 2-cloro-N,N-dimetiletanamina (10 g, 69.4 mmol), yoduro de sodio (1.041 g, 6.94 mmol) y 4-metilbencensulfonotioato de potasio (18.86 g, 83 mmol) se agitó en MeOH (50 i) y se calentó a 60°C durante 72 h. El desarrolló acuoso después de la cromatografía en columna dio compuesto 82 puro (8.5 g, 47%) como un aceite incoloro.
NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.33 (dd, J = 8.4, 0.6 Hz, 2H), 3.09 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.53 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.17 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 144.76, 142.03, 129.92, 127.18, 57.51, 45.14, 34.29, 21.77; MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 260.07, encontrado: 260.16.
Síntesis del Compuesto 85 Se colocó metansulfonato de sodio (11.5 g, 86 mmol) en un matraz de un cuello de 50 mi seco. Se agregó 30 mL de DMF anhidro (Aldrich) usando una jeringa de vidrio seca. Se agregó 5 mL de 3-bromopropionitrilo (compuesto 84) (8.2 g, 61.2 inmol) usando una jeringa de vidrio seca. El matraz de reacción se cerró bajo argón, se selló y se agitó por 24 h a 50°C. La reacción se monitoreó usando TLC (sistema: hexanos/acetato de etilo - 5:5 - v/v). La mezcla de reacción se diluyó con 100 mL de acetato de etilo y se lavó 5 veces con agua (5 * 100 mL). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y evaporaron a sequedad. El residuo se disolvió en 5 mL de diclorometano y se purificó por cromatografía en gel de sílice (CombiFlash) usando un gradiente lineal de acetato de etilo en hexanos. El compuesto 85 puro (7.2 g, 52%) se obtuvo como un aceite incoloro.1H-NMR (CDCl3, 399 MHz). d 3.43 (s, 3H), 3.41 (t, 2H, J = 2.5 Hz), 2.93 (t, 2H, J = 2.5 Hz); 13C-NMR (CDC13, 100 MHz) d 117.7, 51.2, 31.7, 19.6.
Sintesis del Compuesto 87 Compuesto 87: El Compuesto 86 (1.11 mL, 12.5 m ol) y 4-nitrobencensulfinato de sodio (5.23 g, 25.0 mmol) se agregaron en DCM (12.5 mL) para dar una suspensión blanca. Se agregó dibromo (0.64 mi, 12.5 mmol) a la solución agitada. La solución se agitó por 30 min a t.a., y se filtró para remover la sal, después lo filtrado se evaporó bajo presión reducida. El producto crudo se agregó a una columna en gel de sílice y se eluyó con hexano- EtOAc para dar el compuesto 87 puro (4.80 g, 20.6 mmol, 82% de rendimiento).1H NMR (399 MHz, CDCI3) d 8.44 - 8.40 (m, 2H), 8.15 - 8.10 (m, 2H), 2.58 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d 149.00, 128.54, 124.87, 94.61, 18.55; Rf= 0.60 (1:1 EtOAc/hexano).
Sintesis del Compuesto 90 ' Compuesto 89: En un matraz de fondo redondo de 11, se disolvió N-(2-mercaptoetil)acetamida, 88 (11.92 g, 100 mmol) en EtOAc (300 mL) para dar una solución incolora. Se agregaron yoduro de sodio (0.150 g, 1.000 mmol) y 30% de peróxido de hidrógeno (3.40 g, 100 mmol) en H2O (11.3 mL) a la solución la cual se agitó por 45 min a t.a. Se agregó Na2S2C>3 aaturado a la solución. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 300 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron por evaporación rotatoria. El producto crudo se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente MeOH/DCM para dar el compuesto 89 puro (4.94 g, 20.90 mmol, 41.8% de rendimiento), el cual se juzgo por TLC por ser suficientemente puro para uso directo en la siguiente etapa de la reacción. Rf = 0.35 (9:1 DCM/Metanol) Compuesto 90: En un matraz de fondo redondo de 100 compuesto 89 (2.364 g, 10.00 mmol) y 4- nitrobencensulfinato de sodio (4.18 g, 20 mmol) se disolvieron en CH2CI2 (20 mL) para dar una suspensión blanca. Se agregó dibromo (0.516 mi, 10.00 mmol) a la solución agitada. La solución se agitó por 30 min a t.a., y se filtró para remover la sal, después lo filtrado se evaporó bajo presión reducida. El producto crudo se agregó a una columna en gel de sílice y se eluyó con hexano-EtOAc para dar el compuesto 90 puro (2.37 g, 7.79 mmol, 39 % de rendimiento). XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 8.45 - 8.40 (m, 2H), 8.17 - 8.12 (m, 2H), 3.60 - 3.54 (dt, 2H), 3.21 - 3.16 (t, 2H), 2.00 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 130.35, 126.27, 66.97, 58.20, 53.67, 51.52, 36.22, 35.16, 33.67; Rf = 0.40 (EtOAc).
Síntesis del compuestos 93 y 94 Compuesto 92: En un matraz de fondo redondo de 250 mi, 4-clorobencensulfonotioato de sodio (14.5 g, 63.0 mmol) se disolvió en MeOH. Se agregaron Cis-1,4-dicloro-2-buteno, 91 (3.16 g, 30.0 mmol) y yoduro de sodio (450 mg, 3.0 mmol) a la solución agitada. La solución se agitó por 3 h a t.a., después se calentó a 50 °C. Después de la agitación por 18 h a 50 °C, los solventes se removieron bajo presión reducida. El material crudo resultante se diluyó con DCM (300 mL) y se lavó con agua (1 * 100 mL). La capa acuosa se extrajo con DCM (1 x 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente EtOAc/hexano para dar compuesto 92 (5.99 g, 12.8 mmol, 43 % de rendimiento). 1H NMR (399 MHz, CDCI3) d 7.87- 7.84 (m, 4H), 7.56-7.51 (m, 4H), 5.56-5.50 (m, 2H), 3.72-3.68 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)130.35, 126.27, 66.97, 58.20, 53.67, 51.52, 36.22, 35.16, 33.67; Rf = 0.35 (1:3 EtOAc/hexano) .
Compuesto 93: En un matraz de fondo redondo de 100 mi, el compuesto 92 (3.09 g, 6.58 mmol) se disolvió en THF a 0 °C. Se agregaron trietilamina (459 ¡iL, 3.29 mmol) y 2-metil-2-propanetiol (742 mL, 6.58 mmol) a la solución agitada a 0 °C. La solución se agitó por 20 min a 0 °C, después se agregó trietilamina (230 pL, 1.65 mmol) a la solución agitada a 0 °C. Después de la agitación por 40 min a 0 °C, los solventes se removieron bajo presión reducida. Lo resultante se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente EtOAc/hexano para dar compuesto 93 (1.77 g, 4.62 mmol, 70 % de rendimiento). 1H NMR (399 MHz, CDC13) d 7.90 - 7.85 (m, 2H), 7.56 - 7.52 (m, 2H), 5.73 - 5.65 (m, 1H), 5.55 5.48 (m, 1H), 3.78 3.75 (d, 2H), 3.36 3.32 (d, 2H), 1.32 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d 143.54, 140.60, 130.90, 129.83, 128.66, 124.56, 48.29, 37.05, 33.35, 30.16; R/= 0.60 (1:3 EtOAc/hexano).
Compuesto 94: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para el compuesto 93, y sustituyendo 2-propanetiol por 2-metil-2-propanetiol, el compuesto 94 puro se obtuvo (1.13 g, 3.06 mmol, 72 % de rendimiento). 1H NMR (399 MHz, CDC13) d 7.90 - 7.82 (m, 2H), 7.56 - 7.48 (m, 2H), 5.72 - 5.64 (m, 1H), 5.57 - 5.47 (, 1H), 3.79 - 3.72 (d, 2H), 3.33 - 3.26 (d, 2H), 3.61 - 2.92 (m, 1H), 1.27 (d, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 143.28, 140.36, 131.37, 125.63, 124.55, 124.56, 41.32, 38.02, 35.81, 33.08, 22.54; Rf = 0.55 (1:3 EtOAc/hexano).
Sintesis del Compuesto 96 ¡ , Compuesto 96: Los compuestos 9 (1.81 g, 5.50 mmol) y 54 (2.17 g, 8.25 mmol) se combinaron y se secaron por co evaporación con tolueno anhidro (3 c 2 mL). La mezcla se disolvió en 1,2-dicloroetano seco (16.5 mL) . Tamices moleculares 4 Á se agregaron a la solución y la mezcla se agitó 30 min a t.a. Se agregó trimetilsililtriflato (497 pL, 2.75 mmol) a la solución agitada. La solución se agitó por 9 h a t.a., después se agregó 54 adicional (0.723 g, 2.75 mmol) a la solución agitada. Después de la agitación 16 h a t.a., la solución se diluyó con DCM (100 mL) y se lavó con NaHCO3 saturado (1 c 100 mL). La capa acuosa se extrajo con DCM (1 c 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2S04, se filtraron y se concentraron por evaporación rotatoria. Lo crudo resultante se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente EtOAc/hexano para dar el compuesto 96 (2.21 g, 3.73 mmol, 68 % de rendimiento).1H NMR (399 MHz, CDCI3) d 8.42 - 8.36 (d, 2H), 8.128.06 (d, 2H), 6.07 - 6.00 (d, 1H), 5.33 - 5.30 (d, 1H), 5.23 - 5.15 (dd, 1H), 4.69 -4.63 (d, 1H), 4.15 - 4.04 (m, 3H), 4.04-3.87 (m, 2H), 3.84- 3.73 (m, 1H), 3.22-3.12 (t, 2H), 2.12-1.92 (m, 12H); 13C NMR ( 100 MHz , CDC13) 179. 95 , 170.74 , 170. 48 , 150. 77 , 149. 59 128.47, 125.03, 101.40, 71.08, 70.02, 67.39, 66.92, 61.76 51. 12 , 36. 51 , 23. 72 , 20. 92 ; Rf = 0. 25 ( 1 : 9 MeOH/DCM) .
Síntesis del Compuesto 100 . .0 del compuesto 97 (4.87 g, 22.0 mmol) en piridina seca (70 mL) se trató con anhídrido de fenoxiacético (37.8 g, 132.0 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (26.9 mg, 220 ¡mol) . Después de la agitación a t.a., por 12 h, la mezcl se concentró y co evaporó con tolueno in vacuo. Lo resultante se diluyó por DCM (400 mL) y se lavó con NaHCO3 saturado (1 c 400 mL). En la extracción, la capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró in vacuo. Lo resultante se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente EtOAc/hexano para dar el compuesto puro 98 (16.7 g, 22.0 mmol, 100 % de rendimiento). CH NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.36 -6.75 (m, 20H), 6.27 - 6.20 (d, 1H), 5.43 - 5.36 (m, 1H), 5.22 - 5.06 (m, 2H), 4.81 - 4.65 (m, 3H), 4.60 - 4.52 (m, 2H), 4.45 - 4.29 (m, 2H), 4.17 - 4.02 (m, 2H), 3.97 - 3.87 (m, 1H) , 1.85 y 1.74 (d, 3H, rotamers); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 170.20, 168.78, 168.70, 168.36, 167.52, 157.56, 157.48, 157.40, 130.09, 129.70, 129.66, 129.60, 122.32, 122.01, 121.94, 114.61, 114.58, 114.58, 114.39, 91.93, 68.37, 68.25, 67.30, 64.54, 61.25, 46.43, 22.95; Rf = 0.35 (1:1 EtOAc/hexano).
Compuesto 99: El Compuesto 98 (15.15 g, 20.0 mmol) se disolvió en CICH2CH2CI (40 mL) y se agregó trifluorometansulfonato de trimetilsililo (5.43 mL, 30.0 mmol) a la solución agitada a t.a., la solución se agitó por 24 h a 50 °C, se agregó trietilamina (12.6 mL, 90.0 mmol) y la mezcla se concentró in vacuo. Lo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (EtOAc (2.5% Et3N)-hexano) para dar el compuesto 99 ligeramente impuro que contiene cantidades pequeñas de ácido fenoxiacético. Este material se usó en la siguiente etapa del esquema de reacción sin purificación adicional.
Compuesto 100: El Compuesto 99 (3.63 g, 6 mmol) y S-2-hidroxietil-4-nitrobenzenesulfonotioato, 54 (2.76 g, 10.5 mmol) se disolvieron en C1CH2CH2C1 (18 mL) para dar una solución incolora. Tamices moleculares 4Á se agregaron a la solución agitada a t.a., la solución se agitó a t.a., por 30 min después se agregó trifluorometansulfonato de trimetilsililo (0.543 mi, 3.00 mmol). La mezcla se agitó a t.a., por 24 h y la TLC mostró aproximadamente 90% de reacción completada. Se agregó 54 (237.0 mg, 0.90 mmol) adicional a la mezcla y se agitó por 36 h adicionales para completar la reacción. La mezcla se diluyó con DCM (100 mL) y se lavó con NaHCQ3 saturado (1 c 100 mL). La capa acuosa se etrajo nuevamente con CH2Cl2 (1 x 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron, se concentraron y se disolvieron en 120 mL de Ac20-piridina (1:9, v/v). La mezcla se agitó por 12 h, después se concentró bajo presión reducida. Lo resultante se diluyó con CH2C12 (100 mL) y se lavó con NaHCO3 saturado (1 c 100 mL). La capa acuosa se extrajo nuevamente con CH2C12 (1 c 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2S04, se filtraron y se concentraron. Lo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (gradiente EtOAc-hexano) para dar el compuesto puro 100 (2.56 g, 2.94 mmol, 49.0 % de rendimiento). 1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 8.70 - 8 . 62 (d, 2H) , 8.41 - 8.33 (d, 2H), 7.65 - 7.03 (m, 15H), 6.35 - 6.27 (d, 1H), 5.81 - 5.72 (m, 2H), 5.06 - 4.97 (m, 3H), 4.92 - 4.85 (m, 2H), 4.83 - 4.62 (m, 2H), 4.58 - 4.44 (m, 2H), 4.34 - 4.26 (m, 2H), 4.26 - 4.15 (m, 1H), 4.06 - 3.95 (m, 1H), 3.51 - 3.40 (m, 2H), 2.22 y 2.18 (d, 3H, rotamers); 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 171.17, 169.13, 169.05, 168.92, 157.86, 157.80, 157.76, 150.82, 149.63, 130.01, 129.96, 128.47, 125.06, 122.27, 122.23, 114.93, 114.74, 100.86, 70.64, 70.54, 65.36, 64.90, 62.21, 51.30, 36.54, 23.74; Rf = 0.60 (1:1 EtOAc/hexano) .
Síntesis del Compuesto 104 Compuesto 102: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para el compuesto 98, y sustituyendo el compuesto 101 por el compuesto 97, se obtuvo el compuesto puro 102.
Compuesto 103 Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para el compuesto 99, y sustituyendo el compuesto 102 por el compuesto 98, se obtuvo el compuesto puro 103.
Compuesto 104 Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para el compuesto 100, y sustituyendo el compuesto 103 por el compuesto 99, se obtuvo el compuesto puro 103.
Síntesis del compuestos 109 y 111 - — ; , , ; - | ^~^ , , ‘ Compuesto 106: Una solución del compuesto 105 (100 mmol) en 1,2-dicloroetano seco (300 mL) se trató por goteo mediante una jeringa con TiCl4 (110 mmol) durante 2 min. Después de someterlo a reflujo por 16 h, la TLC mostró la reacción completa. Lo crudo se diluyó con DCM y se lavó con NaHCCó saturado. Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron, se concentraron y usaron por la siguiente reacción sin purificación adicional.
Compuesto 107: Tiourea (150 mmol) y el compuesto 106 (100 mmol) se disolvieron en acetona (200 mL) bajo Ar. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y se agitó. Después de 2 h, un precipitado sólido blanco se removió por filtración. Lo precipitado se recristalizó. Los cristales filtrados y Na2S205 (140 mmol) se agregaron a una mezcla agitada de DCM (500 mL) y H2O (250 mL). La mezcla de reacción se calentó a reflujo bajo Ar. Después de 3 h, la mezcla de reacción se enfrió a t.a. y las fases se separaron. La capa acuosa se extrajo nuevamente con DCM. Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron para dar compuesto 107.
Compuesto 108: l-Bromo-2-cloroetano (100 mmol), trietilamina (200 mmol) y el compuesto 107 (100 mmol) se disolvieron en acetonitrilo (200 L) bajo Ar. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y se agitó. La TLC mostró la reacción completa. La mezcla se diluyó con DCM (500 mL) y se lavó con NaHCC>3 (250 mL). La capa orgánica se secó con Na2S04, se filtró, se concentró y se purificó para dar compuesto 108.
Compuesto 109: El compuesto 112 (120 mmol), yoduro de sodio (10.0 mmol) y el compuesto 108 (100 mmol) se disolvieron en MeOH (200 mL) bajo Ar. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y se agitó. La TLC mostró la reacción completa. La mezcla se diluyó con DCM (500 mL) y se lavó con NaHCO3 (250 mL). La capa orgánica se secó con Na2S04, se filtró, se concentró y se purificó para dar compuesto 109.
Compuesto 110: l-Bromo-4-cloro-2,3-cis-buteno (100 mmol), trietilamina (200 mol) y el compuesto 107 (100 mmol) se disolvieron en acetonitrilo (200 mL) bajo Ar. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C. La TLC mostró que la reacción se completó. La mezcla se diluyó con DCM (500 mL) y se lavó con NaHCCh (250 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró y se purificó para dar compuesto 110.
Compuesto 111: El compuesto 112 (120 mmol), yoduro de sodio (10.0 mmol) y el compuesto 110 (100 mmol) se disolvieron en MeOH (200 mL) bajo Ar. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C. La TLC mostró la reacción completa. La mezcla se diluyó con DCM (500 mL) y se lavó con NaHCO3 (250 mL) . La capa orgánica se secó con Na2S04, se filtró, se concentró y se purificó para dar compuesto 111.
Síntesis del compuesto 115 Compuesto 113: 2-Clorosulfonilacetonitrilo (113) se preparó siguiendo el procedimiento de Sammes (como se describió en la patente GB1252903).
Compuesto 114: Monohidrato sulfuro de sodio (65 mmol) se recuperó en 100 mL de agua. El matraz se mantuvo en un baño de agua. El Compuesto 113 (50 mmol) se agregó por goteo a la solución mientras se agita y calentamiento suave del baño de agua. Se observó aparecer azufre y después desaparecer en el matraz. El solvente se evaporó bajo vacio y el residuo se recristalizó de etanol. Cianometansulfonotioato de sodio (compuesto 114) es asi obtenido como un sólido cristalino incoloro.
Compuesto 115: El Compuesto 114 (13.69 g, 86 mmol) se recuperó, con agitación, en DMF anhidro (30 mL) en un matraz de fondo redondo de 100 mi. Después, se agregó 3-bromopropionitrilo (5 mL, 8.2 g, 61.2 mmol) y la mezcla resultante se agitó por 18 h a 50 °C con monitoreo por TLC. E consimiAl finalizar la reacción (se consumió completamente 3-bromopropionitrilo) , la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 mL) y la capa orgánica se lavó con 5 * 20 mL H2O. La capa orgánica separada después se secó (MgSO4), se filtró y se redujo a un aceite por evaporación rotatoria, el aceite crudo se purificó por cromatografía en columna usando un gradiente EtOAc/hexano y las fracciones que contienen material puro se recolectaron y el solvente se removió por evaporación rotatoria después de secado adicional in vacuo para proporcionar el compuesto puro 115 como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 118 Compuesto 116: El Compuesto 51 (2.9 g, 8.91 mmol) en DCM (50 mL) se trató por goteo con dicloruro de oxalilo (0.53 mi, 6.15 mmol) después DMF (10 pL) y se agitó a t.a. Durante la reacción se formó una solución homogénea incolora. Después de 2 h a t.a., el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo blanco se disolvió nuevamente en DCM (20 mL), después se agregó por goteo a piridina agitada (10 mL) solución de etano-1,2-ditiol (8.40 g, 89 mmol), con monitoreo por UPLC/MS. Después de 18 h, se juzgó que la reacción se completó. Los solventes se removieron y el etanotiol restante se removió por destilación trampa con trampa, después el residuo se sometió a purificación por cromatografía en columna con DCM para proporcionar el compuesto puro 116 como un sólido incoloro. Rendimiento fue 1.82 g, 51 %. MS (ESI +): cale (M+Na)+: 424.10, encontrado: 424.06. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.79 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 7.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 5.40 - 5.15 (br, 1H), 4.60 - 4.35 (br, 2H), 4.31 - 4.19 (m, 1H), 3.15 - 3.04 (br, 2H), 2.95 - 2.80 (m, 1H), 2.75 - 2.60 (br, 2H), 1.72 - 1.43 (m, 6H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 203.14, 154.75, 143.92, 141.49, 127.84, 127.19, 125.17, 120.13, 66.81, 62.69, 47.41, 33.01, 25.78, 24.60.
Compuesto 117: A una solución agitada del compuesto 116 (1.7 g, 4.23 mmol) en EtOAc (12 mL) se agregó yoduro de sodio (6.35 mg, 0.042 mmol) y peróxido de hidrógeno (0.144 g, 4.23 mmol) (0.45 L a 30% de solución acuosa) y la mezcla se agitó a t.a., por 15 min. La TLC mostró consumo completo del material de partida. Se agregó tiosulfato de sodio acuoso hasta que la solución llegó a ser incolora. La solución se lavó con agua, se secó (MgSO4), después la cromatografía en columna (EtOAc/hexano), dio compuesto puro 117 como una espuma sólida incolora (1.45 g, 86%). MS (ESI +): cale (M+H)+: 802.07, encontrado: 802.08.1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.78 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.63 (d, J = 5.8 Hz, 4H), 7.42 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 5.42 - 5.25 (br, 2H) , 4.55 - 4.35 (br, 4H), 4.30 - 4.18 (br, 2H), 3.25 - 3.10 (br, 4H), 2.95 - 2.70 (br, 4H), 1.65 - 1.45 (br, 12H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 203.19, 154.71, 143.90, 141.45, 127.80, 127.17, 125.16, 120.10, 66.76, 62.65, 47.37, 37.90, 28.56, 25.73.
Compuesto 118: Se agregó dibromo (0.091 mi, 1.77 mmol) en una forma de goteo durante 2 min a una mezcla agitada de 4-nitrobencensulfinato de sodio (0.742 g, 3.55 mmol) y el compuesto 117 (1.42 g, 1.773 mmol) en DCM (10 mL) a t.a. Después de 30 min con agitación a t.a., la mezcla se filtró y lo filtrado se redujo a una espuma sólida anaranjada in vacuo. La cromatografía en columna (DCM/hexano) dio el compuesto puro 118 (1.26 g, 60 %) como una espuma sólida amarillo pálido. MS (ESI +): cale (M+H)+: 587.71, encontrado: 802.08.
NMR (500 MHz, CDCl3) d 8.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.14 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.63 (s, 2H), 7.43 (t, J= 6.7 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.35 - 5.15 (br, 1H), 4.55 - 4.35 (br, 2H), 4.30 - 4.20 (br, 1H), 3.30 - 3.00 (br, 4H), 1.70 - 1.25 (br, 6H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 202.71, 154.66, 150.60, 149.63, 143.78, 141.46, 128.40, 127.91, 127.21, 125.12, 124.81, 120.18, 66.86, 62.59, 47.35, 35.84, 28.42, 25.61.
Síntesis del compuesto 120 Compuesto 120: El compuesto comercialmente disponible 119 (1 g, 7.04 mmol) y 4-metilbencensulfonotioato de potasio (1.753 g, 7.75 mmol) se agitaron en MeOH (10 mL) durante 5 días a t.a., después a 40 °C durante 24 h. La TLC mostró buena conversión para el producto. El MeOH se evaporó y el residuo se recuperó en DCM (30 mL) y se agregó Boc20 (1.54 g, 7.04 mmol). La mezcla se trató con trietilamina (1.030 i, 7.39 mmol) en una forma de goteo durante 10 min a t.a., hasta que la solución llegó a ser prácticamente homogénea. El lavado con agua (50 mL), secado (MgSO4), filtración y evaporación dio el producto crudo, el cual se purificó adicionalmente por cromatografía en columna para dar el compuesto puro 120 (1.64 g, 65 $ ;) como un sólido incoloro. MS (ESI + ) : cale (M+Na)+: 380.10, encontrado: 380.11. 1H NMR (399 MHz, CDC13) d 7.80 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (dd, J = 8.5, 0.8 Hz, 2H) , 5.54 (ddt, J = 24.7, 16.6, 7.9 Hz, 2H) , 4.65 (s, 1H) , 3.77 - 3.66 (m, 4H) , 2.45 (s , 3H) , 1.43 (s, 9H) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) d 155.83, 145.05, 142.06, 131.80, 130.01, 127.15, 124.55, 79.72, 37.29, 32.75, 28.51, 21.79.
Síntesis del conqpuesto 122 Compuesto 122: Una solución del compuesto comercialmente disponible 121 (1 g, 3.59 mmol) en agua (1 mL) se trató todo a la vez con una solución de hexafluorofosfato de potasio (0.662 g, 3.59 mmol) en agua (10 mL) y se agitó sacudiendola a t.a., por 5 min. Lo sólido resultante se recolectó por filtración, se lavó con 2 c 3mL agua y se secó in vacuo sobre KOH para dar el compuesto puro 122 como un sólido incoloro (1.01 g, 82 %). ¾ NMR (300 MHz, CD3CN) d 3.67 - 3.60 (m, 2H), 3.49 (s, 3H), 3.53 - 3.45 (m, 2H), 3.10 (s, 9H); 13C NMR (126 MHz, CD3CN) d 65.98, 54.05 (g, J = 4.1 Hz), 51.11, 28.99; 19F NMR (376 MHz, CD3CN) d -73.15 (d, J = 706.5 Hz); 31P NMR (162 MHz, CD3CN) d -143.50 (hept, J = 706.6 Hz).
Sintesis del compuesto 125 Compuesto 124: Una solución DMF (50 mL) del compuesto comercialmente disponible 123 (10 mmol) se trató sucesivamente con terc-butil-2-aminoacetato (22 mmol), di-isopropiletilamina (50 mmol) y HBTU (24 mmol). Después de 1 h de agitación a t.a., se agregó agua (100 mL) y la solución resultante se extrajo con EtOAc (2 * 50 mL) y se lavó con 5 % de NaHCO3 (2 c 25 mL) después salmuera diluida(2 c 25 mL), se secó (MgSO4), se filtró y se redujo por evaporación rotatoria. La purificación por cromatografía en columna proporciona el compuesto puro 124.
Compuesto 125: Se agregó dibromo (0.091 mi, 1.77 mmol) en una forma de goteo durante 2 min a una mezcla agitada de 4-nitrobencensulfinato de sodio (0.742 g, 3.55 mmol ) y di-terc-butil-2,21-((4,4'-disulfandiil bis (butanoil))bis(azandiil))diacetato (824 mg, 1.77 mmol) en DCM (10 mL) a t.a. Después de 30 min agitación a t.a., la mezcla se filtró y lo filtrado se redujo a una espuma sólida in vacuo. La cromatografía en columna dio el producto puro como una espuma sólida.
Sintesis del compuesto 129 Compuesto 127: Una solución de etano-1,2-ditiol (1.130 g, 12 mmol) en TFA (10 mL) se trató todo a la vez con el compuesto comercialmente disponible 126 (0.89 g, 9.99 mmol). La solución llegó a estar caliente. Después de 1 h deagitación a t.a., los volátiles se removieron y el residuo se sometió a cromatografía en columna para dar el compuesto puro 127 como un aceite incoloro (0.95 g, 48 %). Rf = 0.6 (5%MeOH/DCM); XH NMR (500 MHz, CDCl3) d 6.09 - 5.93 (br, 1H), 4.41 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.87 - 2.83 (m, 2H), 2.79 (ddd, J = 9.7, 7.3, 3.5 Hz, 2H), 2.04 (s, 3H), 1.71 (t, J = 8.0 Hz, 1H) ; 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 170.25, 40.89, 35.22, 24.91, 23.44.
Compuesto 129: Una solución caliente (35 °C) DMF (10 mL) del compuesto comercialmente disponible 128 (939 mg, 3.0 m ol) se trató en una forma de goteo durante 5 min con una solución DCM (5 mL) del compuesto 127 (250 mg, 1.513 mmol) . Después de verificación por TLC, los solventes se removieron por evaporación rotatoria bajo alto vacio, después el residuo se trituró con DCM (50 mL), se filtró, y lo filtrado se lavó con 5 c 5% de NaHCO3, después se secó (MgSO4), se filtró y se redujo a un sólido amarillo pálido. La cromatografía en columna dio el compuesto puro 129 como un sólido amarillo pálido. MS (ESI +): cale (M+H)+: 320.02, encontrado: 320.34; XH NMR (500 MHz, CDCl3) d 9.28 (dd, J = 2.7, 0.7 Hz, 1H), 8.43 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.9, 0.7 Hz, 1H), 6.10 - 5.90 (br, 1H), 4.41 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 3.13 (dd, J = 8.6, 6.3 Hz, 2H), 2.93 (dd, J = 8.6, 6.4 Hz, 2H), 2.00 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 170.18, 168.57, 145.22, 142.22, 131.81, 119.59, 40.65, 38.59, 30.07, 23.39.
Síntesis del compuesto 134 13 I Compuesto 130: El Compuesto 130 se preparó por un método previamente descrito (Heterociclos, Vol 54, p 139, 2001).
Compuesto 132: Usando un procedimiento análogo descrito previamente por la síntesis del compuesto 126 (Organic Syntheses, Coll. Vol.6, p.5 (1988)), el compuesto 131 (Tetrahedron Letters, 48 (39), 7038-7041; 2007) se conviertió al compuesto 132 por calentamiento suave en la presencia de una solución de formaldehido acuoso que contiene K2CO3.
Compuesto 133: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 127 y sustituyendo el compuesto 132 por el compuesto 126 y el compuesto 130 por etano-1,2-ditiol, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 133.
Compuesto 134: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 129 y sustituyendo el compuesto 133 por el compuesto 127, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 134.
Síntesis del compuesto 140 , _ , Compuesto 136: Una solución enfriada con hielo del compuesto comercialmente disponible 135 (50 g, 342 mmol), y metanol (277 mL) se trató por goteo con ácido sulfúrico (3.36 g, 34.2 mmol) durante 10 min, después se calentó a t.a. gradualmente durante la noche. La mayoría del solvente se removió por evaporación rotatoria, después NaHC03 acuoso saturado se agregó cuidadosamente. El pH de la solución se ajustó hasta 1.9 por adición de HCl 1M, después se extrajo en EtOAc (200 mL), se lavó con salmuera diluida (50 mL), se secó (MgSO4), se filtró y se redujo a 29 g de aceite incoloro. La cromatografía en columna dio el compuesto puro 136 como un sólido incoloro (12.5 g, 23 %).1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 12.5 - 10.5 (vbr, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.63 (s, 2H), 1.32 (s, 6H); 13C NMR (126 MHz, CDC13) d 183.32, 171.76, 51.72, 43.88, 40.60, 25.34.
Síntesis del compuesto 138: El Compuesto 136 (10 mmol) en DCM (50 mL) se trató por goteo con dicloruro de oxalilo (10 mmol) después DMF (10 pL) y se agitó a t.a. Durante la reacción se formó una solución homogénea incolora. Después de 2 h a t.a., el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo blanco se disolvió nuevamente en DCM (20 mL) después se agregó por goteo a piridina agitada (10 mL) una solución del compuesto 137 (10 mmol), con monitoreo por TLC. Después de 18 h, los solventes se removieron y el residuo se sometió a purificación por cromatografía en columna con DCM para proporcionar el compuesto puro 137.
Compuesto 139: El Compuesto 138 (5 mmol) como una solución en THF (20 mL) se agregó a una solución enfriada con hielo de LiBH4 (5 mmol) en THF (20 mL). El progreso de la reacción a t.a., se juzgó por TLC. Después del termino de la reacción (consumo completo del material de partida), se agregó agua (100 mL) cuidadosamente a la solución enfriada con hielo, la cual subsecuentemente se extrajo con EtOAc (2 * 100 mL). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y los solventes se removieron por evaporación rotatoria. El residuo se sometió a cromatografía en columna, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 139.
Compuesto 140: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 80, y sustituyendo el compuesto 139 por el compuesto 79, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 140.
Sintesis del compuesto 143 136 ÜBH -OH 142 (i), (xi> Compuesto 139: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 139 y sustituyendo el compuesto 136 por el compuesto 138, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 141.
Compuesto 142: Una solución del compuesto 141 (8.39 mmol) en DCM/MeOH (12/3 mL) se trató por goteo a 0 °C con una solución 2M de (diazometil)trimetilsilano (1.05 g, 9.23 mmol) en éter durante 30 min. Después de que el reactivo en exceso se apagó con AcOH, se lavó con agua (2 >< 5 mL), sesecó (MgS04), se filtró, el solvente se removió por evaporación rotatoria, después de la cromatografía en columna se obtuvo el compuesto puro 142.
Compuesto 143: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 80, y sustituyendo el compuesto 142 por el compuesto 79, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 143.
Síntesis del compuesto 147 Compuesto 144: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 69a, y sustituyendo el compuesto 136 por el compuesto 67, y el compuesto 54 por NH4CI más iPr2NEt, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 144.
Compuesto 145: Se agregó LiA1H4 (100 mL de una solución 2M en THF) en una forma de goteo a una solución THF enfriada con hielo (500 L) del compuesto 144 (86 mmol). La mezcla se calentó a t.a., después se sometió a reflujo por 0.5 h. El LÍA1H4 residual se destruyó por adición cuidadosa de Na2S04 saturado a la solución enfriada con hielo hasta que se formó un precipitado granular. La mezcla se filtró y se redujo después disolviéndose nuevamente en EtOAc, se secó (MgS04), se filtró y se redujo in vacuo para proporcionar el compuesto 145 el cual es suficientemente puro para uso directo en la siguiente etapa de la reacción.
Compuesto 146: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 124, y sustituyendo el compuesto 145 por el compuesto 123, y Leu-Fmoc-OH por 2-aminoacetato de tere-butilo, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 146.
Compuesto 147: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la sintesis del compuesto 80, y sustituyendo el compuesto 146 por el compuesto 79, y el compuesto 114 por 4-metilbencensulfonotioato de potasio, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 147.
Sintesis del compuesto 150 0 149 · Compuesto 148 : Pivalato de clorometilo comercialmente disponible (10 mmol) se agregó en una forma de goteo a una solución agitada del compuesto 130 (20 mmol) en 1,2-dicloroetano (100 mL) bajo Ar. La solución resultante se calentó para forzar la finalización (notada por la desaparición del material de pivalato de clorometilo por TLC). El solvente se removió por evaporación rotatoria, después el residuo se sometió a cromatografía en columna para proporcionar el compuesto puro 148.
Compuesto 149: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 89, y sustituyendo el compuesto 148 por el compuesto 88, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 149.
Compuesto 150: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 87, y sustituyendo el compuesto 149 por el compuesto 86, de esta manera se obtuvo el compuesto puro 150.
Reactivos de sulforización adicionales: en donde Sa denota cualquiera de las siguientes estructuras: Síntesis de Fosforamiditas En algunas modalidades, la presente invención proporciona fosforamiditas, y métodos de elaboración de las mismas. En algunas modalidades, las fosforamiditas proporcionadas se usan en la síntesis de oligonucleótidos descritos en la presente solicitud. Fosforamiditas ejemplares y su síntesis se describen a continuación.
Síntesis del compuesto 203 ''-"' XMe Compuesto 202 : h^-Bz-5 ' -O-DMTr-2 ' -O-MOE-5-metilcitidina (201) (2.00 g, 2.77 mmol) se trató con amoníaco 2M en 2-propanol (Aldrich, anhidro, 45 mL) y piridina (22.5 mL) a 60 °C por 5 h, después a t.a., durante la noche, con monitoreo por TLC y UPLC/MS. El solvente se removió (3* azeotropo con tolueno) después la cromatografía en columna (0 - 10% MeOH/DCM) dio el compuesto puro 202 (1.62 g, 95 %) como un sólido incoloro, el cual fue homogéneo por TLC y HPLC.
(ESI +): cale (M+H)+: 618.28, encontrado: 618.53.1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 7.82 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.47 - 7.40 (m, 2H), 7.37 - 7.18 (m, 8H), 6.83 (dd, J = 8.9, 1.7 Hz, 4H), 5.93 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 4.43 (td, J = 8.3, 4.9 Hz, 1H), 4.24 (ddd, J = 11.7, 5.1, 3.0 Hz, 1H), 4.07 (dt, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 4.03 - 3.98 (m, 1H), 3.90 (ddd, J = 11.7, 6.3, 3.3 Hz, 1H), 3.79 (d, J = 1.0 Hz, 6H), 3.63 - 3.52 (m, 3H), 3.44 (dd, J = 11.0, 3.0 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.32 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 1.80 - 1.64 (s, br, 1H), 1.13 (s, 3H).
Compuesto 203: Anhídrido isobutírico (0.48 mi, 2.9 mol) se agregó por goteo a una solución del compuesto 202 (1.61 g, 2.61 mmol) en DMF (13 mi) a t.a., la solución se dejó agitar a t.a. durante 24 h, después el solvente se removió in vacuo a 35 °C. La extracción en éter/bicarbonato, después el secado (MgSO4), filtración y remoción del solvente dio el producto crudo como una espuma sólida incolora. La cromatografía en columna (0 - 4% MeOH/DCM) dio el producto puro (1.75 g, 98 %) como una espuma sólida incolora, la cual fue homogénea por TLC y HPLC. (ESI +): cale (M+H)+: 688.32, encontrado: 688.56. XH NMR (399 MHz, CDC13) d 8.00 - 7.75 (br, 1H), 7.45 - 7.39 (m, 2H), 7.34 - 7.20 (m, 8H), 6.84 (dd, J = 9.0, 1.2 Hz, 4H), 5.97 (s, 1H), 4.43 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.20 - 4.04 (m, 3H), 3.79 (d, J = 0.9 Hz, 6H), 3.64 - 3.58 (m, 1H), 3.64 - 3.52 (m, 2H), 3.47 - 3.40 (m, 2H), 3.38 (s, 3H), 1.70 - 1.55 (br, 1H), 1.39 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 1.18 (d, J = 6.9 Hz, 6H).
