JP2010507386A - オリゴリボヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、免疫刺激性RNAオリゴヌクレオチド(ORN)に関する。特に、ORNは、3’ポリGモチーフ、および任意選択により5’ポリGモチーフが直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ORNモチーフを有する。本発明はまた、治療方法およびスクリーニング方法を含む方法およびORNを使用するための関連キットに関する。
Description
本発明は、免疫刺激性RNAオリゴヌクレオチド(ORN)に関する。特に、ORNは、3’ポリGモチーフ、および任意選択により5’ポリGモチーフが直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ORNモチーフを有する。本発明はまた、治療方法およびスクリーニング方法を含む方法ならびにORNを使用するための関連キットに関する。
Toll様受容体(TLR)は、病原体関連分子パターン(PAMP)を認識し、哺乳類における自然免疫において重要な役割を果たす、高度に保存されたパターン認識受容体(PRR)ポリペプチドのファミリーである。現在、TLR1〜TLR10と名づけられた少なくとも10種のファミリーメンバーが同定されている。種々のTLRの細胞質ドメインが、Toll−インターロイキン1受容体(TIR)ドメインを特徴としている。Medzhitov Rら(1998年)Mol Cell2:253〜8頁。TLRによる微生物侵入の認識は、ショウジョウバエおよび哺乳類において進化的に保存されているシグナル伝達カスケードの活性化を引き起こす。TIRドメイン含有アダプタータンパク質MyD88は、TLRと結合し、インターロイキン1受容体関連キナーゼ(IRAK)および腫瘍壊死因子(TNF)受容体関連因子6(TRAF6)をTLRに補充すると報告されている。MyD88依存性シグナル伝達経路は、NF−κB転写因子およびc−Jun NH2ターミナルキナーゼ(Jnk)マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)の活性化、免疫活性化および炎症性サイトカインの産生における重要な工程につながると考えられている。総説については、Aderem Aら(2000年)Nature406:782〜87頁、およびAkira Sら(2004年)Nat Rev Immunol4:499〜511頁参照のこと。
いくつかの特異的TLRリガンドが同定されている。TLR2のリガンドとして、ペプチドグリカンおよびリポペプチドが挙げられる。Yoshimura Aら(1999年)J Immunol163:1〜5頁;Yoshimura Aら(1999年)J Immunol163:1〜5頁;Aliprantis AOら(1999年)Science285:736〜9頁。リポ多糖類(LPS)は、TLR4のリガンドである。Poltorak Aら(1998年)Science282:2085〜8頁;Hoshino Kら(1999年)J Immunol162:3749〜52頁。細菌フラジェリンは、TLR5のリガンドである。Hayashi Fら(2001年)Nature410:1099〜1103頁。ペプチドグリカンは、TLR2のリガンドであるだけでなくTLR6のリガンドでもあると報告されている。Ozinsky Aら(2000年)Proc Natl Acad Sci USA97:13766〜71頁;Takeuchi Oら(2001年)Int Immunol 13:933〜40頁。最近、特定の低分子量合成化合物、イミダゾキノリンイミキモド(R−837)およびレシキモド(R−848)は、TLR7およびTLR8のリガンドであると報告された。Hemmi Hら(2002年)Nat Immunol3:196〜200頁;Jurk Mら(2002年)Nat Immunol3:499頁。
メチル化されていない細菌DNAおよびその合成類似体(CpG DNA)は、TLR9のリガンドである(Hemmi Hら(2000年)Nature408:740〜5頁;Bauer Sら(2001年)Proc Natl Acad Sci USA98、9237〜42頁)という最近の発見を発端にして、特定のTLRのリガンドは、特定の核酸分子を含むということが報告された。最近、特定の種類のRNAは、配列独立的にまたは配列依存的に免疫刺激性であると報告された。さらに、これらの種々の免疫刺激性RNAは、TLR3、TLR7およびTLR8を刺激すると報告された。
本発明は、概して、特定のRNAモチーフを含有する免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド(ORN)、ならびにこのようなORNを含有する関連免疫刺激性組成物、ならびにこのようなORNおよび組成物を使用する方法に関する。本発明のORNは、免疫応答を刺激または増強するような任意の設定または適用において有用であり得る。以下に開示されるように、本発明のORNは、種々の状態、例えば、感染、癌、アレルギーおよび喘息の治療において使用するための、アジュバント、ワクチンおよび他の医薬をはじめとする医薬組成物の調製において特に役に立つ。したがって、特定の態様では、本発明は、本発明のORNを含む組成物ならびにその使用方法に関する。また、以下に開示されるように、本発明のORNおよび組成物は、免疫細胞を活性化する方法、対象にワクチン接種する方法、免疫系不全の対象を治療する方法、感染症の対象を治療する方法、自己免疫疾患の対象を治療する方法、癌の対象を治療する方法、アレルギー状態の対象を治療する方法、喘息、気道リモデリング、エピトープ拡散の促進および抗体依存性細胞傷害(ADCC)の対象を治療する方法において特に役に立つ。
以下に、より詳細に開示されるように、本発明の免疫刺激性ORNは、それらが少なくとも1つの配列依存性免疫刺激性RNAモチーフを含むことを特徴とする。配列依存性免疫刺激性RNAモチーフは、通常、短いRNA配列であるが、特定の実施形態では、モチーフはまた、1つまたは複数の修飾、例えば、修飾されたヌクレオチド間リン酸結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖、ヌクレオチド類似体、デオキシリボヌクレオチド、スペーサー、非ヌクレオチドリンカーまたはそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態では、免疫刺激性RNAモチーフは、本発明の長い免疫刺激性ORNの状況で提供される。また、免疫刺激性RNAモチーフは、キメラDNA:RNA核酸分子の状況で提供され得る。
配列依存性免疫刺激性RNAモチーフおよびこのようなモチーフを組み込むORNは、TLR7のアゴニストであるが、TLR8のアゴニストではないと開示されている。本発明のいくつかの態様によれば、8〜100個のリボヌクレオチドの長さの免疫刺激性RNAオリゴヌクレオチド(ORN)が提供される。ORNは、ポリGモチーフと連結している免疫刺激性ORNモチーフを含み、ポリGモチーフは、免疫刺激性ORNモチーフの3’側にある。ポリGモチーフは、少なくとも4個のGを含む。他の実施形態では、ポリGモチーフは、5、6、7、8、9または10個のGであり得る。Gは、グアノシンまたはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、ORNは、以下の5’GGGGUUUUGGGGG3’(配列番号33)、5’GGGUUUU3’,5’GGGGUUUUGGGG3’(配列番号34)、GUUUUUG(配列番号35)、GGGGGGGUUGUGUGGGGG(配列番号36)、CCCCUUUUGGGGG(配列番号37)、GUUUGUGUGGGG(配列番号38)、GUUGUGUGGGGG(配列番号39)、UUUUUUGGGGG(配列番号40)、UUUUUGGGGG(配列番号41)、UUUUGGGGG(配列番号19)、またはUUUUGGGG(配列番号15)のうちの1つではない。
いくつかの実施形態では、免疫刺激性ORNモチーフは、TLR8モチーフである。本発明のいくつかの態様のTLR8モチーフは、N−U−R1−R2である。
Nは、リボヌクレオチドであり、Nは、Uを含まない。いくつかの実施形態では、Nは、アデノシンまたはシトシン(C)またはそれらの誘導体である。
Uは、ウラシルまたはその誘導体である。
Rは、リボヌクレオチドであり、R1およびR2のうち少なくとも一方は、アデノシン(A)またはシトシンまたはそれらの誘導体である。Rは、N−U−R1−R2が少なくとも2個のAを含まない限り、Uではない。
本発明のORNは、少なくとも1つの、いくつかの実施形態では、2つ以上の(すなわち、2、3または4つの)免疫刺激性モチーフ、N−U−R1−R2を含む。TLR8モチーフを含むORNは、TLR7/8モチーフも任意選択により含み得る。
いくつかの実施形態では、N−U−R1−R2は、少なくとも3個のAまたは少なくとも2個のCを含み得る。任意選択により、N−U−R1−R2は、少なくとも1個のGまたはCを含む。
他の実施形態では、TLR8モチーフは、非ヌクレオチドリンカーを介して5’リボヌクレオチドから離れている。さらに他の実施形態では、TLR8モチーフは、非ヌクレオチドリンカーを介して3’リボヌクレオチドから離れている。任意選択により、TLR8モチーフは、非ヌクレオチドリンカーを介して5’および3’リボヌクレオチドから離れている。
他の実施形態では、TLR8モチーフは、少なくとも1個のAUを含む。さらに他の実施形態では、TLR8モチーフは、少なくとも1個のCUを含む。
さらに他の実施形態では、免疫刺激性ORNモチーフは、TLR7/8モチーフである。TLR7/8モチーフは、例えば、(i)5’−C/U−U−G/U−U−3’、(ii)5’−R−U−R−G−Y−3’、(iii)5’−G−U−U−G−B−3’、(iv)5’−G−U−G−U−G/U−3’および(v)5’−G/C−U−A/C−G−G−C−A−C−3’などのリボヌクレオチド配列を含む。C/Uは、シトシン(C)またはウラシル(U)である。G/Uは、グアニン(G)またはUである。Rはプリンである。Yはピリミジンである。BはU、GまたはCである。G/Cは、GまたはCである。A/Cは、アデニン(A)またはCである。
種々の実施形態では、5’−C/U−U−G/U−U−3’は、CUGU、CUUU、UUGUまたはUUUUである。
種々の実施形態では、5’−R−U−R−G−Y−3’は、GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGUまたはAUGGCである。一実施形態では、塩基配列は、GUAGUGUである。
種々の実施形態では、5’−G−U−U−G−B−3’は、GUUGU、GUUGGまたはGUUGCである。
種々の実施形態では、5’−G−U−G−U−G/U−3’は、GUGUGまたはGUGUUである。一実施形態では、塩基配列は、GUGUUUACである。
種々の実施形態では、5’−G/C−U−A/C−G−G−C−A−C−3’は、GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCACまたはCUCGGCACである。
いくつかの態様では、本発明のORNは、GG(R1)n(U)4〜20(R2)mGGGG(配列番号29)、GG(R1)n(U)5〜20(R2)mGGGG(配列番号30)またはGG(R1)n(U)4(R2)mGGGG(配列番号31)を含む、10〜100個のリボヌクレオチドの長さのORNである。
R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーである。Uは、ウリジンまたはその誘導体である。Gは、グアノシンまたはその誘導体である。n=0〜20かつm=0〜20。いくつかの実施形態では、(R1)nがGGである場合、(R2)mはGではないか、m=0ではない。
他の実施形態では、ORNは、本明細書に記載される式(i)、(ii)、(iii)の特定の修飾されたリン酸結合またはそれらの任意の組合せを含まない。
いくつかの実施形態では、ORNは、rG*rG*rG*rG*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号4)、rG*rG*rG*rG rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号5)、rG*rG*rG*rG*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号6)、rG*rG*rG*rG−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号8)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*dG*dG*dG*dG*dG(配列番号10)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号23)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG(配列番号24)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG(配列番号25)、rU*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号26)、rU*rU*rU*rU*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号27)、またはrG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号21)である。
任意選択により、式の成分は、以下のうちの1つまたは複数として定義される:(R1)nはGGであり、(R2)mはGGGであり、(U)4〜20はUUUUUであり、(U)4〜20はUUUUUUUであり、(U)4〜20はUUUUUUUUUU(配列番号32)であり、GGおよび(R1)nは、直接接続しており、GGおよび(R1)nは、3’−3’結合を介して接続しており、またはGGおよび(R1)nは、スペーサーによって接続している。いくつかの実施形態では、スペーサーは、D−スペーサーまたはリンカーなどの非ヌクレオチドスペーサーである。
本組成物は、滅菌担体をさらに含み得る。
ORNは、一本鎖または二本鎖または部分二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ORNは、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
ORNは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み得る。いくつかの実施形態では、ORNのすべてのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。他の実施形態では、ORNは、少なくとも1つのホスホジエステル様結合を含む。任意選択により、ホスホジエステル様結合は、ホスホジエステル結合である。
一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ORNおよびアジュバントを含む免疫刺激性組成物を提供する。種々の実施形態では、アジュバントは、デポー効果を生じるアジュバント、免疫刺激性アジュバントまたはデポー効果を生じ、かつ、免疫系を刺激するアジュバントである。一実施形態では、本発明のこの態様の免疫刺激性組成物は、免疫刺激性ORNおよびアジュバントのコンジュゲートである。本発明のこの態様の一実施形態では、免疫刺激性ORNは、アジュバントと共有結合によって連結している。他の実施形態では、それらはコンジュゲートしていない。
本発明の組成物は、抗原を任意選択により含み得る。したがって、一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ORNおよび抗原を含む、ワクチンを提供する。一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ORNおよび抗原のコンジュゲートを含むワクチンを提供する。一実施形態では、本発明のこの態様のコンジュゲートは、抗原と共有結合によって連結している免疫刺激性ORNを含む。他の実施形態では、それらはコンジュゲートしていない。種々の実施形態では、抗原は、それ自体抗原であり得る。抗原は、任意の抗原、例えば、癌抗原、微生物の抗原またはアレルゲンであり得る。
一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ORNおよび親油性部分のコンジュゲートを含む免疫刺激性組成物を提供する。一実施形態では、免疫刺激性ORNは、親油性部分と共有結合によって連結している。一実施形態では、親油性部分は、コレステリル、パルミチルおよび脂肪酸アシルからなる群から選択される。一実施形態では、親油性部分は、コレステロールの誘導体、例えば、コレステリルである。
一実施形態では、免疫刺激性ORNは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む。少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドは、通常、免疫刺激性RNAモチーフの外側のどこかに生じ得る。種々の実施形態では、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24の連続するデオキシリボヌクレオチドである。非連続デオキシリボヌクレオチドを含有する免疫刺激性ORNもまた、本発明によって考慮される。種々の実施形態では、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドは、免疫刺激性ORNの5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方である。少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドはまた、キメラDNA:RNA分子のDNA部分に相当する。一実施形態では、キメラDNA:RNA分子のDNA成分は、CpG核酸、すなわち、TLR9アゴニストを含む。一実施形態では、キメラDNA:RNA分子のDNAおよびRNA部分は、ヌクレオチド間リン酸結合を介して共有結合によって連結している。別の実施形態では、キメラDNA:RNA分子のDNAおよびRNA部分は、リンカー、例えば、非ヌクレオチドリンカーを介して、共有結合によって連結している。
一態様では、本発明は、共有結合によって閉じた、部分的に一本鎖である、ダンベル型核酸分子を含む免疫刺激性組成物を提供し、これでは、分子の少なくとも1つの一本鎖部分が、本発明の免疫刺激性RNAモチーフを含む。
一態様では、本発明は、本発明の前記の態様のいずれかの組成物を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリート(cochleate)、ビロソーム、免疫刺激複合体(ISCOM)、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層ベシクル(LUV)、多重膜ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム(emulsome)およびポリカチオン性ペプチドなどの送達ビヒクルおよび任意選択により、薬学的に許容できる担体と関連させて含む医薬組成物を提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、医薬組成物は、抗原を含む。送達ビヒクルのさらなる例は、以下に記載されている。
ORNは、噴霧器または吸入器、例えば、定量吸入器または粉末吸入器中に製剤され得る。いくつかの実施形態では、ORNは、化学療法薬、抗ウイルス薬または薬学的に許容できる担体などのさらなる組成物をさらに含む。薬学的に許容できる担体は、注射または粘膜投与用に製剤され得る。
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、種々の実施形態では、免疫刺激性ORNは、少なくとも1つの5’−5’ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの3’−3’ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの、リンカー部分を含む5’−5’ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの、リンカー部分を含む3’−3’ヌクレオチド間結合またはそれらの任意の組合せを任意選択により含み得る。リンカー部分は、一実施形態では、非ヌクレオチドリンカー部分である。
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、種々の実施形態では、免疫刺激性ORNは、少なくとも1つの2’−2’ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの2’−3’ヌクレオチド間結合、少なくとも2’−5’ヌクレオチド間結合、またはそれらの任意の組合せを任意選択により含み得る。好ましい実施形態では、少なくとも1つの2’−2’ヌクレオチド間結合、少なくとも1つの2’−3’ヌクレオチド間結合または少なくとも2’−5’ヌクレオチド間結合が、免疫刺激性RNAモチーフの外側に存在する。
また、本発明のこれらおよび他の態様によれば、一実施形態では、免疫刺激性ORNは、少なくとも1つの増倍単位を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性ORNは、分岐構造を有し得る。分岐組成物は、3’−5’、5’−5’、3’−3’、2’−2’、2’−3’または2’−5’ヌクレオチド間結合を、任意の組合せで含み得る。一実施形態では、免疫刺激性ORNは、少なくとも2つの増倍単位を含み、いわゆる、デンドリマーが結果として生じる。さらに、特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性ORNは、例えば、直鎖ORNに沿って直列に、分岐構造の異なるアーム上、または直鎖ORNに沿って直列に、かつ、分岐構造の異なるアーム上の両方で配列された、2つ以上の免疫刺激性RNAモチーフを含み得る。分岐構造、例えば、デンドリマーは、少なくとも1つの免疫刺激性CpG核酸を、例えば、分岐構造の分離アームとして任意選択により含み得る。
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、一実施形態では、免疫刺激性ORNは、2’−O−アルキル修飾、2’−フルオロ−アラビノ修飾されたGを少なくとも1個、またはLNA修飾されたGを少なくとも1個含む。
さらに、本発明のこれらおよび他の態様によれば、一実施形態では、免疫刺激性ORNは、CG DNAもRNAジヌクレオチドも含まない。
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を調節する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ORNは、対象において自己免疫疾患または気道リモデリングを治療するために、対象に送達され得る。ORNは、抗原とともに、または抗原を伴わずに対象に投与され得る。任意選択によりORNは、経口、鼻腔、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射および経皮的などの経路によって送達される。ORNは、IFNαなどのサイトカイン発現を誘導するのに有効な量で対象に送達され得る。
一態様では、本発明は、対象にワクチン接種する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に抗原および本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。
一態様では、本発明は、感染性疾患である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。一実施形態では、対象は、ウイルス感染症である。ウイルス感染症は、例えば、B型肝炎またはC型肝炎であり得る。抗ウイルス薬もまた、対象に投与してよい。抗ウイルス薬は、ORNと、任意選択により連結されている。
一態様では、本発明は、癌である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。一実施形態では、対象にさらに、化学療法薬が投与される、または放射線が施される。
一態様では、本発明は、アレルギー状態である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。一実施形態では、対象は、アレルギー性鼻炎である。
一態様では、本発明は、喘息である、またはそのリスクがある対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。一実施形態では、喘息は、ウイルス感染によって悪化した喘息である。ORNは、アレルゲンとともに、またはアレルゲンを伴わずに投与され得る。
別の態様では、本発明は、気道リモデリングの対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。
一態様では、本発明は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を増大する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、ADCCの増大を必要とする対象に有効量の本発明の免疫刺激性ORNおよびADCCを増大するための抗体を投与するステップを含む。一実施形態では、抗体は、癌細胞によって発現される癌抗原または他の抗原に特異的な抗体である。一実施形態では、抗体は、IgG抗体である。
一態様では、本発明は、エピトープ拡散を促進する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、免疫系の細胞を、抗原と接触させるステップと、続いて、この細胞を、少なくとも2用量の本発明の免疫刺激性ORNと接触させるステップの逐次ステップとを含む。一実施形態では、本方法は、in vivoで実施される。一実施形態では、本方法は、対象に、抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与するステップと、続いて、対象に少なくとも2用量の本発明の免疫刺激性ORNを、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で投与するステップとを含む。一実施形態では、本方法は、対象における免疫系抗原曝露をもたらす治療プロトコールを適用することと、それに続いて、少なくとも2用量の本発明の免疫刺激性ORNを、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することとを伴う。種々の実施形態では、治療プロトコールとして、手術、放射線、化学療法、他の癌医薬、ワクチンまたは癌ワクチンがある。一実施形態では、少なくとも2用量の免疫刺激性ORNを、互いに少なくとも1日〜1週間空けて投与する。一実施形態では、少なくとも2用量の免疫刺激性ORNを、互いに少なくとも1週間〜1カ月空けて投与する。一実施形態では、少なくとも2用量の免疫刺激性ORNを、互いに少なくとも1カ月〜6カ月空けて投与する。
一態様では、本発明は、TLR7発現細胞を、IFN−αの産生を刺激するのに有効な量の本発明のRNAオリゴヌクレオチド(ORN)と接触させることによって、IFN−αの産生を刺激する方法であり、ORNに応じたIFN−γまたはIL−12産生は、バックグラウンドと比較して大幅には誘導されない。いくつかの実施形態では、TLR7発現細胞は、in vitroまたはin vivoである。一実施形態では、ORNは、ポリGモチーフと連結している免疫刺激性ORNモチーフであり、ポリGモチーフは、免疫刺激性ORNモチーフの3’側にあり、ポリGモチーフは、少なくとも4個のGを含む。他の実施形態では、ORNは、GG(R1)n(U)4〜20(R2)mGGGG(式中、R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、n=0〜20であり、m=0〜20であり、Uはウリジンまたはその誘導体であり、Gはグアノシンまたはその誘導体である)である。