Síntesis del compuesto 205 205 Compuesto 205: {R) -1-fenil-1-( (S) -pirrolidin-2-il)etanol (4) se secó por destilación azeotrópica con tolueno (3*3 mL). Una solución del compuesto seco 4 (0.725 g, 3.79 m ol) y 4-metilmorfolina (0.833 mi, 7.58 inmol) en tolueno (5 mL) se agregó a una solución enfriada con hielo de triclorofosfina (0.331 i, 3.79 mmol) en tolueno (5 mL), el cual despues se calentó a t.a. por 1 h, después se filtró bajo Ar y se redujo a un aceite el cual se usó en la siguiente etapa de la reacción sin purificación adicional.
Sintesis del compuesto 207 Ci 206 207 Compuesto 207: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis del compuesto 205, y sustituyendo el compuesto 206 por el compuesto 204, el compuesto 207 se obtuvo como un aceite marrón crudo y se usó en la siguiente etapa de la reacción sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 208 O 203 200 W Me Compuesto 208: El Compuesto 203 (1.74 g, 2.53 mmol) se secó por co-evaporación con piridina (3*5 mL) después tolueno (5x5 mL). El 203seco resultante se disolvió en THF (15 L), después se agregó trietilamina (2.47 mi, 17.7 mmol) y la solución se enfrió -78 °C por medio de baño enfriante CO2(s)/acetona. Una solución THF (15 mL) del compuesto crudo 205 (3.79 mmol) se agregó por goteo durante 0.5 h después gradualmente se calentó a t.a. Después de 1 h a t.a., la TLC indicó conversión completa del compuesto 203 para el producto. La mezcla se lavó en un embudo de separación con cloroformo (100 mL) después se extrajo con NaHCC>3 (saturado, acuoso, 50 mL. después 2x25 mL). En cada extracción, los extractos acuosos se lavaron con 1x10 mL adicionales de cloroformo. Los extractos de cloroformo combinados se secaron (MgSO4), se filtraron, y se concentraron por evaporación rotatoria a 32 °C. Lo sólido crudo de esta manera obtenido se disolvió nuevamente en DCM que contiene unas pocas gotas de trietilamina después se sometió a cromatografía en columna con un gradiente de hexano/EtOAc que contiene una concentración constante de 2% de trietilamina para dar el compuesto puro 208 como una espuma sólida blanca.1H NMR (399 MHz, CD3CN) d 7.92 - 7.80 (s, 1H), 7.52 - 7.47 (m, 2H), 7.40 - 7.24 (m, 12H), 6.88 (dd, J = 9.0, 1.1 Hz, 4H), 5.94 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.79 (dt, J = 9.6, 5.6 Hz, 1H), 4.31 - 4.27 (m, 1H), 4.27 - 4.22 (m, 1H), 3.87 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.75 (d, J = 2.0 Hz, 6H), 3.66 (td, J = 5.9, 5.5, 2.2 Hz, 1H), 3.58 - 3.53 (m, 2H), 3.50 (dd, J = 11.1, 2.4 Hz, 1H), 3.38 (dd, J = 11.0, 3.3 Hz, 1H), 3.31 (s, 3H), 2.85 (dq, J = 10.5, 7.4, 6.9 Hz, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.52 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 1.47 - 1.32 (m, 2H), 1.17 (dd, J = 6.9, 0.7 Hz, 6H), 1.05 - 0.90 (m, 2H); 1P NMR ( 162 MHz, CD3CN) d 155. 35.
Síntesis del compuesto 210 209 ° y \ 210 Ph'""»~¾· Me Compuesto 210: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 203 y el compuesto 207 por el compuesto 205, el compuesto puro 210 se obtuvo como una espuma sólida incolora.1H NMR (399 MHz, CD3CN) d 8.31 - 8.27 (m, 2H), 7.86 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.62 - 7.55 (m, 1H), 7.55 - 7.45 (m, 5H), 7.44 - 7.24 (m, 12H), 6.94 - 6.90 (m, 4H), 5.96 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.86 - 4.76 (m, 1H), 4.29 (dd, J = 5.0, 3.8 Hz, 1H), 4.23 (dt, J = 5.8, 2.8 Hz, 1H), 3.92 - 3.80 (m, 2H), 3.78 (s, 6H), 3.74 (ddd, J = 7.1, 5.3, 2.1 Hz, 1H), 3.55 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.51 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.41 (dd, J = 11.1, 3.4 Hz, 1H), 3.30 (s, 3H), 3.26 (ddd, J = 10.3, 6.1, 2.2 Hz, 1H), 2.86 (ddt, J = 10.1, 8.2, 7.2 Hz, 1H), 1.72 (d, J = 0.7 Hz, 3H), 1.62 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.56 - 1.41 (m, 2H), 1.09 - 0.87 (m, 2H); 31P NMR (162 MHz, CD3CN) d 155.22.
Síntesis del compuesto 212 D DMTrO 205, NEl·, . 211 Mb Compuesto 212: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 211 por el compuesto 203, el compuesto puro 212 se obtuvo como una espuma sólida incolora. ¾ NMR (399 MHz, CDCI3) d 9.25 - 8.70 (br, 1H), 7.69 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.46 - 7.40 (m, 2H), 7.40 - 7.17 (m, 12H), 6.81 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 4H), 6.09 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.78 (dt, J = 9.6, 5.2 Hz, 1H), 4.36 - 4.26 (m, 2H), 3.94 - 3.88 (m, 2H), 3.74 (dd, J = 4.0, 0.9 Hz, 6H), 3.69 (td, J = 6.4, 2.9 Hz, 1H), 3.64 - 3.56 (m, 3H), 3.44 - 3.37 (m, 2H), 3.36 (d, J = 0.9 Hz, 3H), 3.00 (dtd, J = 10.3, 7.9, 6.4 Hz, 1H), 1.72 (s, 3H), 1.54 - 1.44 (m, 1H), 1.38 (dd, J = 6.8, 5.4 Hz, 1H), 1.34 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.23 - 1.13 (m, 1H), 0.97 - 0.87 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz , CDC13 ) d 158 . 18 .
Síntesis del compuesto 213 ¡ Compuesto 213: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 211 por el compuesto 209, el compuesto puro 213 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 1H NMR (399 MHz, CDCl3) d 9.55 - 9.10 (br, 1H), 8.09 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.80 - 7.71 (m, 2H), 7.69 - 7.47 (m, 12H), 7.20 - 7.08 (m, 4H), 6.32 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.20 - 5.11 (m, 1H), 4.66 - 4.59 (, 1H), 4.49 - 4.39 (, 1H), 4.33 - 4.24 (m, 1H), 4.16 - 4.02 (m, 8H), 4.00 - 3.93 (m, 1H), 3.91 - 3.84 (m, 2H), 3.73 (dd, J = 11.0, 2.5 Hz, 1H), 3.65 - 3.52 (m, 4H), 3.27 - 3.16 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 1.88 - 1.76 (, 1H), 1.76 - 1.65 (m, 1H), 1.63 - 1.49 (m, 4H), 1.29 - 1.18 (m, 1H); 31P NMR (162 MHz, CDCI3) d 160.08.
Síntesis del compuesto 215 . (i) TMSC1, NEt3, 0°C; (ii) cloruro de 2,4,6-trimetilbencen-1-sulfonilo, DMAP; (iii) 1-metilpirrolidina, 3-hidroxipropanitrilo, DBU, 0°C; (iv) Me0H/H20, 4 d, temperatura ambiente Compuesto 215: (i) Protección TMS Temporal: Una solución de W2-isobutiril-5'-O-DMTr-2'-O-MOE-guanosina (compuesto 214) (15.04 g, 21.1 mol) y trietilamina (11.8 mi, 85 mmol) se recuperó en ACN (200 mL) después se agregó por goteo clorotrimetilsilano (10.4 mi, 82 mmol) a la solución enfriada con hielo la cual se agitó a t.a., por 1 h con monitoreo por TLC. La filtración y remoción del solvente, después extracción (DCM/NaHCO3500 mL/200 mL), secado (MgSO4), filtración, y remoción del solvente dio el compuesto crudo, el cual se usó en la siguiente etapa de la reacción sin purificación adicional. El compuesto fue homogéneo por TLC (Rf= 0.6, (5% MeOH/DCM)). (ii) Activación de posición O6 por protección de Cianoetilo: El residuo se disolvió nuevamente en DCM (500 mL) después se agregó trietilamina (13.1 mi, 94 mmol), seguido por cloruro de 2,4,6-trimetilbencen-l- sulfonilo (6.15 g, 28.1 mmol) y DMAP (0.14 g, 1.146 mmol). La mezcla se agitó a t.a., por 3 h con monitoreo por TLC hasta la desaparición completa del material de partida y emergencia de un nuevo punto por TLC (Rf= 0.9, (5% MeOH/DCM)). (iii) protección de Cianoetilo: 1-metilpirrolidina (22.43 mi, 211 mmol) se agregó lentamente en una forma de goteo a la solución enfriada con hielo con reacción adicional a 0 °C durante 1 h, monitoreo por TLC (nuevo punto, Rf = 0.2, raya, (5% MeOH/DCM)). Se agregaron 3-hidroxipropanitrilo (14.40 mi, 211.0 mmol) después DBU (6.32 mL, 42.1 mmol) en una forma de goteo sucesivamente a la solución aún enfriada con hielo y la agitación continuo por 90 min adicionales, monitoreo por TLC (nuevo punto, Rf = 0.6, (5% MeOH/DCM)). Para forzar que la mayor parte de la reacción finalice, se agregó por goteo 1.6 mL adicional de DBU con monitoreo cuidadoso por TLC. La mezcla se vertió en Na¾P04 (50 g en 400 mL agua), los orgánicos se separaron, y se lavaron con NaH2P04 diluido (10 g in 200 mL agua), se secaron (MgSO4), se filtraron y se redujeron por evaporación rotatoria, (iv) Desprotección TMS: El residuo de esta manera obtenido en la etapa previa se disolvió nuevamente en MeOH (250 mL) después se agregó agua en una forma de goteo teniendo cuidado para no inducir la precipitación. La adición por goteo continuo durante 4 dias con monitoreo por TLC. La mayoría del solvente se removió y el residuo se extrajo (DCM/NaHCO3 (500/200 mL), se filtró y redujo. El residuo se sometió a purificación de columna (0-5% MeOH/DCM) para dar el compuesto puro 215 como una espuma blanca, la cual fue homogénea por TLC y HPLC. (ESI +): cale (M+H)+: 767.34, encontrado: 767.03. XH NMR (300 MHz, CD3CN) d 8.63 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.44 - 7.36 (m, 2H), 7.33 - 7.18 (m, 7H), 6.84 - 6.72 (m, 4H), 6.02 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.74 (td, J = 6.2, 0.9 Hz, 2H), 4.71 - 4.64 (m, 2H), 4.14 - 4.06 (m, 1H), 3.88 - 3.73 (m, 8H), 3.57 - 3.41 (m, 4H), 3.32 -3.23 (m, 3H), 3.08 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.77 (dt, J = 13.7, 6.9 Hz, 1H), 1.14 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 6H).
Síntesis del compuesto 216 Compuesto 216: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 215 por el compuesto 203, el compuesto puro 216 se obtuvo como una espuma sólida incolora.1H NMR (399 MHz, CD3CN) d 8.41 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.50 - 7.44 (m, 2H), 7.40 - 7.19 (m, 12H), 6.80 (dd, J = 8.9, 5.2 Hz, 4H), 6.04 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.99 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.94 (ddd, J = 9.9, 5.2, 3.7 Hz, 1H), 4.75 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.29 (q, J = 3.8 Hz, 1H), 3.89 - 3.82 (m, 1H), 3.76 - 3.68 (m, 7H), 3.64 (ddd, J = 6.8, 5.5, 2.3 Hz, 1H) , 3.50 - 3.46 (m, 2H) , 3.42 ( s , 2H), 3.38 - 3.28 (m, 1H) , 3.21 (s, 3H) , 3.09 (t, J = 6.2 Hz , 2H) , 2.84 (dq, J = 10.2, 7.3 Hz, 1H) , 2.70 - 2.58 (m, 1H) , 1.76 ( s , 3H) , 1.46 - 1.27 (m, 2H) , 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 3H) , 1.07 (d, J = 6.8 Hz, 3H) , 1.04 - 0.89 (m, 2H) ; 31P NMR (162 MHz, CD3CN) d 154.40.
Sintesis del compuesto 217 O""’'''-'' CN Compuesto 217: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 215 por el compuesto 209, el compuesto puro 217 se obtuvo como una espuma sólida incolora.1H NMR (399 MHz, CD3CN) d 8.56 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.44 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, 2H), 7.39 - 7.19 (m, 12H), 6.81 (dd, J = 10.4, 8.9 Hz, 4H), 6.06 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.96 - 4.86 (m, 2H), 4.75 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.30 (td, J = 5.1, 4.7, 2.4 Hz, 1H), 3.83 (dt, J = 11.2, 4.3 Hz, 1H), 3.79- 3.70 (m, 7H), 3.67 (ddd, J = 7.1, 5.2, 2.0 Hz, 1H), 3.52 - 3.45 (m, 3H), 3.41 (dd, J = 10.8, 2.7 Hz, 1H), 3.34 - 3.24 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.08 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.89 - 2.72 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.54 - 1.38 (m, 2H), 1.14 (dd, J = 6.8, 5.4 Hz, 6H), 1.09 - 1.00 (m, 1H), 0. 95 - 0. 83 (m, 1H) ; 31P NMR ( 162 MHz , CD3CN) d 154 . 93.
Síntesis del compuesto 219 NHBz _ Ph' e Compuesto 219 : Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 218 por el compuesto 203, el compuesto puro 219 se obtuvo como una espuma sólida incolora.1H NMR (399 MHz, CDCI3) d 9.31 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.07 - 7.98 (m, 2H), 7.60 - 7.53 (m, 1H), 7.52 - 7.43 (m, 4H), 7.38 - 7.15 (m, 12H), 6.83 - 6.74 (m, 4H), 6.24 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.03 - 4.92 (m, 2H), 4.45 (q, J = 3.8 Hz, 1H), 3.93 (dt, J = 11.4, 4.2 Hz, 1H), 3.77 (ddd, J = 7.5, 5.8, 3.2 Hz, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.60 - 3.49 (m, 3H), 3.47 - 3.37 (m, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.02 - 2.92 (m, 1H), 1.81 (s, 3H), 1.56 - 1.43 (m, 1H), 1.37 (dq, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 1.22 - 1.09 (m, 1H), 0.96 (ddt, J = 13.1, 7.9, 6.8 Hz, 1H); 31P NMR (162 MHz, CDCI3) d 157 .73.
Sintesis del compuesto 220 207, NE 218 ,P .
O —v 220 Ph" Me Compuesto 220: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 218 por el compuesto 209, el compuesto puro 220 se obtuvo como una espuma sólida incolora. XH NMR (399 MHz, CDCl3) d 9.26 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.60 - 7.53 (m, 1H), 7.52 - 7.40 (m, 4H), 7.39 - 7.13 (m, 12H), 6.84 - 6.76 (m, 4H), 6.24 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.99 (dt, J = 10.0, 5.0 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 4.46 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 3.91 (dt, J = 11.1, 4.2 Hz, 1H), 3.85 - 3.69 (m, 8H), 3.63 - 3.50 (m, 3H), 3.42 (dd, J = 10.7, 4.0 Hz, 1H), 3.40 - 3.31 (m, 1H), 3.27 (s, 3H), 3.00 - 2.89 (m, 1H), 1.82 (s, 3H), 1.58 - 1.38 (m, 2H), 1.20 - 1.09 (m, 1H), 1.00 (ddt, J = 12.3, 8.8, 5.9 Hz, 1H); 31P NMR (162 MHz, CDCI3) d 158.98.
Sintesis del compuesto 222 NHAc Compuesto 222: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 221 por el compuesto 203, el compuesto puro 222 se obtuvo como una espuma sólida incolora. XH NMR (499 MHz, CDCl3) d 10.46 (s, br, 1H), 8.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.36 - 7.21 (m, 12H), 7.00 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 9.0, 7.1 Hz, 4H), 6.03 (s, 1H), 4.77 (td, J = 8.7, 4.8 Hz, 1H), 4.34 (dt, J = 9.4, 2.3 Hz, 1H), 3.97 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 6.7, 3.4 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 6H), 3.68 - 3.58 (m, 2H), 3.48 - 3.38 (m, 1H), 3.01 (p, J = 7.8 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.49 (tt, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 1.40 (dq, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.18 (dq, J = 13.9, 7.0 Hz, 1H), 1.02 - 0.90 (m, 1H); 31P NMR (202 MHz, CDC13) d 158.71.
Síntesis del compuesto 223 207, NEt3 221 3 Compuesto 223: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 221 por el compuesto 209, el compuesto puro 223 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 9.76 (s, 1H), 8.70 (d, <J = 7.4 Hz, 1H), 7.48 - 7.41 (m, 2H), 7.41 - 7.18 (m, 12H), 7.06 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 4H), 6.00 (s, 1H), 4.80 (td, J = 9.2, 4.7 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.72 (td, J = 6.6, 3.4 Hz, 1H), 3.70 - 3.62 (m, 4H), 3.53 (dd, J = 11.3, 2.2 Hz, 1H), 3.34 (tdd, J = 10.7, 7.8, 4.9 Hz, 1H), 2.96 (dq, J = 10.3, 7.6 Hz, 1H), 2.25 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.56 - 1.48 (m, 1H), 1.43 (dq, J = 13.1, 6.4 Hz, 1H), 1.24 - 1.16 (m, 1H), 1.00 - 0.91 (m, 1H).31P NMR (202 MHz, CDC13) d 157.17.
Síntesis del compuesto 225 DM DMTrO 205, NEt¾ 224 25 Compuesto 225: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 224 por el compuesto 203, el compuesto puro 225 se obtuvo como una espuma sólida incolora.1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 9.76 (s, br, 1H), 8.70 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.48 - 7.41 (m, 2H), 7.41 - 7.18 (m, 12H), 7.06 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 4H), 6.00 (s, 1H), 4.80 (td, J = 9.2, 4.7 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.72 (td, J = 6.6, 3.4 Hz, 1H), 3.69 - 3.62 (m, 4H), 3.53 (dd, J = 11.3, 2.2 Hz, 1H), 3.34 (tdd, J = 10.7, 7.8, 4.9 Hz, 1H), 2.96 (dq, J = 10.3, 7.6 Hz, 1H), 2.25 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.56 - 1.48 (m, 1H), 1.43 (dq, J = 13.1, 6.4 Hz, 1H), 1.24 - 1.16 (m, 1H), 1.00 - 0.91 (m, 1H); 31P NMR (202 MHz, CDC13) d 158.97.
Síntesis del compuesto 226 Compuesto 226: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 224 por el compuesto 209, el compuesto puro 226 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 1H NMR (499 MHz, CDCl3) d 9.8 - 9.0 (br, 1H), 8.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.36 - 7.19 (m, 12H), 6.80 (dd, J = 11.4, 8.8 Hz, 4H), 6.02 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.82 (td, J = 8.1, 4.9 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 5.0, 2.2 Hz, 1H), 3.81 - 3.76 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.61 - 3.54 (m, 2H), 3.50 - 3.41 (m, 1H), 3.04 (dtd, J = 10.2, 8.0, 6.3 Hz, 1H), 1.75 (s, 3H), 1.56 - 1.47 (m, 1H), 1.44 - 1.35 (m, 1H), 1.26 - 1.18 (m, 1H), 0.95 (dq, J = 12.3, 7.5 Hz, 1H); 31P NMR (202 MHz, CDCI3) d 158.96.
Síntesis del compuesto 228 Compuesto 228: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 227 por el compuesto 203, el compuesto puro 228 se obtuvo como una espuma sólida incolora.31P NMR (202 MHz, CDC13) d 158 .16.
Síntesis del compuesto 229 Compuesto 229: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 227 por el compuesto 209, el compuesto puro 229 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 31P NMR (202 MHz, CDCI3) d 158 . 84.
Síntesis del compuesto 231 NHPac NHPac OMTrO X J OMTrQ 205, MEt; l J V° ; N o or 230 OH ÓM® O A N—i -O 231 Compuesto 231: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 230 por el compuesto 203, el compuesto puro 231 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 1H NMR (499 MHz, CDCl3) d 9.6 - 9.3 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.50 - 7.41 (m, 2H), 7.39 - 7.16 (m, 14H), 7.10 - 7.01 (m, 3H), 6.82 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.21 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.96 (dt, J = 10.1, 5.1 Hz, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.54 (t, J = 4.! Hz, 1H), 4.43 (q, J = 3.9 Hz, 1H), 3.81 - 3.75 (m, 7H), 3.62 (dd, J = 10.8, 3.3 Hz, 1H), 3.54 (s, 3H), 3.46 - 3.42 (m, 1H), 3.41 - 3.33 (m, 1H), 3.01 - 2.93 (m, 1H), 1.82 (s, 3H), 1.56 - 1.47 (m, 1H), 1.44 (dq, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 1.22 - 1.11 (m, 1H), 1.03 0.94 (m, 1H); 31 P NMR (202 MHz, CDCI3) d 158. 11.
Sin esis del compuesto 232 NHPac 207, NB3 230 0 OMe f 232 Compuesto 232: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 230 por el compuesto 209, el compuesto puro 232 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 1H NMR (499 MHz, CDCI3) d 9.8 - 9.2 (br, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.49 - 7.43 (m, 2H), 7.40 - 7.15 (m, 14H), 7.09 - 7.02 (m, 3H), 6.79 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 6.20 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 4.93 (ddd, J - 9.3, 5.0, 3.8 Hz, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.73 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.43 (q, J = 3.9 Hz, 1H), 3.79 - 3.75 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 3.57 (dt, J = 6.8, 3.8 Hz, 1H), 3.52 (s, 3H), 3.46 - 3.36 (m, 2H), 2.99 (dtd, J = 10.1, 7.9, 6.5 Hz, 1H), 1.80 (s, 3H), 1.54 - 1.45 (m, 1H), 1.39 - 1.31 (m, 1H), 1.23 - 1.13 (m, 1H), 0.99 - 0.90 (m, 1H); 31P NMR (202 MHz, CDCI3) d 158.13.
Síntesis del compuesto 234 Compuesto 234: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 233 por el compuesto 203, el compuesto puro 234 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 235 207, NE 233 _ 5 , Compuesto 235: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 233 por el compuesto 209, el compuesto puro 235 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 31P NMR (202 MHz, CDC13) d 158 . 75.
Síntesis del compuesto 237 Compuesto 237: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 236 por el compuesto 203, el compuesto puro 237 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 31P NMR (202 MHz, Cloroformo-d) d 159.51 (d, JP_F = 9.5 Hz).
Síntesis del compuesto 238 Compuesto 238: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 236 por el compuesto 209, el compuesto puro 238 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 31P NMR (202 MHz, Cloroformo-d) d 159.48.
Sintesis del compuesto 240 _ — Compuesto 240: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 239 por el compuesto 203, el compuesto puro 240 se obtuvo como una espuma sólida incolora.31P NMR (202 MHz, CDCI3) d 160.20 (d, Jp-F = 11.0 Hz).
Síntesis del compuesto 241 CN N N DMT Pac 207, Na C NL NH 3 239 241 Compuesto 241: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 239 por el compuesto 209, el compuesto puro 241 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 31P NMR (202 MHz, CDCl3) d 159.66 (d, JP_F = 8.4 Hz).
Síntesis del compuesto 243 NHPac - Compuesto 243: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 242 por el compuesto 203, el compuesto puro 243 se obtuvo como una espuma sólida incolora.31P NMR (202 MHz, CDCl3) d 160.20 (d, J = 11.0 Hz).
Síntesis del compuesto 244 · P 0' N— \ 244 Pfi L * V,¾> Me Compuesto 244: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 242 por el compuesto 209, el compuesto puro 244 se obtuvo como una espuma sólida incolora. 31P NMR (202 MHz, CDCI3) d 156.52 (d, JP.F = 8.5 Hz).
Sintesis del compuesto 246 Compuesto 246: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 245 por el compuesto 203, el compuesto puro 246 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 247 NHAc ' Compuesto 247: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 245 por el compuesto 209, el compuesto puro 247 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 249 O Compuesto 249: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 248 por el compuesto 203, el compuesto puro 249 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 250 .
· Compuesto 250: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 248 por el compuesto 209, el compuesto puro 250 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 252 Compuesto 252: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 251 por el compuesto 203, el compuesto puro 252 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 253 CN Compuesto 253: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 251 por el compuesto 209, el compuesto puro 253 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 255 .
Ph ,’l Me Compuesto 255: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 254 por el compuesto 203, el compuesto puro 255 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 256 HPac Me Compuesto 256: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 254 por el compuesto 209, el compuesto puro 256 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 258 \ Compuesto 258: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 257 por el compuesto 203, el compuesto puro 258 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 259 NHPac Compuesto 259: Usando un procedimiento análogo a aquel descrito por el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 257 por el compuesto 209, el compuesto puro 259 se obtuvo como una espuma sólida incolora.
Ejemplos 2-16.
Resumido a continuación en la Tabla E-l está el procedimiento sintético para los Ejemplos 2-16 en el Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN.
Tabla E-l. Resumen de la Síntesis de Oligonucleótido en el Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN usado para la Síntesis de los Ejemplos 2-16.
Tiempo de Tiempo de etap reacción reactivo suministro (seg) espera (seg) a lpmol lOpmol lpmol lOpmol Destritila 3 + 60 + 3 + 90 1 3% TCA en DCM N.A. N.A. ción 10 + 10 fosforamidita Acoplamien 0.15M en ACN 30 + 30 + 2 5 + 4 10 + 6 to + CMPT 1.2M 600 600 en ACN 5% de Pac20 3 taponado 1 en THF/2,6- 20 30 60 60 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- 4 taponado 2 lutidina + 20 30 60 60 16% de NMI en THF Tiempo de Tiempo de etap reacción reactivo suministro (seg) espera (seg) a lpmol lOpmol S-cianoetil- MetilTio- Sulfonato 300 + 300 + sulfurizac 15 + 5 0.3M 10 + 4x2 3x150 3x150 ión 4x4 II + 600 + 600 - en ACN/BSTFA Ejemplos 2-9: Los oligonucleótidos que contienen enlaces internucleotidicos de diéster de fosforotioato estereodefinidos se sintetizaron en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-l usando 10 pmol de una columna de síntesis y 6.5 prnol de succinilo enlazado a dC en CPG. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5"-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El soporte sólido seco después se trató con 5 mL de solución 1M anhidro de 1,8-diazabicicloundec-7-eno (DBU) en cloruro de ACN-trimetilsililo seco - 16:1 (v/v) por 10 min a t.a., durante este tiempo la solución se empujó lentamente through la columna por medio de una jeringa luer de plástico fijada a la salida de la columna. El soporte después se lavó con ACN seco y se secó bajo vacio. El CPG seco se colocó en un vial de plástico y después se trató con 3 mL de 28% de amoniaco acuoso por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes se evaporaron a sequedad, el residuo se suspendió nuevamente en 10% de DMSO acuoso, y el soporte sólido se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de intercambio de anión (Gradiente de NaCl 0.25 hasta 1.75 M en NaOH 20 mM). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Ejemplos 10-16: Los oligonucleótidos que contiene enlaces internucleotidicos de diéster de fosforotioato estereodefinidos se sintetizaron en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-l usando 1 pmol de columna de síntesis y 3 mmo? de succinilo enlazado a dC en CPG. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El soporte sólido seco después se trató con 5 mL de solución 1M anhidro de 1,5- diazabiciclo(4.3.0) non-5-eno (DBN) en cloruro de ACN- trimetilsililo seco - 16:1 (v/v) por 10 min a t.a. La solución DBN se empujó lentamente a través de la columna por medio de una jeringa luer de plástico fijada a la salida de la columna. El soporte después se lavó con ACN seco y se secó bajo vacio. El CPG seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 2 mL de 28% de amoniaco acuoso por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes se evaporaron a sequedad, el residuo se suspendió nuevamente en 10% de DMSO acuoso, y el soporte sólido se filtró.
Purificación y desalación de ejemplos 2-16: El producto crudo se purificó por Sistema HPLC BGM Waters 2525, equipado con un detector de longitus de onda dual 2487 y con FCO e inyección de Flex. Una columna de vidrio ?R-1 de Waters, 10x200 mm se rellenó con Soporte Source 15Q (GE Healthcare, Pat no.17-0947-01) y se usó con velocidad de flujo de 4 mL/min. La columna se calentó durante todas las purificaciones usando a calentador de fase móvil TL600 y Controlador de temperatura TL150 (Timberline Instruments) fijado a 75 °C. Amortiguador A: NaOH 20 mM y Amortiguador B: NaOH 20 mM, NaCl 2.5 M se usan con etapa de partida de gradientes apartir de 30% de B a 70% de B. Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95 % se combinaron, se concentraron y desalinizaron en el mismo sistema HPLC columna de fase inversa (XBridge Semi Prep, 250x10mm, Ci8, 5pm) con a gradiente de agua a 80% de ACN y velocidad de flujo de 4 mL/min. El producto desalinizado final se concentró en speedvac seguido por liofilización a partir de agua.
Análisis HPLC de oligonucleótidos purificados: La calidad de oligonucleótidos se determinó usando Pac 100 de ADN (10x250 mm) y usando las siguientes condiciones: Amortiguador A: HCl Tris 10 mM, 50% de HC1, pH=8.0 Amortiguador B: A + NaC1040.8 M, pH=8.0 Temperatura de columna: 60 °C Método de gradiente: Tiempo Flujo % de A % de B Curva 1 0.01 1.00 85.0 15.0 2 3.00 1.00 85.0 15.0 1 3 23.00 1.00 40.0 60.0 6 4 25.00 1.00 5.0 95.0 6 5 25.50 1.00 85.0 15.0 6 6 30.00 1.00 85.0 15.0 1 Método de análisis LCMS: Eluyente A: 15 mM TEA, 400 mM HFIP, Water Eluyente B: 50:50 Amortiguador A/Metanol Columna: UPLC0OST Ci81.7 mm, 2.1x500m Temperatura de columna = 50 °C Método de gradiente: Tiempo Flujo % de A % de B Curva 0 0.2 95 5 10 0.2 35 65 6 12 0.2 5 95 6 12.5 0.2 95 5 6 15 0.2 95 5 1 E emplo 2. Sintesis de Oligonucleótido 101 (All-(Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]) Oligonucleótido 101 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14.70 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6310.4.
Ejemplo 3. Sintesis de Oligonucleótido 102 (All-(Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC]) Oligonucleótido 102 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.49 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6310.2.
Ejemplo 4. Síntesis de Oligonucleótido 103 ((Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp , Ep, p, Ep, Ep, Ep)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (5R-9S-5R)) Oligonucleótido 103 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.10 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6310.3.
Ejemplo 5. Síntesis de Oligonucleótido 104 ((Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Ep, Rp, Rp, Ep, Ep, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp) -d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (5S-9R-5S)) Oligonucleótido 104 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.04 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6307.2.
Ejemplo 6. Síntesis de Oligonucleótido 105 ((Sp, Rp, Fp, Rp , Sp, Rp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Rp , Rp, Rp, Rp , Rp , Sp, Rp, Sp) -d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTs6sCsTsTsCsGsCsAsCsC] (1S-17R-1S>) Oligonucleótido 105 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14.75 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6310.2.
Ejemplo 7. Síntesis de Oligonucleótido 106 ((J¾>, Sp, Sp, Sp, Sp , Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp , Sp, Sp, Sp, Sp , Sp , Sp, Rp) -d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (1R-17S-IR)) Oligonucleótido 106 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.43 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para CÍ91H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6309.6.
E emplo 8. Síntesis de Oligonucleótido 107 ( (Rp , Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, R p, Sp, Rp, Sp, Rp, S , Rp, Sp, Rp , Sp, Rp) -d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] ((R/S)9R)) Oligonucleótido 107 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.02 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6310.7.
Ejemplo 9. Sintesis de Oligonucleótido 108 ((Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] ((S/R)9S)) Oligonucleótido 108 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.10 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6307.9.
Ejemplo 10. Sintesis de Oligonucleótido 109 ((Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, R , Rp, Rp , Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp , Sp)«¿[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (3S-13R-3S)) Oligonucleótido 109 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14.91 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6309.5.
Ejemplo 11. Síntesis de Oligonucleótido 110 ((J¾>, 13S-3R)) Oligonucleótido 110 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.24 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6309.3.
Ejemplo 12. Síntesis de Oligonucleótido 111 ( (Sp , Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, SP, Sp , Sp , Spt_ SP ,_ Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] ((18S/R19)) Oligonucleótido 111 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.69 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6309.4.
Ejemplo 13. Síntesis de Oligonucleótido 113 ((gp, ¾>, p, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, gp, gp, gp, gp, gp, gp, gp, gp, gp, gp, gp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (18S/R2)) Oligonucleótido 113 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15.72 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6311.0.
Ejemplo 14. Síntesis de Oligonucleótido 114 ((Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp , gp, J¾p)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] ((RRS)6-R)) Oligonucleótido 114 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14.14 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6313.7.
Ejemplo 15. Síntesis de Oligonucleótido 115 ((gp, Rp, Rp, sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp , Sp, Rp, Rp, Sp, Rp , Rp, Sp, Rp, Rp, Sp) -d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (S- Oligonucleótido 115 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14.30 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C191H246N67O102P19S19: 6310.2; Encontrado: 6313.7.
Ejemplo 16. Síntesis de Oligonucleótido 116 ((Rp, Sp, Rp, Rp, gp, Rp , Rp, Sp, Rp, Rp , gp, Rp, Rp, gp, Rp, Rp, gp, Rp, Rp)d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (RS- (RRS)s-RR)) Oligonucleótido 116 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14.17 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para Ci9iH246N67Oio2Pi9Si9: 6310.2; Encontrado: 6312.4.
Resultados de los Ejemplos 2-16 se resumen en la Tabla E-2, debajo: Tabla E-2. Resumen de los Ejemplos 2-16.
Ejemplo 17. Sintesis de Oligonucleótidos de Control Los oligonucleótidos de control (véase Tabla E-3) se sintetizaron usando los métodos químicos estándar por síntesis de oligonucleótido de fase sólida automatizada (Beaucage, S.L. y Iyer, R.P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223- 2311). Más específicamente, DNA estereoaleatorio se sintetizó usando fosforamiditas de ADN estándar (ChemGenes Co.), etiltiotetrazol (ETT, Muang et al . , Tetrahedron Lett., 2004, 45, 6497-6499) como el activador (Glen Research) y N,N-dimetil-N'- (3-tioxo-3íí-l,2,4-ditiazol-5-il)metanimidamida (DDTT, AM Chemicals) como el agente de sulfurización (Guzaev, A.; Tetrahedron Lett . , 2011, 52, 434-437). El tiempo de acoplamiento de fosforamidita fue 2 min y el tiempo de sulfurización fue 10 min. El oligonucleótido fue desprotegido y se purificó usando métodos estándar. Fosfodiéster de DNA se sintetizó usando fosforamiditas de ADN estándar, ETT como el activador y yodo/piridina/agua como el reactivo oxidante. DNA de 2'-O-Metoxietilo (MOE) se sintetizó usando fosforamiditas de 2'-O-Metoxietilo (MOE) preparado internamente (Martin, P.; Helv. Chim. Acta . 1995, 78, 486-504; Ross, B.; Song, Q.; 2004, solicitud de patente Estadounidense No. 20040082775), ETT como el activador y DDTT como el agente de sulfurización. Los tiempos para acoplamiento fueron 10 min y los tiempos para sulfurización fueron 10 min. RNA se sintetizó usando fosforamiditas de ARN estándar (ChemGenes Co.), ETT como el activador y yodo/piridina/agua como el reactivo oxidante. Los tiempos de acoplamiento fueron 10 min.
Todos los oligonucleótidos se desprotegieron y se purificaron usando métodos estándar.
Purificación de ARN (Oligonucleótido 117): Waters 2525 BGM, detector de longitud de onda dual 2487 equipado con FCO e Inyección de Flexor Amortiguador A: Fosfato de sodio 20 mM, pH=8.5 Amortiguador B: Sodio Fosfato 20 mM, NaBr 1 M, pH=8.5 Columna: columna de vidrio AP-1 de Waters, 10x200mm, rellenado con Super Q-5PW (20), Gel TSK (Intercambio de Anión) de TOSOH Temperatura de columna: 70 °C (Timberline Instruments, calentador de fase móvil TL600 y Controlador de temperatura TL150) Gradiente usado: Tiempo Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 100 0 10 4 100 0 1 25 4 80 20 6 115 4 55 45 6 125 4 0 100 6 130 4 100 0 6 140 4 100 0 1 Como se muestra en la Figura 1, el oligonucleótido 20-mero de fosforotioato diéster quiralmente controlado (All- {Rp) , Oligonucleótido 101, Figura 1, A) tiene un tiempo de retención diferente que el de el oligonucleótido estereoaleatorio estándar 20-mero de fosforotioato diéster (Oligonucleótido 118, Figura 1, C) y tiene un máximo más agudo. Uno de experiencia en la téenica entenderá que durante la purificación del oligonucleótido estereoaleatorio 108, es más probable que la mayoría del oligonucleótido all-(i¾p) (101, presente en un aproximado de 1/219 fracción de la mezcla de oligonucleótido estereoaleatorio 108) pueda ser pérdida.
Los resultados de Ejemplo 17 se resumen en la Tabla E-3, a continuación.
Tabla E-3. Resumen del Ejemplo 17.
Procedimientos para los Ejemplos 18-21: Los oligonucleótidos que contiene enlaces internucleotidicos moríolinoetil fosforotioato triéster estereodefinido se sintetizaron en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-4 usando 1 pinol de columna de síntesis y 0.8 pmol de oxalilo enlazado a dC en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-4. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la síntesis de los Ejemplos 18-21. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) destritila 1 3% TCA en DCM 3 + 60 + 10 N .A. ción fosforamidita 0.15M acoplamien 2 en ACN + CMPT 1.2M 5 + 4 30 + 600 to en ACN 5% de Pac20 en 3 taponado 1 20 60 THF/2,6-lutidina 5% Pac20 en THF/2, 6- 4 taponado 2 lutidina + 16% de 20 60 NMI en THF S-Morfolinoetil- ToluilTioSulf onato Sulfuriza- ° - 3M 300 + 3x150 5 10 + 4 x2 ción en ACN/BSTFA Método de Purificación General para los Ejemplos 18-21: Amortiguador A: Fosfato 20 mM, pH=6.0 (ajustado con ácido fosfórico) Amortiguador B: ACN Columna : : XBridge Prep Ci8, 5 ¡um, Ci8, 250x l0mm, Parte #186003256 Temperatura fijada del calentador de amortiguador Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A Curva Inicial 99 1 5 4 99 1 1 10 4 77 23 6 60 4 70 30 6 65 4 20 80 6 70 4 20 80 6 71 4 99 1 6 80 4 99 1 1 Métodos HPLC analíticos por oligonucleótidos.
Método HPLC 1: Amortiguador A: Fosfato 20 mM, pH=6.0 (ajustado con ácido fosfórico) Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Cíe, 3.5 mm, Ci8, 4.6x50mm, Parte #186003034 Temperatura fijada del calentador de amortiguador 35 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 95 5 3 1 95 5 1 23 1 60 40 6 25 1 40 60 6 25.5 1 95 5 6 30 1 95 5 1 Método HPLC 2: Amortiguador A: TEAA 50 mM, pH 7.8 Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Cis, 3.5 mm, Ci8, 4.6x50mm, Parte #186003034 Temperatura fijada del calentador de amortiguador Señal monitoreada a 254 y 280 n Gradiente usado : Tiempo Flujo (ml/min) % de B Curva Inicial 99 1 2 1 99 1 1 22 1 65 35 6 25 1 5 95 6 25.5 1 5 95 6 30 1 99 1 1 Método HPLC 3: Tiempo Flujo (ml/min) % de A Curva Inicial 85 15 2 1 85 15 1 20 1 60 40 6 22 1 5 95 6 25 1 5 95 6 25.5 1 85 15 6 30 1 85 15 1 Método HPLC 4: Tiempo Flujo (ml/min) % de B Curva Inicial 85 15 2 1 85 15 1 20 1 40 60 6 22 1 5 95 6 25 1 5 95 6 25.5 1 85 15 6 30 1 85 15 1 Ejemplo 18. Sintesis de Oligonucleótido 122 (All-(J¾p)~ d[GslCslCslTslCslAslGslTslCslTslGslCslTslTslCslGslCslAslCslC] (si = Oligonucleótido 122 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC: (Método HPLC 1): 15.2 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C305H455N86O121P19S19 : 8460.25; Encontrado: 8462.0.
Ejemplo 19. Síntesis de Oligonucleót:ido 123 ( d[GslCslCslTslCslAslGslTslCslTslGslCslTslTslCslGslCslAslCslC] ( (1S-17R-1S) Oligonucleótido 123 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 16.2 min.
UPLC/ESI-MS : Calculado para C305H455N8SO121P19S19: 8460.3; Encontrado: 8461.5.
Ejemplo 20. Síntesis de Oligonucleótido 124 (All- (¾>)-d[GslCslCslTslCslAslGslTslCslTslGslCslTslTslCslGslCslAslCslC] i Oligonucleótido 124 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.3 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C305H455N86O121P19S19: 8460.3; Encontrado: 8461.8.
E emplo 21. Síntesis de Oligonucleótido 125 (All- (Rp)-d[5mCslAslTslG]) Oligonucleótido 125 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 16.32 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C58H85N18O22P3S3: 1575.5; Encontrado 1575.2.
En los ejemplos 22 y 42 el oligonucleótido que contiene enlaces internucleotidicos de metoxietil fosforotioato triéster estereodefinidos se sintetizó en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-5 usando 1 pmol de columna de síntesis y 0.8 pmol de oxalilo enlazado a dC en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 m , pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN) . El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-5. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la síntesis de los Ejemplos 22 y 42. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destriti- 1 3% de TCA en DCM 3+ 60+ 10 N.A. lación fosforamidita 0.15M Acopla- 2 en ACN + CMPT 1.2M 5+4 30 + 600 miento en ACN 5% de Pac20 en 3 taponado 1 20 60 THF/2,6-lutidina 5% de Pac20 en 4 taponado 2 THF/2,6-lutidina + 20 60 16% de NMI en THF S-MOE Toluiltiosulfonato 300 + Sulfuri- 0.3M 5 10 + 4><2 3x150 + zación 600 en ACN/BSTFA Ejemplo 22. Síntesis de Oligonucleótido 126 (All- Oligonucleótido 126 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 16.23 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C48H68N15022P3S3: 1396.2; Encontrado 1395.2.
Ejemplo 23: El oligonucleótido que contiene enlaces internucleotidicos fosforotioato triéster del éster voluminoso de N-metilpiperazin estereodefinido se sintetizó en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-6 usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 pmol de oxalilo enlazado a dT en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN) . El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-6. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/AR Usado por la síntesis de Ejemplo 23. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en - lutidina + 16% de NMI 20 60 2 en THF FenilTioSulfonato de N- Metil Piperazin éster Sulfuri- 0.3M 300 + 3x150 10 + 4x2 + 600 en ACN/BSTFA Ejemplo 23. Sintesis de Oligonucleótido 127 (All- Oligonucleótido 127 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 20.24 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C78H122N21O25P3S3: 1943.1; Encontrado: 1941.0.
Ejemplos 24 y 43. El oligonucleótido que contiene enlaces internucleotidicos de fosforotioato triéster de éster voluminoso de orfolino estereodefinido se sintetizó en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-7 usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 pmol de oxalilo enlazado a dT en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-7. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/APN Usado por la sintesis de los Ejemplos 24 y 43. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 5 + 4 30 + 600 miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en THF/2,6- 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI 20 60 2 en THF NitroFenilTioSulfonato de morfolin éster 0.3M Sulfuri- 300 + 3x150 5 10 + 4x2 zación + 600 en ACN/BSTFA Ejemplo 24. Síntesis de Oligonucleótido 128 (All- Oligonucleótido 128 se sintetizó como se describe anteriormente . RT en RP-HPLC (Metodo HPLC 3) : 19.75 min .
UPLC/ESI-MS : Calculado para C75Hn3Ni8028P3S3 : 1902. 9; Encontrado 1904 . 0.
Ejemplo 25: El oligonucleótido que contiene enlaces internucleotidicos de dimetilaminoetil fosforotioato triéster estereodefinidos se sintetizó en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-8 usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 mmo? de oxalilo enlazado a dT en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-8. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la sintesis de Ejemplo 25. tiempo de tiempo de suministr etapa reacción reactivo espera o (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 2 5 + 4 30 + 600 miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en THF/2,6- 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI 20 60 2 en THF dimetilaminoetil- ToluilTioSulfonato 0.3M Sulfuri- 900 + 3x600 5 10 + 4x2 zación + 900 en ACN/BSTFA Ejemplo 25. Síntesis de Oligonucleótido 129 (All- Oligonucleótido 129 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 17.25 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C5iH77Ni80i9P3S3: 1435.4 Encontrado: Ejemplo 26: El oligonucleótido que contiene enlaces internucleotidicos fosforotioato triéster dimetilalanin éster estereodefinidos se sintetizó en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-9usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 pmol de oxalilo enlazado a dT en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desaliriizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-9. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la síntesis de Ejemplo 26. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 0 + 1 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 fosforamidita 0.15M Acopla 2 en ACN + CMPT 1.2M en 5 + 4 30 + 600 miento ACN taponado 5% de Pac20 en 3 20 60 1 THF/2 , 6-lutidina 5% de Pac20 en taponado 4 THF/2,6-lutidina + 20 60 2 16% de NMI en THF NitroFenilTio- Sulfonato de dimetilalanin-Fmoc Sulfuri 900 + 3x 600 5 éster 0.3 M 10 + 4x2 zación + 900 — en ACN/BSTFA Ejemplo 26. Síntesis de Oligonucleótido 130 (All- Oligonucleótido 130 se sintetizó como se describe anteriormente . RT en RP-HPLC (Metodo HPLC 2 ) : 16.45 min.
UPLC/ESI-MS : Calculado para C57H83N18025P3S3 : 1609.5; Encontrado 1609.6.
Ejemplos 27 y 28: El oligonucleótido que contiene enlaces internucleotidicos S-metil fosforotioato triéster estereodefinido se sintetizó en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-10 usando 1 pmol de columna de sintesis y 0.8 mmo? de oxalilo enlazado a dC en HCP. El ciclo de sintesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) con 50% de DMSO por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-10. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la sintesis de los Ejemplos 27 y 28. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministrc espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 2 5 + 4 30 + 600 miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en THF/2,6- 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI 20 60 2 en THF S-metil NitroFenilTioSulfonato Sulfuri- °·3M 300 + 3x150 5 10 + 4x2 zación + 600 en ACN Ejemplo 27. Síntesis de Oligonucleótido 131 (All- (RP) -d[Gs7Cs7Cs7Ts7Cs7As7Gs7Ts7Cs7Ts7Gs7Cs7Ts7Ts7Cs7Gs7Cs7As7Cs7C] Oligonucleótido 131 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC: 27.65 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C210H284N67O102P19S19: 6576.71; Encontrado: 6575.6 Ejemplo 28. Síntesis de Oligonucleótido 132 (All- (¾?)-d[Gs7Cs7Cs7Ts7Cs7As7Gs7Ts7Cs7Ts7Gs7Cs7Ts7Ts7Cs 7Gs7Cs7As7Cs7C] Oligonucleótido 132 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC: 32.65 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C210H284N67O102P19S19: 6576.71; Encontrado: 6574.8.
Síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados que comprende nucleobases modificadas Como generalmente se describe anteriormente y en la presente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados que comprende oligonucleótidos diferente de A, T, C y G. En algunas modalidades, estos oligonucleótidos quiralmente controlados comprise 5-metilcitosina (5mC). Ejemplos no limitantes están presentes en los ejemplos 21 y posteriores.
Ejemplos 29-41 se sintetizaron usando la síntesis automatizada en el sintetizador ABI-394 de conformidad con el ciclo sintético resumido en la Tabla E-ll, usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.75 p ol de oxalilo enlazado a dG en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). Después del final de la síntesis automatizada de Oligonucleótido, el soporte HCP se lavó con ACN seco y se secó bajo vacío. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 L de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (De conformidad con el procedimiento descrito abajo). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 30% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-ll. Resumen para Síntesis de Ollgonucleótldo en un Slntetlzador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la síntesis de los Ejemplos 29-41. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) destritil 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A. ación 10 fosforamidita 0.15M acoplamie 2 en ACN + CMPT 1.2M 5 + 4 30 + 600 nto en ACN taponado 5% de Pac20 en 20 60 1 THF/2 , 6-lutidina 5% de Pac20 en taponado 4 THF/2,6-lutidina + 20 60 2 16% de NMI en THF S-Morfolinoetil ToluilTioSulfonato 0.3M sulfuriza 300 + 3x150 + 600 en ACN/BSTFA Método de Purificación General para los Ejemplos 29-41: Amortiguador A: Fosfato 20 mM, pH=6.0 (ajustado con ácido fosfórico) Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Prep Ci8, 5 mm, Cis, 250><10mm, Parte #186003256 Temperatura fijada del calentador de amortiguador = 50 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1 5 4 99 1 1 10 4 77 23 6 60 4 70 30 6 65 4 20 80 6 70 4 20 80 6 70 4 20 80 6 71 4 99 1 6 80 4 99 1 1 Ejemplo 29. Síntesis de Oligonucleótido 135 (All- (.Rp)-d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG]) Oligonucleótido 135 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 17.50 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para Ci06H278N5iO73PnSn : 5090.0; Encontrado: 5091.9.
Ejemplo 30. Sintesis de Oligonucleótido 136 (All- (Sp)-d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG]) Oligonucleótido 136 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 19.25 min.
UPLC/ESI-MS : Calculado para Ci86H278N5i073PiiSu : 5090.0; Encontrado: 5090.8.
Ejemplo 31. Síntesis de Oligonucleótido 137 ((Sp, RPr J¾P, ¾>, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp) -d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (1S-9R-1S)) Oligonucleótido 137 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 17.85 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C186H278N5I073PIISII: 5090.0; Encontrado: 5091.9.
Ejemplo 32. Sintesis de Oligonucleótido 138 ((Sp, d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (2S-7R-2S)) Oligonucleótido 138 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.10 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C196H278N51O-73P11S11: 5090.0; Encontrado: 5091.9.
Ejemplo 33. Síntesis de Oligonucleótido 139 ( (Rp, Sp, Sp, Sp , Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, J¾p)- d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (1R-9S-1R)) Oligonucleótido 139 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.75 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para Ci86b278M5i073PiiSn: 5090.0; Encontrado: 5088.9.
Ejemplo 34. Síntesis de Oligonucleótido 140 ((!¾>, .¾>, Sp, S , Sp, gp, 5p, Sp, Sp, ¾>, J¾p)~ d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (2R-7S-2R)) Oligonucleótido 140 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.72 in.
UPLC/ESI-MS: Calculado para Ci86H278N5i073PnSn : 5090.0; Encontrado; 5091.3.
Ejemplo 35. Síntesis de Oligonucleótido 141 ((Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp) -d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (3S-5R-3S)) Oligonucleótido 141 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.09 min.
UPLC/ESI-MS ; Calculado para Ci8gH278N51073Pi1Sn ; 5090.0; Encontrado: 5090.9.
Ejemplo 36. Sintesis de Oligonucleótido 142 ((¾>, 2¾>, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp , Rp, Rp , Rp)-d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] (3R-5S-3R)) Oligonucleótido 142 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC: 18.35 min. UPLC/ESI-MS (Método HPLC 1): Calculado para Ci86H278N5i073PiiSn : 5090.0; Encontrado: 5088.9.
Ejemplo 37. Síntesis de Oligonucleótido 143 ( (Sp, d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTs!5mCslG] ((SSR)3-SS)) Oligonucleótido 143 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.48 min.
UPLC/ESI-MS : Calculado para Ci86H278N5i073PiiSii : 5090. 0 ; Encontrado : 5092.0.
Ejemplo 38. Síntesis de Oligonucleótido 144 ( (3¾p, d[5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslG] ((RRS)3-RR)) Oligonucleótido 144 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 18.02 in.
UPLC/ESI-MS: Calculado para CI86H278N51073PIISII: 5090.0; Encontrado: 5091.4.
Ejemplo 39. Síntesis de Oligonucleótido 145 (All- (¾?)- d[5mCslTsl5mCslAslGslTsl5mCslTslGsl5mCslTslTsl5mCslGsl5mC]) Oligonucleótido 145 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 1): 17.30 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C234H352N52O92P14S14: 6388.3; Encontrado: 6390.6.
Ejemplo 40. Síntesis de Oligonucleótido 146 (All- (Rp) -d[Gs!5mCslTslG]) Oligonucleótido 146 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 15.89 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C58H85NI8023P3S3: 1591.5; Encontrado: 1590.8.
Ejemplo 41. Síntesis de Oligonucleótido 147 (All- (Rp) -d[5mCslAslGslT]) Oligonucleótido 147 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 16.30 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C58H85N18O22P3S3: 1575.5; Encontrado: 1575.2.
Ejemplo 42. Síntesis de Oligonucleótido 148 (All-(Rp) -d[5mCs2As2Gs2Ts25mCs2Ts2Gs25mCs2Ts2Ts25mCs2G]) Oligonucleótido 148 se sintetizó como se describe anteriormente, usando el reactivo de sulfurización en el Ejemplo 22. RT en RP-HPLC (Método HPLC 3): 16.51 min. UPLC/ESI-MS : Calculado para Ci53H223N4o073Pi1S1i: 4484.1; Encontrado: 4483.0.
Ejemplo 43. Síntesis de Oligonucleótido 149 (All- (JRp)-d[5mCs4As4Gs4Ts45mCs4Ts4Gs45mCs4Ts4Ts45mCs4G]) Oligonucleótido 149 se sintetizó como se describe anteriormente, usando el reactivo de sulfurización en el Ejemplo 24. RT en RP-HPLC (Método HPLC 4): 17.87 min. UPLC/ESI-MS : Calculado para C252H388N51O95PHSH: 6345.6; Encontrado: 6346.5.
Síntesis de oligonucleótidos quiméricos quiralmente controlado que comprende diferentes enlaces internucleotídicos Como generalmente se describe anteriormente y en la presente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona oligonucleótido quiralmente controlado que comprende diferentes enlaces internucleotídicos. Los ejemplos no limitantes a continuación ilustran estos oligonucleótidos quiralmente controlados, y los métodos para sintetizar los mismos.
Ejemplos 44-45 ilustran la síntesis de oligonucleótido quimérico quiralmente controlado que comprende diferentes enlaces internucleotídicos . Los oligonucleótidos que contiene mezclas de enlaces internucleotídicos morfolinoetil fosforotioato triéster/fosforotioato diéster diastereoméricamente puras se sintetizaron en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-12 usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 pmol de oxalilo enlazado a dT en HCP. Ya que cada ciclo interactivo permite un reactivo de sulfurización diferente a reaccionar, se usan dos tiosulf onatos diferentes. La síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El soporte sólido seco después se trató con 5 mL de solución anhidro 1M de 1,5-diazabiciclo(4.3.0)non-5-eno (DBN) en cloruro de ACN-trimetilsililo seco - 16:1 (v/v) por 10 min a t.a. La solución DBN se empujó lentamente a través de la columna por medio de una jeringa luer de plástico fijada a la salida de la columna. El soporte después se lavó con ACN seco y se secó bajo vacío. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-12. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la síntesis de los Ejemplos 44-45. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 fosforamidita 0.15M Acopla en ACN + CMPT 1.2M en 5+ 4 30 + 600 miento ACN taponado 5% de Pac20 en 20 60 1 THF/2,6-lutidina 5% de Pac20 en taponado THF/2,6-lutidina + 20 60 2 16% de NMI en THF S-Morfolinoetil Toluiltiosulfonato de Sulfuri- 0.3 M 300 + 3x150 10 + 4 x2 - + 600 en ACN/BSTFA S-cianoetil Metiltiosulfonato Sulfuri- 0.3M 300 + 3x150 10 + 4x2 + 600 - en ACN/BSTFA Ejemplo 44. Síntesis de Oligonucleótido 150 (All- (I¾>)-d[TsCslAsT]) Oligonucleótido 150 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 12.72 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C45H62N13O21P3S3: 1310.2; Encontrado: 1309.2 Ejemplo 45. Síntesis de Oligonucleótido 151 (All-(Sp)-d[CslAsGslT]) Oligonucleótido 151 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 14.71 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para C5iH72Ni702iP3S3: 1448.4; Encontrado: 1446.9.
Ejemplo 46 describes la síntesis de oligonucleótido quimérico quiralmente controlado que comprende tanto enlaces internucleotídicos de fosfato diéster y enlaces internucleotídicos modificados. Los oligonucleótidos ejemplares que contiene mezcla de enlaces internucleotídicos morfolinoetil fosforotioato triéster/fosfodiéster se sintetizaron en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-13 usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 pmol de oxalilo enlazado a dT en HCP. Ya que cada ciclo interactivo permite reactivos de sulfurización u oxidación diferentes a reaccionar, un reactivo de tiosulfonato se usó por sulfurización en un ciclo y se usó oxidación promovida por yodo en otro ciclo. La síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN) . El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla £-13. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/?KN Usado por la síntesis de Ejemplo 46. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) destritil 1 3% de TCA en DCM 3+ 60+ 10 N.A. ación fosforamidita 0.15M acoplaie 2 en ACN + CMPT 1.2M en 5 + 4 30 + 600 nto ACN taponado 5% de Pac20 en 20 60 1 THF/2,6-lutidina 5% de Pac20 en taponado THF/2,6-lutidina + 20 60 2 16% de NMI en THF S-Morfolinoetil Toluiltiosulfonato de sulfuriza 0.3 M 300 + 3x150 10 + 4x2 + 600 xidacón 10 300 piridina/Agua Ejemplo 46. Sintesis de Oligonucleótido 152 (All- (Sp) -d[CslAGslT]) Oligonucleótido 152 se sintetizó como se describe anteriormente . RT en RP-HPLC (Metodo HPLC 2 ) : 13. 42 min.
UPLC/ESI-MS : Calculado para C51H72N17O22P3S2 : 1432 . 3 ; Encontrado 1431.7.
Ejemplo 47 describes la síntesis de oligonucleótido quimérico quiralmente controlado que comprende un enlace internucleotídico de fosfodiéster y tanto enlaces internucleotídicos de fosfotriéster y fosfodiéster quiralmente puros, modificados. Los oligonucleótidos quiralmente controlados que contiene mezclas de enlaces morfolinoetil fosforotioato triéster/fosfodiéster/fosforotioato diéster se sintetizaron en un sintetizador ABI-394 de ADN/ARN de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-14 usando 1 pmol de columna de síntesis y 1.5 pmol de oxalilo enlazado a dT en HCP. Ya que cada ciclo interactivo permite reactivos de sulfurización u oxidación diferentes a reaccionar, dos reactivos de tiosulfonato diferentes se usan por los dos ciclos de sulfurización diferentes y se usó oxidación promovida por yodo por otro ciclo. La síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El soporte sólido seco después se trató con 5 mL de solución anhidro 1M de 1,5-diazabiciclo (4.3.0)non-5-eno (DBN) en cloruro de ACN-trimetilsililo seco - 16:1 (v/v) por 10 min a t.a. La solución DBN se empujó lentamente a través de la columna por medio de una jeringa luer de plástico fijada a la salida de la columna. El soporte después se lavó con ACN seco y se secó bajo vacío. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa ~pH 1.5 que contiene 10% de D SO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Gradiente de 5 a 65% de ACN en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6.0). Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-14 . Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN Usado por la síntesis de Ejemplo 47. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destriti- 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A. lación 10 fosforamidita 0.15M Acopla- 2 en ACN + CMPT 1.2M en 5+ 4 30 + 600 miento ACN taponado 5% de Pac20 en 3 20 60 1 THF/2,6-lutidina 5% de Pac20 en taponado 4 THF/2,6-lutidina + 20 60 2 16% de NMI en THF S-cianoetil MetilTioSulfonato 300 + Sulfuri- 0.3M 5 10 + 4x2 3x150 + zación 1 en ACN/BSTFA S-Morfolinoetil ToluilTioSulfonato Sulfuri- 0.3M 300 + 6 10 + 4x2 3x150 + zación 2 600 en ACN/BSTFA I20.02 M, 7 oxidación 10 300 piridina/Agua Ejemplo 47. Síntesis de Oligonucleótido 153 (All-(Sp)-d[CAslGsT]).
Oligonucleótido 153 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 2): 11.48 min. UPLC/ESI-MS: Calculado para C45H6iN1602iP3S2: 1318.1; Encontrado: 1318.1.
Como se apreciará por una persona experta en la téenica, los siguientes ejemplos 46 y 47, y otros ejemplos y métodos descritos en la presente, oligonucleótidos quiméricos quiralmente controlados más largos pueden ser preparados.
Oligonucleótidos Quiralmente Puros Tienen Diferentes Propiedades que la mezcla de Diastereómeros de Síntesis No Estereoespecífica Como se describe anteriormente y en la presente, en algunas modalidades, la presente solicitud proporciona oligonucleótidos quiralmente puros que tienen diferentes propiedades químicas y biológicas que la mezcla de diastereómeros con la misma secuencia base pero sintetizado a través de síntesis de oligonucleótido no estereoespecífico.
E emplo 48. HPLC Profile de oligonucleótidos quiralmente puros y Mixture de Diastereómeros from Síntesis No Estereoespecífica.
Oligonucleótidos de fosforotioato diéster quiralmente puros A (Completo RP, Oligonucleótido 101) y B (Completo SP, Oligonucleótido 102) y non-no estereoespecífico C (enlaces internucleotídicos de fosforotioato diéster estereoaleatorio), los cuales se elaboran por síntesis estándar de oligonucleótido no estereoespecífico, se analizaron por las mismas condiciones Rp-HPLC y los rastros de HPLC correspondientes son representados en la Figura 2.
Como claramente se demostró en la Figura 2, la estereoquímica de los oligonucleótidos 20-mero de fosforotioato diéster afecta su comportamiento como se determina por RP-HPLC y IEX-HPLC. Sin la intenación para ser limitado por teoría, una correlación se observa entre los tiempos de retención (RT) obtenido por RP-HPLC y IEX-HPLC, ya que se conservan las tendencias de RT. El estereoisómero completo RP (A) tiene una retención más corta que el estereoisómero completo SP (B), mientras el oligonucleótido de fosforotioato diéster estereoaleatorio (C), es una mezcla de todos los estereoisómeros 219, tiene un máximo de HPLC amplio, eluido entre los diaestereoisómeros completo RP y completo SP del extremo.
Como se apreciará por aquellos expertos en la téenica, los datos presentados junto con esto confirman que los análisis descritos comparan diferentes composiciones de oligonucleótido quiralmente controlado o no controlado (por ejemplo, estereoaleatorio) de la misma secuencia muestra que la composición de oligonucleótido quiralmente no controlada ejemplificada (es decir, como se preparó por síntesis de oligonucleótido controlada no quiral), incluyen solamente un nivel extremadamente bajo de ciertos tipos de oligonucleótido, tal como el tipo completo Rp o Sp.
Ejemplo 49. Experimento de Desnaturalización Termica (Tm).
Cada Hebra de ADN se mezcló con ARN complementario en concentración equimolar de 0.5 mM en lxPBS. Se preparó 2.5 mL total de solución por cada duplo y la mezcla se calentó a 90 °C por 2 min y se dejó enfriar durante el curso de varias horas. Las mezclas después se almacenaron a 4 °C por 2 hrs. Se registró la absorbancia a 254 nm a un intervalo de 0.5 min partiendo del gradiente de temperatura desde 15 °C a 90 °C con aumento de 0.5 °C/minuto, usando a Espectrómetro UV Perkin Elmer equipado con una unidad Peltier. La absorbancia a 254 nm se gráfico contra la temperatura y los valores Tm se calcularon del primer derivado respectivo de cada curva.
La Figura 3 ilustra la diferencia en Tm entre dos oligonucleótidos de fosforotioato diaestereoisómero estereopuro (20-mero A completo RP y 20-mero B completo SP) y el oligonucleótido fosforotioato estereoaleatorio (C). El ADN fosforotioato completo RP demuestra afinidad alta hacia ARN complementario cuando se compara a tanto el diaestereoisómero completo SP opuesto y el 20-mero estereoaleatorio.
La Tabla E-15 a continuación resumen las diferencias entre oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio.
Tabla E-15 . Diferencias entre oligonucleótido quiralmente controlado y estereoaleatorios.
Ejemplo 50. Actividad biológica de oligonucleótidos quiralmente puros Después de verificación por OD todas las moléculas candidatas de oligonucleótido se diluyeron a partir de concentración de 20mM. Experimento de transfección delantero multidosis se estableció en placas de 96 cavidades usando células Hep3B (ATCC®, Cat.HB-8064™) usando reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Cat.11668-019).
Protocolo de transfección: Células Hep3B 2X104 por cavidad se sembraron e incubaron por 24 horas a 37°C en una incubadora de CO2 en 100 ml de medio MEM libre de antibiótico (Life Technologies, Cat.11095098) gue contiene 10% de FBS y 1% de Glutamax I (Life Technologies, Cat.35050061). Doce diluciones se establecieron en agua libre de nucleasa (Tabla E-16).
Tabla E-16. Concentraciones de placa base de transfección de oligonucleótido.
Para cada cavidad, 0.5pL de Lipofectamina 2000 se mezclaron con 9.5pL de medio de suero reducidoen Opti MEM I (Life Technologies, Cat.31985062) e incubaron por 5 minutos. Después de la incubación , lOpL de cada uno de los candidatos a las concentraciones reportadas se mezcló con la Lipofectamina 2000 diluida por pipeteo suave. La mezcla después se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente para permitir formación de complejo. Durante este tiempo el medio de crecimiento celular se reemplazó con 80 mL de MEM libre de antibiótico reciente como previamente se describió.20 pL de complejo lipid-oligo se mezcló suavemente en cada cavidad llevando el volumen total hasta 100 pL. Las células después se incubaron por 24 horas a 37 °C en una incubadora de CO2.
Extracción de ARN: Después de 24 horas de incubación, el medio de crecimiento celular se removió y se extrajo ARN usando un kit Directo ARNm Dynabeads (Life Technologies, Cat. 61012) por las instrucciones proporcionadas en el manual del kit sin modificaciones. Este sistema de perlilla Oligo (dT)25 magnético permite tratamiento de ADNse de elusión por extracción de poli (A) ADN de costo efectivo y alto rendimiento robusto. El ARN se eluyó en agua libre de nucleasa y se almacenó a -80 °C. síntesis de ADNc: Se usó 10 mL de ARN en 20 mL de reacción de síntesis de ADNc usando un Kit de Transcripción Inversa de ADNc de Alta Capacidad (Life Technologies, Cat. 4374967) usando el protocolo del kit con Inhibidor de ARNse. La transcripción inversa se realizó en un formato de 96 cavidades en un ciclor término Touch C1000 (Biorad, Cat.185- 1196EDU).
Análisis de expresión del Gen: La expresión Gen se midió por PCR cuantitativa usando un Master Green I SYBR LightCiclor® 480 (Roche, Cat. 04707516001) on Intrumento PCR en tiempo real LightCiclor 480. Cebadores para las secuencias Homo Sapiens de la Apolipoproteina B objetivo (Apo B) (NM_000384) y deshidrogenasa Gliceraldehido-3-fosfato endógena control (GAPDH) (NM_002046) se diseñaron y ordenaron de IDT (Tabla E-17).
Tabla E-17. Secuencias de cebadores purificados por HPLC usadas para cuantificación de expresión del gen.
Medición del control objetivo y endógeno se realizó en cavidades separadas usando material de la misma plantilla de ADNc. Las condiciones PCR del ensayo green SYBR se establecieron como se describió en el protocolo Master Green I SYBR (Tabla E-18).
Tabla E-18: Condiciones PCR en -tiempo real para el ensayo green SYBR.
Análisis de curva de fusión muestra picos de amplicón únicos por cada par de cebador (Figura 4).
Los datos son un resultado de 3 réplicas biológicas. Todas las muestras se compararon a control no transfectado Naive. Los siguientes resultados se observaron cuando se evalúa la expresión del gen por PCR de tiempo real usando green SYBR (Tabla E-19, Figura 5).
Tabla E-19. Da-tos IC5o completos evaluados por green lgunas modalidades, los oligonucleótidos controlados proporcionados muestran una IC50 por debajo de 8 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 por debajo de 7 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IO50 por debajo de 6 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 por debajo de 5 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 por debajo de 4 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 por debajo de 3 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 por debajo de 2 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 0.5-8 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 1-4 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 1.5-3 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 1.5-2 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 0.5-2 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 1-2.5 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC5o dentro de un intervalo de 1.5-3 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC5o dentro de un intervalo de 2.5-5 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 3-6 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo de 5-8 nM. En algunas modalidades, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una IC50 dentro de un intervalo entre un limite superior y un limite inferior. En algunas de tales modalidades, el limite superior es 8, 5, 4, o 3 nM. En algunas de tales modalidades, el límite inferior es 1, 1.5, 2, o 2.5 nM. Como se puede observar con reference a los Ejemplos, la presente descripción específicamente ejemplifica varios oligonucleótidos quiralmente controlados o composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados mostrando estos valores IC50 representativos.
La Tabla E-19 ilustra que cuando la prueba en forma quiralmente controlada, ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados/composiciones de oligonucleótido son más potentes que la mezcla ésteroaleatoria de oligonucleótido correspondiente (Oligonucleótidos 105, 109, 115 y 116 comparados a Oligonucleótido 118); pueden también ser más activos que Mipomersen, el cual es una mezcla estereoaleatoria de oligonucleótido (Oligonucleótidos 104, 105, 106, 107, 109, 115 y 116 comparado a 120).
Preparaciones Quiralmente Controladas Adicionales Ejemplo 51. Preparación de Preparaciones de Oligonucleótidos Quiralmente Controladas . , - El presente ejemplo describe la preparación de una variedad de composición quiralmente controlada particular de ciertos oligonucleótidos como se describe en la presente. En particular, el presente ejemplo describe preparación de oligonucleótido utilizando lcaa-CPG-500 cargado.
Se disolvió N -Bz-5 '-O-DMTr-2'-O-M0E-5mC (1) (4.0 g, 5.5 mmol) en DCM anhidro (20 mL) y se mezcló con 2 equiv de anhídrido succínico (1.1 g, 11.1 mmol) y 3 equiv de 4 -N,N- dimetilaminopiridina (2.0 g, 16.6 mmol). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después de consumo completo del material de partida como se determinó por TLC (1 hora), los solventes se evaporaron a sequedad, el residuo crudo se disolvió en DCM que contiene 1% de trietilamina, después se purificó por cromatografía instantánea en gel de sílice usando a gradiente de 0 - 2% de MeOH en DCM que contiene 2% de trietilamina. Rendimiento del compuesto puro (2) después de la evaporación fue 4.5 g, 88%. El 3 ' -0-succinato resultante (2) (0.92 g, 1.0 ol), se recuperaron ,2\-diisopropiletilamina (0.82 mi, 5.0 mmol) y CPG-500 (lOg) en DMF (50mL) después se agregó HBTU (0.42 g, 1.1 mmol). La mezcla fue sacudida por 2 h, después se filtró. El soporte se lavó con DMF, MeOH y finalmente, DCM después se secó in vacuo. Análisis de catión de tritilo (monitoreado a 504 nm) mostró que la carga del nucleósido en el soporte (3) fue 63 pmol/g .
Composiciones quiralmente controladas de oligonucleótidos que contiene enlaces internucleotídicos desoxi quimérico y 2'-0-M0E fosforotioato triéster estereodefinidos se sintetizaron en Sintetizador de ADN/ARN MerMade-12 (BioAutomation) de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-20 usando una columna de síntesis MM- 6-200 (BioAutomation) cargada con 2.0 g (126 pmol) de succinilo no tapado enlazado a ?Z-Bz-d'-O-DMTr-2’-0-M0E-5mC (63 pmol/g, lcaa CPG-500 de Glen Research. El ciclo de síntesis de oligonucleótido se realizó con una etapa perliminarmente taponada (taponado 2) y sin remoción del grupo oligonucleótido 5'-0-DMTr terminal final (DMT activado). Las etapas de sulfurización estereoespecíficas se realizaron usando el reactivo S-(2- cianoetil)metiltiosulfonato 0.3M siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de taponado de dos etapas (Tabla E-20).
Una vez que la síntesis automatizada del ciclo de oligonucleótido se completó con el grupo 5'-O-DMTr final mantenido, la columna de síntesis fue recuperada del sintetizador de ADN/ARN y se secó bajo vacío. El soporte seco fue transferido en un sintetizador de péptido manual de vidrio vacío y 40 L de solución de 1,5-diazabiciclo [4.3.0]non-5-eno 0.5M (DBN), N, 0-bis (trimetilsilil)trifluoroacetamida 0.25M (BSTFA) en ACN fue continuamente hecho pasar a través del soporte por 5 min sin detener el flujo en el sintetizador de péptido manual. El soporte se lavó por 50% de Py/ACN y se secó con flujo de argón por 1 seg. Después, el soporte fue transferido en un vial de plástico de tapa de rosca vacío y se trató con 5% de EtOH/ NH3 conc (20 mL) a 60 °C por 6 h, y se dejó a temperatura ambiente por 12 h. El soporte se removió por filtración y se lavó con NH3 conc. Lo filtrado se secó in vacuo después lo resultante se disolvió en TEAA 50 mM (120 mL) . Filtración adicional se realizó cuando existe una suspensión en la solución. La solución se cargó en un cartucho Sep-Pak (Waters, Cartuchos Sep-Pak Vac 35cc (lOg) Ci8). El cartucho se lavó con 20% de ACN/TEAA 50 mM (70 L) para remover todas las secuencias truncadas taponadas y 50% de ACN/agua que contiene 0.5% de NH3 concentrado (50 mL) para eluir el oligonucleótido DMT activado de longitud completa.
La solución que contiene el oligonucle+otido DMT activado se secó in vacuo después se diluyó con TEAA 50 mM (120 mL) y se cargó en otro cartucho Sep-Pak (Waters, Cartuchos Sep-Pak Vac 35cc (lOg) Ci8). El cartucho se lavó con agua milli Q (50 mL), 2% de TFA/agua (50 mL), después agua (50 mL). El oligonucleótido desactivaco con DMT se eluyó con 50% de ACN/agua que contiene 0.5% de NH3 concentrado (50 mL).