本発明の制限の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、任意の1つの要素または要素の組合せを伴う本発明の制限の各々は、本発明の各態様に含まれ得ることが予想される。この発明は、以下の説明に示される、または図面において例示される成分の構成および配置の詳細には、その適用に制限されない。本発明は、他の実施形態であり得、種々の方法で実行または実施され得る。また、本明細書において用いられる表現および技術用語は、説明目的のものであって、制限と見なされるべきではない。「含む(including)」、「含む(comprising)」または「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」および本明細書におけるそれらの変形の使用は、以後列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を包含するものとする。
図は単に例示であり、本明細書に開示される本発明の実施可能性に必要とされるわけではない。
細胞をオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるサイトカイン産生を示す2つのグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。TLR7/8免疫刺激性ORN(配列番号1および2)および3種の試験配列(配列番号4、5および8、表1を参照のこと)が示されている。y軸は、pg/mlでのIFN−α(図1A)またはIL−12p40(図1B)濃度であり、x軸は、μMでのlog ORN濃度である。
細胞をオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるサイトカイン産生を示す2つのグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。TLR7/8免疫刺激性ORN(配列番号1および2)および3種の試験配列(配列番号3、6および7、表1を参照のこと)が示されている。y軸は、pg/mlでのIFN−α(図2A)またはIL−12p40(図2B)濃度であり、x軸は、μMでのlog ORN濃度である。
細胞をオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるサイトカイン産生を示す2つのグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。TLR7/8免疫刺激性ORN(配列番号1)および4種の試験配列(配列番号9〜12)が示されている。y軸は、pg/mlでのIFN−α(図3A)またはIFN−γ(図3B)濃度であり、x軸は、μMでのORN濃度である。
細胞をオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるIFN−α産生を示すグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。DOTAP(DO)を伴う、および伴わない、配列番号10および修飾されたG(7−デアザ−rG)を含む同等配列が示されている。y軸は、pg/mlでのIFN−α濃度であり、x軸は、μMでのORN濃度である。
細胞を種々の3’修飾を含むオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるIFN−α産生を示すグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。配列番号12および10種の試験配列が示されている。y軸は、pg/mlでのIFN−α濃度であり、x軸は、μMでのORN濃度である。
細胞をオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるサイトカイン産生を示す2つのグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。配列番号21および5種の試験配列、ならびにTLR7/8免疫刺激性ORN配列番号1が示されている。
細胞をオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるサイトカイン産生を示す3つのグラフである。ポリrGを含むORNは、TLR8を欠くpDCにおけるTLR7依存性IFN−α産生を刺激するということを実証する。ヒトPBMC(n=2)(図7A)、単球(図7B)またはpDC(図7C)を、配列番号14(4μM)、免疫刺激性CpG ODN配列番号28(0.5μM)または配列番号12(0.5μM)を用い、DOTAP(20μg/ml)の存在下24時間刺激し、IFN−αを測定した。y軸は、試験されたORN、ODNまたは培地であり、x軸は、pg/mlでのIFN−α濃度である。
ネズミ樹状細胞におけるサイトカイン産生の刺激を示す4つのグラフである。ネズミCD11+脾細胞を回収し、ORNを用いて20時間処理した。上清を、IFN−α(図8A)、IL−6(図8B)、IL−12p40(図8C)およびIP−10(図8D)濃度についてELISAによって分析した。細胞を、DOTAP(DO)を伴う、既知TLR7/8刺激性ORN(配列番号48)、TLR7/8を刺激する小分子R−848、配列番号12のコレステロールタグを付け、3’Gストレッチで修飾されたORN(DOTAPを伴う、および伴わないの両方、それぞれ、配列番号11および12)ならびにDOTAPを伴う配列番号12で処理した。y軸は、pg/mlでのサイトカイン濃度であり、x軸は、nMでの治療用量濃度である。
in vivoでのサイトカイン産生の刺激を示す4つのグラフである。sv129マウスに、未修飾ORN(配列番号12)、同配列のコレステロール修飾されたORN(配列番号11)、同配列および3’ポリGストレッチを含むORN(配列番号21)またはR−848を用いて静脈内注射した。すべてのORNは、DOTAPを2:1の比(w/w)で用いて製剤した。マウスを出血させ、ELISAによって、血清をIFN−α(図9A)、IL−12p40(図9B)、IP−10(図9C)およびTNF−α(図9D)濃度について分析した。y軸は、pg/mlでのサイトカイン濃度であり、x軸は、nMでの治療用量濃度である。
in vivoでのサイトカイン産生の刺激を示す2つのグラフである。sv129マウスに静脈内注射した。注射の3時間後、ORNで刺激した後のマウスにおいて、血清をサイトカイン産生について試験した。図10Aは、30μgの配列番号21+DOTAP、30μgの配列番号21単独、またはDOTAPまたは水単独での刺激を示す。x軸は、投与された用量であり、y軸は、pg/mlでのIP−10濃度である。図10Bは、未修飾ORN(配列番号12)、同配列のコレステロール修飾されたORN(配列番号11)または同配列および3’ポリGストレッチを含むORN(配列番号21)を用いて注射した後の、IP−10濃度を示す。x軸は、μgでの治療用量であり、y軸は、pg/mlでのIP−10濃度である。
細胞を、種々の3’修飾を含むオリゴリボヌクレオチド(ORN)と接触させた後の、ヒトPBMCによるIFN−α産生を示すグラフである。ORN(出発濃度:2μM+50μg/ml DOTAP)を、ヒトPBMCとともにインキュベートし、上清を、ELISAによって、サイトカイン濃度について24時間後にアッセイした。TLR7/8刺激性ORN配列番号48(DOTAPを伴うおよび伴わない)および修飾された3’末端を有する6種の試験配列(DOTAPなし)が示されている。y軸は、pg/mlでのIFN−α濃度であり、x軸は、log μMでのORN濃度である。
TLR7および/またはTLR8依存性に、ヒト免疫系を刺激すると思われる、免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド(ORN)が記載されている。例えば、GUリッチおよびCUリッチモチーフを含有し、ポリG末端を欠くORNは、TLR7およびTLR8に対して作用すると思われる。AUリッチモチーフを含み、ポリG末端を欠くORNは、TLR8のみに対して作用すると思われるが、これは、それらが、サイトカイン、例えば、TLR9活性化と関連している、TNF−α、IL−12およびIFN−γを刺激し、TLR7活性化と関連しているIFN−αを刺激しないためである。例えば、単球の活性化は、直接TLR8媒介性効果である可能性が最も高いが、これは、単球がTLR8を発現するが、TLR7を発現せず、ssRNA刺激時にTNF−αを分泌するのに対しIFFN−α産生pDCは、TLR7を発現し、TLR8を発現しないとわかっているからである。最近、本発明者らは、異なる免疫プロフィールを有するORNを同定し、RNA媒介性反応の活性化のためのモチーフを規定した。それらのORNの中には、ヒトPBMCによるIFN−α産生を誘導しないが、相当な量のTNF−α、IL−12およびIFN−γを誘導し、TLR7の大きな刺激は伴わず、主にTLR8の刺激を示すものもあった。これらのORNは、少なくとも米国特許出願番号第11/603,978号に記載されている。
本発明は、特定のモチーフを有するORNが、実質的な量のTLR8媒介性(すなわち、TLR8発現細胞によって産生されるサイトカインの産生、例えば、単球からのTNF−α)免疫活性化を誘導することなく、TLR7媒介性と呼ばれる、RNA媒介性pDC免疫応答(例えば、IFN−α産生)を誘導し得るという予期しない発見を伴う。本明細書において、「実質的な量」とは、誘導されるレベルが、上記のGUリッチおよびCUリッチモチーフを含有し、ポリG末端を欠くもの、またはTLR8を刺激すると思われる他のORNなどのORNによって誘導されるレベルと比較した場合に最小であることを意味するものとする。したがって、本発明のORNは、RNA TLR8または7/8リガンドにとって典型的なサイトカイン、例えば、炎症性サイトカインTNF−α、IL−6をあまり誘導しない。
本明細書に記載されるORNのクラスは、3’ポリGモチーフ、および任意選択により5’ポリGモチーフが直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ORNモチーフを含み、ほぼTLR7様免疫応答の活性化のみを特徴とする免疫プロフィールと関連している。例えば、図1に示されるように、本発明のORN配列番号4、配列番号8および配列番号5は、DOTAPとともに製剤された場合に極めて多量のIFN−αを誘導し、IFN−γまたはIL−12のような、他の応答の大幅な誘導はない。対照的に、TLR7およびTLR8関連サイトカインの両方を刺激することがわかっている陽性対照ORN、配列番号1および2は、多量のIFN−αおよび多量のIL−12p40の両方を誘導した。非常に驚くべきことに、本発明によれば、TLR7/8およびTLR8応答を媒介するものなどの免疫刺激性ORNモチーフは、ORN中に1つまたは複数のポリGモチーフが組み込まれている場合に、TLR7免疫プロフィールを生じるということも発見された。
本発明のいくつかの態様による免疫刺激性RNAモチーフは、ポリGモチーフと連結している免疫刺激性ORNモチーフであり、ポリGモチーフは、免疫刺激性ORNモチーフの3’側にあり、ポリGモチーフは、少なくとも4個のGを含む。
すべてではないがいくつかの実施形態では、ORNは、具体的に、TLR7/8および/またはTLR8モチーフを含む。TLR7/8モチーフは、例えば、5’−C/U−U−G/U−U−3’、5’−R−U−R−G−Y−3’、5’−G−U−U−G−B−3’、5’−G−U−G−U−G/U−3’または5’−G/C−U−A/C−G−G−C−A−C−3’などのリボヌクレオチド配列を含み得る。C/Uは、シトシン(C)またはウラシル(U)であり、G/Uは、グアニン(G)またはUであり、Rはプリンであり、Yはピリミジンであり、Bは、U、GまたはCであり、G/Cは、GまたはCであり、A/Cは、アデニン(A)またはCである。5’−C/U−U−G/U−U−3’は、CUGU、CUUU、UUGUまたはUUUUであり得る。種々の実施形態では、5’−R−U−R−G−Y−3’は、GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGUまたはAUGGCである。一実施形態では、塩基配列は、GUAGUGUである。種々の実施形態では、5’−G−U−U−G−B−3’は、GUUGU、GUUGGまたはGUUGCである。種々の実施形態では、5’−G−U−G−U−G/U−3’は、GUGUGまたはGUGUUである。一実施形態では、塩基配列は、GUGUUUACである。種々の他の実施形態では、5’−G/C−U−A/C−G−G−C−A−C−3’は、GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCACまたはCUCGGCACである。
TLR8モチーフは、例えば、N−U−R1−R2(式中、Nは、リボヌクレオチドであり、Nは、Uを含まず、Uは、ウラシルまたはその誘導体であり、Rは、リボヌクレオチドであり、ここで、R1およびR2の少なくとも一方はアデノシン(A)またはシトシンまたはその誘導体である)である。Rは、N−U−R1−R2が少なくとも2個のAを含まない限り、Uではない。いくつかの実施形態では、Nはアデノシンまたはシトシン(C)またはその誘導体である。ORNは、2つ以上のN−U−R1−R2モチーフを任意選択により含む。
他の実施形態では、ORNは、具体的に、TLR7/8および/またはTLR8モチーフを排除する。
ORNは、以下の構造:GG(R1)n(U)4〜20(R2)mGGGG(配列番号29)を有し得る。他の態様では、RNAモチーフは、GG(R1)n(U)5〜20(R2)mGGGG(配列番号30)である。他の態様では、RNAモチーフは、GG(R1)n(U)4(R2)m、GGGG(配列番号31)(式中、(R1)nがGGである場合、(R2)mはGではないか、m=0ではない)である。
ポリUとは、少なくとも4個のUのストレッチを指す。ポリGとは、少なくとも2個のGのストレッチを指す。
R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、(R1)nはGGである。他の実施形態では、(R2)mはGGGである。
Uはウリジンまたはその誘導体である。(U)4〜20または(U)5〜20は、例えば、UUUUU、UUUUUUUまたはUUUUUUUUUU(配列番号32)であり得る。
Gは、グアノシンまたはその誘導体である。n=0〜20である。m=0〜20である。
いくつかの実施形態では、RNAモチーフは、配列番号4〜6および8〜12のいずれか1つのORNである。
いくつかの実施形態では、ORNは、5’GGGGUUUUGGGGG3’(配列番号33)、5’GGGGUUUUGGGG3’(配列番号34)、GUUUUUG(配列番号35)、GGGGGGGUUGUGUGGGGG(配列番号36)、CCCCUUUUGGGGG(配列番号37)、GUUUGUGUGGGG(配列番号38)、GUUGUGUGGGGG(配列番号39)、UUUUUUGGGGG(配列番号40)、UUUUUGGGGG(配列番号41)、UUUUGGGGG(配列番号19)、またはUUUUGGGG(配列番号15)ではない。
他の実施形態では、ORNは、
R1は、水素(H)、COOR、OH、C1〜C18アルキル、C6H5または(CH2)m−NH−R2、であり、ここで、Rは、Hまたはメチル、ブチル、メトキシエチル、ピバロイルオキシメチル、ピバロイルオキシベンジルまたはS−ピバロイルチオエチルであり、R2は、H、C1〜C18アルキルまたはC2〜C18アシルであり、mは、1〜17であり、
Xは、酸素(O)または硫黄(S)であり、
NuおよびNu’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である
ただし、R1がHである場合、XはSである]、
Xは、OまたはSであり、
X1は、OH、SH、BH3、OR3またはNHR3であり、ここで、R3は、C1〜C18アルキルであり、
X2およびX3は各々独立に、O、S、CH2またはCF2であり、
NuおよびNu’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である
ただし、
(a)X、X2およびX3のうち少なくとも1つはOではない、またはX1はOHではなく、
(b)X1がSHである場合、X、X2およびX3のうち少なくとも1つはOではなく、
(c)XおよびX2がOであり、X1がOHである場合、X3はSではなく、Nuは3’Nuであり、Nu’は5’Nu’であり、
(d)X1がBH3である場合、X、X2またはX3のうち少なくとも1つはSである]および
(iii)(i)および(ii)の任意の組合せ
からなる群から選択される修飾されたリン酸結合を含まず、
式IIIAもしくは式IIIBとして示される少なくとも1つのヌクレオチド類似体
R4は、HまたはORであり、ここで、Rは、HまたはC1〜C18アシルであり、
Bは、核酸塩基、修飾された核酸塩基またはHであり、
XおよびX5は各々独立に、OまたはSであり、
X4は、OH、SH、メチルまたはNHR5であり、ここで、R5は、C1〜C18アルキルであり、
破線は各々独立に、隣接する単位、水素または有機基との任意選択の結合を表し、
ただし、XおよびX5の少なくとも一方はOではない、またはX4はOHではない]
を含まない。
ORNは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明の方法によれば、修飾されたORNは、ヒト細胞中のコード配列のものと相補的である配列を含むようには設計されず、したがって、アンチセンスORNまたはサイレンシングRNA(siRNA)であるとは考えられない。「相補的でない」ORNとは、標的細胞中の1つの特定のコーディング領域と強力にハイブリダイズできる配列を含むものではないものである。したがって、本明細書において用いる場合、相補的でないORNの投与は、特に、本発明に記載されるORNが一本鎖である場合、サイレンシングRNAとして用いられる二本鎖分子と比較して、遺伝子サイレンシングをもたらさない。
いくつかの実施形態では、本発明のORNは、10〜30ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態では、ORNは、10〜50ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態では、本発明のORNは、10〜100ヌクレオチドの間の長さである。
いくつかの実施形態では、ORNは、安定化され得る主鎖を有する。一実施形態では、主鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、糖リン酸主鎖である。一実施形態では、主鎖は、完全にホスホロチオエートである。ORNは、少なくとも1つのホスホジエステル様結合を含み得る。いくつかの例では、ホスホジエステル様結合は、ホスホジエステル結合である。
本発明のORNと、TLR7/8モチーフ、すなわちGU含有反復配列、またはLTR8モチーフ、すなわちAU含有反復配列を有するORNについて、IFN−αと、IFN−γおよびIL−12などの他の炎症性サイトカインの産生の間の明確な相違が観察された。ポリG−ポリU−ポリGモチーフ、例えば、配列番号4〜6および8〜12を有する本発明のORNは、PBMCおよびpDC刺激時にIFN−αサイトカイン産生を示したが、IFN−γおよびIL−12産生は示さなかった。
したがって、本発明のORNは、バックグラウンドと比較して、有意な量のIFN−αまたはIFN−α関連分子を誘導する免疫応答を誘導する能力を有する。バックグラウンドと比較して、有意な量のIFN−αまたはIFN−α関連分子とは、バックグラウンドと比較して、IFN−αまたはIFN−α関連分子のレベルの20%を超える変化であることが好ましい。いくつかの実施形態では、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%を超えるものである。他の実施形態では、本発明のORNによって誘導されるIFN−αの量は、TLR7/8ORNまたはTLR8ORNによって誘導されるIFN−αの20%以上である。本発明のORNによって誘導されるIFN−αの量は、任意選択により、in vitroアッセイにおいて300pg/mlを超えるものであり得、または1.5μMを超えるEC50を有し得る。
IFN−α関連分子とは、本明細書において用いる場合、IFN−αの発現と関連するサイトカインまたは因子である。これらの分子として、それだけには限らないが、MIP1−β、IP−10およびMIP1−αが挙げられる。
本発明は、概して、1つまたは複数の免疫刺激性RNAモチーフを含む免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド、本発明の1つまたは複数の免疫刺激性ORNを含有する免疫刺激性組成物ならびに本発明の免疫刺激性ORNおよび免疫刺激性組成物の使用方法に関する。
本明細書において用いる場合、用語「RNA」とは、3’−5’ホスホジエステル結合(複数可)により共有結合によって連結している2つ以上のリボヌクレオチド(すなわち、リン酸基、およびプリンまたはピリミジン核酸塩基(例えば、グアニン、アデニン、シトシンまたはウラシル)と連結しているリボース糖を各々含む分子)を指すものとする。
異なる実施形態では、免疫刺激性RNAモチーフを含む免疫刺激性ORNは、単一のモチーフまたは2つ以上の免疫刺激性RNAモチーフを含み得る。単一の免疫刺激性ORN中に2つ以上の免疫刺激性RNAモチーフを有すること、例えば、免疫刺激性ORNが2つ以上のTLRと結合し得るようモチーフが配置される場合が有利であり得ると考えられている。例えば、免疫刺激性ORNは、2つ以上のTLR7受容体と結合し、それによって、得られる免疫刺激性効果を増幅または改変し得る。
免疫刺激性ORN中に2つ以上の免疫刺激性RNAモチーフがある、モチーフは通常、免疫刺激性ORNの中の任意の位置に生じ得る。例えば、2つのモチーフがある場合、各々、免疫刺激性ORNの末端に存在し得る。あるいは、1つのモチーフが末端に存在し、1つのモチーフの両末端に、免疫刺激性ORNの少なくとも1つのさらなるヌクレオチドが隣接する場合もある。さらに別の実施形態では、各モチーフの両末端に、免疫刺激性ORNの少なくとも1つのさらなるヌクレオチドが隣接する場合もある。
免疫刺激性ORNとして、それだけには限らないが、左から右に5’から3’方向で示される以下の配列が挙げられる:
rG*rG*rG*rG rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号4)、
rG*rG*rG*rG rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号5)、
rG*rG*rG*rG rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号6)、
rG*rG*rG*rG−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号8)、
rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*dG*dG*dG*dG*dG(配列番号10)、
rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号21)、
rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*G*G*G*G*G(配列番号42)。
rG*rG*rG*rG rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号4)、
rG*rG*rG*rG rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号5)、
rG*rG*rG*rG rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号6)、
rG*rG*rG*rG−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号8)、
rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*dG*dG*dG*dG*dG(配列番号10)、
rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号21)、
rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*G*G*G*G*G(配列番号42)。
他の免疫刺激性ORN配列ならびに制御配列は、以下の表1に示す。
上記のように、RNAは、3’−5’ホスホジエステル結合によってつながっているリボヌクレオチドのポリマーである。特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性ORNは、RNAである。しかし、本発明の免疫刺激性ORNは、以下に記載するように、RNAに限定されない。
本発明の免疫刺激性ORNは、一実施形態では、1個以上の修飾された核酸塩基、すなわち、A、C、GおよびUの誘導体を含み得る。これらの修飾された核酸塩基の具体的な実施形態として、それだけには限らないが、5−置換シトシン(例えば、5−メチル−シトシン、5−フルオロ−シトシン、5−クロロ−シトシン、5−ブロモ−シトシン、5−ヨード−シトシン、5−ヒドロキシ−シトシン、5−ヒドロキシメチル−シトシン、5−ジフルオロメチル−シトシンおよび非置換または置換5−アルキニル−シトシン)、6−置換シトシン、N4−置換シトシン(例えば、N4−エチル−シトシン)、5−アザ−シトシン、2−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体(例えば、N,N’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン)ならびにウラシルおよびその誘導体(例えば、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−ブロモビニル−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−ヒドロキシ−ウラシル、5−プロピニル−ウラシル)、チミン誘導体(例えば、2−チオチミン、4−チオチミン、6−置換チミン)、グアノシン誘導体(7−デアザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン(例えば、7−デアザ−7−(C2〜C6)アルキニルグアニン)、7−デアザ−8−置換グアニン、ヒポキサンチン、N2−置換グアニン(例えば、N2−メチル−グアニン)、8−置換グアニン(例えば、8−ヒドロキシグアニンおよび8−ブロモグアニン)および6−チオグアニン)またはアデノシン誘導体(5−アミノ−3−メチル−3H,6H−チアゾロ[4,5−d]ピリミジン−2,7−ジオン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン(例えば、N6−メチル−アデニン、8−オキソ−アデニン))が挙げられる。塩基はまた、ユニバーサル塩基(例えば、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、3−ニトロピロール、P−塩基およびK−塩基)、芳香環系(例えば、ベンゾイミダゾールまたはジクロロ−ベンゾイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド)芳香環系(例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン)または水素原子(dSpacer)によって置換され得る。好ましい塩基修飾として、ウラシルおよび7−デアザ−グアニンがある。これらの修飾されたU核酸塩基およびその対応するリボヌクレオシドは、民間の供給業者から入手可能である。