Tabla E-20. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador de ADN/ARN MerMade 12 Usado por la sintesis quiral ente controlada. volumen de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (mL) Destri- 1 3% de TCA en DCM 3 x 10 3 x 24 tilación 2 x 450 fosforamidita quiral Acopla (MOE) 2 0.15M en ACN + CMPT 2 x 3.4 miento 2 x 300 1.2M en ACN (ADN) 5% de Pac20 en THF/2,6- 3 taponado 1 8 60 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- 4 taponado 2 lutidina + 16% de NMI 6.8 60 en THF S- (2-cianoetil) metanotiosulfonato 0.3 Sulfuri- 5 9 600 zación - en ACN/BSTFA Síntesis de Oligonucleótido ONT-75 (All (Rp))- Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC Síntesis de Oligonucleótido ONT-80 (All (Sp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC Síntesis de Oligonucleótido ONT-77 (Rp, Rpr Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Spr Rp, Rp, Rp, Rp) - Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5R-10S-4R) Síntesis de Oligonucleótido ONT-81 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp , R , Rp, Sp, Sp, Sp, Sp)- Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5S-10R-4S) Síntesis de Oligonucleótido ONT-87 {Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp) - Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5R-(SSR)3-5R) Síntesis de Oligonucleótido ONT-88 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp)- Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5S-(RRS)3-5S) Síntesis de Oligonucleótido ONT-89 (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp)- Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC ((SR)gS) Síntesis de Oligonucleótido ONT-82 (All (Rp))- GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5naCsAsAsTsGs5mC Síntesis de Oligonucleótido ONT-84 (All (Sp))-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC Síntesis de Oligonucleótido ONT-85 {Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp) - GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC (5R-10S-4R) Síntesis de Oligonucleótido ONT-86 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp)- GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC (5S-10R-4S) Ejemplo 52: Método RP-HPLC general para el análisis de oligonucleótidos DMT activado crudo y DMT desactivado purificado El presente ejemplo describe Análisis RP-HPLC de composiciones de oligonucleótido crudas y purificadas preparadas por la síntesis quiralmente controlada como se describe en la presente.
Amortiguador A: TEAA 50 mM, pH 7.0 Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Cíe, 3.5 mm, Cíe, 4.6x50m, Parte #186003034 Temperatura de columna = 50 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo(min) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1 2 1 99 1 6 52 1 50 50 6 55 1 5 95 6 55.5 1 5 95 6 56 1 99 1 6 60 1 99 1 1 Ejemplo 53: General Metodo IEX-HPLC para el análisis de DMT activado crudo y DMT desactivado puro oliqonucleótidos El presente ejemplo describe Análisis IEX-HPLC de composiciones de oligonucleótido crudas y purificadas preparada por la sintesis quiralmente controlada como se describe en la presente.
Amortiguador A: TrisHCl 10 mM, 50% de ACN, pH 8.0 Amortiguador B: TrisHCl 10 mM, NaC104 800 M, 50% de ACN, pH 8.0 Columna: DIONEX, ADNPac, PA-100, Analítico, 4.0x250mm, Parte #063000 Temperatura de columna = 60 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 85 15 3 1 85 15 1 23 1 60 40 6 25 1 5 95 6 25.5 1 85 15 6 30 1 85 15 1 Ejemplo 54: Método UPLC-LCMS general para el análisis de Oligonucleótidos DMT desactivado puro El presente ejemplo describe Análisis UPLC-LCMS de composiciones de oligonucleótido purificadas preparadas por la síntesis quiralmente controlada como se describe en la presente .
Amortiguador A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, Water Amortiguador B: 50:50 Amortiguador A/Metanol Columna: UPLC0OST Ci81.7 mm, 2.1x500mm Temperatura de columna = 50 °C Gradiente usado: Tiempo Flujo %A %B Curva Inicial 0.2 80 20 2 0.2 80 20 1 22 0.2 30 70 6 25 0.2 5 95 6 25.5 0.2 80 20 6 30 0.2 80 20 1 Ejemplo 55 : Método IEX-HPLC general para la purificación de oligonucleótido DMT desactivado crudo El presente ejemplo describe purificación por IEX-HPLC de composiciones de oligonucleótido cudas preparadas por la síntesis quiralmente controlada como se describe en la presente .
Amortiguador A: NaOH 20 mM, pH 11.0 Amortiguador B: NaOH 20 mM, NaCl 2.5 M, pH 11.0 Columna: columna vacío Waters AP-2 (Waters), envasado internamente como se acostumbra con soporte Source 15Q (GE Healthcare). Columnas de purificación individual se envasaron y se usaron por los diferentes oligonucleótidos estereopuros.
Instrumento: Purificador AKTA, equipado con la bomba P-900, el detector UPC-900 y 50 mL de inyección SuperLoop (GE Healthcare) Temperatura del calentador de amortiguador establecida a = 70 °C Señal monitoreada a 254 nm Volumen de fracciones: 5 mL Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo de B Curva Inicial 100 o 25 10 100 0 1 40 10 85 15 6 60 10 85 15 1 80 10 70 30 6 100 10 70 30 1 140 10 60 , 40 6 180 10 60 40 1 200 10 45 55 6 210 10 45 55 1 211 10 100 0 6 235 10 100 0 1 Fracciones recolectadas son individualmente analizadas por IEX-HPLC analítico usando las condiciones analíticas y gradiente descritos anteriormente. Las fracciones puras se combinaron para proporcionar material purificado de 95% y la pureza por arriba como se determina por los perfiles de absorbancia UV 254 nm.
Tabla E-21. Recopilación de las propiedades fisicoquímicas para los oligonucleótidos fosforotioato estereopuros sintetizados como se describió en Ejemplo XX.
Secuencia A: secuencia ApoB humana 5'-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC-3 '.
Secuencia B: secuencia ApoB de ratón 5'-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAs AsTsGs5mC-3'.
Nucleótidos subrayados indican 2'-O-M0E. s = enlace de fosforotioato.5mC = 5-metil-2'-desoxicitidina.5 C = 5- metil-2'-O-MOE-citidina. Arquitectura estereo describe la naturaleza estereoisomérica (Rp/Sp) de cada átomo de fósforo en un enlace de fosforotioato del oligonucleótido proporcionado. Tiempo de retención (tR) en IEX-HPLC y valores de peso molecular encontrados (PM) se obtuvieron usando los métodos analíticos correspondientes para los compuestos purificados (descritos anteriormente). de DMT desactivado El presente ejemplo describe análisis RP-HPLC de composiciones de oligonucleótido purificadas preparadas por la síntesis quiralmente controlada como se describe en la presente.
Amortiguador A: TEAA 50 mM, pH 7.0 Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Ci8, 3.5 mm, Ci8, 4.6><50mm Temperatura de columna = 50 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo(min) Flujo (mL/min) de A % de B Curva Inicial 95 5 2 1 95 5 1 52 1 70 30 6 54 1 5 95 6 54.5 1 5 95 1 55 1 99 1 6 60 1 99 1 1 Panel A de la Figura 37 es una superposición de rastros de RP-HPLC de oligonucleótido DMT desactivado purificado ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41 ( díastereomezcla ) -Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC .
Panel B de la Figura 37 mostró una vista expandida del Panel A con cada curva etiguetada coo sigue: Panel A de la Figura 38 es un traslape de RP-HPLC del Oligonucleótido DMT desactivado puro ONT-82, ONT-84, ONT-85, ONT-86, y ONT-83 ( diastereomezcla ) -GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC Panel B de la Figura 38 mostró una vista expandida de Panel A, con cada curva etiquetada como sigue: Ejemplo 57:_ Experimento de Desnaturalización Termica (Tm) El presente ejemplo describe caracterización de composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados usando desnaturalización térmica.
Cada Hebra de ADN se mezcló con su hebra de ARN complementaria en concentración equimolar de 1 mM en lxPBS. Se preparó 3 mL de solución total para cada duplo y la mezcla se calentó a 90 °C por 2 in y se dejó enfriar durante el curso de varias horas. Las mezclas después se almacenaron a 4 °C por 2 hrs. Absorbancia a 254 nm se registró a un intervalo de 0.5 min partiendo del gradiente de temperatura desde 15.0 °C a 95.0 °C con aumento de 0.5 °C/minuto, usando Series CarylOO (Agilent Technologies). La absorbancia a 254 nm se gráfico contra la temperatura y los valores Tm se calcularon del primer derivado respectivo de cada curva.
Figura 39 presenta un traslape Tm de oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio .
Figura 39 ilustra la diferencia en Tm entre cuatro oligonucleótidos de fosforotioato diastereoisoméricos estereopuros (gapmeros all-Rp 20-mer, all-Sp 20-mer, 5R-10S- 4R y 5S-10R-4S) y el oligonucleótido de fosforotioato estereoaleatorio. El ADN de fosforotioato completo Rp demuestras la gran afinidad hacia ARN complementario (Tm = 85.1 °C) cuando se compara a 20-mero completo Sp (Tm = 75.1 °C) el cual tiene la afinidad menor. Gapmeros 5R-10S-4R y 5S- 10R-4S y el oligonucleótido de fosforotioato estereoaleatorio todos mostraron valores intermediarios (Intervalo Tm = 80.1- 81.2 °C).
Tabla E-22, posterior, dio Valores Tm por los oligonucleótidos de fosforotioato estereopuros y estereoaleatorios estudiados que tiene la secuencia ApoB humana 5'- Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC-3 ' con varias arquitecturas estereoquímicas en el armazón de fosforotioato.
Tabla E-22 Ejemplo 58: Preparación Oligonucleótidos de siARN quiralmente controlados ejemplares Dirigidos a PCSK9 Proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), en una enzima involucrada en metabolismo de colesterol. PCSK9 se une al receptor por lipoproteína de baja densidad (LDL), iniciando su destrucción. A pesar que LDL es asociado con el receptor también se elimina cuando el receptor es destruido, el efecto neto de unión PCSK9 de hecho incrementa los niveles de LDL, ya que el receptor pude de otra forma repetir el ciclo para la superficie celular y remover más colesterol.
Varias compañías son desarroladoras de agentes terapéuticos dirigidos a PCSK9. De relevancia particular a la presente descripción, cada una de Isis Pharmaceuticals, Santaris Pharma, y Alnylam Pharmaceuticals han desarrollado un agente de ácido nucleico que inhibe PCSK9. El producto de Isis Pharmaceuticals, un oligonucleótido antisentido, ha sido mostrado por incrementar la expresión del LDL y disminuye la circulación total de nveles de colesterol en ratones (Graham et al "Antisense inhibition of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 reduces serum LDL in hyperlipidemic mice". J. Lipid Res. 48 (4): 763-7, Abril 2007). Ensayos clínicos iniciales con el producto de Alnylam Pharmaceuticals, ALN-PCS, reveló que la interferencia de ARN ofrece un mecanismo efectivo para inhibir PCSK9 (Frank-Kamenetsky et al "Therapeutic RNAi targeting PCSK9 acutely lowers plasma cholsterol in rodents and LDL cholesterol in nonhuman primates". Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. 105 (33): 11915-20, Agosto 2008).
El presente ejemplo describe la preparación de una variedad de agentes siARN quiralmente controlados o estereoaleatorio dirigidos a PCSK9. Específicamente, este Ejemplo describe la preparación de cada uno de las siguientes composiciones de oligonucleótido como se ilustra en la Tabla E-23 posterior: Tabla E-23: NOTA: letras minúsculas representan residuos de ARN 2OMe; letras mayúsculas representan residuos de ARN 2?H; y negritas y cursivas "s" indican una porción de fosforotioato.
Lcaa-CPG-500 usado en la preparación de estos oligonucleótidos se preparó de conformidad con la siguiente reacción: , En particular, 5'-O-DMTr-2'-desoxitimidina (1) ( 4 .28 g, 7 . 86 ranol) se disolvió en DCM anhidro ( 50 mL) y se mezcló con 2 equiv de anhídrido succínico (1.57 g, 15.7 inmol) y 3 equiv de 4-N, W-dimetilaminopiridina (2.88 g, 23.6 rrunol). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después del consumo completo del material de partida como se determinó por TLC (1 hora), los solventes se evaporaron a sequedad, el residuo crudo se disolvió en DCM que contiene 1% de trietilamina después se purificó por cromatografía instantánea en gel de sílice usando a gradiente de 0 - 2% de MeOH en DCM que contiene 2% de trietilamina. Rendimiento del compuesto puro (2) después de la evaporación fue 5.5 g, 94%. El 5'-O-DMTr-2'-desoxitimidina-3'-O-succinato resultante (2) (0.60 g, 0.81 mol), N, N-diisopropiletilamina (0.71 mL, 4.02 mmol) y CPG-500 (10 g) se recuperaron en DMF (50 mL) después se agregó HBTU (0.37 g, 0.97 mmol). La mezcla fue sacudida por 2 h después se filtró. El soporte se lavó con DMF, MeOH y finalmente, DCM después se secó in vacuo. El análisis de catión de tritilo (monitoreado a 504 nm) mostró que la carga de nucleósido en el soporte (3) fue 38 pmol/g.
Cada oligonucleótido, que contiene enlaces internucleotídicos fosfodiéster 2'-OH y 2 '-OMe y fosforotioato diéster 2'-desoxi y 2'-OMe estereodefinido como se indicó anteriormente en la Tabla E-23, se sintetizó en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 de conformidad con los ciclos resumidos en la Tabla E-24 y Tabla E-25 respectivamente, usando 10 pmol de capacidad de columna de síntesis cargada con 130 mg (4.9 mmo?) de succinilo enlazado a 5'-O-DMTr-2'-desoxitimidina (38 pmol/g). Antes de la síntesis, se realizó una etapa perliminarmente taponada (taponado 2) y la síntesis fue terminada con remoción de los grupos 5'-O-DMTr terminales. La etapa de oxidación se realizó usando una solución 5-6M comercialmente disponible de hidroperóxido de tere-butilo (TBHP) en decano, la cual fue después diluida con cuatro partes de diclorometano. La etapa de sulfurización estereoespecífica se realizó usando el reactivo S-cianoetilmetiltiosulfonato 0.3M siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de taponado de dos etapas (Tabla E-25).
Una vez que el ciclo de síntesis de oligonucleótido automatizado se completó y el grupo 5'-0-DMTr final se removió, la columna de síntesis fue recuperada del sintetizador de ADN/ARN y se secó bajo vacío. 10 mL de solución de 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno 0.5 M (DBN), N, O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida 0.25 M (BSTFA) en ACN fue continuamente agregado al soporte a través de la columna de síntesis por 1 in sin detener el flujo usando una jeringa unida a un extremo de la columna de síntesis. El soporte después se lavó con ACN anhidro y se secó bajo vacío. Después, el soporte seco fue transferido en un vial de plástico de tapa de rosca vacío y se trató con 40% de Solución acuosa de MeNH2 (0.5 mL) a 60 °C por 10 min. Después de que, el vial fue inmediatamente enfriado y después de la dilución con DMSO (0.5 mL), el soporte se removió por filtración, se lavó nuevamente con DMSO (1 mL) y se filtró. Lo filtrado se enfrió y después inmediatamente se trató con 3HF-Et3N (0.75 mL) a 60 °C por 10 min, después inmediatamente se congeló y se almacenó a 4 °C antes de la purificación.
Tabla E-24. Resumen para la Síntesis de Oligonucleó ido en un Sintetizador de ADN/ARN ABI 394 (ciclo de AR2T sustituido con 2'-O-TBDMS y 2'-OMe) tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 120 + 1 3% de TCA en DCM N. A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 7 + 6 30 + 600 miento ACN + CMPT 2M en ACN 5% de Pac20 en THF/2,6- 3 taponado lutidina + 16% de NMI en 10 20 THF hidroperóxido de tere- oxidació 4 butilo 1.1 M en 4:1 20 110 n diclorometano:decano Tabla E-25. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador de ADN/ARN ABI 394 (Ciclo ARN 2'-desoxi y 2'-OMe fosforotioato es ereodef inido) tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 120 + 1 3% de TCA en DCM N . A. tilación 10 30 + 900 fosforamidita quiral (2'-OMe Acopla 2 0.15M en ACN + CMPT 8 + 6 RNA) miento 2M en ACN 30 + 600 (ADN) taponado 5% de Pac20 en 30 60 1 THF/2 , 6-lutidina 5% de Pac20 en taponado 4 THF/2,6-lutidina + 30 60 2 16% de NMI en THF S- (2-cianoetil) metiltiosulfonato Sulfuri- 0.3M 120 + 3x60 5 15 + 3x4 zación + 300 - en ACN/BSTFA Ejemplo 59. Metodo IEX- general para el análisis de crudo y DMT desactivado puro ARN oligonucleótidos.
Amortiguador A: fosfato de sodio 20 mM, pH 11.0 Amortiguador B: fosfato de sodio 20 mM, NaBr 1 M, pH 11.0 Columna: DIONEX, ADNPac, PA-100, Analítico, 4.0x250mm Temperatura de columna = 60 °C Señal monitoreada a 254 y 280 n Gradiente usado: Tiempo (in) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 95 5 3 1 95 5 1 23 1 20 80 6 25 1 5 95 6 25.5 1 95 5 6 30 1 95 5 1 Ejemplo 60 Método UPLC-LCMS general para el análisis de Oligonucleótidos ARN DMT desactivado puros.
Amortiguador A: TEA 15 M, HFIP 400 M, Water Amortiguador B: 50:50 Amortiguador A/Metanol Columna: UPLC0OST Ci81.7 mm, 2.1><500mm Temperatura de columna = 50 °C Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo (mL/in) % de A o o.de B Curva Inicial 0.2 95 5 10 0.2 35 65 12 0.2 5 95 12.5 0.2 95 5 15 0.2 95 5 Ejemplo 61. Método IEX-HPLC general para la purificación de oligonucleótidos ARN DMT desactivado puros.
Amortiguador A: fosfato de sodio 20 mM, pH 8.5 Amortiguador B: fosfato de sodio 20 mM, NaBr 1 M, pH 8.5 Columna: Columna vacía Waters AP-2 (Waters), envasada en casa habitualmente con el soporte Source 15Q (GE Healthcare). La misma columna de purificación se usó por los diferentes oligonucleótidos estereopuros.
Instrumento: unidad HPLC Waters equipada con el módulo de gradiente binario 2525, el detector de absorbancia dual 2487 y 20 mL de Inyección de Flexor (Waters).
Temperatura del calentador de amortiguador establecida a = 70 °C Señal monitoreada a 254 nm y 280 nm Volumen de fracciones: 4.5 mL Gradiente usado: Tiempo (in) Flujo (L/min) % de A % de B Curva Inicial 100 0 10 10 100 0 1 25 10 80 20 6 85 10 67.5 32.5 6 95 10 67.5 32.5 1 155 10 55 45 6 165 10 0 100 6 170 10 100 0 6 180 10 100 0 1 Fracciones recolectadas son individualmente analizadas por IEX-HPLC analítico usando las condiciones analíticas y gradiente descrito anteriormente. Las fracciones puras se combinaron para proporcionar material purificado de 95% y la pureza por arriba como se determina por los perfiles de absorbancia UV a 254 nm.
Ejemplo 62. Metodo RP-Sep-Pak general para la desalación de oligonucleótidos ARN purificados.
La solución de las fracciones puras combinadas se cargó en un cartucho Sep-Pak (Waters, Cartuchos Sep-Pak Vac 35cc (lOg) Ci8) pre-cacondicionado con agua. Después de cargar la muestra (100 mL), el cartucho se lavó con agua milli Q (50 mL) para remover toda la sal y después lavó con 50% de ACN/agua para eluir el oligonucleótido ARN desalado de longitud completa. La solución recolectada se concentró in vacuo a un volumen de 5 mL y liofilizada a partir de agua.
E emplo 63: Preparación de Agentes de siARN de doble hebra Usando Hebras de oligonucleótido quiralmente controlado El presente ejemplo describe la preparación de agentes de siARN de doble hebra por templado térmico de hebras de oligonucleótido quiralmente controlado como se describe anteriormente.
Cada Hebra de ARN se mezcló con su hebra de ARN complementaria en concentración equimolar de 10 mM en lxPBS. Se preparó 0.5 mL de solución total para cada duplo y la mezcla se calentó a 90 °C por 2 min y se dejó enfriar durante el curso de varias horas. Las mezclas después se almacenaron a 4 °C. Propiedades fisico-quimicas de las hebras de ARN utilizadas están presentes abajo en la Tabla E-26.
Tabla E-26.
Secuencias de oligonucleótido usadas, siARN PCSK9 humana: hebra sentido (S) 5'-uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT-3 '; Hebra antsentido 1 (ASI) 5'-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT-3 '; Hebra antsentido 2 (AS2) 5'-asAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT-3 '. Nucleótidos de letra mayúscula: RNA, nucleótidos de letra minúsculas 2'-0Me, d = 2'-desoxi, s = fosforotioato. La arquitectura estereo describe la naturaleza estereoisomérica (configuración absoluta Rp/Sp) de cada átomo de fósforo en un enlace de fosforotioato del oligonucleótido proporcionado. Valores de peso molecular encontrado (PM) se obtuvieron usando los métodos analíticos correspondientes para los compuestos purificados (descrito anteriormente).
La Figuras 51 mostró traslapes de Perfiles IEX-HPLC mostrando diferencia en tiempos de retención entre oligonucleótidos de ARN estereopuros.
La Figura 52 mostró traslapes de perfiles IEX-HPLC mostrando diferencia en tiempos de retención entre oligonucleótidos de ARN estereopuros.
Además a los anteriormente específicamente ejemplificados, oligonucleótidos de siARN quiralmente controlados preparados, la presente invención proporciona la preparación de siARN duplos que tiene varios enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral, y enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral completo.
Por ejemplo, de conformidad con la presente invención, enlaces de fosforotioato quiral múltiples se introducen dentro de un Oligonucleótido ARN usando las 3'- fosforamiditas de ARN quiral apropiado, que tiene grupos protectores 2'-OH adecuados, tal como 2'-O-Piv0M (Debart et al . , Chem. Eur. J. , 2008, 14, 9135), 2'-0-CEM (Ohgi et al . , Org. Lett . , 2005, 7, 7913; Wada et al . , J. Org . Chem. , 2012, 77, 7913), 2'-O-T0M (Pitsch et al., Helv. Chim . Acta, 2001, 84, 3773) o 2'-0-TC (Dellinger et al . , J. Am. Chem. Soc. , 2011, 133, 11540). Cada una de las hebras sentido siARN de PCSK9 Humanas que tienen varios enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral completo pueden ser preparados de conformidad con la presente invención: NOTA: letras minúsculas representan residuos ARN de 2'-OMe; letras mayúsculas representan residuos ARN; d residuos 2'-desoxi; y "s" indica una porción de fosforotioato.
Ejemplos de sintesis por Hebras antisentido siARN PCSK9 Humanas que tiene varios enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral completo.
NOTA: letras minúsculas representan residuos ARN de 2'-OMe; letras mayúsculas representan residuos ARN; d = residuos 2'-desoxi; y "s" indica una porción de fosforotioato . 5 Alternativamente o adicionalmente, la presente invención proporciona la preparación de siARN duplos que tiene varios enlaces internucleotidicos de fosforotioato quiral y enlaces internucleotidicos de fosforotioato quiral completo y porciones de ribosa completamente modificadas.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, enlaces de fosforotioato quiral múltiples se introducen dentro de un oligonucleótido ARN completamente modificado por ribosa usando las 3'-fosforamiditas ARN quirales apropiadas, que tienen la modificación 2'-química de ribosa deseada correspondiente, tal como 2'-desoxi-2'-fluoro (2'-F) o 2’-O-metilo (2'-0Me). Para dar pero en unos cuantos ejemplos, pueden ser preparadas cada una de las siguientes Hebras sentido completamente modificadas por 2'-F/2'OMe siARN de PCSK9 Humanas que tienen varios enlaces internucleotidicos de fosforotioato quiral y enlaces internucleotidicos de fosforotioato quiral completo.
NOTA: letras minúsculas representan residuos ARN de 2'-OMe; letras mayúsculas representan residuos ARN 2'-F; d = residuos 2'-desoxi; y "s" indica una porción de fosforotioato.
Ejemplos de síntesis para Hebras antisentido completamente modificada por 2'-F/2'-OMe siARN de PCSK9 Humanas que tienen varios enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos de fosforotioato quiral completo.
NOTA: letras minúsculas representan residuos ARN de 2'-OMe; letras mayúsculas representan residuos ARN de 2'-F; d = residuos 2'-desoxi; y "s" indica una porción de fosforotioato.
Para ensamblar duplos, Hebra de ARN recocida térmica y se realizó la preparación de siARN duplos. Específicamente, cada Hebra de ARN se mezcló con su hebra de ARN complementaria en concentración equimolar de 10 m en lxPBS. Se preparó 0.5 mL de solución total para cada duplo y la mezcla se calentó a 90 °C por 2 min y se dejó enfriar durante el curso de varias horas. Las mezclas después se almacenaron a 4 °C.
Siguiendo la etapa de templado térmico de la hebra de ARN, se pueden preparar todas las combinaciones posibles de duplo de siARN recociendo cualquiera de las Hebras Sentido con cualquier hebra complementaria de las Hebras antisentido.
Todos los siARN duplos preparados se pueden evaluar in vitro por sus propiedades de silenciamientodel gen PCSK9, después de la transfección en células HeLa o células Hep3B (por ejemplo, como se describe en la presente). De conformidad con la presente invención, diferentes potencias se pueden observar para diferente duplos, por ejemplo, que varía en número, posición, y/o arquitectura estereo de los enlaces de armazón de fosforotioato quiral, y opcionalmente también en presencia, nivel, y/o tipo de uno o más de otras modificaciones químicas.
Cualquiera o todas las propiedades de siARN tal como: resistencia a nucleasa, penetración celular, escape endosomal, estabilidad termodinámica de duplo, estructura tridimensional del duplo, afinidad hacia las variadas etapas mecanisticas de interacciones enzimáticas, afinidad hacia el mARN objetivo, efectos dirigidos específicos, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinéticas, etc. se pueden modular e influenciar por la estereoquímica de los enlaces de armazón de fosforotioato quiral, como se describe en la presente.
Ejemplo 64. Preparación de Preparaciones de oligonucleótido quiralmente controladas ' .
- I El presente ejemplo describe la preparación de una variedad de composiciones quiralmente controladas particulares de ciertos oligonucleótidos descritas en la presente.
A^-Acetil-S'-O-DMTr-2'-O-metilcitidina (1) (1.15 g, 1.91 mmol) se disolvió en DCM anhidro (20 mL) y se mezcló con 2 equiv de anhídrido succínico (0.383 g, 3.82 m ol) y 3 equiv de 4-N,N-dimetilaminopiridina (0.701 g, 5.73 mmol). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después del consumo completo del material de partida como se determinó por TLC (1 hora), los solventes se evaporaron a sequedad, el residuo crudo se disolvió en DCM que contiene 1% de trietilamina, después se purificó por cromatografía instantánea en gel de sílice usando a gradiente de 0 - 2% de MeOH en DCM que contiene 2% de trietilamina. Rendimiento del compuesto de succinilo puro (2) después de la evaporación fue 1.50 g, 98 %. MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 702.27, encontrado: 702.34. La íZ-acetH -ó'-O-DMTr-3'-O-succinil-2' -O-metilcitidina resultante (2) (0.18 g, 0.22 mmol), N, N- diisopropiletilamina (0.18 mL, 0.79 mmol) y Amino Soporte™ GE Custom (1 g) se recuperaron en DMF (5 mL) después se agregó HBTU (0.10 g, 0.26 mmol). La mezcla fue sacudida por 2 h, después se filtró. El soporte se lavó con DMF, MeOH y finalmente DCM después se secó in vacuo. Análisis de catión de tritilo (monitoreado a 504 nm) mostró que la carga de nucleósido en el soporte (3) fue 180 pmol/g.
Ejemplo 65. Preparación de Preparaciones de oligonucleótido cpiiralmente controladas * i í Usando un procedimiento análogo a aquel descrito en el Ejemplo 64, A^-Fenoxiacetil-S1-O-DMTr-31-O-succinil-2'-O-metilguanosina (4, MS (ESI +ve): cale (M+H)+: 834.30, encontrado: 834.32) fue cargada en Amino Soporte™ GE Custom. Análisis de catión de tritilo (monitoreado a 504 nm) mostró que la carga de nucleósido en el soporte (6) fue 140 pinol/g.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos que contienen enlaces internucleotidicos fosforotioato triéster 2'-OMe estereodefinido se sintetizarin en Sintetizador de ADN/ARN ABI 394 de conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-27 usando 10 pinol de capacidad para columna de síntesis cargada con 60 mg (10.8 y 8.4 p ol respectivamente) de ya sea 5'-O-DMTr-2'-O-metil-GPac enlazado a succinilo no tapado (6, 140 pmol/g) o 5'-O-DMTr-2'-0-metil-CAc (3, 180 pmol/g). El ciclo de síntesis se realizó con una etapa perliminarmente taponada (taponado 2) y con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal. Las etapas de sulfurización estereoespecificas se realizaron usando el reactivo S-(2-cianoetil)metiltiosulfonato 0.3M en ACN que contiene BSTFA, siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de taponado de dos etapas (Tabla E-27).
Una vez que el ciclo de síntesis de oligonucleótido automatizado se completó, y el grupo 5'-0-DMTr final se removió, la columna de síntesis fue recuperada del sintetizador de ADN/ARN y se secó bajo vacío. El soporte seco fue transferido en un sintetizador de péptido manual de vidrio vacío y 10 mL solución de 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno 0.5M (DBN), N, O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida 0.25 M (BSTFA) en ACN fue continuamente agregado al soporte por 5 min sin detener el flujo en el sintetizador de péptido manual. El soporte se lavó por ACN y se secó in vacuo. Después, el soporte se trató con 5%de EtOH/NH3 concentrado (5 mL) a 60 °C por 6 h, y se dejó a temperatura ambiente por 12 h. El soporte se removió por filtración y se lavó con NH3 concentrado. Lo filtrado se concentró in vacuo después se purificó por IEX.
Tabla E-27. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destriti- 3 + 120 + 3% de TCA en DCM N. A. lación 10 fosforamidita 0.15M Acopla + 6 30 + 900 miento ACN 5% de Pac20 en taponado 1 30 60 THF/2 , 6-lutidina 5% de Pac20 en taponado 2 THF/2,6-lutidina + 30 60 16% de NMI en THF (S-cianoetil)- metiltiosulfonato Sulfuri- 0.3M 120 + 3x60 15 + 3x4 II + 300 -II- en ACN/BSTFA Síntesis de Oligonucleótido ONT-94: (All ( Sp) ) - gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 18.26 min. PM cale: 3563.9; PM encontrado: 3562.6.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-96: (All (J¾p))— gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 18.16 min. PM cale: 3563.9; PM encontrado: 3561.7.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-98: {Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp) -gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 18.05 min. PM cale: 3563.9; PM encontrado: 3562.5.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-lOO: (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp) -gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 17.86 min. PM cale: 3563.9; PM encontrado: 3561.1.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-102: {Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp) -gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 18.30 min. PM cale: 3563.9; PM encontrado: 3561.3.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-104: (Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp) -gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 17.95 min. PM calc3563.9; PM encontrado: 3562.7.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-95: (All (Sp))-gscscsuscscsasg. fcR (IEX-HPLC): 14.78 min. PM cale: 2709.2; PM encontrado: 2707.4.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-97: (All (Rp))-gscscsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 15.60 min. PM cale: 2709.2; PM encontrado: 2708.3.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-99: (Rp, Sp, Rp , Sp, Rp, Sp, Rp) - gscscsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 16.10 min. PM cale: 2709.2; PM encontrado: 2708.0.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-101: (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp) -gscscsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 16.23 min. PM cale: 2709.2; PM encontrado: 2708.2.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-103: (.Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp) -gscscsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 16.26 min. PM cale: 2709.2; PM encontrado: 2707.8.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-105: (Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp) -gscscsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 16.22 min.
PM cale: 2709.2; PM encontrado: 2710.0.
Oligonucleótidos que contiene enlaces internucleotidicos fosforotioato triéster 2'-OMe y fosforotioato triéster 2'-O-M0E quiméricos estereodefinidos se sintetizaron on ADN/RNA ABI 394 en una forma análoga a aquellas descritas en los presentes ejemplos.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-90: (All (Rp)) GMOEsGMOESUsGMOES(SMOEScisasGMOEsGMOE£ . tp (1EX—HPLC): 1S.35 min. PM cale: 3828.2; PM encontrado: 3826.5.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-119: (All (Sp)) - GMOEsGMOESUsGMOEsGMOEsesasGMOEsGiioESc. ÜR (IEX—HPLC): 16.42 min. PM cale: 3828.2; PM encontrado: 3827.2.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-91: (All (Rp)) GMoESCSCSUscscsasg. tR (IEX-HPLC): 15.69 min. PM cale: 2753.3; PM encontrado: 2751.5.
Síntesis de Oligonucleótido ONT-120: (All (Sp)) GMoESCSCsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 14.71 min. PM cale: 2753.3; PM encontrado: 2751.4.
Ejemplo 66. Método IEX-HPLC general para el análisis de oligonucleótidos RIPtido DMT desactivado crudos y purificados : Amortiguador A: TrisHCl 10 mM, 50% de ACN, pH 8.0 Amortiguador B: TrisHCl 10 mM, NaC104800 mM, 50% de ACN, pH 8.0 Columna: DIONEX, ADNPac, PA-200, Analítico, 4.0><250mm Temperatura de columna = 60 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: iempo (min) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 95 5 2 1 95 5 1 22 1 70 30 6 25 1 5 95 6 25.5 1 95 5 6 30 1 95 5 1 Ejemplo 67 Método UPLC-LCMS general para el análisis de Oligonucleótidos RIPtido DMT desactivado puros: Amortiguador A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, Agua Amortiguador B: 50:50 Amortiguador A/Metanol Columna: UPLC@OST Ci81.7 mm, 2.1x500mm Temperatura de columna = 50 °C Gradiente usado: Tiempo (min) Fluj (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 0.2 80 20 2 0.2 80 20 1 22 0.2 30 70 6 25 0.2 5 95 6 25.5 0.2 80 20 6 30 0.2 80 20 1 E emplo Método IEX-HPLC general para la purificación de oligonucleótido RIPtido DMT desactivado crudo : Amortiguador A: NaOH 20 mM, pH 11.0 Amortiguador B: NaOH 20 mM, NaCl 2.5 M, pH 11.0 Columna: Columna vacía Waters AP-1 (Waters), envasada en casa habitualmente con soporte Source 15Q (GE Healthcare). La misma columna de purificación se usó por los diferentes oligonucleótidos RIPtido estereopuros.
Instrumento: Purificador AKTD, equipado con la bomba P-900, el detector UPC-900 y 50 mL de inyección SuperLoop (GE Healthcare) Temperatura del calentador de amortiguador establecida a = 70 °C Calentador de columna fijado a = 70 °C Señal monitoreada a 254 nm Volumen de fracciones: 5 mL Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 100 0 15 4 100 0 1 25 4 90 10 6 35 4 90 10 1 45 4 80 20 6 60 4 80 20 1 80 4 65 35 6 95 4 65 35 1 120 4 45 55 6 125 4 45 55 1 126 4 100 0 6 140 4 100 0 1 Fracciones recolectadas son individualmente analizadas por IEX-HPLC analítico usando las condiciones analíticas y gradiente descrito anteriormente. Las fracciones puras se combinaron para proporcionar material purificado de 95% y la pureza por arriba como se determina por los perfiles de absorbancia UV a 254 nm.
Método RP-Sep-Pak general para la desalación de oligonucleótidos RIPtidos purificados. La solución de las fracciones puras combinadas se cargó en un cartucho Sep-Pak (Waters, Cartuchos Sep-Pak Vac 35cc (10 g) Cig) pre acondicionados con agua. Después de cargar la muestra (100 mL), el cartucho se lavó con agua milli Q (50 mL) para remover toda la sal y después lavó con 50% de ACN/agua para eluir el oligonucleótido ARN desalado de longitud completa. La solución recolectada se concentró in vacuo a un volumen de 5 mL y liofilizada a partir de agua.
Un panel de RIPtidos modificado con fosforotioato completamente estereocontrolado (8-mero o 10-mero) que se une a hTR desduno son investigados por la inhibición de la actividad del complejo telomerasa RNP in vitro. El ensayo Cy5-TRAP (Shay et al . , Na t . Protoc. , 2006, 1, 1583), una variación del TRAP (Shay et al . , Science, 1994, 266, 2011), es usado para determinar los valores IC50 para los RIPtidos de fosforotiato estereocontrolados usando Extractos de célula HeLa, de conformidad con protocolos previamente reportados (Verdine et al . , J. Biol . Chem. , 2012, 287, 18843).
Ensayos TRAP se realizaron siguiendo los protocolos previamente reportados que usan fluorescencia como un sistema de cuantificación, con algunas modificaciones. Brevemente, la extensión de un sustrato artificial fluorescente para telomerasa se llevó a cabo por 30 minutos a 30 °C, seguido por amplificación con 30 Ciclos PCR (34 °C 30 s, 59 °C 30 s, 72 °C 1 min). El potencial inhibitorio de los RIPtidos es inicialmente valorado en extractos de célula HeLa, en experimentos por duplicado, usando un intervalo de concentración a 600 pM-60 mM. Experimentos con RIPtidos seleccionados se repitieron por un intervalo de concentración de 0.06 pM-60 mM en extractos de célula HeLa, DU145 (cáncer de próstata) y HEK293. Varios controles se usaron en estos ensayos: un control positivo (lisado celular sin tratar), controles negativos (solamente amortiguador, inactivado con calor y RNase se trató extractos de célula), y Control de amplificación PCR (60 mM de RIPtido se agregó después de alargamiento de telomerasa y antes del PCR). En ciertas modalidades, preparaciones RIPtido quiralmente controladas muestran inhibición mejorada de hTR comparada con el control positivo y/o inhibición mejorada de hTR comparada con el control negativo; en algunas modalidades, algo, pero opcionalmente no todos los RIPtidos de una secuencia proporcionada muestra estas propiedades. En algunas modalidades, por "mejorado" en este contexto se refiere a mejorado por aproximadamente cinco veces y aproximadamente diez veces. En algunas modalidades, por "mejorado" se refiere a, al menos aproximadamente 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, o 10.0-veces.