修飾されたG核酸塩基の具体的な実施形態として、N2−ジメチルグアニン、7−デアザグアニン、8−アザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン、7−デアザ−7−(C2〜C6)アルキニルグアニン、7−デアザ−8−置換グアニン、8−ヒドロキシグアニンおよび6−チオグアニンが挙げられる。一実施形態では、修飾されたG核酸塩基は、8−ヒドロキシグアニンである。これらの修飾されたG核酸塩基およびその対応するリボヌクレオシドは、民間の供給業者から入手可能である。
特定の実施形態では、少なくとも1つのβ−リボース単位が、β−D−デオキシリボースまたは修飾された糖単位によって置換されてもよく、ここで、修飾された糖単位は、例えば、β−D−リボース、α−D−リボース、β−L−リボース(「スピーゲルマー(Spiegelmers)」におけるような)、α−L−リボース、2’−アミノ−2’−デオキシリボース、2’−フルオロ−2’−デオキシリボース、2’−O−(C1〜C6)アルキル−リボースから選択され、好ましくは、2’−O−(C1〜C6)アルキル−リボースは、2’−O−メチルリボース、2’−O−(C2〜C6)アルケニル−リボース、2’−[O−(C1〜C6)アルキル−O−(C1〜C6)アルキル]−リボース、LNAおよびα−LNA(Nielsen Pら(2002年)Chemistry−A European Journal8:712〜22頁)、β−D−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、2’−フルオロアラビノフラノースおよび炭素環式および/または鎖式糖類似体(例えば、Vandendriesscheら(1993年)Tetrahedron49:7223頁に記載される)および/またはビシクロ糖類似体(例えば、Tarkov Mら(1993年)Helv Chim Acta76:481頁に記載される)から選択される。
本発明の免疫刺激性ORNの個々のリボヌクレオチドおよびリボヌクレオシドは、あるいは、非ヌクレオチドリンカー、特に、脱塩基リンカー(dSpacers)、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位によって連結されていてもよい。さらなるリンカーとして、C3、C6およびC12アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカーおよびまた、C3またはC6チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーがある。本発明の免疫刺激性ORNの個々のヌクレオチドおよびリボヌクレオシドは、あるいは、アルキルまたは置換アルキル基によってさらに置換されていてもよい芳香族残基によって連結されていてもよい。
RNAは、3’−5’ホスホジエステル結合によってつながっているリボヌクレオチドのポリマーである。本発明の免疫刺激性ORNのヌクレオチドは、3’−5’ホスホジエステル結合によってつながっている場合もある。しかし、本発明はまた、普通でないヌクレオチド間結合、例えば、具体的に、5’−5’、3’−3’、2’−2’、2’−3’および2’−5’ヌクレオチド間結合を有する免疫刺激性ORNも包含する。一実施形態では、このような普通でない結合は、免疫刺激性ORN内のどこかに1つまたは複数のこのような結合が生じ得るとしても、免疫刺激性RNAモチーフから排除される。遊離端を有する免疫刺激性ORNについては、1つの3’−3’ヌクレオチド間結合を含むことは、結果として、2つの遊離5’末端を有する免疫刺激性ORNとなり得る。逆に、遊離端を有する免疫刺激性ORNについては、1つの5’−5’ヌクレオチド間結合を含むことは、結果として、2つの遊離3’末端を有する免疫刺激性ORNとなり得る。
本発明の免疫刺激性組成物は、2つ以上の、分岐単位によって連結され得る免疫刺激性RNAモチーフを含有し得る。ヌクレオチド間結合は、3’−5’、5’−5’、3’−3’、2’−2’、2’−3’または2’−5’結合であり得る。したがって、用語2’−5’は、リボースの炭素原子に従って選択される。普通でないヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合であり得るが、あるいは、ホスホロチオエートまたは本明細書に記載される任意の他の修飾された結合のように修飾され得る。以下の式は、本発明の、ヌクレオチドの分岐単位によって分岐している免疫刺激性ORNの一般構造を示す。したがって、Nu1、Nu2およびNu3は、3’−5’、5’−5’、3’−3’、2’−2’、2’−3’または2’−5’結合によって連結され得る。免疫刺激性ORNの分岐はまた、非ヌクレオチドリンカーおよび脱塩基スペーサーの使用と関わり得る。一実施形態では、Nu1、Nu2およびNu3は、同一または異なる免疫刺激性RNAモチーフを表す。別の実施形態では、Nu1、Nu2およびNu3は、少なくとも1つの免疫刺激性RNAモチーフおよび少なくとも1つの免疫刺激性CpG DNAモチーフを含む。
免疫刺激性ORNは、ダブラー(doubler)またはトレブラー(trebler)単位(Glen Research、Sterling、VA)、特に、3’−3’結合を含む免疫刺激性ORNを含有し得る。ダブラー(doubler)単位は、一実施形態では、1,3−ビス−[5−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル−2−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホルアミダイトに基づいたものであり得る。トレブラー(trebler)単位は、一実施形態では、Tris−2,2,2−[3−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホルアミダイトの組み込みに基づいたものであり得る。複数のダブラー(doubler)、トレブラー(trebler)または他の増倍単位による免疫刺激性ORNの分岐は、本発明のさらなる実施形態であるデンドリマーにつながる。分岐した免疫刺激性ORNは、免疫刺激性ORNの分岐していない形と比較して異なる免疫効果を有する、TLR3、TLR7およびTLR8などの免疫刺激性RNAの受容体の架橋につながり得る。さらに、分岐した、またはそうでなければ多量体の免疫刺激性ORNの合成によって、RNAを分解に対して安定化することができ、弱い、または部分的に有効なRNA配列が治療上有用なレベルの免疫活性を発揮するのを可能にし得る。免疫刺激性ORNはまた、ペプチド修飾試薬またはオリゴヌクレオチド修飾試薬(Glen Research)に起因するリンカー単位を含有し得る。さらに、免疫刺激性ORNは、ペプチド(アミド)結合によってポリマーと接続している、1個以上の天然または非天然アミノ酸残基を含有し得る。
本発明の組成物は、二次以上の構造を含む、また含まないポリマーを包含する。例えば、ポリマーは、一実施形態では、少なくとも2つの隣接する水素結合した塩基対によって提供される二次構造を形成できる、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体またはヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の組合せの配列を含む。一実施形態では、少なくとも2つの隣接する水素結合した塩基対は、2セットの少なくとも3個の連続する塩基を伴う。関連する塩基の連続する性質は、いわゆるクランプを形成するのに熱力学的に有利である。しかし、連続する塩基は、特に、高GC含量および/または延長された配列がある場合、必要でない場合もある。通常、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個の塩基対がある。水素結合した塩基対は、一実施形態では、従来のワトソン−クリック塩基対、すなわちG−C、A−UまたはA−Tであり得る。他の実施形態では、水素結合した塩基対は、非従来型塩基対、例えば、G−U、G−G、G−AまたはU−Uであり得る。さらに他の実施形態では、水素結合した塩基対は、フーグスティーンまたは他の塩基対であり得る。
一実施形態では、二次構造は、ステムループ二次構造である。ステムループまたはヘアピン二次構造は、相補的な、または少なくとも部分的に相補的な配列間の分子内水素結合塩基対形成によって生じ得る。相補的または少なくとも部分的に相補的な配列とは、それぞれ、完全なまたは中断された逆方向反復配列を表す。例えば、5’−X1−X2−X3…X3’−X2’−X1’−3’(ここで、X1およびX1’、X2およびX2’ならびにX3およびX3’は各々、水素結合した塩基対を形成し得る)によって提供される塩基配列を有するポリマーは、完全なまたは中断された逆方向反復を含む場合があり、折り畳まれ、ステムループ二次構造を形成する可能性を有する。5’−X1−X2−X3…X3’−X2’−X1’−3’(ここで、X1およびX1’、X2およびX2’ならびにX3およびX3’は各々、水素結合した塩基対を形成し得る)によって提供される塩基配列を有するポリマーはまた、分子間の水素結合した塩基対によって分子間複合体を形成する可能性を有することが認められよう。2つ以上の逆方向反復がある場合、個々のポリマーはまた、相互作用して、二量体の分子間複合体だけでなく高次の分子間複合体または構造を形成する可能性がある。当業者ならば、条件および/または配列は、別のものを上回って二次構造の1種の形成に有利に働くように選択できるということは認識するであろう。
3’−5’、5’−5’、3’−3’、2’−2’、2’−3’および2’−5’ヌクレオチド間結合は、直接または間接であり得る。さらに、ポリUモチーフは、ポリGモチーフと直接的または間接的に連結され得る。さらに、ORN式のいずれのヌクレオチドも、互いに直接的または間接的に連結され得る。例えば、GGおよび(R1)nは、直接接続され得る。直接結合は、3’−3’結合であり得る。あるいは、GGおよび(R1)nは、間接的に、すなわち、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーを介して接続されて連結され得る。
これに関連して「直接結合」とは、介在するリンカー部分のない、本明細書に開示されるリン酸結合または修飾されたリン酸結合を指す。介在するリンカー部分は、本明細書に開示されるリン酸結合または修飾されたリン酸結合とは異なる有機部分であり、例えば、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、dSpacer(すなわち、脱塩基デオキシヌクレオチド)、ダブラー(doubler)単位またはトレブラー(trebler)単位を挙げることができる。間接結合は、ヌクレオチド性および非ヌクレオチド性のリンカーおよびスペーサーを含む。
特定の実施形態では、免疫刺激性ORNは、別の実体とコンジュゲートして、コンジュゲートを提供する。例えば、免疫刺激性ORNは、ペプチド、タンパク質、低分子量リガンド、脂質部分または核酸とコンジュゲートされ得る。本明細書において用いる場合、コンジュゲートとは、任意の物理化学的手段、例えば、疎水性相互作用および共有結合カップリングによって互いに結合している任意の2つ以上の実体の組合せを指す。
別の実施形態では、免疫刺激性ORNは、免疫調節性受容体によって認識される低分子量リガンドとコンジュゲートされ得る。この受容体は、TLRファミリーのメンバー、例えば、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8またはTLR9であることが好ましい。低分子量リガンドは、これらの受容体の天然リガンドの模倣体である。例として、それだけには限らないが、TLR7またはTLR8のいずれかを刺激する、R−848(レシキモド)、R−837(イミキモド;ALDARA(商標)、3M Pharmaceuticals)、7−デアザ−グアノシン、7−チア−8−オキソ−グアノシンおよび7−アリル−8−オキソ−グアノシン(Loxoribine)が挙げられる。D−グルコピラノース誘導体、例えば、3D−MPL(TLR4リガンド)もまた、免疫刺激性ORNとコンジュゲートされ得る。Pam3−Cysは、免疫刺激性ORNとコンジュゲートさせることのできるTLR2リガンドの一例である。CpGモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドとして、TLR9リガンドがあり、これらもまた、本発明の免疫刺激性ORNとコンジュゲートさせることができる。一実施形態では、TLR9シグナル伝達を刺激するのに有効なCpGモチーフを含む少なくとも1つのオリゴデオキシヌクレオチドが、本発明の免疫刺激性ORNとコンジュゲートされている。種々のTLRのリガンドの1分子へのコンジュゲーションは、受容体の多量体化につながり、これが、免疫刺激の増強または任意の単一のこのようなリガンドに起因するものとは異なる免疫刺激性プロフィールをもたらし得る。他の実施形態では、CpG ODNは、治療法において、コンジュゲートされずに混合されるか、または同時投与される。
一態様では、本発明は、本発明の免疫刺激性ORNと親油性部分とのコンジュゲートを提供する。特定の実施形態では、免疫刺激性ORNは、親油性部分と共有結合によって連結している。親油性部分は、通常、遊離端を有する免疫刺激性ORNの1つまたは複数の末端に生じるが、特定の実施形態では、親油性部分は、免疫刺激性ORNに沿ってどこにでも生じ得、したがって、免疫刺激性ORNが遊離端を有することを必要としない。一実施形態では、免疫刺激性ORNは、3’末端を有し、親油性部分が3’末端と共有結合によって連結している。親油性基は、通常、コレステリル、修飾されたコレステリル、コレステロール誘導体、還元コレステロール、置換コレステロール、コレスタン、C16アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸(cholenic acid)、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンEなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン(Texaphyrine)、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン(digoxygenin)、ジメトキシトリチル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素(例えば、Cy3またはCy5)、ヘキスト33258色素、ソラレンまたはイブプロフェンであり得る。特定の実施形態では、親油性部分は、コレステリル、パルミチルおよび脂肪酸アシルから選択される。一実施形態では、親油性部分は、コレステリルである。本発明の免疫刺激性ORN中に1つまたは複数のこのような親油性部分を含むことは、それらに、ヌクレアーゼによる分解に対して、なおさらなる安定性を付与すると考えられている。本発明の単一の免疫刺激性ORN中に2つ以上の親油性部分がある場合、各親油性部分は、他のものとは独立に選択され得る。
一実施形態では、親油性基は、免疫刺激性ORNのヌクレオチドの2’位と結合している。親油性基は、あるいはまたはさらに、免疫刺激性ORNのヌクレオチドの複素環式核酸塩基と連結され得る。親油性部分は、任意の適した直接または間接結合によって、免疫刺激性ORNと共有結合によって連結され得る。一実施形態では、結合は直接であり、エステルまたはアミドである。一実施形態では、結合は間接であり、スペーサー部分、例えば、1つまたは複数の脱塩基ヌクレオチド残基、トリエチレングリコール(スペーサー9)またはヘキサエチレングリコール(スペーサー18)などのオリゴエチレングリコールまたはブタンジオールなどのアルカン−ジオールを含む。
一実施形態では、本発明の免疫刺激性ORNは、カチオン性脂質と組み合わされる。カチオン性脂質は、免疫刺激性ORNの、エンドソーム区画への輸送を補助すると考えられており、エンドソーム区画ではTLR7が見られる。一実施形態では、カチオン性脂質は、DOTAP(N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチル−スルフェート)である。DOTAPは、ポリマーを、細胞中に輸送する、具体的には、エンドソーム区画に輸送し、そこでポリマーをpH依存性に放出し得ると考えられている。ポリマーは、エンドソーム区画にあると、特定の細胞内TLRと相互作用し、免疫応答の発生に関与するTLR媒介性シグナル変換経路を誘発し得る。エンドソーム区画への輸送を含む同様の特性を有する他の物質を、DOTAPの代わりに、またはDOTAPに加えて用いてもよい。他の脂質製剤として、例えば、EFFECTENE(登録商標)(特定のDNA濃縮エンハンサーを含む非リポソーム脂質)およびSUPERFECT(登録商標)(新規作用性デンドリマー技術)、SMARTICLES(登録商標)(細胞膜を通過すると、正の電荷を有するようになる電荷可逆性粒子)および脂質二重層を使用する安定核酸脂質粒子(Stable Nucleic Acid Lipid Particles(SNALPs))が挙げられる。リポソームは、例えば、N−[1−(2,3ジオレイルオキシ)−プロピル]−N、N、N−トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)などのカチオン性脂質から形成される、LIPOFECTIN(登録商標)およびLIPOFECTACE(商標)として、Gibco BRLから市販されている。リポソームを作製する方法は、当技術分野で周知であり、多数の刊行物に記載されている。リポソームはまた、Gregoriadis G(1985年)Trends Biotechnol3:235〜241頁に概説されている。他の実施形態では、本発明の免疫刺激性ポリマーは、微粒子、シクロデキストリン、ナノ粒子、ニオソーム、デンドリマー、ポリカチオン性ペプチド、ビロソームおよびウイルス様粒子またはISCOMS(登録商標)と組み合わされる。他の実施形態では、ORNは、カチオン性脂質担体を含まない。本発明のORNの1つの利点は、このような担体を必要としないことである。
一実施形態では、本発明の免疫刺激性ORNは、共有結合によって閉じた、ダンベル型分子の形であり、一次および二次構造の両方を有する。以下に記載されるように、一実施形態では、このような環状オリゴリボヌクレオチドは、介在する二本鎖セグメントによって接続されている2つの一本鎖ループを含む。一実施形態では、少なくとも1つの一本鎖ループは、本発明の免疫刺激性RNAモチーフを含む。本発明の、他の共有結合によって閉じたダンベル型分子は、キメラDNA:RNA分子を含み、例えば、二本鎖セグメントは、少なくとも部分的にDNA(例えば、ホモ二量体dsDNAまたはヘテロ二量体DNA:RNAのいずれか)であり、少なくとも1つの一本鎖ループは、本発明の免疫刺激性RNAモチーフを含む。あるいは、キメラ分子の二本鎖セグメントはRNAである。
特定の実施形態では、免疫刺激性ORNは、単離されている。単離された分子とは、実質的に純粋であり、通常、天然では、またはin vivo系において見られる他の物質を、意図される使用にとって実用的かつ適当な程度まで含まない分子である。特に、免疫刺激性ORNは、例えば、医薬品の製造において有用であるよう、十分に純粋であり、細胞の他の生物学的成分を十分に含まない。本発明の単離された免疫刺激性ORNは、医薬品において薬学的に許容できる担体と混合され得るので、免疫刺激性ORNは、医薬品のわずかな重量比率のみを含む場合がある。それにもかかわらず、免疫刺激性ORNは、生物系において関連している可能性のある物質から実質的に分離されているという点で実質的に純粋である。
本発明における使用のために、本発明の免疫刺激性ORNは、当技術分野で公知のいくつかの手順のいずれかを使用して、または適合させて、de novo合成できる。例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト法(Beaucage SLら(1981年)Tetrahedron Lett22:1859頁);ヌクレオシドH−ホスホネート法(Garegg Pら(1986年)Tetrahedron Lett27:4051〜4頁;Froehler BCら(1986年)Nucl Acid Res 14:5399〜407頁;Garegg Pら(1986年)Tetrahedron Lett27:4055〜8頁;Gaffney BLら(1988年)Tetrahedron Lett29:2619〜22頁)。これらの化学は、市販されているさまざまな自動化核酸シンセサイザーによって実施できる。本発明に従って有用な、さらなる合成法は、Uhlmann Eら(1990年)Chem Rev90:544〜84頁およびGoodchild J(1990年)Bioconjugate Chem1:165頁に開示されている。
オリゴリボヌクレオチド合成は、溶液中または固相支持体上で実施できる。溶液中では、ブロックカップリング反応(二量体、三量体、四量体など)が好ましいが、固相合成は、単量体のビルディングブロックを用いて段階法で実施されることが好ましい。ホスホトリエステル法、H−ホスホネート法およびホスホルアミダイト法などの種々の化学が記載されている(Eckstein F(1991年)Oligonucleotides and Analogues、A Practical Approach、IRL Press、Oxford)。ホスホトリエステル法では、反応性リン基が、酸化状態+Vにあるが、ホスホルアミダイトおよびH−ホスホネートアプローチのカップリング反応では、より反応性のホスホル+III誘導体を用いる。後者の2つのアプローチでは、リンは、カップリングステップ後に酸化されて安定なP(V)誘導体が生じる。酸化剤が、ヨウ素/水/塩基である場合、ホスホジエステルは脱保護後に得られる。対照的に、酸化剤がBeaucage試薬などの硫化剤である場合、脱保護後にホスホロチオエートが得られる。
オリゴリボヌクレオチド合成のための効率的な方法として、MatteucciおよびCaruthersによる、オリゴデオキシヌクレオチドについて最初に記載されたようなホスホルアミダイト化学を用いる固体支持体合成の組合せがある。Matteucci MDら(1981年)J Am Chem Soc 103:3185頁。
オリゴリボヌクレオチドの合成は、オリゴデオキシヌクレオチドと類似しているが、オリゴリボヌクレオチド中に存在する2’−ヒドロキシ基は、適したヒドロキシ保護基によって保護されなくてはならないという相違がある。単量体は、例えば、RNA単量体ビルディングブロック中の2’−O−t−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基によって保護され得る。しかし、2’−O−トリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基(TOM−Protecting−Group(商標))を含有する単量体を用いるRNA合成が、より高いカップリング効率を生じると報告されているが、これは、TOM−Protecting−Groupは、TBDMS基よりも低い立体障害を示すためである。TBDMS保護基はフッ化物を用いて除去されるのに対し、TOM基については、室温で、エタノール/水中、メチルアミンを用いて迅速な脱保護が達成される。オリゴ(リボ)ヌクレオチド合成では、3’から5’末端への鎖伸長が好ましく、これは、3’−ホスホル(III)基またはその活性化された誘導体を有するリボヌクレオチド単位の、別のヌクレオチド単位の遊離5’−ヒドロキシ基とのカップリングによって達成される。
合成は、好都合なことに、自動化DNA/RNAシンセサイザーを用いて実施できる。したがって、シンセサイザーの供給者によって推奨される合成サイクルを使用してよい。リボヌクレオシドホスホルアミダイト単量体については、カップリング時間は、デオキシヌクレオシド単量体と比較して長い(例えば、400秒)。固相支持体として、500〜1000Å制御孔ガラス(controlled pore glass)(CPG)支持体または有機ポリマー支持体、例えば、プライマー支持体PS200(Amersham)を使用してよい。固相支持体は、通常、最初のヌクレオシド、例えば、その3’末端を介して結合される、5’−O−ジメトキシトリチル−N−6−ベンゾイルアデノシンを含有する。5’−O−ジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸で切断した後、例えば、5’−O−ジメトキシトリチル−N−保護された2’−O−tブチルジメチルシリル−ヌクレオシド−3’−O−ホスホルアミダイトを用いて鎖伸長を達成する。連続反復サイクルの後、完成したオリゴリボヌクレオチドを支持体から切断し、濃アンモニア/エタノール(3:1、v:v)を用いて30℃で24時間処理によって脱保護する。TBDMS保護基を、トリエチルアミン/HFを用いて最後に切断する。粗オリゴリボヌクレオチドは、イオン交換高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、イオン対逆相HPLCまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって精製し、質量分析によって特性決定できる。
5’−コンジュゲートの合成は、分子のホスホルアミダイトを、固相合成における末端ヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基と連結されるようカップリングすることによって容易である。このようなリガンド、例えば、コレステロール、アクリジン、ビオチン、ソラレン、エチレングリコールまたはアミノアルキル残基の種々のホスホルアミダイト誘導体は、市販されている。あるいは、アミノアルキル基を、固相合成の間に導入することもでき、これによって、活性エステル、イソチオシネート(isothiocynate)またはヨードアセトアミドなどの活性化されたコンジュゲート分子による合成後誘導体化が可能となる。
3’末端コンジュゲートの合成は、通常、対応して修飾された固相支持体、例えば、市販のコレステロールで誘導体化された固相支持体などを用いて達成される。しかし、コンジュゲーションは、ヌクレオチド間結合、核酸塩基で、またはリボース残基で、例えば、リボースの2’位でも行われ得る。
環状オリゴリボヌクレオチドについては、オリゴヌクレオチド鎖の伸長は、ヌクレオチドPS固相支持体(Glen Research)上で、標準ホスホルアミダイト化学を用いて実施できる。次いで、環化反応を、固相支持体上で、ホスホトリエステルカップリング手順を用いて実施する(Alazzouziら(1997年)Nucleosides Nucleotides16:1513〜14頁)。水酸化アンモニウムを用いる最終脱保護では、事実上、溶液になる生成物のみが所望の環状オリゴヌクレオチドである。
本発明の環状オリゴリボヌクレオチドは、閉じた円形のRNAを含み、二本鎖RNAを伴うか伴わない一本鎖RNAを含み得る。例えば、一実施形態では、環状オリゴリボヌクレオチドは、二本鎖RNAを含み、介在する二本鎖セグメントによって接続されている2つの一本鎖ループを含むダンベルコンホメーションを呈する。共有結合によって閉じた、ダンベル型CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、米国特許第6,849,725号に記載されている。別の実施形態では、環状オリゴリボヌクレオチドは、二本鎖RNAを含み、介在する二本鎖セグメントによって接続されている3つ以上の一本鎖ループを含むコンホメーションを呈する。一実施形態では、免疫刺激性RNAモチーフは、1つまたは複数の一本鎖セグメント中に位置する。