Condiciones de Cultivo Celular. La línea de célula de riñón embriónico transformada HEK293 y la linea de celula de cáncer de próstata DU145 se mantienen en DMEM complementado con 10% de suero de bovino fetal en 5% de COå a 37 °C. Extractos solubles de célula para Ensayos TRAP se prepararon por lisis de detergente de 106 células con 200 pL IX Amortiguador de Lysis CHAPS (Chemicon) como se describió en en las instrucciones del fabricante.
De conformidad con la presente invención, diferentes potencias y/o otras propiedades diferentes pueden ser observadas por las variadas estereoarquitecturas de RIPtidos de fosforotioato completamente estereocontrolados. Por ejemplo, propiedades de RIPtido tal como: resistencia a nucleasa, acumulación de tejido, penetración celular, escape endosomal, estructura tridimensional del RIPtido, afinidad hacia el objetivo RNA hTR plegado, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinéticas, etc., puede variar por preparaciones de RIPtido quiralmente controladas que forman la misma secuencia pero difieren entre si con respecto a diferente ubicación y/o estereoquímica de uno o más enlaces de armazón de fosforotioato quirales.
Ejemplo 69 : Composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados muestra diferente actividad in vivo comparada con composiciones quiralmente no controladas que tiene la misma secuencia El presente ejemplo compara in vivo actividad farmacológica de oligonucleótidos quiralmente puros con el observado por la mezcla estereoaleatorio "precursora" (es decir, por a composición que contiene oligonucleótidos de la misma secuencia como los oligonucleótidos quiralmente puros pero no exhiben pureza quiral, por ejemplo como un resultado del que ha sido preparadopor medio de un proceso estereoaleatorio). Cuatro oligonucleótidos quiralmente puros, cada de los cuales tiene una complementariedad de secuencia a la de un transcripto objetivo particular o gen que codifica una proteina de interes son sintetizados, formulados y administrados dos veces por semana durante 5 semanas a dos niveles de dosis cada una, a animales que expresan el gen objetivo. Los niveles de niveles de proteina codificadas se cuantificaron. En este ejemplo, los oligonucleótidos que tienen un antisentido de secuencia a (y por lo tanto objetivo) Apolipoproteína-B humana (ApoB) se usaron para prueba de concepto en ratones transgénicos que expresan ApoB humano Artículos de Prueba Los artículos de prueba son PBS solo (es decir, control sin oligonucleótido) o la composición relevante del oligonucleótido (es decir, oligonucleótidos Mipomersen (ONT- 41), ONT-75, ONT-77, ONT-80, o ONT-81 (véase Ejemplo 52 para estructuras) se formularon en IX PBS (diluido desde 10X PBS (Life Technologies, AM9624) usando agua libre de nucleasa (Qiagen, 129115)) a 0.5 y 1 mg/mL para dosificación a 5 y 10 mg/kg, respectivamente. Las formulaciones se basan en masa absoluta sin ajuste para el material activo. Las concentraciones de oligonucleótido se confirmaron por medición con un Carry-100 UV-Vis (Agilent Technologies). Las muestras de todos los artículos de prueba se verificaron para niveles de endotoxina usando un ensayo de endotoxina cromogénica pirocromo cinética (Associates de Cape Cod, 1500-5, E005-5). Todas las muestras probadas se encontraro que tienen una cantidad inferior de endotoxina que el límite aceptable 0.5 EU/ml.
Animales y Procedimiento In Vivo Ratones transgénicos hembras (ratones huApoB) que expresan altas concetraciones de plasma de apolipoproteína B100 humana y lipoproteína(a) (J. Clin. Invest. 92: 3029- 3037) se obtuvieron de Taconic (cepa B6.SJL-Tg(APOB)1 102Sgy N20+?, modelo #1004-F). Todos los animales se someten a genotipo antes del suministro.
Los animales son suministrados y se dejan aclimatarse por al menos siete días antes del inicio del estudio. A todos los ratones se les proporciona alimento regular y agua ad libitum, no se somenten a ayunas antes de la administración del compuesto. Los ratones son aleatorizados en grupos de estudio, y dosificados intraperitonealmente (IP) a 10 ml/kg a los Días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29 y 32, en base al peso corporal del ratón individual medido antes de la dosificación en cada día de dosificación. Se recolectó sangre durante el curso del estudio a los Dias 0 (día antes de la primera dosis), 17, 24, 31, 38, 45, 52 y 60 por submandibular (mejilla) se desangra y se sacrifica el en Día 66 por punción cardiaca, y después se procesa a suero.
Ensayo de Proteína Apolípoproteína B Niveles de proteína ApoB en suero se midieron usando un Kit ELISA Humano ApoB (Abcam, abl08807). Muestras de suero se diluyeron 1:20,000 y se sometieron a ensayo por el protocolo recomendado del kit sin modificaciones. Se realizaron lavados automáticos con periodos de remojado de 30 segundos usando un Aquamax 4000 (Molecular Devices). Las reacciones se detuvieron después de 12 minutos de incubaciones con el sustrato Cromogen y se tomaron mediciones con un Spectramax M5 (Molecular Devices).
Se generaron curvas estándar trazando la concentración estándar en el eje x y la absorbancia a 450 nm media correspondiente en el eje y. La línea de mejor ajuste se determinó por análisis de regresión usando ajuste de curva log-log. Cada placa de ensayo incluye un control negativo (PBS tratado) y un positivo (tratado con Mipomersen) y cada muestra de suero de ratón se sometió a ensayo en 4 réplicas téenicas.
Para cada muestra, el nivel absoluto medio de ApoB se normalizó al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de la expresión de proteína ApoB. En un caso, un animal se excluyo del análisis ya que las mediciones derivadas de la media cohorte por 2 desviaciones estándar. Los niveles relativos de expresión de proteína ApoB se usaron para análisis estadístico (Graphpad Pris ) por ANOVA de 2 vías seguido por la prueba post-hoc de Newman-Keuls.
Resultados Los resultados se muestran en la Tabla E-28a y Figura 40. en relación a PBS, 5 mg/kg IP ONT-75 resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en el día 24 del estudio, a 87% (p < 0.05). En relación a PBS, 5 mg/kg IP ONT-77 resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero, en los días 24, y 31 del estudio, ao 72% (p < 0.0001), 81% (p < 0.05) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 5 mg/kg IP ONT-80 resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 24 y 31 del estudio, a 83% (p < 0.05), 80% (p < 0.05) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 5 mg/kg IP ONT-81 resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17 y 24 del estudio, a 85% (p < 0.05), 70% (p < 0.0001) de niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28a: Niveles de Apolipoproteína B Humana en suero en relación a PBS Después de Dosis 1P múltiples de 5 mg/kg de Estereoisoómeros o Mipomersen en Ratón huApoB (N = 4-5] a: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) b: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) c: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) d: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) w: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.5 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) x: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) y: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) z: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-75 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significantemente menor de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 (p < 0.0001), y 45 (p < 0.05) del estudio. Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-77 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significantemente menor de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 31 y 38 (p < 0.0001), 24 (p < 0.001) y 45 (p < 0.05) del estudio. Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-80 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significantemente menor de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 (p < 0.0001), pero no fue diferente en el día 45 (p > 0.05) del estudio. Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-81 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significantemente menor de niveles de proteína ApoB en suero en los dias 17, 31 y 38 (p < 0.0001), 24 (p < 0.001) y 45 (p < 0.01) del estudio. La Figura 40 mostró el curso de tiempo de Niveles de proteina B de apolipoproteina humana en suero con relación a PBS después de 5 mg/kg de dosificación IP de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB. Las flechas hacia abajo indican días de dosificación. Se muestran medias del grupo normalizadas para el grupo de control PBS, en donde cada uno de los grupos comprende 4-5 anmales. Las barras de error representan desviaciones estándar.
Los resultados de 10mg/kg del paradigma de dosificación se muestran en la Tabla E-28b y Figura 53. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-75 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteina ApoB en suero en los dias 17, 24 y 38 del estudio, a 78% (p<0.0001), 76% (p < 0.0001) y 82% (p<0.001), respectivamente. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-77 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteina ApoB en suero en los dias 17, 24, 31, 38, 45 y 52 del estudio, a 62% (p < 0.0001), 61% (p < 0.0001), 54% (p < 0.0001), 59% (p < 0.0001), 72% (p < 0.0001), y 73% (p < 0.0001) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-80 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteina ApoB en suero en los dias 17, 24, 31, 38, 45, 52 y 66 del estudio, a 55% (p < 0.0001), 59% (p < 0.0001), 73% (p < 0.0001), 67% (p < 0.0001), 76% (p < 0.0001), 76% (p < 0.0001), y 80% (p<0.01) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-81 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteina ApoB en suero en los dias 17, 24, 31, 38 y 45 del estudio, a 49% (p < 0.0001), 62% (p < 0.0001), 71% (p < 0.0001), 74% (p < 0.0001) y 79% (p < 0.001) de niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28b: Niveles de Apolipoproteina B Humana en suero en relación a PBS Después de Dosis IP múltiples de 10 mg/kg Estereoisoómeros (ONT-75, -77, -80 o -81) o Mipomersen en Ratón huApoB (N = 4-5) a: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) b: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.01 (ANOVA.de 2 vias con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) c: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.001 (ANOVA de 2 vias con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) d: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vias con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) w: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) x: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) y: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post- hoc de Newman-Klauls) z: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post- hoc de Newman-Klauls) Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-75 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente menor (baja) de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31,38, 45, 52, 60 (p < 0.0001), y 66 (p < 0.001) del estudio. Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-77 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente menor (baja) de niveles de proteina ApoB en suero en los días 17, 24, 31, 38, y 45 (p < 0.0001), 60 (p < 0.05) y 66 (p < 0.01) del estudio. Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-80 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente menor (baja) de niveles de proteina ApoB en suero en los días 24, 31, 38 y 45 (p < 0.0001), 17 (p <0.001) y 66 (p <0.01). Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-81 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente menor (baja) de niveles de proteína ApoB en suero en los días 24, 31, 38 y 45 (p < 0.0001), 17 (p < 0.01), 52 y 66 (p < 0.001) del estudio.
Para el día 38 (es decir, 6 días después de la última dosis), los niveles de proteína ApoB en suero han regresado a la línea base después de ONT-75. Considerando la reducción del nivel de proteína ApoB en suero inicial, la velocidad de regreso a la línea base de la proteína ApoB en suero fue más lenta después de ONT-77 y ONT-80 y el nivel de la proteína ApoB en suero es similar a los niveles de Mipomersen para el dia 52.
Los resultados de 5mg/kg del paradigma de dosificación de arqutecturas estereopuras adicionales se muestran en la Tabla E-28c y Figura 54. En relación a PBS, 5 mg/kg de ONT-87 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 del estudio, a 27% (p<0.0001), 40% (p < 0.0001), 55% (p<0.0001) y 71% (p<0.0001) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 5 mg/kg ONT-88 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteina ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 del estudio, a 47% (p<0.0001), 34% (p < 0.0001), 69% (p<0.0001) y 85% (p<0.0001) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 5 mg/kg ONT-89 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24 y 31 del estudio, a 43% (p<0.0001), 48% (p < 0.0001) y 85% (p<0.05) de niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28c: Niveles de Apolipoproteína B Humana en suero en relación a PBS Después de Dosis IP múltiples de 5 mg/kg de Estereoisoómeros (ONT-87, -88 o -89) o Mipomersen en Ratón huApoB (N = 3-4) a: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) b: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) c: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) d: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) w: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) x: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) y: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post- hoc de Newman-Klauls) z: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post- hoc de Newman-Klauls) Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-87 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente mayor (baja) de niveles de proteína ApoB en suero en el día 31, (p < 0.01) del estudio. Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-88 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente menor (baja) de niveles de proteina ApoB en suero en el dia 17 (p < 0.05 del estudio). Comparado con 5 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-89 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente menor (baja) de niveles de proteina ApoB en suero en el dia 38 (p < 0.05) del estudio.
Los resultados de 10mg/kg del paradigma de dosificación de arqutecturas estereopuras adicionales se muestran en la Tabla E-28d y Figuras 55 y 56. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-87 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, y 24 del estudio, a 27% (p<0.0001), 14% (p < 0.0001) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-88 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, y 24 del estudio, a 23% (p<0.0001), y 17% (p < 0.0001) de niveles de control, respectivamente. En relación a PBS, 10 mg/kg ONT-89 IP resultó en reducciones significantes de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, y 24 del estudio, a 29%(p<0.0001), y 23% (p < 0.0001) de niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28d: Niveles de Apolipoproteina B Humana en suero en relación a PBS Despues de Dosis IP múltiples de 10 mg/kg Estereoisoómeros (ONT-87, -88 o -89) o Mipomersen en Ratón huApoB (N = 3-4) a: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) b: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) c: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) d: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control Mipomersen (ONT-41), con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) w: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.05 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) x: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.01 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) y: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) z: Estadísticamente diferente a partir del grupo de control PBS, con p< 0.0001 (ANOVA de 2 vías con Prueba post-hoc de Newman-Klauls) Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-87 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente mayor (baja) de niveles de proteína ApoB en suero en el día 17, (p < 0.05) del estudio. Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-88 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente mayor (baja) de niveles de proteína ApoB en suero en el día 17 (p < 0.05) del estudio. Comparado con 10 mg/kg de Mipomersen IP, ONT-89 administrado con el mismo paradigma de dosificación resultó en reducción significativamente mayor (baja) de niveles de proteína ApoB en suero en el día 17 (p < 0.05) del estudio.
Por lo tanto, en al menos algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de oligonucleótido quiralmente controladas que muestra una actividad biológica y se caracterizan por persistencia prolongada y/o velocidad más lenta de decaimiento de esta actividad durante un tiempo comparada con una referencia apropiada (por ejemplo, una preparación de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, incluyendo particularmente preparaciones estereoaleatorias). En algunas modalidades en donde esta persistencia prolongada y/o velocidad más lenta de decaimiento se observó, siempre que las composiciones quiralmente controladas puedan ser administradas de conformidad con un régimen de dosificación con dosis totales menores y/o periodos más largos entre dos o más dosis que es utilizada con la composición estereoaleatoria "precursora" para lograr efecto biológico y/o terapéutico comparable. Por ejemplo, el regreso más lento a la linea base de la proteina ApoB en suero siguiendo el tratamiento con oligonucleótido quiralmente puro comparado con Mipomersen como se demuestra en el presente Ejemplo, se sugiere que los oligonucleótidos ApoB quiralmente puros se puedan dosifcar con menos frecuencia que la mezcla estereoaleatoria parenteral (por ejemplo, que Mipomersen).
Los resultados presentados en este Ejemplo demuestran, por ejemplo, que composiciones de oligonucleótido quiralmente puras pueden tener actividad farmacológica significativamente diferente in vivo comparada con una referencia apropiada (por ejemplo, una preparación de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, incluyendo particularmente preparaciones estereoaleatorias), y específicamente comparada con una preparación estereoaleatoria "parenteral". Aquellos expertos en la téenica, a la vista de esta demostración, apreciarán que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados siempre que por la presente descripción tengan actividades y características inesperadas. Aquellos expertos en la téenica, a la vista de la presente descripción, además pueden apreciar que metodologías variadas siempre que, incluyendo métodos terapéuticos que utiliza régimen de dosificacións que difiere de aquellos utilizadas por composiciones quiralmente no controladas (por ejemplo, de la misma secuencia de nucleótido). En algunas modalidades, las dosis individuales relativamente grandes de oligonucleótidos quiralmente controlados (por ejemplo, quiralmente puro) se pueden utilizar para compararse con un control (por ejemplo, control estereoaleatorio). En algunas modalidades, dosis individuales relativamente más pequeñas de oligonucleótidos quiralmente controlados (por ejemplo, quiralmente pur) se pueden utilzar para compararse con un control (por ejemplo, un control estereoaleatorio). En algunas modalidades, dosis relativamente pequeñas de oligonucleótidos quiralmente controlados (por ejemplo, quiralmente puro) se pueden utilizar para compararse con un control (por ejemplo, un control estereoaleatorio) dentro de un periodo de tiempo proporcionado.
Ejemplo 70: Agentes siARN Que comprenden Oligonucleótidos quiralmente controlados Inhiben PCSK-9 El presente ejemplo demuestra inhibición exitosa de la expresión del gen objetivo usando agentes siARN comprendidos de oligonucleótidos quiralmente controlados como se describe en la presente. Específicamente, este Ejemplo describe hibridización de hebras de oligonucleótido individuales preparadas a través de síntesis quiralmente controladas como se describe en la presente, así que composiciones de oligonucleótido siARN quiramente controlado de doble hebra se proporcionan. Este Ejemplo además demuestra transfección exitosa de células con estos agentes y, además, inhibición exitosa de expresión del gen objetivo.
Transfección siARN de Moléculas siARN quirales Células Hep3B, o HeLa son inversamente transfectadas a una densidad de 2.OcIO4células/cavidad en placas de 96 cavidades. La transfección de siARN se llevó a cabo con lipofectamina RNAiMax (Life Technologies, cat. No. 13778-150) usando el protocolo del fabricante, excepto con una cantidad disminuida de Lipofectamina RNAiMax de 0.2ul por cavidad. Doce, diluciones de duplo siARN 1:3 se crearon partiendo de luM. lOul de lOx siARN duplo después se lipoplexó con una mezcla preparada de 9.8ul de medio libre de suero y 0.2ul de Lipofectamina RNAiMax por cavidad. Después de una incubación de 10-15 minutos, 2.0*104células en 80ul de Medio de crecimiento celular EMEM (ATCC, 30-2003) se agregaron llevando el volumen final hasta lOOul por cavidad. Dos eventos de transfección separadas se realizaron por cada dosis. 24 horas después de transfección, células Hep3B o HeLa se lisaron y mARN PCSK9 se purificó usando Kit de Aislamiento ARN total MagMAXTK-96 (Life Technologies, AM1830); 15ul de cADN se sintetizó con Kit de Transcripción Inversa cADN de Alta Capacidad con inhibidor de ARNse (Life Technologies, 4374967). La expresión del gen se evaluó por PCR de tiempo real en un Lightciclor 480(Roche) usando un Mezcla Maestra de Sondas (Roche, 04 707 494 001) de conformidad con el protocolo del fabricante usando un juego de sonda Taq an etiquetado con FAM para PCSK9 (Life Technologies, Hs03037355__ml) y un control endógeno limitado por el cebador GAPDH etiquetado con VIC (Life Technologies, NM_0020 46.3).
IC50s y Análisis Datos Se usó el método Ct del ta delta para calcular los valores. Las muestras se normalizaron a hGAPDH y calibradas para transfectar mock y muestras no tratadas. Se suó una molécula estereoaleatoria como control positivo. Los datos son representados como una media de 2 réplicas biológicas usando Prisma Graphpad. Una curva de regresión lineal de cuatro parámetros se fijo a los datos y la parte inferior y superior son reducidos a constantes 0 y 100 respectivamente para calcular un IC50 relativo.
Tabla E-29. Valores IC50 relativos [Transfección Hep3B] Tabla E-30. Valores IC50 relativos [Transfección HeLa] Tabla E-31. Valores IC50 relativos de siARNs con 3 estereocentros fosporotioato [Transfección HeLa] Las Figuras 45-50 presentan resultados de estos estudios. La Figura 45 mostró el % de mARN PCSK-9 restante después del tratamiento de Hep3B con siARN duplo. La Figura 46 mostró el % de mARN PCSK-9 restante después del tratamiento de Hep3B con ajuste de curva de siARN duplo. La Figura 47 mostró el % de mARN PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con siARN duplo. La Figura 48 mostró el % de mARN PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con ajuste de curva de siARN duplo. La Figura 49 mostró el % de mARN PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con siARN duplo que contiene 3 estereo-centros de Fosforotiato. La Figura 50 mostró el % de mARN PCSK-9 restante después del tratamiento de HeLa con siARN duplo que contiene estereo-centros de 3 ajustes de curva de Fosforotiato.
Como se puede observar, en las moléculas con un fosforotioato estequiométricamente definido único en cada hebra, se observó una potencia ligeramente incrementada con moléculas con estereoquímica Sp en el fosforotioato en ambas hebras sentido y antisentido. Mientras los agentes siARN específicamente ejemplificados contienen solamente un centro quiral por hebra, aquellos expertos en la téenica, que leerán la presente descripción, pueden reconocer la significancia del efecto diferencial demostrado como prueba del principio que la presencia de quiralidad puede impactar la actividad.
El impacto de quiralidad es más pronunciada en siARN con más de dos estereocentros . En siARN 3 fosforotioatos quirales (uno en la hebra sentido y dos en la hebra antisentido), una estereoquímica Sp en el extremo 5' (entre nucleótidos ni y n2) combinado con una estereoquímica Rp en el extremo 3' (entre nucleótidos n20 y n21) de la hebra antisentido tiene efectos nocivos en potencia. Sin embargo, una estereoquímica Rp en el extremo 5' (entre nucleótidos ni y n2) combinado con una estereoquímica Sp en el extremo 3' (entre nucleótidos n20 y n21) de la hebra antisentido muestra una baja en mejoramiento mARN de PCSK-9 significante sobre siARN control estereoaleatorío. Los resultados sugieren que ambas hebras son afectadas por la estereoquímica del fosforotioato. Es igualmente que la eficacia observada diferencia podrá incrementarse para agentes con números grandes de centros qirales y, sin embargo que ambas ubicaciones y tipos del centro quiral pueden impactar la actividad, por ejemplo a través de los efectos en estabilidad, potencia y/o ambos. Aquellos expertos en la téenica, que leerán la presente descripción, por lo tanto apreciaran que proporciona enseñanzas de ambas composiciones de oligonucleótido quiralmente controladas de hebra doble y sencilla, y usos de los mismos que, en al menos alguna de las modalidades, distinguir estos oligonucleótidos quiralmente controlados y agentes de agente estereoaleatorios de secuencias idénticas.
Ejemplo 71. Oligonucleótidos ejemplares adicionales y Síntesis de los mismos.
Oligonucleótidos N101-N104 se sintetizaron usando la síntesis automatizada en el sintetizador ABI-394 ADN/ARN de conformidad con el ciclo sintético resumido en Tabla E-32, usando 1 mmo? de columna de síntesis y 1.7 mpno? de oxalilo enlazado a dGCE,Pac en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). Después del final de la síntesis automatizada de Oligonucleótido, el soporte HCP se lavó con ACN seco y se secó bajo vacío. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de NH3/Py saturado por 1 h a 55 °C, después 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por 18 h a TA. Los solventes después se evaporaron y el residuo se resuspendió con solución acuosa de HCl ~pH 1.5 que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (de conformidad con el procedimiento descrito abajo) . Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (de conformidad con el procedimiento descrito abajo). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-32. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/AR Usado por la síntesis de oligonucleótidos N101-N102. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en THF/2,6 3 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI en 20 60 2 THF S-(N- metilpiperazinoetil- Sulfuri- ToluilTioSulfonato 0.3M 360 + 5 7 + 1.5x4 3x180 + zación 900 en ACN/BSTFA E emplo 72. Metodo HPLC por N101 y N102: Amortiguador A: TEAA 50 mM, pH 9.6 (ajustado con TEA) Amortiguador B: ACN Columna: XBridge C8, 3.5 mm, 4.6x50mm, Parte #186003034 Temperatura fijada del calentador de amortiguador 35 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado : Tiempo Flujo (ml/min) % de B Curva Inicial 99 1 2 1 99 1 1 22 1 70 30 6 25 1 5 95 6 25.5 1 5 95 6 30 1 99 1 1 Ejemplo 73. Método UPLC-LCMS general para N101 y N102.
Amortiguador A: formiato de amonio lOmM, pH 9.5 [ajustado con NH3 ac.) Amortiguador B: ACN Columna: UPLC@OST Cíe 1.7 mm, 2.1><500mm Temperatura de columna = 35 °C Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo (mL/min) Curva Inicial 0.5 2 0.5 1 12 0.5 6 13 0.5 6 13.5 0.5 6 15 0.5 1 Ejemplo 74. Método de Purificación General para N101 y N102: Amortiguador A: TEAA 50 m pH=9.6 (ajustado con TEA) Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Prep Ci8, 5 mm, Ci8, 250><10mm, Parte #186003256 Temperatura fijada del calentador de amortiguador TA Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1 5 4 99 1 1 10 4 95 5 6 30 4 74 26 6 35 4 5 95 6 36 4 5 95 6 38 4 99 1 6 45 4 99 1 1 100 mL de 49-51% de ácido fosfórico se agregó a cada fracción (pH 3) y se verificó por HPLC, después se almacenó a -80°C hasta que se congeló. Las fracciones se mantuvieron en liofilizador para un acoplamiento de horas hasta que 1/2 del volumen después se almacenó a -80°C.
Ejemplo 75._ Método de desalación general para N101 y N102: Amortiguador A: ácido fórmico 10 mM Amortiguador B: ACN Columna : XBridge Prep Ci8, 5 mm, C18, 250><10mm, Parte #186003256 Temperatura fijada del calentador de amortiguador= TA Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 100 0 12 4 100 0 1 13 4 65 35 6 21 4 65 35 1 21.5 4 100 0 6 30 4 100 0 1 Fracciones recolectadas se almacenaron en -80°C hasta que se congeló y se mantienen en liofilizador hasta sequedad y se verificó por HPLC.
Ejemplo 76. Síntesis de Oligonucleótido N101 (All- Oligonucleótido N101 se sintetizó como se describe anteriormente y se purificó. RT en RP-HPLC: (Método HPLC NI): 15.9 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 1614.64; Encontrado [+H]: 1615.06.
Ejemplo 77. Síntesis de Oligonucleótido N102 (All-(£p)-d[5mCsl6Asl6Gsl6T]) Oligonucleótido N102 se sintetizó como se describe anteriormente y se purificó. RT en RP-HPLC (Método HPLC NI): 16.4 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 1614.64; Encontrado [+H]: 1614.97.
Ejemplo 78. Sintesis de Oligonucleótido N103 (All- (¾>)-d[5mCsl6Asl6Gsl6Tsl65mCsl6Tsl6Gsl65mCsl6Tsl6Tsl65mCsl6G]) Oligonucleótido N103 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC NI): 18.4 min.
UPLC/ESI-MS: Calculado para Cw HsuN^OgsPuS : 5233.38; Encontrado: 5234.7.
Ejemplo 79. Síntesis de Oligonucleótido N104 (All- (Sp)~ d[5mCsl6Asl6Gsl6Tsl65mCsl6Tsl6Gsl65mCsl6Tsl6Tsl65mCsl6G] ) Oligonucleótido N104 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC NI): 18.7 min.
UPLC/ESI-MS: Caled: 5233.38; Encontrado: 5232.9.
Oligonucleótidos N105-N106 se sintetizaron usando la síntesis automatizada en el sintetizador ABI-394 ADN/ARN de conformidad con el ciclo sintético resumido en Tabla E-33, usando 1 mmo? de columna de síntesis y 1.7 pmol de oxalilo enlazado a dGCE,Pac en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). Después del final de la síntesis automatizada de Oligonucleótido, el soporte HCP se lavó con ACN seco y se secó bajo vacío. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de NH3/i-PrOH sat. por 16 h a 55 °C. El solvente fue después evaporó y el residuo se resuspendió con pH 7.0 solución acuosa que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa. El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-33 . Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador de ADN/ARN ABI-394 Usado por la síntesis de oligonucleótidos N105-N106. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 2 5 + 4 30 + 600 miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en 3 20 60 1 THF/2,6-lutidina 5% de Pac20 en taponado 4 THF/2,6-lutidina + 16% 20 60 2 de NMI en THF 0.3 M 360 + Sulfuri 5 7 + 1.5x4 3x180 + zación _ _ _ — 900 en ACN/BSTFA Ejemplo 80. Metodo HPLC para N101 y N102: Amortiguador A: TEAA 50 M, pH 7.0 Amortiguador B: ACN Columna: XBridge C8, 3.5 mm, 4.6xl50mm, Parte #186003034 Temperatura fijada del calentador de amortiguador Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1 2 1 99 1 1 22 1 80 20 6 25 1 5 95 6 25.5 1 5 95 6 30 1 99 1 1 E emplo 81. Metodo UPLC-LCMS general para N101 y N102.
Amortiguador A: formiato de amonio lOmM, pH 7.0 Amortiguador B: ACN Columna: UPLCdOST Ci81.7 mm, 2.1*500mm Temperatura de columna = 35 °C Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 0.5 99 1 2 0.5 99 1 1 12 0.5 70 30 6 13 0.5 5 95 6 13.5 0.5 5 95 6 15 0.5 99 1 1 Ejemplo 82. Síntesis de Oligoimcleótido N105 (All- Oligonucleótido N105 se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC: (Método HPLC N2): 14. min.
UPLC/ESI-MS: Caled: 1977.78/ Encontrado[-H]: 1978.8.
Ejemplo 83. Síntesis de Oligonucleótido N106 (All-(Sp)-d[5mCs9As9Gs9T]) Oligonucleótido N106 se sintetizó y se purificó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC N2): 14.7 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 1977.78; Encontrado[-H]: 1977.37.
Oligonucleótidos xxx se sintetizaron usando la síntesis automatizada en el sintetizador ABI-394 ADN/ARN de conformidad con el ciclo sintético resumido en Tabla E-33, usando 1 mmo? de columna de síntesis y 1.7 ¡umol de oxalilo enlazado a dGCE,Pac en HCP. El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). Después del final de la síntesis automatizada de Oligonucleótido, el soporte HCP se lavó con ACN seco y se secó bajo vacío. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de NH3/i-PrOH sat. por 16 h a 55 °C. El solvente fue después evaporó y el residuo se resuspendió con pH 7.0 solución acuosa que contiene 10% de DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa. El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-34. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforaidita 0.15M en 5 + 4 30 + 600 miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en THF/2,6- 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado lutidina + 16% de NMI en 20 60 2 THF 0.3 M 300 + - 10 + 4x2 3x150 + 600 ACN/BSTFA Ejemplo 84. Método de Purificación General Amortiguador A: TEAA 50 mM Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Prep Cíe, 5 mm, C18, 250xl0mmf Parte #186003256 Temperatura fijada del calentador de amortiguador ta Señal onitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (l/min) de A de B Curva Inicial 99 1 5 4 99 1 1 10 4 95 5 6 30 4 74 26 6 35 4 5 95 6 36 4 5 95 6 38 4 99 1 6 45 4 99 1 1 Método HPLC 5: Tiempo Flujo (ml/min) % de A Curva Inicial 80 20 2 1 80 20 1 22 1 45 55 6 25 1 5 95 6 25.5 1 5 95 6 26 1 85 20 6 30 1 85 20 1 ONT-60 : Oligonucleótido 149 All-(-Rp)- El oligonucleótido se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 5): 15.80 min.
UPLC/ESI-MS: Caled: 6345.6; Encontrado: 6340.7.
ONT-69: All-(gp)- d[5mCsl6As8Gs8Ts85mCs8Ts8Gs85mCs8Ts8Ts85mCs8G] El oligonucleótido se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 5): 18.61 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 6345.6; Encontrado: 6340.6.
Ejemplo 85.
Los oligonucleótidos block ero y altmero modificado con P que contiene ambos enlaces internucleotidicos fosforotioato diéster estereodefinido y morfolinoetil fosforotioato triéster estereodefinido se sintetizaron en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARNde conformidad con el ciclo resumido en la Tabla E-4 usando 1 pinol columna de síntesis y 1.7 mmo? de oxalilo enlazado a dGCE,Pac en HCP. Ya sea enlace de fosforotioato modificado con P estereodefinido fue introducido en posiciones predeterminadas dentro de la secuencia para realizar ya sea la etapa de sulfurización (1) o (2). El ciclo de síntesis se realizó con remoción del grupo 5'-O-DMTr terminal (DMT Desactivado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se colocó en un vial de plástico y se trató con 1 mL de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) por un periodo de 18 h a t.a. Los solventes después se evaporaron y el residuo se suspendió nuevamente en DMSO y el soporte HCP se filtró. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones que tienen pureza por arriba de 95% se combinaron, se concentraron y desalinizaron por HPLC de fase inversa (Gradiente de 0 a 80% de ACN). El producto desalinizado final se liofilizó a partir de agua.
Tabla E-4. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetizador de ADN/ARN ABI-394 Usado por la síntesis de Ejemplo 85. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI en 20 60 2 THF S-Morfolinoetil p- Clorofenilo tiosulfonato 300 + Sulfuri- °-3M 10 + 4x2 3x150 + 600 en ACN/BSTFA S-cianoetil Metiltiosulfonato 0.3M 300 + Sulfuri- 10 + 4x2 3x150 + 600 en ACN/BSTFA Ejemplo 86._ Metodo de Purificación General por E emplo 85: Amortiguador A: Fosfato 20 mM pH=6.0 (ajustado con ácido fosfórico) Amortiguador B: ACN Columna: XBridge Prep Ci8, 5 mm, Ci8, 250><10mm, Parte #186003256 Temperatura fijada del calentador de amortiguador^ 50 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1 5 4 99 1 1 10 4 77 23 6 60 4 70 30 6 65 4 20 80 6 70 4 20 80 6 71 4 99 1 6 80 4 99 1 1 Método HPLC 6 Amortiguador A: acetato de amonio 20 mM, pH 6.0 Amortiguador B: ACN Columna: XBridge C8, 3.5 mm, 4.6xl50m, Parte #186003034 Temperatura fijada del calentador de amortiguador 60 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo Flujo (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 90 10 2 1 90 10 1 22 1 75 25 6 25 1 5 95 6 25 1 5 95 6 25. 5 1 90 10 6 30 1 90 10 1 d[5mCslAslGsTs5mCsTsGs5mCsTsTsl5mCslG] El oligonucleótido se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 6): 9.39 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 4297.9; Encontrado: 4295.3 ONT-72:_ All- (gp)- d[5mCslAslGsTs5mCsTsGs5mCsTsTsl5mCslG] El oligonucleótido se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 6): 10.84 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 4297.9; Encontrado: 4295.7 ONT-73:_ All-(Rp)- d[5mCslAsGslTs5mCslTsGsl5mCsTslTs5mCslG] 5 El oligonucleótido se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 6): 13.54 min.
UPLC/ESI-MS: Caled: 4524.2; Encontrado: 4522.6 d[5mCslAsGslTs5mCslTsGsl5mCsTslTs5mCslG] El oligonucleótido se sintetizó como se describe anteriormente. RT en RP-HPLC (Método HPLC 6): 15.52 min. UPLC/ESI-MS: Caled: 4524.2; Encontrado: 4521.0 Propiedades de oligonucleótido del fármaco tal como: resistencia a nucleasa, acumulación de tejido, penetración celular, escape endosomal, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinéticas, etc. son todas moduladas e influenciadas por la estereoquímica de los enlaces de armazón de fosforotioato quiral.
Oligonucleótidos RNA que contiene enlaces fosfodiéster internucleotídico 2'-OH, 2'-OMe, 2'-F, 2'-desoxi, o fosforotioato diéster estereodefinido internucleotídico o fosforotioato triéster estereodefinido internucleotídico (ProDrug) (ya sea liberación de un fosfodiéster internucleotídico (PO) o un fosforotioato diéster estereodefinido internucleotídico (PS)) son sintetizados en Sintetizador de ADN/ARN ABI 394 de conformidad con los ciclos resumidos en la Tabla E-35, Tabla E-36, Tabla E-37 y Tabla E- 38, usando a 10 pinol de capacidad columna de síntesis cargado con 130 mg (4.9 pmol) de oxalilo enlazado a 5'-O-DMTr-2'- desoxitimidina preparada como previamente se describió. Antes de la síntesis, se realizó una etapa perli inarmente taponada (taponado 2) y la síntesis es terminada con remoción de los grupos 5'-O-DMTr terminales. La etapa de oxidación se realizó usando una solución 5-6M comercialmente disponible de hidroperóxido de tere-butilo (TBHP) en decano la cual fue después diluida con cuatro partes diclorometano. La etapa de sulfurización estereoespecíf ica por enlace fosforotioato diéster estereodefinido internucleotidico se realizó usando el reactivo S-cianoetilmetiltiosulfonato 0.3M siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de taponado de dos etapas (Tabla E-36). La etapa de sulfurización estereoespecífica para fosforotioato triéster estereodefinido internucleotidico liberando un enlace fosfodiéster estereodefinido internucleotidico (PS) se realizó usando el reactivo S- (2\7-morfolinoetiltioéster-etil)-para-nitro-Toluiltiosulfonato 0.3 M siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de taponado de dos etapas (Tabla E-37). La etapa de sulfurización estereoespecífica para fosforotioato triéster estereodefinido internucleotidico liberando un enlace fosfodiéster internucleotidico (PO) se realizó usando el reactivo S- (U-morfolinoetil)-Toluiltiosulfonato 0.3M siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de taponado de dos etapas (Tabla E-38). Para Nucleótidos ARN 2'-OH, grupos protectores 2 ' -0- base se usaron, tal como 2'-0-Piv0M (Debart et al., Chem . Eur J. , 2008, 14, 9135) o 2'-0-TC (Dellinger et al., J. Am . Chem .
Soc. , 2011, 133, 11540). Ultra-mild (C-Ac, G-Pac, A-Pac) se usaron grupos protectores para todas las nucleobases.
Una vez que el ciclo de síntesis de oligonucleótido automatizado se completó y el grupo 5'-O-DMTr final se removió, la columna de síntesis es recuperada del sintetizador de ADN/ARN y se secó bajo vacío. 10 mL de solución de 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno 0.5 M (DBN), N, 0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida 0.25 M (BSTFA) en ACN es continuamente agregado al soporte a través de la columna de síntesis por 1 min, sin detener el flujo usando una jeringa unida a un extremo de la columna de síntesis. El soporte después se lavó con ACN anhidro y se secó bajo vacío. Después, el soporte seco es transferido en un vial de plástico de tapa de rosca vacío y se trató con 10% de solución n-PrNH2 en piridina anhidra (1.5 mL) a temperatura ambiente por 12 h. Después de que, los solventes se evaporaron a sequedad y el residuo incluyendo el soporte sólido se disolvió en 2 mL de agua/DMSO (50/50) a pH 5, el soporte se filtró y los filtrados se recolectaron, inmediatamente se congelaron y se almacenaron a -80 °C antes de la purificación.