本発明の免疫刺激性ORNは、単独で、またはアジュバントなどの他の薬剤と組み合わせて有用である。アジュバントとは、本明細書において用いる場合、抗原に応じた免疫細胞活性化、例えば、体液性および/または細胞性免疫応答を増強する抗原以外の物質を指す。アジュバントは、補助細胞の蓄積および/または活性化を促進して、抗原特異的免疫応答を増強する。アジュバントは、抗原に対する防御免疫を誘導するために用いられるワクチン、すなわち、抗原含有組成物の有効性を増強するために用いられる。
アジュバントは、2つの一般的な機序によって作用することができ、所与のアジュバントまたはアジュバント製剤は、一方または両方の機序によって作用し得る。
第1の機序は、抗原特異的免疫応答が発生する細胞または部位への抗原の分布に物理的に影響を及ぼすことであり、これは、特異的領域または細胞種をターゲッティングすることを含む抗原の体内分布を変更し、または抗原が身体中にゆっくりと放出され、その結果、抗原に対する免疫細胞の曝露を延長するようなデポー効果を生じさせる送達ビヒクルであり得る。
このクラスのアジュバントとして、それだけには限らないが、ミョウバン(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム);鉱油または非鉱油のいずれかから製造された油中水または水中油型エマルジョンを含むエマルジョンベースの製剤が挙げられる。これらは、モンタニド ISA 720(Seppic、AirLiquide、Paris、France)、MF−59(Span85およびTween80で安定化された、水中スクアレンエマルジョン;Chiron Corporation、Emeryville、Calif.)、およびPROVAX(安定化界面活性剤およびミセル形成剤;IDEC Pharmaceuticals Corporation、San Diego、Calif.)などの水中油型エマルジョンであり得る。これらはまた、モンタニド ISA 50(オレイン酸マンニドおよび鉱油の油性組成物、Seppic)またはモンタニド ISA 206(オレイン酸マンニドおよび鉱油の油性組成物、Seppic)などの油中水エマルジョンであり得る。
第2のアジュバント機序は、免疫応答モディファイヤーまたは免疫刺激性物質としてである。これらは、抗原に対してより良好に提示、認識または応答する免疫細胞の活性化をもたらし、このようにして、抗原特異的応答が、動力学、大きさ、表現型または記憶について増強される。免疫応答モディファイヤーは、通常、Toll様受容体などの特異的受容体またはいくつかの他の非TLR経路のうちの1つ(例えば、RIG−I)を介して作用するが、いくつかについては経路はまだわかっていない。このクラスのアジュバントとして、それだけには限らないが、Q.サポナリア(saponaria)樹木の樹皮から精製されたサポニン、例えば、QS21(HPLC分画を用いて21番目のピーク中に溶出する糖脂質;Antigenics、Inc.、Worcester、Mass.);ポリ[ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン(PCPPポリマー;Virus Research Institute、USA)、Flt3リガンドおよびリーシュマニア伸長因子(精製リーシュマニアタンパク質;Corixa Corporation、Seattle、Wash.)が挙げられる。TLRを介して作用する多数のアジュバントがある。TLR4を介して作用するアジュバントとして、リポ多糖の誘導体、例えば、モノホスホリル脂質A(MPL;Ribi ImmunoChem Research、Inc.、Hamilton、Mont.)およびムラミルジペプチド(MDP;Ribi)およびトレオニルムラミルジペプチド(t−MDP;Ribi)、OM−174(脂質Aと関連しているグルコサミンジサッカライド;OM Pharma SA、Meyrin、Switzerland)が挙げられる。フラジェリンは、TLR5を介して作用するアジュバントである。二本鎖RNAは、TLR3を介して作用する。TLR7および/またはTLR8を介して作用するアジュバントとして、TLRを認識および活性化する、一本鎖RNAまたはオリゴリボヌクレオチド(ORN)および合成低分子量化合物、例えば、イミダゾキノリンアミン(例えば、イミキモド、レシキモド;3M)が挙げられる。TLR9を介して作用するアジュバントとして、ウイルスもしくは細菌起源のDNAまたは合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、例えば、CpG ODNが挙げられる。
物理的効果および免疫刺激性効果の両方を有するアジュバントは、上記で同定された機能の両方を有する化合物である。このクラスのアジュバントとして、それだけには限らないが、ISCOMS(混合サポニン、脂質を含有し、ウイルスの大きさの、抗原を入れることができる孔を有する粒子を形成する免疫刺激性複合体;CSL、Melbourne、Australia)、Pam3Cys、SB−AS2(MPLおよびQS21を含有する水中油型エマルジョンであるSmithKline Beecham アジュバントシステム番号2:SmithKline Beecham Biologicals[SBB]、Rixensart、Belgium)、SB−AS4(ミョウバンおよびMPLを含有するSmithKline Beecham アジュバントシステム番号4;SBB、Belgium)、CRL1005などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー(これらは、ポリオキシエチレンの鎖が隣接する直鎖の疎水性ポリオキシプロピレンを含有する、Vaxcel、Inc.、Norcross、Ga.)およびSyntex アジュバント製剤(SAF、Tween80および非イオン性ブロックコポリマーを含有する水中油型エマルジョン;Syntex Chemicals、Inc.、Boulder、Colo.)、モンタニドIMS(例えば、IMS1312、可溶性免疫賦活薬と組み合わせた水ベースのナノ粒子、Seppic)ならびに以下に記載される多数の送達ビヒクルが挙げられる。
また、本発明の免疫刺激性ポリマーおよび別のアジュバントを含み、他のアジュバントが、キトサンなどのカチオン性多糖またはプロタミンなどのカチオン性ペプチド、ポリエステル、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)または上記の1つまたは複数の共重合体である、組成物が提供される。
また、本発明の免疫刺激性ORNおよび別のアジュバントを含み、他のアジュバントがサイトカインである組成物が提供される。一実施形態では、本組成物は、本発明の免疫刺激性ORNおよびサイトカインのコンジュゲートである。
サイトカインとは、炎症および免疫応答を媒介する多数の種類の細胞によって産生される、可溶性タンパク質および糖タンパク質である。サイトカインは、免疫系の細胞間の情報交換を媒介し、局所的ならびに全身性に作用して細胞を補充し、その機能および増殖を調節する。サイトカインのカテゴリーは、自然免疫のメディエーターおよび調節因子、適応免疫のメディエーターおよび調節因子ならびに造血の刺激因子を含む。サイトカインの中には、インターロイキン(例えば、中でも、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18およびインターロイキン19〜32(IL−19〜IL−32))、ケモカイン(例えば、中でも、IP−10、ランテス、MIP−1α、MIP−1β、MIP−3α、MCP−1、MCP−2、MCP−3、MCP−4、エオタキシン、I−TACおよびBCA−1)ならびに1型インターフェロン(例えば、INF−αおよびIFN−β)、2型インターフェロン(例えば、IFN−γ)、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)をはじめとする他のサイトカインならびにGM−CSF、G−CSFおよびM−CSFをはじめとする種々のコロニー刺激因子(CSF)が含まれる。
また、本発明の免疫刺激性ORNおよび免疫刺激性CpG核酸を含む組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、本発明の免疫刺激性ORNおよびCpG核酸のコンジュゲート、例えば、RNA:DNAコンジュゲートである。
免疫刺激性CpG核酸とは、本明細書において用いる場合、CpGモチーフを含み、免疫系の細胞の活性化または増殖を刺激する天然または合成DNA配列を指す。免疫刺激性CpG核酸は、いくつかの交付済み特許、公開特許出願および他の刊行物、例えば、米国特許第6,194,388号;同6,207,646号;同6,214,806号;同6,218,371号;同6,239,116号;および同6,339,068号に記載されている。一実施形態では、免疫刺激性CpG核酸は、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)6〜100ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、免疫刺激性CpG核酸は、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)8〜40ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ORNは、CGジヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ORNは、CGジヌクレオチドを含まない。
免疫刺激性CpG核酸は、異なるクラスのCpG核酸を含む。あるクラスは、B細胞を活性化するのに強力であるが、IFN−αの誘導およびNK細胞活性化においては比較的弱く、このクラスはBクラスと呼ばれている。BクラスCpG核酸は、通常、十分に安定化されており、特定の好ましい塩基構成内にメチル化されていないCpGジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第6,194,388号;同6,207,646号;同6,214,806号;同6,218,371号;同6,239,116号;および同6,339,068号参照のこと。別のクラスは、IFN−αの誘導およびNK細胞活性化に対して強力であるが、B細胞の刺激では比較的弱く、このクラスはAクラスと呼ばれている。AクラスCpG核酸は、通常、少なくとも6ヌクレオチドの、回帰性ホスホジエステルCpGジヌクレオチド含有配列および安定化されたポリG配列を、5’および3’末端のいずれかまたは両方に有する。例えば、公開された国際特許出願WO01/22990参照のこと。さらに別のクラスのCpG核酸は、B細胞およびNK細胞を活性化し、IFN−αを誘導し、このクラスは、Cクラスと呼ばれる。最初に特性決定されたように、CクラスCpG核酸は、通常、十分に安定化されており、Bクラス型配列およびGCリッチパリンドロームまたはほぼパリンドロームを含む。このクラスは、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第2003/0148976号に記載されている。
免疫刺激性CpG核酸はまた、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第2003/0148976号に開示されるような、いわゆるソフトおよびセミソフトCpG核酸を含む。このようなソフトおよびセミソフト免疫刺激性CpG核酸は、ヌクレアーゼ耐性およびヌクレアーゼ感受性ヌクレオチド間結合の組合せを組み込み、ここでは、異なる種類の結合が一定の基準に従って配置されている。
本発明は、一態様では、本発明の免疫刺激性ORNおよび抗原を含むワクチンを提供する。「抗原」とは、本明細書において用いる場合、T細胞抗原受容体またはB細胞抗原受容体によって認識され得る任意の分子を指す。この用語は、宿主免疫系によって外来性であるとして認識される、いずれの種類の分子も広く含む。抗原とは、通常、それだけには限らないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、多糖、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物および寄生生物などの多細胞生物およびアレルゲンを含む。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである抗原に関しては、このような抗原は、このような抗原をコードする核酸分子を含み得る。抗原として、さらに詳しくは、それだけには限らないが、癌細胞および癌細胞中または癌細胞上に発現される分子を含む癌抗原;微生物および微生物中または微生物上に発現される分子を含む微生物抗原;アレルゲンならびに自己反応性T細胞などの他の疾患関連分子が挙げられる。したがって、本発明は、特定の実施形態では、癌、感染性疾患、アレルギー、耽溺、異常に折り畳まれたタンパク質によって引き起こされる疾患、自己免疫疾患およびコレステロール管理のためのワクチンを提供する。
感染性疾患に対するワクチンは、予防的なものである場合も、治療的なものである場合もある。ワクチン中の抗原は、完全な生存している(弱毒化された)もの、完全な死滅している/不活化されているもの、組換え型の生存している弱毒化されたもの、精製されたサブユニット、組換え型のサブユニットまたはペプチドであり得る。ワクチンは、さらなるアジュバントまたはアジュバントの組合せをさらに含む場合がある。さらなるアジュバントは、デポー効果を有するもの(例えば、ミョウバン)および、免疫モディファイヤー(例えば、別のTLRアゴニストまたは非TLR経路によって作用するもののいずれか)またはこれらの効果の両方を有するアジュバント、例えば、免疫刺激複合体(ISCOM(登録商標))であり得る。アジュバントは、以下により詳細に記載される。