Tabla E-35. Resumen para Síntesis de Oligonucleótido en un Sintetlzador de ADN/AR ABI 394 tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 120 + 1 3% de TCA en DCM N. A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 2 7 + 6 30 + 600 miento ACN + CMPT 2M en ACN 5% de Pac20 en THF/2,6- 3 taponado lutidina + 16% de NMI en 10 20 THF hidroperóxido de tere- 4 oxidación butilo 1.1 M en 4:1 20 110 dicloroetano:decano Tabla E-36. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador de ADN/ARN ABI 394 tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 120 + 1 3% de TCA en DCM N. A tilación 10 30 + 900 fosforamidita quiral (2'-OMe Acopla¬ 2 0.15M en ACN + CMPT 2M 8 + 6 RNA) miento en ACN 30 + 600 (ADN) taponado 5% de Pac20 en THF/2,6- 30 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI 30 60 2 en THF S- (2-cianoetil) metiltiosulfonato 0.3M Sulfuri- 120 + 3x60 5 15 + 3x4 zación - - + 300 en ACN/BSTFA Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN. tiempo de tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 1 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en 2 5+ 4 30+ 600 miento ACN + CMPT 1.2M en ACN taponado 5% de Pac20 en THF/2,6- 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI 20 2 en THF S- (N-morfolinotioéster- etil-p-nitro- Sulfuri- Toluiltiosulfonato 0.3M ^00 + 5 10 + 4c2 3x150 + zación 600 en ACN/B5TFA Tabla E-38. Resumen para Sintesis de Oligonucleótido en un Sintetizador ABI-394 de ADN/ARN. tiempo de Tiempo de etapa reacción reactivo suministro espera (seg) (seg) Destri- 3 + 60 + 3% de TCA en DCM N.A. tilación 10 Acopla- fosforamidita 0.15M en ACN 2 600 20 60 1 lutidina 5% de Pac20 en THF/2,6- taponado 4 lutidina + 16% de NMI en 20 60 2 THF S-Morfolinoetil Toluiltiosulfonato 0.3M 300 + Sulfuri 5 4x2 3x150 + zación - - 600 en ACN/BSTFA (slO Síntesis de Oligonucleótido: (-Rp) uucuAGAccuGuuuuGcuudTslOdT Síntesis de Oligonucleótido ONT-107: (Sp) -uucuAGAccuGuuuuGcuudTs1OdT Síntesis de Oligonucleótido ONT-108: (í?p)- AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTs1OdT Síntesis de Oligonucleótido ONT-109: (Sp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTs1OdT Síntesis de Oligonucleótido: (Rp, Rp) -aslAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT Síntesis de Oligonucleótido: (Sp, Rp) ~ aslGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT Síntesis de Oligonucleótido: (Sp, Sp)-aslGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT Síntesis de Oligonucleótido: (Rp, Sp)- aslGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT Síntesis de Oligonucleótido: (All (Sp))- uslucuslAGAccsluGusluusluGcuudTslOdT Síntesis de Oligonucleótido: (All {Rp) ) ~ As1OAGcAAAAcAGGslUCuAslGAs1Ad s10dT Templado térmico de hebra ARN y preparación de siARN duplos. Cada hebra de ARN se mezcló con su hebra de ARN complementaria en concentración equimolar de 10 mM en lxPBS. Se preparó 0.5 mL de solución total para cada duplo y la mezcla se calentó a 90 °C por 2 min y se dejó enfriar durante el curso de varias horas. Las mezclas después se almacenaron a 4 °C.
Después de la etapa de templado de hebra ARN térmica, todas las posibles combinaciones de siARN duplo se prepararon templando cualquiera de las hebras sentido con cualquier hebra complementaria posible de las Hebras antisentido.
Todos los siARN duplos preparados se evaluaron in vitro por sus propiedades de silenciamiento del gen PCSK9, seguido por transfección en células HeLa o Células Hep3B.
Todos los siARN duplos preparados con grupos ProDrug se evaluaron ín vitro por sus propiedades de silenciamiento del gen PCSK9, seguido por recuperación libre en Células Hep3B, células Huh-7 o hepatocitos primarios humanos .
Diferentes potencias se observaron, moduladas por el número, la posición y la arquitectura estereo de los enlaces de armazón de fosforotioato quiral, se combinaron con las capas de modificaciones químicas adicionales y grupos ProDrug explorados.
Propiedades SiARN tal como: resistencia a nucleasa, penetración celular, escape endosomal, estabilidad termodinámica de duplo, estructura tridimensional del duplo, afinidad hacia las variadas etapas mecanísticas de interacciones enzimáticas, afinidad hacia el mARN objetivo, efectos objetivo específicos, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinéticas, etc. son todas moduladas e influenciadas por la estereoquímica de los enlaces de armazón de fosforotioato quiral así como también la presencia o la ausencia del grupo ProDrug.
La unión de PO y PS libera grupos ProDrug a los siARN duplos mejora su suministro intracelular y recuperación libre en la ausencia de reactivo de transfeción o ligando objetivo.
Ejemplo 87: Estudios de estabilidad de Oligonucleótidos Diastereomérreamente puros El presente ejemplo compara la estabilidad in vi tro de oligonucleótidos quiralmente puros con el observado por la mezcla estereoaleatoria "precursora" (es decir, por una composición que contiene oligonucleótidos de la misma secuencia como los oligonucleótidos quiralmente puros, pero no exhiben pureza quiral, por ejemplo como un resultado del que ha sido preparado por medio de un proceso estereoaleatorio). Siete oligonucleótidos quiralmente puros, cada uno de los cuales tiene una complementariedad de secuencia a la de un transcripto objetivo particular o gen que codifica una proteína de interés se sintetizaron, formularon y valoraron para estabilidad metabólica usando tres diferentes matrices biológicas: fosfodiesterasa de veneno de serpiente (svPDE), nucleasa Pl (nPl) y homogenados de hígado completo de rata. Niveles de oligonucleótido de longitud completa se cuantificaron por IEX-HPLC después de diferentes periodos de incubación. Los resultados presentados en este Ejemplo demuestra, por ejemplo, que las composiciones de oligonucleótido quiralmente puras pueden tener estabilidad metabólica significativamente diferente comparada con una referencia apropiada (por ejemplo, una preparación de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, incluyendo particularmente preparaciones estereoaleatorias), y específicamente comparada con una preparación estereoaleatoria "parenteral". En este Ejemplo, oligonucleótidos que tiene una secuencia antisentido a (y por lo tanto dirigidos a) Apolipoproteína-B humana (ApoB) se usan por prueba de concepto en estudios metabólicos de estabilidad.
Estudio de digestión Fosfodiesterasa de Veneno de serpiente (svPDE) por oligonucleótidos ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41 Se usó el protocolo reportado por Oka et al . (J. Am . Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037) con modificaciones menores. Se purificó el oligonucleótido (10 nmoles) en agua (50 pL), se agregó a la solución acuosa (450 mL, pH 8.6) que contiene svPDE (4 c 10~3 unidades), Tris-HCl 100 mM y MgCl215 mM. La mezcla fue incubated at 37 °C con shaking at 400 rpm. Una alícuota de 50 mL fue fue recuperada en cada punto de tiempo (O h, 12 h, I d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d y 7 d) y fue apagada con 25 pL de EDTA 150 mM, 2 pL de solución de Proteinasa K (20 mg/mL) y 30 pL de amortiguador de Lysis (Qiagen, #129115) y la mezcla se calentó a 60 °C por 20 min. 5pL de estándar interno (5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3', un oligonucleótido 27-mero (nucleótidos subrayados son 2'-MOE modificado), (200 mM) se agregó a la alícuota. Análisis de cuantificación se realizaron por IEX-HPLC y la identificación del etabolito se llevó a cabo por UPLC/MS. Los resultados son ilustrados en la Figura 59.
Análisis IEX-HPLC mostró degradación de fosforotioato 20-mero durante incubación con svPDE sin diferencia significante entre estereoisómeros. Análisis LCMS de metabolites reveló que la mayoría de los productos de degradación se formaron como un resultado de desulfurización. Como se reportó previamente por Prakash et al . ( Biochemistry 2002, 41 , 11642-11648), Prhavc et ai. ( Org. Lett . , 2003, 5, 2017-2020) y otros, también se observa que modificaciones 2'-MOE en extremos 5' y 3' protege estos oligómeros de digestión svPDE al cual es una exonucleasa 3'5'.
Estudio de digestión de Nucleasa P1 (nPl) por oligonucleótidos ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT- 88, ONT-89 y ONT-41 Se empleó el protocolo reportado por Oka et al. (J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037) con modificaciones menores. Oligonucleótido purificado (10 nmoles) en Waters (50 pL) se agregó aúna solución acuosa (500 mL, pH 7.2) que contiene nPl (20 unidades), Tris-HCl 100 mM y ZnCl21 mM. La mezcla fue incubada a 37 °C con agitación a 400 rpm. Una alícuota de 50 mL fue recuperada en cada punto de tiempo (0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, I d, 2 d,) y fue apagada con 25 m? de amortiguador de detención (EDTA 150 mM, 2 pL de solución de Proteinasa K (20 mg/mL) y 30 pL de amortiguador de Lysis (Qiagen, #129115) y la mezcla se calentó a 60 °C por 20 min. 5 m? de estándar interno (5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3 '), un oligonucleótido 27-mero (nucleótidos subrayados son 2'-MOE modificado) (200 mM) se agregó a la alícuota. Análisis de cuantificación se realizaron por IEX-HPLC y la identificación del metabolito se llevó a cabo por UPLC/MS. Los resultados son ilustrados en las Figuras 60-67.
Nucleasa nPl ha sido previamente reportada para enlaces de fosforotioato ADN específicamente desdoblados que tiene una (Sp) configuración absoluta en los átomos de fósforo (Porter et al., Biochemistry, 1983, 22, 1369-1377; Oka et al., J. M. Chem. Soc. , 2008, 130, 16031-16037). Se observó un patrón similar de desdoblamiento para los oligonucleótido fosforotioato gapmero 5-10-5 2'-MOE estudiados, en donde nPl fue encontrado por digerir eficientemente el núcleo ADN de los oligonucleótidos gapmero en lo centrps fosforotioato (Sp), sin afectar las alas 2'- MOE, las cuales son estables independientes de estereoquímica. La digestión completa del núcleo de ADN se observó en una hora para el oligonucleótido diastereomezcla estereoaleatoria ONT-41, así como también por los oligonucleótidos estereopuros que contienen enlaces internucleotídicos (Sp)-fosforotioato en el núcleo ADN (ONT-77, ONT-80, ONT-87, ONT-88 y ONT-89). Todos los productos del desdoblamiento son claramente identificados por UPLC/MS. Como previamente se reportó en la literatura, se encontró que ADN de fosforotioato (Rp) claramente no es sustrato para nPl. Los dos oligonucleótidos quiralmente puros que tiene núcleos ADN de fosforotioato (Ap) (ONT-75 y ONT-81) son completamente estables para nPl por un periodo de incubación de 1 h a 37°C. ONT-75 y ONT-81 mostraron c.a.10-15% de périda de productos de longitud completa durante el curso de incubación durante varios dias. Los resultados presentados en este Ejemplo demuestran, por ejemplo, que composiciones de oligonucleótido quiralmente puras pueden tener estabilidad metabólica significativamente diferente en un ensayo nPl comparada con una referencia apropiada (por ejemplo, una preparación de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, incluyendo particularmente preparaciones estereoaleatorias), y específicamente comparada con una preparación estereoaleatoria "parenteral".
Método IEX-HPLC general para el análisis de productos de digestión de enzima Amortiguador A: TrisHCl 10 mM, 50% de ACN, pH 8.0 Amortiguador B: TrisHCl 10 M, NaC104800 M, 50% de ACN, pH 8.0 Columna: DIONEX, ADNPac, PA-100, 4.0><250mm, Parte #063000 Temperatura de columna = 60 °C Señal monitoreada a 254 y 280 nm Gradiente usado: Tiempo (in) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 95 5 2 1 95 5 1 3 1 75 25 6 10 1 35 65 6 10.1 1 95 5 6 12.5 1 95 5 1 Método UPLC-LCMS general para el análisis de productos de digestión de enzima.
Amortiguador A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, Agua Amortiguador B: 50:50 Amortiguador A/Metanol Columna: UPLCOOST Cíe 1.7 mm, 2.1><500mm Temperatura de columna = 60 °C Gradiente usado: Tiempo (min) Flujo (mL/min) % de A % de B Curva Inicial 0.2 70 30 2 0.2 70 30 1 27 0.2 35 65 6 27.5 0.2 5 95 6 28.5 0.2 5 95 6 29 0.2 70 30 6 30 0.2 70 30 1 Estabilidades Metabólicas In Vitro de Oligonucleótidos Diastereoméricamente puros Humanos en Homogenados de Higado Completo de Rata Preincubados La estabilidad metabólica de oligonucleótidos quiralmente puros en homogenados de higado completo de rata in vi tro fue medida. El protocol empleado aquí ha sido previamente reportado y usado para evaluar la estabilidad de fármacos de oligonucleótido.
Protocolo: El protocolo reportado por Geary et al fue empleado en el actual estudio (Oligonucleótidos , 2010, 20, 309) con algunas modificaciones.
Sistema de Prueba: Se proporcionaron dos ratas Sprague-Dawlcy macho ( Rattus norvegicus) por Charles River Laboratories, Inc., (Hollister, CA).
Recolección de Tejido: Los animales se aclimataron en el cuato de estudio por dos dias antes de la recolección de tejido. Al momento de recolección de tejido, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal (IP) de solución de pentobarbital de sodio. La perfusión de higado se realizó usando 500 mL de salina/animal congelada, administrada por medio de la vena porta hepática. Después de la reperfusión, los hígados se seccionaron y se mantuvieron en hielo. Los hígados se picaron en piezas pequeñas, después se pesaron.
Preparación de Homogenado del Higado: Las piezas picadas de tejidos del hígado se transfirieron a tubos de centrifugación de 50 mi tarados y se pesaron. El amortiguador de homogenización refrigerados (Tris 100 mM, pH 8.0, acetato de magnesio 1 mM, con agentes antibióticos, antimicóticos) se agregaron a cada tubo, de forma que los tubos contienen 5 mL del amortiguador por gramo. Usando el homogenizador de tejido TissueRuptor QIAGEN, la mezcla hígado/amortiguador se homogenizó mientras se mantiene el tubo en hielo. Las concentraciones de proteina del homogenado de hígado se determinaron usando un ensayo de proteína BCA Pierce. Los homogenados de hígado se dividieron en alícuotas de 1 i, se transfirieron a crioviales y se almacenaron a -60°C.
Condiciones de Incubación: Alícuotas de 1 mL de este homogenado de hígado congelado (concentración de proteína = 31.9 mg/mL) se descongelaron e incubaron a 37 °C por 24 h. Se tomaron seis tubos eppendorf (2 mL) y se agregó 450 mL del homogenado en cada tubo.50 pL del oligonucleótido de prueba (200 pM) se agregó a cada tubo. Inmediatamente después del mezclado, 125 pL del (5c) amortiguador de detención (2.5% de IGEPAL, NaCl 0.5 M, EDTA 5 M, Tris 50 mM, pH = 8.0) y 12.5 pL de 20 mg/mL de Proteinasa K (Ambion, # AM2546) se agregó a un tubo por un punto de tiempo de 0 horas. La mezcla después se calentó a 60 °C por una hora. Las mezclas de reacción restantes se incubaron a 37 °C con agitación a 400 rpm en un agitador de Microplaca de Incubación VWR. Después de la incubación por un periodo indicado (1, 2, 3, 4, y 5 días), cada mezcla se trató con 125 pL de (5c) amortiguador de detención (2.5% de IGEPAL, NaCl 0.5 M, EDTA 5 mM, Tris 50 mM, pH = 8.0) y 12.5 mL de 20 mg/mL de Proteinase K (Ambion, # AM2546).
Desarrolló y Bioanálisis : (5'— GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3'), un oligonucleótido 27-mero (nucleótidos subrayados son 2'-MOE modificado) se usó como el estándar interno por cuantificación de Oligonucleótidos Diastereoméricamente puros. 50 pL de estándar interno (200 pM) se agregó a cada tubo seguido por adición de 250 pL de 30% de hidróxido de amonio, 800 pL de Fenol: Cloroformo: alcohol isoamilico (25:24:1). Después del mezclado y centrifugación a 600 rp , la capa acuosa se evaporó en velociad vac hasta 100 pL y se cargó en una columna Sep Pak (C18, lg, WAT 036905). Todos los lavados acuosos de la columna Sep pak se probaron método rápido IEX-HPLC para asegurar que no se encuentre producto aquí. El acetonitrilo eluido se concentró a sequedad y se disolvió en 100 pL de agua y se analizó usando RP-HPLC.
Eluyente A = Acetato de tributilamonio lOmM, pH=7.0 Eluyente B = ACN Columna: XTerra MS Ci8, 3.5 mm, 4.6x150 mm, Parte número: 186000432 Temperatura de columna = 60 °C Gradiente HPLC: Tiempo Flujo % de A % de B Curva 1 1.0 65 35 2 5.0 1.0 65 35 1 3 30.0 1.0 40 60 6 4 35.0 1.0 5 90 6 5 36.0 1.0 65 35 6 6 40.0 1.0 65 35 1 La Figura 68 mostró que diferente oligonucleótidos quiralmente puros tienen diferentes perfiles de estabilidad metabólica en ho ogenados de hígado de rata. El experimento también demuestra que la mezcla diastereoisomérica ONT-41 tiene un perfil de estabilidad metabólica diferente comparado con oligonucleótidos estereodefinido diastereoméricamente puros con la misma secuencia y composición química (ONT-75 y ONT-77 se usaron aquí como ejemplos, pero esta observación, como se aprecia por una persona de experiencia ordinaria en la téenica, puede ser extrapolada a otros posibles diaestereoisómeros fosforotioato estereodefinido diastereoméricamente puros de esta molécula).
El oligonucleótido ONT-75, que tiene armazón de fosforotioato estereocontrolado con configuración absoluta Rp completa en todos átomos de fósforo es completamente degradado en el día uno en homogenados de hígado competo de ratas preincubados a 37°C, demostrando la estabilidad metabólica menor de los tres usandos en el estudio.
Los otros oligonucleótido fosforotioato estereodefinido diastereoméricamente puros ONT-77 (que tiene configuración absoluta: 5R-10S-4R) son más de dos veces más estables que el ONT-41 estereoaleatorio (Mipomersen). Después de incubación por 5 dias, 40% del oligonucleótido de longitud completa permance para ONT-77 diastereoméricamente puro contra aproximadamente 15% del oligonucleótido de longitud completa para el ONT-41 estereoaleatorio (Mipomersen). Una comparación directa entre ONT-77 y ONT-41 claramente demuestra una estabilidad metabólica significativamente más alta para el isómero estereocontrolado 5R-10S-4R (ONT-77), a través de todos los puntos de tiempo analizados. La arquitectura estereodefinida del isómero diastereoméricamente puro ONT-77 claramene afecta la velocidad de degradación y la estabilidad metabólica total de este oligonucleótido. Estas observaciones conducen a la conclusión, sin la intención de ser limitada por teoría, que la estereoquímica Sp aplicada al núcleo ADN del oligonucleótido 5-10-5 gapmero proporciona resistencia a endonucleasa mejorada y por lo tanto estabilidad metabólica mejorada comparada con la diastereomezcla estereoaleatori. Algunas otras arquitecturas estereo usadas por otros isómeros fosforotioato estereocontrolados diastereoméricamente puros de esta secuencia pueden ser esperados para mostrar aún estabilidad metabólica mayor en este experimento.
Mientras se desees ser limitados por teoría, los resultados presentados en este Ejemplo demuestran, por ejemplo, que la estereoquímica Jp en el enlace de fosforotioato (ONT-75) es metabólicamente menos estable en homogenados de hígado de rata que en ONT-77, el cual contiene el núcleo ADN Sp. Los resultados presentados en este Ejemplo también demuestran, por ejemplo, que las composiciones de oligonucleótido quiralmente puras pueden tener estabilidad metabólica significativamente diferente en homogenado de hígado de rata comparada con una referencia apropiada (por ejemplo, una preparación de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, incluyendo particularmente preparaciones estereoaleatorias), y específicamente comparada con una preparación estereoaleatoria "parenteral". En este Ejemplo, oligonucleótidos que tiene una secuencia antisentido to (y por lo tanto dirigidos a) Apolipoproteína-B humana (ApoB) se usan por prueba de concepto en estudios metabólicos de estabilidad. Se proporcionan oligonucleótidos quiralmente controlados que pueden tener estabilidad incrementada o disminuida hacia enzimas endógenas. Proporcionando oligonucleótido y composiciones quiralmente controlados y métodos del mismo, la presente invención proporciona oligonucleótidos y composiciones que tienen propiedades farmacológicas mejoradas que los oligonucleótidos quiralmente no controlado conocidos y sus composiciones.
Estabilidades Metabólicas In Vibro de siARN duplos PCSK9 Humano Que tiene Enlaces Fosforotioato Diéster Estereocontrolados en Suero Humano.
Un protocol similar a procedimientos reportados previamente (Oka et al . , J. Am. Chem . Soc . 2008, 130, 16031-16037) is usado. Se agregaron síARN duplos (2.5 pmoles) en agua (50 pL) a suero humano (450 pL). La mezcla es incubada a 37 °C con agitación a 400 rpm. Alícuotas de 50 mL se recuperaron en cada punto de tiempo (O h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h) y se apagaron con 25 pL de EDTA 150 M, 2 pL de solución de Proteinasa K (20 mg/mL) y 30 pL de amortiguador de Lysis (Qiagen, #129115) y la mezcla se calentó a 60 °C por 20 min. 5pL de Estándar interno (5r-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3 ', un oligonucleótido 27-mero (nucleótidos subrayados son 2'-MOE modificado) (200 pM) se agregó a la alícuota. Análisis de cuantificación se realizaron por IEX-HPLC y la identificación del metabolito se llevó a cabo por UPLC/MS.
En algunas modalidades, el siARN duplos que tiene a fosforotioato diastereomericamente puro 3' terminal con la configuración Sp muestra estabilidad metabólica alta en suero humano comparada a los siARNs que tienen el fosforotioato con la configuración Rp, o la diastereomezcla estereoaleatoria, en la misma posición. En otras modalidades, el siARN duplos que tiene un fosforotioato diastereoméricamente puro 5' terminal con la configuración Sp muestra estabilidad metabólica alta en suero humano, comparada a los siARNs que tiene el fosforotioato con la configuración Rp, o la diastereomezcla estereoaleatoria, en la misma posición. En otras modalidades, siARN duplos que tiene fosforotioato diastereoméricamente puro con la configuración Sp, en ambas extremidades 3' y 5' muestra estabilidad etabólica alta en suero humano comparado a los siARNs que tienen el fosforotioato con la configuración Rp, o la diastereomezcla estereoaleatorias, en las mismas posiciones. En otras modalidades, siARN duplos que tiene fosforotioato diastereoméricamente puro múltiple con la configuración Sp muestra estabilidad metabólica alta en suero humano, comparada a los siARNs que tiene múltiples fosforotioatos con la configuración Rp, o la diastereomezcla estereoaleatorias. En otras modalidades, siARN duplos que tiene armazón completo de fosforotioato diastereoméricamente puros con la configuración Sp, muestra estabilidad metabólica alta en suero humano comparada a los siARNs que tienen el armazón completo de fosforotioatos con la configuración Rp, o las diastereomezclas estereoaleatorias.
Ejemplo 88. Composiciones de oligonucleótidos quiralmente controladas muestran diferente potencia in vitro comparadas con composiciones quiralmente no controladas que tiene la misma secuencia El presente ejemplo compara actividad farmacológica de oligonucleótidos quiralmente puros in vitro con el observado por la mezcla estereoaleatoria "precursora" (es decir, por a composición que contiene oligonucleótidos de la misma secuencia como los oligonucleótidos quiralmente puros pero no exhiben pureza quiral, por ejemplo como un resultado del que ha sido preparado por medio de un proceso estereoaleatorio). Cuatro oligonucleótidos quiralmente puros, cada uno de los cuales tiene una complementariedad de secuencia a la de un transcripto objetivo particular o gen que codifica una proteina de interés se sintetizaron, formularon, y transíectaron en hepatocitos de ratón primarios. Se cuantificaron niveles mARN para valorar el nivel de supresión. En este Ejemplo, oligonucleótidos que tiene una secuencia antisentido a (y por lo tanto dirigidos a) Apolipoproteina-B humana (ApoB) se usan para prueba de concepto en ratones transgénicos que expresan ApoB humano.
Transfección de Hepatocitos primarios de ratón con Oligonucleótidos Se usaron ratones C57BL6 machos de 7 semanas de edad para extraer y colocar hepatocitos primarios de ratón en placas de 96 cavidades (sin traslape) (Celsis/Bioreclamation IVT). La transfección de Hepatocitos primarios se llevó a cabo con lipofectina (Life Technologies, cat. No.18292-037) usando el protocolo del fabricante, usando 0.5ul de Lipofectina por placa de 96 cavidades. Doce, diluciones 1:3 de siARN duplo se crearon partiendo de 6uM. lOul de lOx oligo después se lipoplexó con una mezcla preparada de 9.5ul de Medio Gro HI In vitro (Celsis Cat. Z99009) medio libre de suero y 0.5ul de Lipofectina por cavidad. Después de una incubación de 10-15 minutos, 20 ul de oligo lipoplexado se agregó a hepatocitos primarios en 80ul de Medio Gro HI In vitro llevando el volumen final hasta lOOul por cavidad.24 horas después de la transíección, se U saron las células.
Ensayo mAKN de Apolipoproteina B mARN total se purificó de U sado celular usando Kit de Aislamiento ARN total MagMAX™-96 (Life Technologies, AM1830); 15ul de cADN se sintetizó con Kit de Transcripción Inversa cADN Alta Capacidad con Inhibidor de ARNse (Life Technologies, 4374967). La expresión del gen fue evaluada por PCR de tiempo real en un Lightciclor 480 (Roche) usando una Mezcla Maestra de Sondas (Roche, 04 707 494 001) de conformidad con protocolo de fabricante usando los siguientes cebadores : Cebadores de apolipoproteina B Humana: [Plantilla: (número de acceso a GenBank M35186)] • Cebador delantero: CGTGGGCTCCAGCATTCTA • Cebador inverso: AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC • Sonda PCR: FAM-CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA-TAMRA Cebadores GAPDH de Ratón: • Cebador delantero: GGCAAATTCAACGGCACAGT • Cebador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT • Sonda PCR: 5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3' Análisis de DAtos El método Ct delta delta se usó para calcular valores. Para cada muestra, la señal ApoB media se normalizó a la señal GAPDH media, y entonces se normalizó a la relación correspondiente media para muestras transfectadas y no tratadas mock, para obtener el nivel relativo de expresión de proteina ApoB. La mezcla estereoaleatoria "precursora" se usó para referencia. Una curva de regresión lineal de cuatro parámetros se fijó a los datos, y la parte inferior y superior se redujeron a unas constantes de 0% y 100% respectivamente para calcular un IC50 relativo usando Graphpad Prism.
Ls respuestas a la dosis in vitro (Figuras 71 y 72) muestran que los oligonucleótidos quiralmente puros tienen potencias significativamente diferentes, con ONT-83 siendo el más potente, y ONT-84 y ONT-85 siendo los menos potentes, con una diferencia de 8.6 veces en los IC50 (Tabla E-39).
Tabla E-39. Valores IC50 de estereoisómeros (ONT- 83, -84, -85 o -86) por Supresión de Niveles de mAKN de Apolipoproteina B/GAPDH de Rabón en Hepatocitos de ratón primarios Los resultados presentados en este Ejemplo demuestran, por ejemplo, que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente puros pueden tener actividad farmacológica significantemente diferente in vitro comaprada con una referencia apropiada (por ejemplo, una preparación de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, que incluye preparaciones particularmente esteroaleatorias), y específicamente comparada con una preparación estereoaleatoria "parenteral". Aquellos expertos en la téenia, en vista de esta demostración, apreciarán que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionadas por la presente descripción, tienen actividades y características inesperadas .
Equivalen-tes Habiéndo descrito algunas modalidades ilustrativas de la invención, debe ser aparente para aquellos expertos en la técnica que lo anterior es solamente ilustrativo y no limitante, habiéndo sido presentado por medio de ejemplo solamente. Numerosas modificaciones y otras modalidades ilustrativas están dentro del alcance de uno de habilidad ordinaria en la técnica y están contempladas como que caen dentro del alcance de la invención. En particular, aunque muchos de los ejemplos presentados aquí involucran combinaciones específicas de actos de métodos o elementos sistémicos, se debe entender que estos actos y estos elementos pueden ser combinados en otras formas para realizar los mismos objetivos. Los actos, elementos y características discutidas solamente en conjunto con una modalidad no están propuestas para ser excluidas a partir de un papel similar en otras modalidades. Además, para una o más limitaciones de función más medios mencionados en las siguientes reivindicaciones, los medios no están propuestos para ser limtiados a los medios descritos en la presente para realizar la función mencionada, sino están propuestos para cubrir en alcance cualquiera de los medios, conocidos ahora o desarrollados después, para realizar la función mencionada.
El uso de términos ordinarios como "primero", "segundo", "tercero", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento reivindicado, no basta para connotar cualquier prioidad, procedencia, u orden de un elemento reivindicado sobre otro o el orden temporal en el cual los actos de un método son realizados, sino son usados solamente con etiquetas para distinguir un elemento reivindicado que tiene un cierto nombra a partir de otro elemento que tiene un mismo nombre (pero por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos reivindicados. De manera similar, el uso de a), b), etc. , o i), ii), etc. no basta para connotar cualquier prioridad, procedencia, u orden de etapas en las reivindicaciones. De manera similar, el uso de estos términos en la especificación no basta para connotar cualquier prioridad requerida, procedencia u orden.
La especificación escrita anterior es considerada por ser suficiente para permitir a una persona experta en la téenica practiar la invención. La presente invención no está limitada en alcance por los ejemplos proporcionados, puesto que los ejemplos están propuestos como una ilustración única de un aspecto de la invención y otras modalidades funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y objetos de la invención no son necesariamente abarcados por cada modalidad de la invención D s o\ ? K) Jn O Oí O n o s\ \ n o en o en 20 \ > jn O Ln o en (? > \J N> O C i en (? ? n ro o en o Cn 20 V) Ji O O? O n D en s> > Ni n O en O en < \ ? N) !— 1 Jn O Oí O en 20 ? I— 1 n O en o Cn 20 696 D o 1 O n O cn \3 > Ji O Cn (Ji O r o en o en ? o Ni i— 1 Ln en o n eo I— 1 n o CJi o en D cn \> > 1P O Cn o Cn ( ) \ N) Jl O n en \> n O c_n O LTI O 00 ? ) n O en O en <sO kD \ G n o en o cn oo o V) IV) Ln o n o CJi V oD o ? N> Ji O en O n oO o NJ (? n O en O CJ1 20 I? o en o (Ji 00 \ N) n O (J1 O en D 00 Cn ? I? J O en O n o eo o N) J1 O en en O oo ? K3 Ji O en o n eo oo oo v> > Ln O en o Cn 00 \J > n O en cn o \ ho n o en o (Ji O D ? Ni O en o n e oo ro ? > O Cn O n OJ \> o f— 1 Ui o Cn o (J1 O £> >0 > LJl O en O n O eo n ? r Ji o en en D D > ui O n en O APÉNDICE (B) .
Ib (SEQ ID 1(10:11) .1. 1.3 * 0.1 i.8 * 0.0 1c (SEQ ID HO;15) , . ....E.. 13.3 = 4.4 9-5 ± 1.8 id (SEQ ID HO;16> ..M..JÍ..SMC. 13.0 = 2.3 18.3 a 7.5 2 (SEQ ID RO*.17 )RTCGA¾SGT<XA<¾³TJCTC 2.9 = 0.2 13.6 = 2.0 2a (SEQ ID K0;18 ) , .C^.CTC. C.. . 7.7 = 0.8 24.2 ± 3.2 2b (SEQ ID HO:19) ..Z..CTC.ZG..Z . 1.6 = 0.5 2.8 * 2.2 2c (SEQ ID HOí20) ..Z.,OtC. S. .... 3.1 ¾ 0.6 7.3 = 1.4 2d (SEQ ID HQ:21 ) ..£..CIC.^G. .Z. , 7.4 » 1.4 27.7 * 5.4 2e (SEQ ID HO¡22) ........A .. !.( c 2,{ SU 3D (SEQ ID NOialJGAGAaEGCTGCiACCTrCCAT 4.9 = 0.5 19.9 * 3.6 3 Da (SEQ ID HO«24 ) . Í -.C.. 5.6 = 1.5 33.9 * 6.8 3 De (SEQ ID KO:28) . . ¡5. 4.4 as 1.2 10.0 * 4.4 3Df (SEQ ID MO:29 ) ..... J....... 1.6 ± 0.1 7.7 ± 0.4 3Dg (SEQ ID HOi30) .. .CC.G.aCTG.. S.l * 1.5 18.6 * 1.5 3» (SEQ ID 110:31 ) TCCATGTCgffiTCCTGA QCT 1.1 : 0.2 23.2 ± 4.9 3 Na (SEQ ID HO:32) CT . 0.9 * 0.1 1.8 * 0.5 3fib (SEQ ID HO·33) . Z ... 1.3 * 0.3 1.5 x 0.6 3 Me (SEQ ID 140:34 ) . _^..Z .. 5.4 ± 1.5 8.5 * 2.6 3Ild (SEQ ID HO:35) . A _ G . 17.2 a 9.4 M0 3 Me (SEQ ID 110:36) . . C..A. 3.6 * 0.2 14.2 * 5.2 4 TCAACGTT S.l * 1.4 19.2 * S.2 4a ....GC.. 1.1 : 0,2 1.5 * 1.1 4b ...GCGC. 4.5.* 0.2 9.6 » 3.4 5 4c — icaa. 2.7.* í.o ME > N (Jl O en Oí TABLAS Inducción de secreción de IL-6 de Marina por porciones CpG en ADN bacterico a oliaonudeótidos. : i TABLA 5 Inducción de secreción de cítocina PBMC humana por oliaos CpG : S«¾ ID NOS47 TABLA 9 Inducción de la actividad deTiKpor ADN que contiene porciones de CpG pero no rot AON sin CpG ADN n Ciocina agregada Cítalas dí Ratón Células Humanas D*pt . >ímguno i .00 0 a 00: t I?i-2 16.08 13.82 8. Col i. DM¾ 7.23 S ,#5 ADN de tino de temerá i .00 C.Í0 Sxpt . Ninguno 0.00 3.26 2 - Ninguno 3«? 0.30 Los dínueíeótidos CpG son subrayados, los oligoaucleótidos fueron sintetizados con armazones modificadas con fosforotioato para mejorar su resistencia a la nucleasa. 1 Medido por incorporación de timidina 3 H después de 48 horas de cultivo con olígonudeótidos a una concentración de 200 nM como se describe en el Ejemplo 1. 2 Medido en unidades líricas US 6,214,806 B1 TABLA 1 Número ODN cypt t, ratones C3H¾FeJ I**# 014 * 15.4 88, r 15.7 ^5,8 * o 95 PoO 2? H * 3.5- 25.8 t 5,0* *^3.5 * 23 1631 47 ti i I U 46.141U.7 56.8 * , 11 1835 3 8 * ?L 44.4 * L! 96.8 t 0.78 1789 n o n K ».7V * 20.4 9f»,K x 2 1826 W8 » 7K \H T m 9* 8 * 14 Ninguno (sabia) 71 II * 7.4 603 * 69 97.8 * i 3 32Ls ratones C5735/é 1908 180 t 2.6 16.6 i 2. ? . * 3 / 17b») 102 t 2.3* «.6 * 2.1* 8. * 51) 1585 110* 2.2* 9,5 * 2.2* 84,6 *29 201 14 i * 2.1 U»t J.9 «3.4 * 24 Ninguno (sabia) JIM * ,3.4 16.9 ± 2.3 esspt 5 1908 19.0 a 2.5 30.9 2.1 89.4 t 1.4 1760 9.1 * 0.8- 7.7 í 0.7* «4.6 * 0.5 1972 is.a * o 145 * 1.4 84.2 * : 2 © de la actividad NK por oÍgodesoxérudeótidos CpG (ODN) % de lisis Específica de YAC- 1 * % de lisis Específica de 2€ 1 i Elector; ObfefiTO _ Efector; Objetivo Ninguno -U -1.4 18.5 16,6 1 16.3 24.5 48,7 4 2 3Dd 17.1 27.0 57,0 40,0 ODN m -CPG -18 -1.7 14.8 15,4 5 TABLA 3 Inducción de la actividad NK por APN que contiene porciones CpG pero no por ADN sin CpG ADN o ckodaa agregada LU / 10 *' CeMas Humanas Células de ratón Kxpt. I Ninguno o.so o.oa p,-a 16. $8 15,82 ADN de JI edi 7.23 5. OS ADN de tHB» de tomara 0.00 0.00 Bxp * 2 Ninguno 0,00 3,28 11» n¥R»KS KUkOg«« (SE3 10 mi21) 7.38 ll.Se l«S - - - ftc - 5EQ 10 W3s:22 > 0.00 4,4 Expt . 3 Ningnno 0.00 t« 13 «TIsSA^TmOWT 10 BO;23 > 5 ,22 17 SS — - X - (SE3 10 HG¡24 » 0.32 ND 1519 ¾5CATG¾ST CC QIÍE0C5 leí® ID K3l5 ) 3,35 1765 .....".......-c,.. (SE'J 10 113:25 ) 0 ,11 Los dkmcleottdos CpG en las secuencias ODN están indicados por subrayado; X indice mediato sina. Las letras mmóscutes indican ios enlaces intertmeteótidos modificados por fosforotioato resistentes s oucteasa. los cuales, en experimentos de tibiados, finart» más de 20 veces tan potentes como el ODN no modificado, dependiendo de las bases de. flanqueo Se usaron entremos Pol G (g) en algunos ODN. debido a qtie incrementan significantemente el nivel de la absorción de ODN Las fríe as punteadas indican que algunas bases son idénticas a aquellas en te secuencia directamente precedente con la excepción de los candaos Meados 5 TABLA 4 Inducción de ODN de ActñidadLítica deNK£LU] Qf1H Secuencia (5 '—31 > > LO Ninguno 0.01 1754 WZmQG IGA’KÍTGWTfCCCC'TC (SEQ ID NOt2« } 0.02 1758 TerCCCAGCCTOCeCCAT < SEQ ID MO*27) o ,m mi TJ CGCGTOCGACCCTCT ( StQ ID HOí28> 0.05 1776 KSft G¾A¿GAM!1¾ TTCCCCTC < SEQ ID NOi29) 0.05 1« 1777 «XAT »#jeGAGCI¾TTrCCCCTC { 8E ID NO*3C} 0.05 1778 AOCBTGQJlCGMCTGTTrCCCCTC ( SEQ ID NOt311 9.0i 177# JWCJI¡W»llC®TACTSTTTCCCCrC < 5EQ ID NQi3 ) 0.02 1780 ACCAT SGATGGl !TGTTTCCCCTr < SEQ ID NOs31) i*2f 1781 I^CA IGI^CT ’Wr TCCC Tr <SEQ ID NOt34} 8. I# 1823 ÍJCATGACGTTGAGC } SEQ ID NOí35) 0.00 15 1824 CACG GAGGGGCAE ( SEQ ID HÜ136) 0.01 1825 CTGCTG&GA TGGAS { SEQ ID NOt37} 0.01 1828 TCAGCOTGCGCC ( SEQ ID ?&>*38} 0.01 lB2t ATGACGTTCCTGACGT { SEQ ID «Os39} 0.42 183&2 RAMDOM SEQÜENCE 0*25 1834 tCTCCC&GC (XGCGCAT ( 5SQ ID NOt 0 } §.0d 2fl IBM fCUCCCAGCíXCC CCAT ( § XD Nüí41 | 9.46 I8i§ VXMTOTCGmCT&SCGTf ( SEQ ID NO í 4:2 } . Ifl 1841 TccJu Aocot ccTAOccTr í sm ID !»*« } 1.45 1842 «SSfCQCTQTCTCCeCTTCrr ( SEQ ID NOt 44 } 0.06 1851 TCCKICGTTCCTGK!GTT SEQ ID NO f 45 y 2.32 1 Las unidades Meas (LU) se sudíeron como se describe (8). Brevemente, PBMC se recolectaron a partir de donadores normales y se centrifugaron sobre Ftcofi, después se cultivaron con osind OD indicado (tes cuates se agregaron a cultivos a 6 pgml) por24 horas. Después se determinó su capacidad para Ksar células K562 etiquetadas con SI Cr. Los resobados mostrados son típicos de aquellos obtenidos con varios donadores humanos normales diferentes 2 Esta mezcla de o o contiene una selección aleatoria de todas tas 4 bases en cada posktcm.
TABLA 5 Macaón de NK LU por ODK de CpG de fosforotioato con baenas porciones omt Secuencia (5 *— .V > «f? 1 expt . 2 mxpt . 3 Nmguüü C .CJO 1 ,26 0.16 1940 TCCATfiTSSWCCRSTSSTT (SEQ ID NO!23 2.33 HB HE 1960 TCCtefCgTfCC STiQgrT (SEQ ID NO¡45) ND 0.48 i .99 1961 TCCftTCÍffirtirTGTQSTT (SEQ ID 80:47) 4.03 1.23 5 , 08 1962 TCCSfStCG/S TC CVKSVCGT (StQ ?E 80:13) ND USO 5.34 1963 XCC¾TCTairTCCTCTa*'« (SEQ SO 80149} 3.42 ND WO 1965 Keig egwywgcgccCT (SEQ ID NO¡14} 0.46 0.42 3.4» 1966 ¾S¾35CTCTCTCQiC,n,CTE (SEQ ID NO:44) 2.62 ND ND 1967 TSS 5®W'rGCC®fTCTr (SEQ ID NO*.15) 5.92 i, SI 8 , 32 1968 ¾S¾¾iC¾3TTGTC®fTTCTT (SEQ ID SO:16) 3.77 5,26 6.12 1979¡. TCCKKTZGTTCCTGTZGTT (SEQ ID NO:2) 1 , 32 ND ND 1982 TCCAGGACTKTCTCAGCTT (SEO ID NO:50) 0.05 ND 0.98 1990 ®oc&T¾gre££TOctTTCT (SE ID NO¡51) 2.10 ND ND 1991 K«17b|^K£?*TK¾5·G1 (SEQ ID NO:52} 0.89 N» N© 2002 Tcgi>ggi¾aswrtcaA«>CT (SKQ ID N0s53) 4 ,02 1.31 9.75 2005 vsgg tatg&rwi vf (SXQ ID 86t7j> ND 4.22 12.75 2006 T®¾2GGGE¾'?¾,PTTT(?T®,GT (SEQ ID NÜ!S) ND 6.17 12.62 2007 TCgTOgraCTSffTOTCTCGCT (SEQ ID NOiS} ND 2.53 0.«« 2008 GcoteccTtsTí n^fflra ÍSEQ ID NO:9) m 1.37 i.15 20» OCGCCCGGCBSCGCBCaCCC (SEQ IB NO»54} m 0.31 o.cs 2012 TGTCfi7TTCTCQ:TrT0TCGTT (SEO ID NO:ID) 2.32 11.61 2013 TciigQiTgrcST&agcsTCagcgyr <SEQ ID NO;33) m 0.3S 5,22 2014 *K¾3 TG«3¾·b?*G»¾? TG (SEQ ID NO:ll) 5 , 71 10.99 2015 VSSTSSSQS^TT (SEQ IB NOi ) m 4.53 10,13 301* Wf¾£f';?l¾S,!¾ (SEQ IB NO*56) m 6.51 8.06 PBMC esencialmente como se describe ea presente. Los resobados son representativos de 6 experimentos separados: coda experimento representa on donador diferente. 2 Esta es la versión media a de ODN 1840: 2 - 5- metil citosina LU son umdacfcs tricas; ND = no realizado, dmocleótidos de CpG son subrayados por claridad TABLA 6 inducción de k ptoBfera ón de celalas B humanas por ODN CpG de fosfoiotioato «dice de estimula can 1 I S i ' ' . ! 1 ; s » _ .
; - : . . ICácks = células de bazo humanas almacenadas a -?0°C. Después de la recolección quánrgica o PBMC recolectado a partir de donadores normales y centrifugados sobre FseotL . Las células se ctiK aron en piscas microátuladoras de fondo enU de 96 cavidades con a sin el ODN in<fc ado (las cuales se agregaron a cultivos a $ uml). N -12 experimentos. Las celdas se coltivaioa por 4-7 días, se pulsaron con 1 uCÍ de ?H tsratdiaa por 18 Loras antes de ser recolectadas y contadas con esctnttkctón. El índice de estimulación = la relación de cpm en células sm ODN con aqueSas en cavidades quehan sido estimuladas a través del periodo de cdtivo con él ODN indicada (no existen más adiciones de ODN después que los cultivos se establecieren). ND = no realizado.
TABLA 7 Inducción de secreción ÍL- 12 humana por ODN CpG defbsíbrotioaío OCtJj secuencia ( 5‘ -3‘ ) « * Ninguno 6 1962 KC' 'TCroTOCTfGWW (S¾Q 10 NO? 13 ) ? * 1965 TCC7G C tWFPPTTCTCtí S (SEQ ID 430814 } 16 196 / ,rcG¾cGc¾GTcrecccTTC!rr fSEQ ID NOS 15 ) 41 ?96b TCG^Gcm mfeGT rcT (SEQ ?O NO? 16 ) 24 2005 TCGTCGTTClCSST GTCSGtT (SEQ ID NO: 7 ) 25 2006 TCGTCGTT TC CGTfTT&TCGTr (SEQ ID ND:6 ) 2» 2014 TQTCe TOTCGTTaTCeiT (SEQ LD NU! II ) 28 2015 TCGICGTCGICGTT (SEQ ID NOt 12 } 14 2016 lPBMC fueron recolectados a partir de donadores normales y se centrifugaron sobre FtcoB. después dte ctAraron a 106 citate¾zv !art «n placas mrrotinrtadoras de 96 cavidades con o sin el ODN indicada los cuales se agregaren a cultivos a 6 uginl. Los sobrenadantes se recolectaron a 24hr y se probaron por los «vete P.-12 por ELISA como se describe en los métodos. Una curva estándar se contó en cada experimento, b cual representa un donador diferente.
TABLA 8 Diferentes porciones de CpG estimulan las c élulas murases B óptimas y la activación de NK OPU Secuencia Activación de cc iru B1 Activación de NK^ 1668 TCCMCACGT-TCGTCRTSC (SåQ 13 HOt SS ) 42, 849 2.52 1753 !20»CCC4GCG¾G^C*'r (SEQ 13 110*27 ) 1, 747 S.4S t*»*E 367 0.C0 Los dmucteótidos CpG son subrayados: los ofigorai eótidos fuerce sintetizados eos armazones modificados con fosfoiotioata para mejorar sn resistencia a tatdeasa.
^Medido por meorporadón de tmád ta ¾ después de 48ínr de cultivo con oligodesoxmucleóttdos a una concentración de 200 nM como se describe en el Ejemplo 1.
^Medido enuddades iticas ÜS 6,218,371 TABLA 1 ! ! A¾^C5C;^Ag C¾C (SXQ 10 NOs 11j CAGAAflfl WGACCTTCCAT (SBQ 10 NOs 12» GAeiUkQSCTCSX CTT^AT (SSQ G0 NO; S3| GAQII¾SClSSACC,PTS¾'r «SBQ 10 mt 141 GiSCiMOSG XTTCCAI (SEQ ID SOs 15) GASCAESCIGGACCTTCCAT (SXQ 10 NOS 16) GAGAASffiCIGGACZTTCCAI (SEQ ID MOt lf| GASIASiAro^CCTTCCAf (SXQ ID NO* 1»! i ¡ í . . . ic ?Í>H ai 5a» t»Bf»C»«at5WO»MI.
BC »«» Sí 38S i agtxauoaiBSfafmuvZ » «»a ai sa» i ae vaioouXQiwiKüÍM.
B» so» ai 3as iíx>ím¿uxa¿^u>svsss. ¿* er 333 i MCvaiaxuTCwmisa. oz ?» >i>« OI 533 C»5ITBXi>¾lVCOI»l Bl¾i 5* ' »« ar 3H3 ??M???»)q?2?35¾)?«;o? »* ·o« ai Ss» £ 03IU3I?>;»0!C)EM¥B»£.
- I i . i i i otoi TABLA 1 - co n tin n a r ion secuencias ( ) ^«eceAoecTOssceAT <<¾¾ te »o* 59) T*Mxscsw«eecrcT E¾ ÍS> 80» 60) AC<¾fG8ÍCCA¾C1¾mCCCC®C ( S£2 » 80» 61) RCCA’rssscGifficrír ccccTC <SE0 ID 80: 63) &?£»?^Leo¾€¾·b?·?¾:€6«?·e (M¾ » 80» 63) ACCA¾33ACGTACTGTTTCCCCTC < SEQ ID 80: 64 ) «WiMKGffixricrrTcccCTC (SBÜ 10 HCH 65) KCAÍGSItóÜTSCt^fTKÍCCie i$m¿ 10 »0s 66) Ci¾¥f«í«eGí¾A1' ÍSS® IB MOt 67) C»GC!FCSAGíST«aAC <S8ft XB 80» 6B) TcwscffPGcecc (SEQ IB 80* 6») rcc&foícewcctercsii (B¾ £880* 73) •fcc&TMGffnccrJSScsri ( SSQ ID 80: 74) TCCTCQC TOJCSCCCCTtCtT ($WÜ IB »: 75) m omxiT<itic< (SEO 80» 7«) ecmT mccma sm! (SEO IB 80 s 77) CCA7i3t^«*?TreTC§TT' <&«¾ XB 801 78) iccTO'Jisffcc ¾P£St»i ($2¡Q ID 80» 79) sccwCTSPfrcctcTfisn (S m m 80: 80) c<sGT¾rfTrn¾!T£gTf <*ÉQ TI· 80» ftl) ¾ffigT®i^c^ccra3¾T i$m IB NOt 82) ^S^TGTie^TT C-IT (SEQ IB 80: 83) TCCWOTZGTTCCTOTZ6TT (SEQ IB 80: 84) «C*CSMOTCÍ!CTPCIlfi<m (SSft TD 80* BS) T£c&Ti¾eBTOca sc3T*m <SE¾ IB «Oí 86) TABLA 1 - continuación secuencias .
{ ¾G1CCT GTC6TTTGT^T ÍSEQ ID NOl 94) TOlfia roi!CSrTGT!CfilTTG Cfi T fSlQ ID NOS 95 ) ^¾QGTOS¾lG<r!STC¾tr,f (SEQ ID DOS 96) ¾ SS1Si5SSTr ÍSEQ ID NOS 97) mcomi!QSTT {SBQ ID NOS 98) TC€¾ A¾TOCt^¾ T (SEQ ID NOS 99) TCCAZGIICGTTCCraACGTT SEQ ID NO* 100 0TCG<*/C)T ÍSEQ ID NO: 101) TABLA 2 Inducción de secreción efe IL-I2 por ofigonucfeótidD CpG de fosforotbato HL-12 ¡M/Bl i OBH secuencia {5 * -3 * ) expt . I expt. 2 ' 1{8MC fueron recolectados a partíi de donador s normales y se centrifugaren sobre FicoflL después de ccétivaron a 10^ cóMas/casidad enpíacas mieioátuladoras de 96 cavidades coa o sin los o&gonuclectidos «otSca bs ios niales se agregaron a cukrv’os a 6 pg½L Los sobrenadantes se recolectaron a 24ir y se probaron por los niveles H-12 por ELISA como se describe en los métodos. Una curva estándar se corrió en cada «tperimerto, lo cual representas» donador diferente TABLA 3 n¾j {T14ÍÍ Compuesto (5 &p) (4 lv*|}.) ProSfeadón decateT ?*M-® 1.? 25 13 J €¡50 },9 15 19,? 0}<l + GMNt F 7b US í 5 TABLA 1 Estimulación de «igcwucleótido (te celulas B de ratón índice de estimulado!!' ODN Semencia (5' a y> t 3H Urkflna Produccita Ig 1 (SEQ ID «0*91 } GCTAGACGrTTAGCGT 6.1 * 0.8 17.9 * 3.6 (SEQ. ID NOi4 ) * . « » , .1» · « , . A4.» 1.2 * 0.2 1.7 * 0.8 Ib (SEQ ID KOI 13) • * .. » »1» . « , ... , 1.2 *1 1.8 x 0,0 i« (SEQ ID «0*14 ) 10,3 * 4.4 9.5 * 1.8 ' i , .
. . . . - . Z tote 3 astil efestna.
. ¡ . ' - . . I : les petos indican identidad; los dmuefeitidos CpO están subrayados; D-no «afeado El experimento se MÍO al menos ttes vece: eos resultados sondares. El nívd de P.-8 de cultivos de control no estimulados de ambos CHLll y células B espléracas fue S 10 pg'iú. ?1 nivel de IgM de cultivo no estimulado fot 341 t82ng¾illos oígonurieótidos CpG están subrayados y ¡os puntos «etican tdemdid.
Lo absotcióu de ur¿lma fc [ 3 H] se indicó como un incremento en v eces (81 índice de estimulacióti) a partir del control no esttadado <232 6? 213.68 cpm). Las células se estimularos con 20 p de rasos CpG O-QOTí. Los datos presentan lamedla i DSde triplicados 0 Medido por ELBA. 5 TABLA 3 Inducción de secreción de IL-6 murino por porciones CpG en ADN bacteriano u oligonucleótidos Tratamiento; IL-6 (pg/ml) ADN de timo de temerá = 10 ADN de tino de ternera + DNase £ 10 ADN de.E cok 1 6 .5 ¾ 94*1 ADN de L cok + DNase -10 ADN de K calí metilado con CpG ^10 LPS 280,1 ± 17.1 Medio (sin ADN) £ o ODN 5a SEQ. ID. HoiI ATGGACTCTCCACKXSTTCTC 1096· * 372*0 189.5 5d SEQ, ID* No: 4 .... AGG*.C..T 110 Se ID. lo: 5 851.1 i 114.4 TABLA 3 - continuación Inducción de secreción de ¡L-6 murino par porciones de CpG en ADN bacteriano u oíigormcleótidos 5£ SEQ. ID. No ·.6 ..2. .. .. .2<3. .2. £10 87.26 Celulas de bazo agotadas de células T a partir de ratones DBA 2 fueron estimuladas coa oigoondeótidos modificados con fosfbdiéstef (O-ODN) (20 m¾4), ADN efe timo de ternera (50 (jgfad) o ADN de E. coli (50 pgrif) con o sin d tratamiento de enzima o LPS (10 pgrmL) por 24 hrs.
Los datos representan lamedla (pg f) + SD de triplicados. Los dkmclcótidos de CpG son subrayados y los puntos indican la identidad. Z indica 5-metikstosina.
TABLA 4 Secreción de IL-6 marino inducido por esttmnlación de ADN wo E ti l t ADN de E. coli 13858 ± 3343 ADN de timo de ternera <50 CpG S-ODN 20715 ± « S-ODN sin CpG <50 Los ratones (2 ratooes/grapo) íiaercm inyectólos í.v. con 100 ml de PBS, 200 ug de ADN de E, coli o ADN de taño de ternera, o 500 mg de CpG S-ODN o S-ODN de control son CpG. Los talones se mezclaron 2 hr después de la inyección y se analizó ana dilación 1:10 de cada suero por ELISA de IL-6. El inste de scmrviEdad de ELISA de IL-6 fue 5 pgml Las secuencias del CpG S-ODN es S'GCATGACGT-TGAGCD' (SEC ID NO:6) y dd S-ODN no cstimniador es 5’GCTAGATGTTAGCGT3' (SEC ID NO:49). Se observan que aunque existe un CpG en la secuencia 48. está también cercano al extremo 3' para efectuar la estimulación, como se explica en k presente. Los datos representan + dle SD de duplicados El experimento se hizo al metros dos veces con resultados similares 5 TABLA 5 jadacctóa de te secreción de cko aa FBMC banana por otgos CpG ODM Secuencia fS‘-30 IL-6, IBÍy Q CSP ÍLJ2 512 ?CTMC r I Oi< i í’í "???AP 50» Míi 15.6 7ü 250 , . . ios puntos indican identidad, tos dinudeótidos Cpír estás subrayados 1 medido por ELISA tisaorb kits QaanÉdae de R&D Systems (pg/ad). Las cehias se cnhivatoó en 10% de ¡mero antologo eos bs oBgodesoxmneteótódos indicados (12 p 'mt) por 4te en ei caso de TNF-a o 24 te para tes otras atocinas antes de e el sobrenadante se cosechara y ensayare». Los datos sos presentados como el d d de citadas anterior que no se agregó oligodesaxinucleótido. 5 TABLA 6 ? Se determinaron tos niveles de todas las atocinas por ELISA usando kits Quantíktne a partir de R&D Systems como se describe en la tabla previa Los resultados son representativos usando PBMC a partir de diferentes donadores 2 Las células fueron pretratadas por 15 man con éster metüko de L-leucfl-L-leudna (M~ LME) para determinar si ía producción de citocina bajo estas condidones fue a partir de manockos (o otras células sensibles aL-LME). 3 H IC ADN se metió usando 20%g de ADN de metttasa CpG (New England Btcdabs) de conformidad con las direcciones del fabricante, y la metfiación se confirmó por digestión con Hpa-II y Msp-L Como un control negativo. las muestras se incluyeron conteniendo dos veces la cantidad máxima de LPS contenido en la concentración más ato de EC ADM d OTÉ SÉ»para inducir ía producción de dtoána detectóte bajo estas cond iones experinentales ND = no realzado TABLA ? U ADN de CDG induce la exprestón de dtodaa en macrófagos humanos 11 -í» (pg,-mU GM-CSF ipgml) TNF-aQjgfiiil) Células solas o 1} |f CTADN (50/^ mil 0 0 Ci EC ADN (5ü /fg naij 2íMJ 15.6 Jtíüíl TABLA 8 TABLA 9 IaAiccioade la actividad de NK por APIS que condena porciones de CpG pero no por ADN s CpG _ LD/lO _ ADN o Ckocina agragada Ochalas de Ratón Célalas Humanas Expt. 1 Ninguno 0.00 9.00 IL-2 16. S8 15.82 ADN de E. con 7.23 5.05 ADN de tino de tema* 0.00 0.00 Expt. 2 Ninguno 0.00 3.26 1585 qqGGTCAACGTTGacaaao (SEQ ID No.12 ) 7.18 17.98 1529 - - gtc- - (SEQ ID No.50 ) 0.00 4.4 Expt. 3 Ninguno 0.00 1513 GCTJtGACGTTAGTGI (SEQ ID No.42 ) 5.22 X 6S - Z - (SEQ ID No.52 ) 0.02 TO 1513 ICCATGT££jTTCCTG&TGCT (SEQ ID MOS38) 3.35 — (SEQ ID No.53) 0.11 Los oligonucleótidos en la secuencia de OPN están indicados por el subrayado; Z indica metilcitosina. Las letras minúsculos indican enlaces de intemucleótidos modificados con fbsforoíioato resistentes a nncleasa los cuales, en experimentos de titulación fueron más de 20 veces tan patentes corno ODN no modificados dependiendo de las bases de flanqueo. Loe extremos Poli G (g) se usaron en algo de ODN, debido a que incrementa significantemente el nivel de absorción de ODN. 5 TABLA 10 la Actividad lírica de NK (LLP ODM CeUas i,i secuencia sola 5’-31 ) 0,01 375* ftCnAri¾AC5firtCrrer.rTCCCC*rC 0- 92 SEQ tn BQ*59 175* I TCCCBCiCeTOCGCrAT 0.35 SKQ rr»«Oí45 1761 ta cecsTscoftcccr x 0.J5 SEQ ID BO;50 177í ACCAraGACOftACKyrmccccTc 8*Í33EQ ED BOi61 1777 RCSASSCACCTKICTOEraceCCTC 8,15 SEQ ED «O*«2 177* D^AfKACCA CTOPrrCCCCTC 0.H SEQ P>»OÍ63 171* fMXAr®SACGTRCT®EXTCCCClC 9.32 SEQ ID 10*.64 179* MXtATSGACGGriCTCTTTCCCCTC 0.29 SEQ ID BOJ65 1781 RCCAUSGACGTICTGrnrCCCCTC ¡38 SEQ EP BO i 1B2 J QCAieSCGtrTOfteCT .13 SEQ ID N3íS 1021 CASGriGACGOGCAT 0.31 SEQ ID HOi67 1825 CTSCESSGACTGCAC 6.11 SEQ ID ISOi68 102* TCMSCSSKSCWtX o.o» SEQ rn BO: 182* *k*SACiSTTCC»3*C«rr O. tZ SEQ ED «Oí70 183** RABDOM 6SQQEBCE 0.25 1834 TCTCCCAGCetSOCSCAT 0,00 SEQ ID BO;73 1S3S TCTCCCAGCGCGCQCC¾T 0.16 SEQ EP BO*72 IB ift TCCASMCCVrTCCJCTCSTT 2.70 SEQ ED «O;73 1841 !ECeASaGCGTTCCiEAiaCSTT1 1.15 SEQ ED BO*74 1842 KSTCSCtCTCKCGeiTCTT 0.Í6 SEQ ID BQ«.75 2.32 SEQ ID »Qí 76 1 Las unidades Meas (LU) se midieron coate se describe (8). Brevemente. PBMC se rcc cctan» a partir de donadores normales y se centrifugaron sobre Fícofi. después se cultivaron con o sil el GDN indicado (los cuales se agregaron a cuteros a 6 pg‘aii) por 24 horas Después se determinó su capacidad para Mssr células K.562 etiquetadas con SlCt. Los resultados mostrados son típicos de aquellos obtenidos con varios donadores humanos normales diferentes. 2 Esta mezcla de oigo contiene una selección aleatoria de todas tas 4 bases en cada posición 5 TABLA 11 Macaón de NK LU par ODI9 de CpG de fesfaetioato con buenas pracioncs orar' Celulas «epl . 1 <®3CJ»t . 2 »xpt . 3 secuencia sote ;s· .3 ' ) CE¾ 3C KO i 0.00 1.20 0.45 1840 TC.CAT ST0£TTCC"C,T££TT 13 2.33 ND HD 1960 CCT©TST CCK¡¾¡g7T 17 ND 0.48 ¡3.99 1961 TTCATSTSSTTTTJCSTSarr 18 4.03 1.23 5 ,0* 1962 TCKP»TB?G¥s3R™T£bTT 52 ND 1.60 5.74 1963 TCCTT GTCGT CCCGTGLTT 19 3.42 ND WD 1965 TCCTGT^7T?T3GT££TT 53 0.46 0.42 3.48 1966 TCGTC SCTGTCTCCGCTT CTT 15 2.62 ND HD 1367 TCGTC SCTGT'CIGCCCTZ CT1 54 0.92 1.64 3.32 1963 '?osc ao anyb?^?Y?at?! ES 3.77 5.2S £ .12 197 a 3 «"CTMP a<r*za'?'rr¾' ?IT zatn 1 .32 ND WD 1982 TCCftGSACTTClC^CAAGTT 19 0.05 WD 9.98 1990 KCATÍS^efíSTCSSTITT 80 2.10 HD WD 1991 tíOT¾¾27TCCOT S I 0.8S ND HD 2002 82 4.02 1.31 9.77 2005 TCGTC 8TTG?g3T7GTgGTT 47 NO 4.22 12.75 2006 ?x¾¾£·¥·T«5¾*TG ?O¾T S6 ND 6 ,17 12.82 2007 TCGTCSTTGTC TiTJC^CaTJ 9 ND 2.68 9.66 2008 GCSjlGfiSaTTGTCGC GTCfiTl 56 Mí 1.37 8.15 2010 acgGcaaacoGceegeGCce 83 ND 0.01 9.05 2012 i 8 ND 2.02 11 , «i 20 3 TGtCSTTG CfirrG £G7 TSTCGTT 84 ¡® 0.56 5.22 2014 GT¥7TGTCGTTGTCG7 T 60 ND 5.74 19.85 2019 51 * 4.53 10.13 2018 TCTnQtTTGTKgrt 85 ND 6.54 3 . CMS ^ PBMC esanaa nenle como se describe en la presente. Los resultados son representativos de 6 experimentos separados; cada experimento representa im donador diferente. 2 Esta es la versión metñada de OD 1S40 SEC ID 170:83); Z = 5- metí dtosma en los restónos 8 y 17; Lü san raridades Meas; D = no realzado; bs dsnocleetkfes CpG son subrayados para claridad TABLA 12 üpfocdfefcdfc lagrdfeadottd c u s B jananas oo* ODN CPO de ftefoe tioaio ! i| .' - i ! ' .
Las células se esteraron en placas nrioroáriatess de fondo en U de 96 cavidades con o ski el ODN ÍndíraAi {las cuales se agregaron a cultivos s 6 umli. N =12 eapp-jneatau. Las cáuks se ctárivarun por 4-7 días» se jpskaron con i mq de ¾i ikmdina por 1S horas anees de ser recolectadas y contadas con esdmflac&L El Indice de esiinuhcfcii = la retador* de cpm en células sin ODN con aquellas en cavidades quehau sido estimuladas a través del período de cidsvo con el ODN fcdícade <ao existen nús adiciones de ODN después que los cíte os se estdledenio}. D - no realzado.
TABLA 13 Inducción de secreción de 3L-12 humana por 0014 CPG de fosforotioato solas 19€2 TCCtGfECerCCmGTOSXT 52 19 0 1965 TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT 53 36 0 196? TCGTCGCTGTCTGCCCTTCTT 54 41 0 1968 TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT 55 24 0 20 OS TOGTCGT GTCGTTGTCGTT 47 25 0 2006 TCGTCCTTTTO CGTrTTOTCGTT 46 29 15 TABLA 13 - continuación Inducción de srrn-rron P .-2 hrnnarta por 2 OIS <XC6TCG?C»TC<m 51 14 0 2016 ’fCTCGCTGTCG'FF 85 3 0 lPBMC fiicton rc<-olecfadcs a partí de donadores normales y se centrifugaron sobre FtcoL después de chivaron a 10^ céfcúas/cavkiad en placas racrotitoiadorai de 96 cavidades con o sin d ODN adicado los cuales se agregaron a cultivos a 6 pg'ai. Los sobrcm nntcs se recolectaron a 24hr y se probaron por los «vetes TI- i 2 por ELISA como se describe en los métodos Una nava estándar se corrió en cada experimento, lo cual representa un donador diferente.
TABLA 14 Difaat>fe»rordciiics tic CpG estimulan k <r mn ¿ntim,. de K y cchlas B muñías QOII Üecuencii Activación de cotias Bl Activación de NK^ 1C68 TCCRTGACGTTCCTGATGC (SEQ.3D,HOt7) 42, 849 2.52 175*¾CTCCGJtfifig»Ssa¾C¾lM ÍSSQ.2D,HO»45 > 1, 747 6.66 367 8.00 Los d ucleótidoo CpG son subrayados; los oligonucleótidos fueron sintetizados con armazones modificadas con fbsfbrotioato para mejorar su resistencia a la nucleasa. 1 Medido por incorporación de ttaidina 3 H después de 48 botas de cultivo con oligonucleótidos aúna concentración de 200 nM como se describe en el Ejemplo I . 2 Medido eit wmdate tilicas ; . * ’ s . , . r , . . ¡ - · . i . - . . i : TABLA 6 QDN usado con ADK ptáamdo i . i (SIQ ID NO: 67) 2023 TCGTCGTTOKGTWTOTCGTT 5 Nata: (SEC ID NO: 51-67. respectivamente) TABLA 10 Porciones CpG inhibidoras pueden bloquear la proBferadón de c fluías B inducida por xa porción CpG medio 194 1668 TCCA GASe TCCTOA!raCTHSEa ?& NO: 68) 34,669 1668 4 1735 <SC®FI ffTIl¾GCG ^SEQ ID TOsSS) 24,452 1720 ^CATGlSSCTTCCTaK^iJ iSBS ID NOs7G } 601 1720 ¨ 1735 1109 TABLA 11 Bretes inhibidores de porciones CpG 'malas" «a d Oügo 1619 de CpG "bueno* _ Qligotíodleárido agregado 1L-12 I lf safo 1619 # 1949 { CCKM^^TSC saio^Gi i ID BO:?2)) 1619 # 1952 { TC€A1¾TCGTTCCSCGCGCG· (SEQ ID 80:73} ) 1619 + 1953 \ TCC&^TCGXICCTSCCGCT (SEQ ID 80:74)) 1619 * 1955 <OC«3COOGCC¾ÍCtKS3CSCCCíSE¾ ID 80:75)) Motas: ; Lasecumennfce^Wl!fesTCCft^lSiCTCCTBATGCf (SEQ ID NOsll) 1949 tiene sdtamcate 1 GOG en d¡ extemo 3', t! cual no tiene esencialmente actividad inhfokbra 5 TABLA 13 buhe ación de parcfemes CpG nrutráfcantes i® cuales t educen la inducción de la secrettea por na atata CpG-S en el misino ODX (neiaralaacion-cfc) Etaoresifa efe atocina «adocid* por ODN 2 ODD seene a 51 ~3‘ 1 IL— 6* 11-12 IIW-Y natguno 5 206 8S8 1619 TCCATGTSgJTTCCTGATGCT (SEO ID TK> s 73 ) 1465 3130 4628 1952 . . ... , .{ggcgecs (SEft ID MO :73) 559 1615 2135 1953 . . . , , .C£ t. . (SEO tD KO ! ? 4) 557 1834 2000 1 Los puntos en la secuencia de ODK 1932 y 1933 Mean te identidad a ODK 1619; los dsouckótidos de CpG son subrayadas por claridad. ODK sin porciones CpG-N o CpG-S feten poco o ningún efecto en b producción de atocina Los datos mostrados son representativos de 4 experimentos. 2 Todas las dtodnas son dadas en pg-itL metido per ELISA en sobrenadantes a partir de céUas del bazo DBA2 cuhivadss en placas de 96 cavidades a 2 a 107 cé ksml per 24 horas con el ODN indicado a iOug'ajl . s desviación estándar de las cavidades triplicadas fue <3%. Kktgune del ODK Msce cantidades bonificantes de 1L~5.
TABLE 14 Irfgbkión (fe sccredón de rifocta inducida por CPG por rwnfetes CpO-X que contienen ODK OOB secuencia S’-j' secreción de JE- 12 secredóa de 11-12 inducida pot CpG-5 ! 1 cedas de bato BALB/c se oítóvat s «1 flacas de 96 cavidades a 2 x 107 cSah l con d OD Meado t»or 24 horas y después los sobrenadantes se sometieron a ensayo por IL-12 por ELISA (pt'inl)- 2 Las céWas se establecidas las metras como en 1 exepeto que la secreción de IL-12 se indago por la adición de CpG 0DN 1619 (TCCATGTCGTTCCTGATGCT) a 39 pgóriL Los datos mostrados son representativos de 5 experimento 5 APÉNDICE (C) Secuencias de miAKN Humanas Ejemplares >hsa-let-7a-l MI0000060 UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGA GAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA >hsa-let-7a-2 MI0000061 AGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAÜAGUUUAGAAUUACAUCAAGGGAGAUAACU GUACAGCCUCCUAGCUUUCCU >hsa-let-7a-3 MI0000062 GGGUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUGGGGCUCUGCCCUGCUAUGGGAUAA CUAUACAAUCUACUGUCUUUCCU >hsa-let-7b MI0000063 CGGGGUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUUCAGGGCAGUGAUGUUGCCCCUCG GAAGAUAACUAUACAACCUACUGCCUUCCCUG >hsa-let-7c MI0000064 GCAUCCGGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUUAGAGUUACACCCUGGGAG UUAACUGUACAACCUUCUAGCUUUCCUUGGAGC >hsa-let-7d MI0000065 CCUAGGAAGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUUUAGGGCAGGGAUUUUGCCCAC AAGGAGGUAACUAUACGACCUGCUGCCUUUCUUAGG >hsa-let-7e MI0000066 CCCGGGCUGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUUGAGGAGGACACCCAAGGAGAUC ACUAUACGGCCUCCUAGCUUUCCCCAGG >hsa-let-7f-l MI0000067 UCAGAGUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUGUGGGGUAGUGAUUUUACCCUGU UCAGGAGAUAACUAUACAAUCUAUUGCCUUCCCUGA >hsa-let-7f-2 I0000068 UGUGGGAUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUUUAGGGUCAUACCCCAUCUUGG AGAUAACUAUACAGUCUACUGUCUUUCCCACG >hsa-let-7g MI0000433 AGGCUGAGGUAGUAGUUUGUACAGUUUGAGGGUCUAUGAUACCACCCGGUA CAGGAGAUAACUGUACAGGCCACUGCCUUGCCA >hsa-let-7i MI0000434 CUGGCUGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUUGGUCGGGUUGUGACAUUGCCCGCU GUGGAGAUAACUGCGCAAGCUACUGCCUUGCUA >hsa-mir-1-l MI0000651 UGGGAAACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUAUGGACCUGCUAAGCUAUGGAAU GUAAAGAAGUAUGUAUCUCA >hsa-mir-l-2 MI0000437 ACCUACUCAGAGUACAUACUUCUUUAUGUACCCAUAUGAACAUACAAUGCU AUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUUUUUGGUAGGC >hsa-mir-7-l MI0000263 UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUA GAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUCUGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG >hsa-mir-7-2 MI0000264 CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGU UGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUCCCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA >hsa-mir-7-3 MI0000265 AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUU GUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACAGCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC >hsa-mir-9-l MI0000466 CGGGGUUGGUUGUUAUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGGUGUGGAGUC UUCAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUAAAAAUAACCCCA >hsa-mir-9-2 MI0000467 GGAAGCGAGUUGUUAUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGUAUUGGUCUU CAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUAAAAACUCCUUCA >hsa-mir-9-3 I0000468 GGAGGCCCGUUUCUCUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGCCACAGAGCC GUCAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUAGAAAUGAUUCUCA >hsa-mir-10a MI0000266 GAUCUGUCUGUCUUCUGUAUAUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUGUAAGGAA UUUÜGUGGUCACAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUAUGUAGUUGACAUAAACACUCCGCUCU >hsa-mir-10b MI0000267 CCAGAGGUUGUAACGUUGUCUAUAUAUACCCUGUAGAACCGAAUUUGUGUG GUAUCCGUAUAGUCACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAUAUAUGGUCGAUGCAAAAACUUCA >hsa-mir-15a I0000069 CCUUGGAGUAAAGUAGCAGCACAUAAUGGUUUGUGGAUUUUGAAAAGGUGC AGGCCAUAUUGUGCUGCCUCAAAAAUACAAGG >hsa-mir-15b MI0000438 UUGAGGCCUUAAAGUACUGUAGCAGCACAUCAUGGUUUACAUGCUACAGUC AAGAUGCGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUAGAAAUUUAAGGAAAUUCAU >hsa-mir-16-l I0000070 GUCAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUU AUCUCCAGUAUUAACUGUGCUGCUGAAGUAAGGUUGAC >hsa-mir-16-2 MI0000115 GUUCCACUCUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUAGUGAAAUAUAUAUUAAAC ACCAAUAUUACUGUGCUGCUUUAGUGUGAC >hsa-mir-17 MI0000071 GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUÜACAGUGCAGGUAGUGAUAUGUGCAUCUA CUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCAUUAUGGUGAC >hsa-mir-18a MI0000072 UGUUCUAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAGUGAAGUAGAUUAGCAUCUACUGC CCUAAGUGCUCCUUCUGGCA >hsa-mir-18b MI0001518 UGUGUUAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAGUGAAGCAGCUUAGAAUCUACUGC CCUAAAUGCCCCUUCUGGCA >hsa-mir-19a MI0000073 GCAGUCCUCUGUUAGUUUUGCAUAGUUGCACUACAAGAAGAAUGUAGUUGU GCAAAUCUAUGCAAAACUGAUGGUGGCCUGC >hsa-mir-19b-l MI0000074 CACUGUUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUGUGAUAUUCU GCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUAGUG >hsa-mir-19b-2 MI0000075 ACAUUGCUACUUACAAUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCAGCGUAUAUAUG UAUAUGUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGAUAAUGU >hsa-mir-20a MI0000076 GUAGCACUAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAGUGUUUAGUUAUCUACUGCAUU AUGAGCACUUAAAGUACUGC >hsa-mir-20b I0001519 AGUACCAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAGUUUUGGCAUGACUCUACUGUAGU AUGGGCACUUCCAGUACU >hsa-mir-21 I0000077 UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACAC CAGUCGAUGGGCUGUCUGACA >hsa-mir-22 MI0000078 GGCUGAGCCGCAGUAGUÜCUUCAGUGGCAAGCUUUAUGUCCUGACCCAGCU AAAGCUGCCAGUUGAAGAACUGUUGCCCUCUGCC >hsa-mir-23a MI0000079 GGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAU UGCCAGGGAUUUCCAACCGACC >hsa-mir-23b MI0000439 CUCAGGUGCUCUGGCUGCUUGGGUUCCUGGCAUGCUGAUUUGUGACUUAAG AUUAAAAUCACAUUGCCAGGGAUUACCACGCAACCACGACCUUGGC >hsa-mir-23c MI0016010 AGUGACUUUCCAGGUGUCACACAGUGAGUGGCAUAAUCAGAGUACAAUUUG AGUCAUGCCCAUACAUCACAUUGCCAGUGAUUACCCAAGGAAAGUGACG >hsa-mir-24-l MI0000080 CUCCGGUGCCUACUGAGCUGAUAUCAGUUCUCAUUUUACACACUGGCUCAG UUCAGCAGGAACAGGAG >hsa-mir-24-2 MI0000081 CUCUGCCUCCCGUGCCUACUGAGCUGAAACACAGUUGGUUUGUGUACACUG GCUCAGUUCAGCAGGAACAGGG >hsa-mir-25 MI0000082 GGCCAGUGUUGAGAGGCGGAGACUUGGGCAAUUGCUGGACGCUGCCCUGGG CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGACAGUGCCGGCC >hsa-mir-26a-l MI0000083 GUGGCCUCGUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUGUGCAGGUCCCAAUGGGCCU AUUCUUGGUUACUUGCACGGGGACGC >hsa-mir-26a-2 MI0000750 GGCUGUGGCUGGAUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUGUUUCCAUCUGUGAGG CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUCUGGAGGCAGCU >hsa-mir-26b MI0000084 CCGGGACCCAGUUCAAGUAAUÜCAGGAUAGGUUGUGUGCUGUCCAGCCUGU UCUCCAUUACUUGGCUCGGGGACCGG >hsa-mir-27a MI0000085 CUGAGGAGCAGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCAGGGUCCACACCAAGUCGUGU UCACAGUGGCUAAGUUCCGCCCCCCAG >hsa-mir-27b MI0000440 ACCUCUCUAACAAGGUGCAGAGCUUAGCUGAUUGGUGAACAGUGAUUGGUU UCCGCUUUGUUCACAGUGGCUAAGUUCUGCACCUGAAGAGAAGGUG >hsa-mir-28 MI0000086 GGUCCUUGCCCUCAAGGAGCUCACAGUCUAUUGAGUUACCUUUCUGACUUU CCCACUAGAUUGUGAGCUCCUGGAGGGCAGGCACU >hsa-mir-29a MI0000087 AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUC UGAAAUCGGUUAÜ >hsa-mir-29b-l MI0000105 CUUCAGGAAGCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGAUUUAAAUAGUGAUUGUCU AGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUCUUGGGGG >hsa-mir-29b-2 MI0000107 CUUCUGGAAGCUGGUUUCACAUGGUGGCUUAGAUUUUUCCAUCUUUGUAUC UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUUAGGAG >hsa-mir-29c MI0000735 AUCUCUUACACAGGCUGACCGAUUUCUCCUGGUGUUCAGAGUCUGUUUUUG UCUAGCACCAUUUGAAAUCGGUUAUGAUGUAGGGGGA >hsa-mir-30a MI0000088 GCGACUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUC AGUCGGAUGUUUGCAGCUGC >hsa-mir-30b I0000441 ACCAAGUUUCAGUUCAUGUAAACAUCCUACACUCAGCUGUAAUACAUGGAU UGGCUGGGAGGUGGAUGUUUACUUCAGCUGACUUGGA >hsa-mir-30c-l MI0000736 ACCAUGCUGUAGUGUGUGUAAACAUCCUACACUCUCAGCUGUGAGCUCAAG GUGGCUGGGAGAGGGUUGUUUACUCCUUCUGCCAUGGA >hsa-mir-30c-2 MI0000254 AGAUACUGUAAACAUCCUACACUCUCAGCUGUGGAAAGUAAGAAAGCUGGG AGAAGGCUGUUUACUCUUUCU >hsa-mir-30d MI0000255 GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCA GUCAGAUGUUUGCUGCUAC >hsa-mir-30e MI0000749 GGGCAGUCUUUGCUACUGUAAACAUCCUUGACUGGAAGCUGUAAGGUGUUC 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>hsa-mir-92b MI0003560 CGGGCCCCGGGCGGGCGGGAGGGACGGGACGCGGUGCAGUGUUGUUUUUUC CCCCGCCAAUAUUGCACUCGUCCCGGCCUCCGGCCCCCCCGGCCC >hsa-mir-93 MI0000095 CUGGGGGCUCCAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAGUGUGAUUACCCAACCUAC UGCUGAGCUAGCACUUCCCGAGCCCCCGG >hsa-mir-95 MI0000097 AACACAGUGGGCACUCAAUAAAUGUCUGUUGAAUUGAAAUGCGUUACAUUC AACGGGUAUUUAUUGAGCACCCACUCUGUG >hsa-mir-96 MI0000098 UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGUGUCUCUCCGCUCUGAGC AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUGGGAAA >hsa-mir-98 MI0000100 AGGAUUCUGCUCAUGCCAGGGUGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUUGUGGGGUA GGGAUAUUAGGCCCCAAUUAGAAGAUAACUAUACAACUUACUACUUUCCCUGGUGUGUGGC AUAUUCA >hsa-mir-99a MI0000101 CCCAUUGGCAUAAACCCGUAGAUCCGAUCUUGUGGUGAAGUGGACCGCACA AGCUCGCUUCUAUGGGUCUGUGUCAGUGUG >hsa-mir-99b MI0000746 GGCACCCACCCGUAGAACCGACCUUGCGGGGCCUUCGCCGCACACAAGCUC GUGUCUGUGGGUCCGUGUC >hsa-mir-100 MI0000102 CCUGUUGCCACAAACCCGUAGAUCCGAACUUGUGGUAUUAGUCCGCACAAG CUUGUAUCUAUAGGUAUGUGUCUGUUAGG >hsa-mir-101-l MI0000103 UGCCCUGGCUCAGUUAUCACAGUGCUGAUGCUGUCUAUUCUAAAGGUACAG UACUGUGAUAACUGAAGGAUGGCA >hsa-mir-101-2 MI0000739 ACUGUCCUUUUUCGGUUAUCAUGGUACCGAUGCUGUAUAUCUGAAAGGUAC AGUACUGUGAUAACUGAAGAAUGGUGGU >hsa-mir-103a-l MI0000109 UACUGCCCUCGGCUUCUUUACAGUGCUGCCUUGUUGCAUAUGGAUCAAGCA GCAUUGUACAGGGCUAUGAAGGCAUUG >hsa-mir-103a-2 MI0000108 UUGUGCUUUCAGCUUCUUUACAGUGCUGCCUUGUAGCAUUCAGGUCAAGCA GCAUUGUACAGGGCUAUGAAAGAACCA >hsa-mir-103b-l MI0007261 UCAUAGCCCUGUACAAÜGCUGCUUGAUCCAUAUGCAACAAGGCAGCACUGU AAAGAAGCCGA >hsa-mir-103b-2 MI0007262 UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUGACCUGAAUGCUACAAGGCAGCACUGU AAAGAAGCUGA >hsa-mir-105-l MI0000111 UGÜGCAUCGUGGUCAAAUGCÜCAGACUCCUGUGGUGGCUGCUCAUGCACCA CGGAUGUUUGAGCAUGUGCUACGGUGUCUA >hsa-mir-105-2 MI0000112 UGUGCAUCGUGGUCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGUGGCUGCUUAUGCACCA CGGAUGUUUGAGCAUGUGCUAUGGUGUCUA >hsa-mir-106a MI0000113 CCUUGGCCAUGUAAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGCUUUUUGAGAUCUACU GCAAÜGUAAGCACUÜCUUACAÜUACCAUGG >hsa-mir-106b MI0000734 CCUGCCGGGGCUAAAGUGCUGACAGUGCAGAUAGUGGUCCUCUCCGUGCUA CCGCACUGUGGGUACUUGCUGCUCCAGCAGG >hsa-mir-107 MI0000114 CUCUCUGCUUUCAGCUUCUUUACAGUGUUGCCUUGUGGCAUGGAGUUCAAG 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>hsa-mir-133a-2 MI0000451 GGGAGCCAAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGACUGUC CAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGUGCAUUGAUGGCGCCG >hsa-mir-133b MI0000822 CCUCAGAAGAAAGAUGCCCCCUGCUCUGGCUGGUCAAACGGAACCAAGUCC GUCUUCCUGAGAGGUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUACAGCAGGGCUGGCAAUGCCCAGUCC UUGGAGA >hsa-mir-134 MI0000474 CAGGGUGUGUGACUGGUUGACCAGAGGGGCAUGCACUGUGUUCACCCUGUG GGCCACCUAGUCACCAACCCUC >hsa-mir-135a-l MI?000452 AGGCCUCGCUGUUCUCUAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGAUUCUACUGCUCA CUCAUAUAGGGAUUGGAGCCGUGGCGCACGGCGGGGACA >hsa-mir-135a-2 MI0000453 AGAUAAAUUCACUCUAGUGCUUUAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGAUAGUAA UAAAGUCUCAUGUAGGGAUGGAAGCCAUGAAAUACAUUGUGAAAAAUCA >hsa-mir-135b MI0000810 CACUCUGCUGUGGCCUAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGAUUGCUGUCCCAAA CUCAUGUAGGGCUAAAAGCCAUGGGCUACAGUGAGGGGCGAGCUCC >hsa-mir-136 MI0000475 UGAGCCCUCGGAGGACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCAU CAUCGUCUCAAAUGAGUCUUCAGAGGGUUCU >hsa-mir-137 MI0000454 GGUCCUCUGACUCUCUUCGGUGACGGGUAUUCUUGGGUGGAUAAUACGGAU UACGUUGUUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAGUCGAGGAGAGUACCAGCGGCA >hsa-mir-138-l 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GGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU >hsa-mir-146a MI0000477 CCGAUGUGUAUCCUCAGCUUUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUUGUGUCAGUG UCAGACCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAGCUGGGAUAUCUCUGUCAUCGU >hsa-mir-1 6b MI0003129 CCUGGCACUGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUGUGAGCUCUAGCAAUGCCCUG UGGACUCAGUUCUGGUGCCCGG >hsa-mir-147a MI0000262 AAUCUAAAGACAACAUUUCUGCACACACACCAGACUAUGGAAGCCAGUGUG UGGAAAUGCUUCUGCUAGAUU >hsa-mir-147b MI0005544 UAUAAAUCUAGUGGAAACAUUUCUGCACAAACUAGAUUCUGGACACCAGUG UGCGGAAAUGCUUCUGCUACAUUUUUAGG >hsa-mir-148a MI0000253 GAGGCAAAGUUCUGAGACACUCCGACUCUGAGUAUGAUAGAAGUCAGUGCA CUACAGAACUUUGUCUC >hsa-mir-148b MI0000811 CAAGCACGAUUAGCAUUUGAGGUGAAGUUCUGUUAUACACUCAGGCUGUGG CUCUCUGAAAGUCAGUGCAUCACAGAACUUUGUCUCGAAAGCUUUCUA >hsa-mir-149 MI0000478 GCCGGCGCCCGAGCUCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCCGUGCUUGUCCGAGG AGGGAGGGAGGGACGGGGGCUGUGCUGGGGCAGCUGGA >hsa-mir-150 MI0000479 CUCCCCAUGGCCCUGUCUCCCAACCCUUGUACCAGUGCUGGGCUCAGACCC UGGUACAGGCCUGGGGGACAGGGACCUGGGGAC >hsa-mir-151a MI0000809 UUUCCUGCCCUCGAGGAGCUCACAGUCUAGUAUGUCUCAUCCCCUACUAGA CUGAAGCUCCUUGAGGACAGGGAUGGUCAUACUCACCUC >hsa-mir-151b MI0003772 ACCUCUGAUGUGUCAGUCUCUCUUCAGGGCUCCCGAGACACAGAAACAGAC ACCUGCCCUCGAGGAGCUCACAGUCUAGACAAACAAACCCAGGGU >hsa-mir-152 MI0000462 UGUCCCCCCCGGCCCAGGUUCUGUGAUACACUCCGACUCGGGCUCUGGAGC AGUCAGUGCAUGACAGAACUUGGGCCCGGAAGGACC >hsa-mir-153-l MI0000463 CUCACAGCUGCCAGUGUCAUUUUUGUGAUCUGCAGCUAGUAUUCUCACUCC AGUUGCAUAGUCACAAAAGUGAUCAUUGGCAGGUGUGGC >hsa-mir-153-2 MI0000464 AGCGGUGGCCAGUGUCAUUUUUGUGAUGUUGCAGCUAGUAAUAUGAGCCCA GUUGCAUAGUCACAAAAGUGAUCAUUGGAAACUGUG >hsa-mir-154 MI0000480 GUGGUACUUGAAGAUAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCGCUUUAUUUGUGACGA AUCAUACACGGUUGACCUAUUUUUCAGUACCAA >hsa-mir-155 MI0000681 CUGUUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUUUUUGCCUCCAACUGACUCCUACAU AUUAGCAUUAACAG >hsa-mir-181a-l MI0000289 UGAGUUUUGAGGUUGCUUCAGUGAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUUUGGA AUUAAAAUCAAAACCAUCGACCGUUGAUUGUACCCUAUGGCUAACCAUCAUCUACUCCA >hsa-mir-181a-2 MI0000269 AGAAGGGCUAUCAGGCCAGCCUUCAGAGGACUCCAAGGAACAUUCAACGCU GUCGGUGAGUUUGGGAUUUGAAAAAACCACUGACCGUUGACUGUACCUUGGGGUCCUUA >hsa-mir-181b-l 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GGCCUGGCUGGACAGAGÜUGUCAUGUGUCUGCCUGUCUACACUUGCUGUGC AGAACAUCCGCUCACCUGUACAGCAGGCACAGACAGGCAGUCACAUGACAACCCAGCCU >hsa- ir-215 MI0000291 AUCAUUCAGAAAUGGUAUACAGGAAAAUGACCUAUGAAUUGACAGACAAUA UAGCUGAGUUUGUCUGUCAUUUCUUUAGGCCAAUAUUCUGUAUGACUGUGCUACUUCAA >hsa-mir-216a MI0000292 GAUGGCUGUGAGUUGGCUUAAUCUCAGCUGGCAACUGUGAGAUGUUCAUAC AAUCCCUCACAGUGGUCUCUGGGAUUAUGCUAAACAGAGCAAUUUCCUAGCCCUCACGA >hsa-mir-216b MI0005569 GCAGACUGGAAAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGAUGUCACUGAGGAAAUCACA CACUUACCCGUAGAGAUUCUACAGUCUGACA >hsa-mir-217 MI0000293 AGUAUAAUUAUUACAÜAGUUUUUGAUGUCGCAGAUACUGCAUCAGGAACUG AUUGGAUAAGAAUCAGUCACCAUCAGUUCCUAAUGCAUUGCCUUCAGCAUCUAAACAAG >hsa-mir-218-l MI0000294 GUGAUAAUGUAGCGAGAUUUUCUGUUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGUUGC GAGGUAUGAGUAAAACAUGGUUCCGUCAAGCACCAUGGAACGUCACGCAGCUUUCUACA >hsa-mir-218-2 MI0000295 GACCAGUCGCUGCGGGGCUUUCCUUUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGUGGA ACGAÜGGAAACGGAACAUGGUUCUGUCAAGCACCGCGGAAAGCACCGUGCUCUCCUGCA >hsa-mir-219-l MI0000296 CCGCCCCGGGCCGCGGCUCCUGAUUGUCCAAACGCAAUUCUCGAGUCUAUG 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>hsa-mir-335 MI0000816 ÜGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCG UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA >hsa-mir-337 MI0000806 GUAGUCAGUAGUUGGGGGGUGGGAACGGCUUCAUACAGGAGUÜGAUGCACA GUUAUCCAGCUCCUAUAUGAUGCCUUUCUUCAUCCCCUUCAA >hsa-mir-338 MI0000814 UCUCCAACAAUAUCCUGGUGCUGAGUGAUGACUCAGGCGACUCCAGCAUCA GUGAUUUUGUUGAAGA >hsa-mir-339 MI0000815 CGGGGCGGCCGCUCUCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACGUGUGCCUGCCUGUG AGCGCCUCGACGACAGAGCCGGCGCCUGCCCCAGUGUCUGCGC >hsa-mir-340 MI0000802 UUGUACCUGGUGUGAUUAUAAAGCAAUGAGACUGAUUGUCAUAUGUCGUUU GUGGGAUCCGUCUCAGUUACUUUAUAGCCAUACCUGGUAUCUUA >hsa-mir-342 MI0000805 GAAACUGGGCUCAAGGUGAGGGGUGCUAUCUGUGAUUGAGGGACAUGGUUA AUGGAAUUGUCUCACACAGAAAUCGCACCCGUCACCUUGGCCUACUUA >hsa-mir-345 MI0000825 ACCCAAACCCUAGGUCUGCUGACUCCUAGÜCCAGGGCUCGUGAUGGCUGGU GGGCCCUGAACGAGGGGUCUGGAGGCCUGGGUUUGAAUAUCGACAGC >hsa-mir-346 MI0000826 GGUCUCUGUGUUGGGCGUCUGUCUGCCCGCAUGCCUGCCUCUCUGUUGCUC UGAAGGAGGCAGGGGCUGGGCCUGCAGCUGCCUGGGCAGAGCGG >hsa-mir-361 MI0000760 GGAGCUUAUCAGAAUCUCCAGGGGUACUUUAUAAUUUCAAAAAGUCCCCCA GGUGUGAUUCUGAUUUGCUUC >hsa-mir-362 MI0000762 CUUGAAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGUGCUAUUUCAGUGCAACACACCUA UUCAAGGAUUCAAA >hsa-mir-363 MI0000764 UGUUGUCGGGUGGAUCACGAUGCAAUUUUGAUGAGUAUCAUAGGAGAAAAA UUGCACGGUAUCCAUCUGUAAACC >hsa-mir-365a MI0000767 ACCGCAGGGAAAAUGAGGGACUUUUGGGGGCAGAUGUGUUUCCAUUCCACU AUCAUAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAUUGCUCUUGCA >hsa-mir-365b MI0000769 AGAGUGUUCAAGGACAGCAAGAAAAAUGAGGGACUUUCAGGGGCAGCUGUG UUUUCUGACUCAGUCAUAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAUUGUUCUUGCAGUGUGCAUCGGG >hsa-mir-367 MI0000775 CCAUUACUGUUGCUAAUAUGCAACUCUGUUGAAUAUAAAUUGGAAUUGCAC UUUAGCAAUGGUGAUGG >hsa-mir-369 MI0000777 UUGAAGGGAGAUCGACCGUGUUAUAUUCGCUUUAUUGACUUCGAAUAAUAC AUGGUUGAUCUUUUCUCAG >hsa-mir-370 MI0000778 AGACAGAGAAGCCAGGUCACGUCUCUGCAGUUACACAGCUCACGAGUGCCU GCUGGGGUGGAACCUGGUCUGUCU >hsa-mir-371a MI0000779 GUGGCACUCAAACUGUGGGGGCACUUUCUGCUCUCUGGUGAAAGUGCCGCC AUCUUUUGAGUGUUAC >hsa-mir-371b MI0017393 GGUAACACUCAAAAGAUGGCGGCACUUUCACCAGAGAGCAGAAAGUGCCCC CACAGUUUGAGUGCC >hsa-mir-372 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UUGAGCAGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUCGCUUUAUUUAUGUUGAAUCACAC AAAGGCAACUUUUGUUUG >hsa-mir-378a MI0000786 AGGGCUCCUGACUCCAGGUCCUGUGUGUUACCUAGAAAUAGCACUGGACUU GGAGÜCAGAAGGCCU >hsa-mir-378b MI0014154 GGUCAUUGAGUCUUCAAGGCUAGUGGAAAGAGCACUGGACUUGGAGGCAGA AAGACC >hsa-mir-378c I0015825 GGAGGCCAUCACUGGACUUGGAGUCAGAAGAGUGGAGUCGGGUCAGACUUC AACUCUGACUUUGAAGGUGGUGAGUGCCUC >hsa-mir-378d-l MI0016749 ACUGUUUCUGUCCUUGUUCUUGUUGUUAUUACUGGACUUGGAGUCAGAAAC AGG >hsa-mir-378d-2 MI0003840 GAAUGGÜUACAAGGAGAGAACACUGGACUUGGAGUCAGAAAACUUUCAUCC AAGUCAUUCCCUGCUCUAAGUCCCAUUUCUGUUCCAUGAGAUUGUUU >hsa-mir-378e MI0016750 CUGACUCCAGUGUCCAGGCCAGGGGCAGACAGUGGACAGAGAACAGUGCCC AAGACCACUGGACUUGGAGUCAGGACAU >hsa-mir-378f MI0016756 GUCAGGUCCUGGACUCCCAUAGUUUUCAGGCUGCUAAACAACAGAACGAGC ACUGGACUUGGAGCCAGAAGUCUUGGG >hsa-mir-378g MI0016761 CACUGGGCUUGGAGUCAGAAGACCUGGCUCCAGCCCAGCUC >hsa-mir-378h MI0016808 ACAGGAACACUGGACUUGGUGUCAGAUGGGAUGAGCCCUGGCUCUGUUUCC UAGCAGCAAUCUGAUCUUGAGCUAGUCACUGG >hsa-mir-378i MI0016902 GGGAGCACUGGACUAGGAGUCAGAAGGUGGAGUUCUGGGUGCUGUUUUCCC ACUCUUGGGCCCUGGGCAUGUUCUG >hsa-mir-379 MI0000787 AGAGAUGGUAGACUAUGGAACGUAGGCGUUAUGAUUUCUGACCUAUGÜAAC AUGGÜCCACUAACUCU >hsa-mir-380 MI0000788 AAGAUGGUUGACCAUAGAACAUGCGCUAUCUCUGUGUCGUAUGUAAUAUGG UCCACAUCUU >hsa-mir-381 MI0000789 UACUUAAAGCGAGGUUGCCCUUUGUAUAUUCGGUUUAUUGACAUGGAAUAU ACAAGGGCAAGCUCUCUGUGAGUA >hsa-mir-382 MI0000790 UACUUGAAGAGAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCGCUUUACUUAUGACGAAUCA UUCACGGACAACACUUUUUUCAGUA >hsa-mir-383 MI0000791 CUCCUCAGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCUUUGGGUGGAUAUUAAUCAGCCAC AGCACUGCCUGGUCAGAAAGAG >hsa-mir-384 MI0001145 UGUUAAAUCAGGAAUUUUAAACAAUUCCUAGACAAUAUGUAUAAUGUUCAU AAGUCAUUCCUAGAAAUUGUUCAUAAUGCCUGUAACA >hsa-mir-409 MI0001735 UGGUACUCGGGGAGAGGUUACCCGAGCAACUUUGCAUCUGGACGACGAAUG UUGCUCGGUGAACCCCUUUUCGGUAUCA >hsa-mir-410 MI0002465 GGUACCUGAGAAGAGGUUGUCUGUGAUGAGUUCGCUUUUAUUAAUGACGAA ÜAUAACACAGAUGGCCUGUUUUCAGUACC >hsa-mir-411 MI0003675 UGGUACUUGGAGAGAUAGUAGACCGUAUAGCGUACGCUUUAUCUGUGACGU AUGUAACACGGUCCACUAACCCUCAGUAUCAAAUCCAUCCCCGAG 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Claims (100)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
1. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizada porque comprende una pluralidad de oligonucleótidos de al menos un tipo, en donde cada tipo es definido por: 1) secuencia base; 2) patrón de enlaces de cadena principal; 3) patrón de centros quirales de cadena principal; y 4) patrón de porciones-X de cadena principal.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un unímero.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un estereounímero, unimero de modificación-P, o unimero de enlace.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un altmero.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un estereoaltmero, altmero de modificación-P, o altmero de enlace.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un blockmero.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un estereoblockmero, blockmero de modif icación-P, o blockmero de enlace.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un gapmero.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un skipmero
10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es un oligonucleótido antisentido, un antagomir, un microARN, un pre-microARN, un antimir, un supermir, una ribozima, un adaptador Ul, activador de ARN, agente de ARNi, un oligonucleótido señuelo, un oligonucleótido que forma triplex, o un aptámero.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es útil en la regulación del nivel de una proteína, o un ARN.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es útil en la regulación del nivel de un ARNm.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el oligonucleótido de al menos un tipo es útil en la regulación del nivel de un microARN .
14 . La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende uno o más enlaces de internucleótidos de fosforotioato triéster.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 10 enlaces de internucleótidos de fosforotioato triéster.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende al menos 10, al menos 12, o al menos 15 enlaces de internucleótidos de fosforotioato triéster.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende uno o más enlaces de internucleótidos modificados independientemente que tienen la estructura de la fórmula I: > W +Y-PII-Z->f- X-L-R1 (I) en donde: P* es un átomo de fósforo asimétrico y es ya sea Rp o Sp; W es 0, S o Se; cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S- , -N(-L-R1)-, o L; L es un enlace covalente o un alquileno Ci-C50 lineal o ramificado opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente sustituidasustituidas por un alquileno Ci- C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, — CºC— , C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, - C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N (R')C(O)-, N(R')C(0)0-, -0C(0)N(Rf)-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, - N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, O -C(0)0-; R1 es halógeno, R, o un alifático CI-CIQ opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente sustituidas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC— , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, - C(O)-, -C(S)-, -C(NR')~, -C(O)N (R')-, -N (R')C(O)N(R')~, - N(R')C(O)-, -N(R')C(0)O-, -0C(0)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, - S(0)2N(R')-, -N(R')S(0)2-, -SC(O)-, -C(0)S-, -OC(O)-, o - C (O)0-; cada R' es independientemente -R, -C(0)R, -CO2R, o —S02R, O: dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterocielico opcionalmente sustituido, o dos R' en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbociclico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido; -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado a partir de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno, o heterociclileno; cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático Ci~C6f fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo, o heterocielilo; y cada representa independientemente una conexión a un nucleósido.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende uno o más enlaces de internucleótidos modificados independientemente que tienen la estructura de la fórmula I-a, I-b, o I-c.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende uno o más enlaces de internucleótidos modificados independientemente que tienen la estructura de la fórmula I-c.
20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende además uno o más enlaces de fosfato diéster.
21. Una composición de oligonucleótido que está quiralmente controlada, caracterizada porque la composición contiene niveles predeterminados de uno o más oligonucleótidos de tipo individuales, en donde un tipo de oligonucleótido es definido por: 1) secuencia base; 2) patrón de enlaces de cadena principal; 3) patrón de centros quirales de cadena principal; y 4) patrón de porciones-X de cadena principal.
22. La composición de oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la composición es quiralmente pura.
23. La composición de oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la composición es quiralmente uniforme.
24. La composición de oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la composición contiene niveles predeterminados de al menos dos tipos de oligonucleótidos.
25. La composición de oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la composición contiene niveles predeterminados de al menos tres o al menos cuatro tipos de oligonucleótidos.
26. La composición de oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 21, caracterizada porque uno o más tipos de oligonucleótidos son seleccionados a partir de la Tabla 2
27. Un oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizado porque comprende uno o más enlaces de internucleótidos de fosforotioato triéster.
28. La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 10 enlaces de internucleótidos de fosforotioato triéster.
29. Un oligonucleótido quiralmente controlado caracterizado porque comprende al menos 10, al menos 12, o al menos 15 enlaces de internucleótidos de fosforotioato triéster.
30. Un oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizado porque comprende uno o más enlaces de internucleótidos modificados independientemente que tienen la estructura de la fórmula I: (I) en donde: P* es un átomo de fósforo asimétrico y es ya sea Rp o Sp; W es 0, S o Se; cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S- , -N(-L-R1)-, o L; L es un enlace covalente o un alquileno Ci-C5o lineal o ramificado opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de L son opcionalmente e independientemente sustituidas por un alquileno Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, C=C , -C(R')2- , -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N (R')—, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(0)-, -N(R')C(O)0-, -0C(0)N(R') , -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2N(R')-, -N (R')S(0)2-, - SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o -C(0)0-; R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido en donde una o más unidades de metileno son opcionalmente e independientemente sustituidas por un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C6, — CºC- , -C(R')2-, -Cy-, -0-, -S-, -S-S-, -N (R')-, - C(0)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(0)N (R')-, -N(R')C(0)N(R')-, - N(R')C(0)-, -N(R')C(0)0-, -0C(0)N(R')-, -S(0)-, -S(0)2-, - S(0)2N(R')~, -N(R')S(0)2-, -SC(0)-, -C(0)S-, -0C(0)-, o - C(0)0-; cada R' es independientemente -R, -C(0)R, -CO2R, o —S02R, O: dos R' en el mismo nitrógeno son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo heteroarilo o heterocielico opcionalmente sustituido, o dos R' en el mismo carbono son tomados junto con sus átomos de intervención para formar un anillo arilo, carbociclico, heterociclico o heteroarilo opcionalmente sustituido; -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado a partir de fenileno, carbocielileno, arileno, heteroarileno, o heterociclileno; cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado a partir de alifático C1-C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo; y cada representa independientemente una conexión a un nucleósido.
31. Un oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizado porque comprende uno o más enlaces de internucleótidos modificados independientemente que tienen la estructura de la fórmula I-a, I-b, o I-c.
32. Un oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizado porque comprende uno o más enlaces de internucleótidos modificados independientemente que tienen la estructura de la fórmula I-c.
33. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-32, caracterizado porque al menos un tipo de oligonucleótido comprende además uno o más enlaces de fosfato diéster.
34. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-33, caracterizado porque comprende al menos 5, al menos 6, o al menos 7 enlaces internucleotídicos modificados consecutivos, y al menos uno de los enlaces internucleotídicos modificados consecutivos no es un enlace de fosforotioato diéster.
35. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-34, caracterizado porque comprende al menos un enlace internucleotídico que tiene la estructura de .
36. Un oligonucleótido quiralmente seleccionado a partir de la Tabla 2.
37. Un método para elaborar un oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizado porque comprende las etapas de: (1) acoplamiento; (2) tapado; (3) modificación; (4) desbloqueo; y (5) repetición de los pasos (1) - (4) hasta que se logra una longitud deseada.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la etapa de acoplamiento comprende el uso de CMPT y , en donde BPR0 es una núcleobase protegida.
39. El método de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizado porque la etapa de tapado comprende las etapas de tapado del grupo amino en el auxiliar quiral y el tapado del 5'-OH sin reaccionar.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la etapa de tapado comprende el uso de (Pac)20.
41. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la etapa de modificación comprende sulfurización.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la etapa de sulfurización comprende usar un reactivo de sulfurización de la fórmula S-I o S-II.
43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el ciclo que comprende tal etapa de sulfurización forma un enlace internucleotidico que tiene la estructura de la fórmula I.
44. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la etapa de desbloqueo comprende las etapas de usar un ácido.
45. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 10% del producto crudo.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 5% del producto crudo.
47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 4% del producto crudo.
48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 3% del producto crudo.
49. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 2% del producto crudo.
50. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 1% del producto crudo.
51. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque todos los oligonucleótidos que son un nucleótido más cortos que la longitud deseada, cuando se combinan, son de menos de 0.5% del producto crudo.
52. Un método para elaborar una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizado porque comprende proporcionar uno o más tipos de oligonucleótidos en una cantidad pre-determinada.
53. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque un precursor de fosforotioato diéster se usa para cada enlace de fosforotioato diéster.
54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el precursor de fosforotioato
55. El método de conformidad con la reivindicación 53 o 54, caracterizado porque cada precursor de fosforotioato diéster se convierte a un enlace de fosforotioato diéster después de que se logra la longitud de oligonucleótido deseada.
56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-55, caracterizado porque al menos una etapa de modificación es reemplazadapor una etapa de oxidación.
57. Un método para la modificación de un oligonucleótido caracterizado porque comprende las etapas de: (1) proporcionar un oligonucleótido quiralmente controlado; (2) proporcionar un reactivo de modificación; y (3) hacer reaccionar el oligonucleótido quiralmente controlado con el reactivo de modificación bajo condiciones adecuadas para efectuar la modificación del fósforo de enlace del oligonucleótido quiralmente controlado.
58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el reactivo de modificación es de la fórmula S-I o S-II.
59. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque al menos un precursor de fosforotioato diéster se convierte a un enlace de fosforotioato diéster.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque cada precursor de fosforotioato diéster se convierte a un enlace de fosforotioato diéster.
61. Reactivos de sulfurización que tienen la fórmula de S-I.
62. Reactivos de sulfurización que tienen la fórmula de S-II.
63. Un reactivo de sulfurización seleccionado a partir de la Tabla 5.
64. Una composición farmacéutica para tratar una enfermedad caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-36, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
65. Un método que comprende las etapas de administrar a un sujeto que sufre de o es susceptible a cáncer, una cantidad de una composición de oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26 y 64, suficientemente para parcialmente o completamente aliviar, mitigar, confortar, inhibir, prevenir, retardar el comienzo de, reducir la severidad de, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características del cáncer.
66. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-35, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC.
67. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 66, seleccionado a partir de la Tabla 4.
68. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-36, 66 y 67, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >50%.
69. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >60%.
70. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >70%.
71. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >80%.
72. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >85%.
73. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >90%.
74. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >95%.
75. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >98%.
76. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado tiene una pureza de >99%.
77. Un oligonucleótido quiralmente controlado de una de las estructuras representadas en la Figura 26.
78. Un oligonucleótido quiralmente controlado de una de las estructuras representadas en la Figura 27.
79. Un oligonucleótido quiralmente controlado de una de las estructuras representadas en la Figura 28.
80. Un oligonucleótido quiralmente controlado de una de las estructuras representadas en la Figura 29.
81. Un oligonucleótido quiralmente controlado de una de las estructuras representadas en la Figura 30.
82. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, que comprende uno o más oligonucleótidos representados en la Figura 26.
83. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, que comprende uno o más oligonucleótidos representados en la Figura 27.
84. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, que comprende uno o más oligonucleótidos representados en la Figura 28.
85. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, que comprende uno o más oligonucleótidos representados en la Figura 29.
86. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, que comprende uno o más oligonucleótidos representados en la Figura 30.
87. Un oligonucleótido quiralmente controlado de cualquiera de las estructuras representadas en el documento WO 2012/030683.
88. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, que comprende un oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las estructuras representadas en el documento WO 2012/030683.
89. Un oligonucleótido quiralmente controlado, que tiene cualquiera de las secuencias base descritas o representadas en el documento WO 2012/030683.
90. Un oligonucleótido quiralmente controlado preparado por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-60.
91. Un oligonucleótido quiralmente controlado preparado por un método que comprende uno o más ciclos representados en el Esquema de reacción I.
92. Un oligonucléotido quiralmente controlado preparado por un método que comprende uno o más ciclos representados en el Esquema de reacción I-b.
93. Un oligonucleótido quiralmente controlado preparado por un método que comprende uno o más ciclos representados en el Esquema de reacción I-c.
94. Un oligonucleótido quiralmente controlado preparado por un método que comprende uno o más ciclos representados en el Esquema de reacción I-d.
95. El oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-36 y 66-94, caracterizado porque el oligonucleótido quiralmente controlado no está ligado a un soporte sólido.
96. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizada porque comprende un oligonucleótido que tiene cualquiera de las secuencias base descritas o representadas en el documento WO 2012/030683.
97. Una composición de oligonucleótido quiralmente controlado, caracterizada porque comprende un oligonucleótido quiralmente controlado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-36 y 66-95.
98. Un método caracterizado porque comprende las etapas de: a) realizar un primer análisis de una primera composición, en el cual la primera composición comprende una pluralidad de diferentes tipos de un oligonucleótido; y b) comparar el primer análisis realizado con un segundo análisis, bajo condiciones comparables como el primer análisis, de una segunda composición, en el cual la segunda composición es una composición quiralmente controlada del oligonucleótido, en donde las diferencias entre el primero y segundo análisis reflejan diferencias en la presencia o nivel de al menos un tipo de oligonucleótido en la primera comparada con la segunda composición.
99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la segunda composición contiene solamente un tipo único de oligonucleótido.
100. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la segunda composición es una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26 y 95-96.
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