癌に対するワクチンもまた、予防的である場合も、治療的である場合もある。癌抗原は、完全細胞(個々のDCワクチン)または1つまたは複数のポリペプチドまたはペプチドであり得る。これらは、通常、担体分子と結合している。ワクチンは、上記のものなどのさらなるアジュバントまたはアジュバントの組合せをさらに含む場合がある。癌抗原は、以下により詳細に論じられる。
アレルギーを治療するためのワクチンについては、抗原は、アレルゲンまたはアレルゲンの一部である。アレルゲンは、送達ビヒクル内に含有されているか、送達ビヒクルと結合しているかのいずれかであり得る。アレルゲンは、免疫刺激性ORNと連結させてもよい。アレルゲンは、以下により詳細に論じられる。
耽溺を治療するためのワクチンは、例えば、ニコチン耽溺、コカイン耽溺、メタンフェタミンまたはヘロイン耽溺を治療するのに有用であり得る。これらの場合における耽溺性分子は、天然分子またはハプテンである。耽溺に対するワクチンに含めるための「抗原」は、通常、小分子であり、担体タンパク質または他の担体粒子とコンジュゲートされる場合もあり、ウイルス様粒子中に組み込まれる場合もある。
異常に折り畳まれたタンパク質によって引き起こされた疾患を治療するためのワクチンは、伝染性海綿状脳症(クロイツフェルト・ヤコブ病の異型)などの疾患を治療するのに有用であり得る。この場合において「抗原」は、スクレイピープリオンであり、担体タンパク質または生存弱毒化ベクターと結合させることができる。アルツハイマー病に対するワクチンの一例として、例えば、β−アミロイドペプチドまたはタンパク質を標的とするワクチンがある。
自己免疫疾患を治療するためのワクチンも提供される。これらのワクチンは、自己免疫細胞が認識する分子が同定されている自己免疫疾患を治療するのに有用であり得る。例えば、ミエリンと反応する自己反応性T細胞に対するワクチンは、多発性硬化症を治療するのに使用される。
心血管疾患および状態を治療するのに有用なワクチンも提供される。このワクチンは、この疾患の病因論の一因となっているとわかっている分子、例えば、リポタンパク質、コレステロールおよびコレステロール代謝に関与する分子を標的とし得る。コレステロールを管理するためのワクチンは、例えば、抗原としてコレステロールエステル輸送タンパク質(CETP)を含む。CETPは、アテローム産生抑制性アポA−I含有HDL粒子からアテローム生成的アポB含有VLDLおよびLDLへのコレステロールの交換を促進する。このようなワクチンは高コレステロールを治療するため、またはアテローム性動脈硬化症の進行を遅延するために使用できる。このワクチンは、標的分子がわかっている他の心血管疾患および状態を治療するために使用できる。
本発明は、一態様では、対象にワクチン接種するための医薬の調製のための本発明の免疫刺激性ORNの使用を提供する。
本発明は、一態様では、ワクチンを調製する方法を提供する。本方法は、本発明の免疫刺激性ORNを、抗原と、および任意選択により、薬学的に許容できる担体と密接な関係に置くステップを含む。
いくつかの実施形態では、免疫刺激性ORNおよび抗原またはアレルゲンはコンジュゲートされている。抗原および免疫刺激性ORNは、直接コンジュゲートされていてもよく、またはそれらはリンカーを介して間接的にコンジュゲートされていてもよい。
種々の実施形態では、抗原は、微生物抗原、癌抗原またはアレルゲンである。「微生物抗原」とは、本明細書において用いる場合、微生物の抗原であり、それだけには限らないが、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌を含む。このような抗原は、無傷の微生物ならびにその自然分離体および断片または誘導体ならびにまた、天然微生物抗原と同一または類似であり、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物を含む。化合物は、天然微生物抗原に対する免疫応答(体液性および/または細胞性)を誘導する場合に天然微生物抗原と類似である。このような抗原は、当技術分野では日常的に用いられ、当業者には周知である。
ウイルスは、小さな感染性病原体であり、通常、核酸コアおよびタンパク質コートを含有するが、生物から独立していない。ウイルスはまた、タンパク質を欠く感染性核酸の形をとり得る。ウイルスは、その中で複製できる生細胞の不在下では生存できない。ウイルスは、エンドサイトーシスまたはDNA(ファージ)の直接注射のいずれかによって特定の生細胞に侵入し、増殖し、疾患を引き起こす。次いで、増殖したウイルスが放出され、さらなる細胞に感染し得る。一部のウイルスは、DNA含有ウイルスであるが、他のものは、RNA含有ウイルスである。いくつかの態様では、本発明はまた、プリオンが疾患進行に関係している疾患、例えば、ウシ海綿状脳症(すなわち狂牛病、BSE)または動物におけるスクレイピー感染またはヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病などを治療することを意図する。
ウイルスとして、それだけには限らないが、エンテロウイルス(それだけには限らないが、ピコナウイルス科のウイルス、例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスを含む)、ロタウイルス、アデノウイルスおよびA型、B型、C型D型およびE型肝炎などの肝炎ウイルスが挙げられる。ヒトにおいて見られたウイルスの特定の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる:レトロウイルス科(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、HIV−1(HTLV−IIIとも呼ばれる、LAVまたはHTLV−III/LAVまたはHIV−III;および他の分離株、例えば、HIV−LP;ピコナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カリシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こす株);トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラビウイルス科(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(例えば、エボラウイルス);パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス);オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルス);ブニヤウイルス科(例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス);アレナウイルス科(出血熱ウイルス);レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス);ビルナウイルス科;ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(パルボウイルス);パポバウイルス科(Papovaviridae)(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス科(ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV));ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);イリドウイルス科(例えば、アフリカブタ熱ウイルス);および他のウイルス急性咽頭気管支炎ウイルス、アルファウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパーウイルス、ノーウォークウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザ、SARsウイルス、ウエストナイルウイルス。
細菌は、二分裂によって無性生殖的に増殖する単細胞生物である。それらは、形態学、染色反応、栄養および代謝性要求、抗原構造、化学組成および遺伝的相同性に基づいて分類され、名づけられている。細菌は、その形態学的な形、球状(球菌)、直鎖状の桿状体(桿菌)および曲がったまたはらせん状の桿状体(ビブリオ、カンピロバクター、スピリルムおよびスピロヘータ)に基づいて3つの群に分類され得る。細菌はまた、より通常は、その染色反応に基づいて、2つのクラスの生物、グラム陽性およびグラム陰性に特性決定される。グラムとは、微生物学実験室において、よく実施される染色法を指す。グラム陽性生物は、染色手順後に染色剤を保持し、濃い紫色に見える。グラム陰性生物は、染色剤を保持しないが、対比染色剤を取り込み、ピンク色に見える。
感染性細菌は、それだけには限らないが、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を含む。グラム陽性菌として、それだけには限らないが、パスツレラ種、スタフィロコッカス種およびストレプトコッカス種が挙げられる。グラム陰性菌として、それだけには限らないが、大腸菌、シュードモナス種およびサルモネラ種が挙げられる。感染性細菌の特定の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる:ピロリ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、マイコバクテリア種(例えば、結核菌、鳥結核菌、M.イントラセルラーレ、M.カンサシ、M.ゴルドネ)、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿性連鎖球菌(グループAストレプトコッカス)、ストレプトコッカス・アガラクチア(グループBストレプトコッカス)、ストレプトコッカス(ビリダンス群)、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス(嫌気性種)、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌、炭疽菌、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイド種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテニュー(Treponema pertenue)、レプトスピラ、リケッチアおよびアクチノミセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)。
寄生生物とは、生存するために他の生物に依存しており、したがって、その生活環を継続するために別の生物に侵入または感染してなくてはならない生物である。感染した生物、すなわち、宿主は、寄生生物に栄養および生育地の両方を提供する。広い意味では、この用語、寄生生物は、すべての感染性病原体(すなわち、細菌、ウイルス、真菌、原虫および蠕虫)を含み得るが、一般的に言えば、この用語は、もっぱら原虫、蠕虫および外寄生生物性節足動物(例えば、マダニ、ダニなど)を指すよう用いられる。原虫とは、細胞内および細胞外の両方で、特に、血液、腸管または組織の細胞外マトリックスにおいて増殖できる単細胞生物である。蠕虫とは、ほとんど細胞外である多細胞生物である(トリキネラ種は例外である)。蠕虫は、普通、増殖するには、一次宿主から出て、二次宿主に伝染する必要がある。これらの上記のクラスとは対照的に、外寄生生物性節足動物は、宿主身体の外表面と寄生関係を形成する。
寄生生物は、細胞内寄生生物および偏性細胞内寄生生物を含む。寄生生物の例として、それだけには限らないが、熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、バベシア・ディバージェンス(Babesia divergens)、トリパノソーマ・クルージ、トキソプラズマ原虫、トリキナ、森林型熱帯リーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマおよびマンソン住血吸虫が挙げられる。
真菌は、真核生物であり、そのうちほんのわずかなものだけが、脊椎動物哺乳類に感染を引き起こす。真菌は真核生物であるので、原核生物の細菌とは大きさ、構造的構成、生活環および増殖の機序が大きく異なる。真菌は、通常、形態学的特徴、生殖様式および培養特徴に基づいて分類される。真菌は、対象において種々の種類の疾患、例えば、真菌抗原の吸入後の呼吸器アレルギー、毒性物質、例えば、タマゴテングダケ毒素および毒キノコによって産生されるファロトキシンおよびアスペルギルス種によって産生されるアフラトキシンの経口摂取による真菌中毒を引き起こし得るが、すべての真菌が感染性疾患を引き起こすわけではない。
感染性真菌は、全身性感染症または表在性感染症を引き起こし得る。一次全身性感染症は、正常な健常な対象において起こり得、日和見感染症は、免疫低下対象において最も高い頻度で見られる。一次全身性感染症を引き起こす最も一般的な真菌病原体として、ブラストミセス属、コクシジオイデス属およびヒストプラズマ属がある。免疫低下または免疫抑制対象において日和見感染症を引き起こす一般的な真菌として、それだけには限らないが、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンスおよび種々のアスペルギルス種が挙げられる。全身性真菌感染症は、内部臓器の侵襲的感染である。これらの生物は、通常、肺、消化管または静脈内カテーテルを通って身体に侵入する。こういった種類の感染は、一次病原性真菌または日和見感染真菌によって引き起こされ得る。
表在性真菌感染は、内部組織への侵入を伴わない外表面での真菌の増殖を伴う。典型的表在性真菌感染として、皮膚、毛髪または爪が関与する皮膚真菌感染症が挙げられる。
真菌感染と関連している疾患として、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、黒色分芽菌症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、真菌性眼感染症、真菌性毛髪、爪および皮膚感染症、ヒストプラスマ症、ロボ真菌症、菌腫、外耳道真菌症、パラコクシジオイデス症、播種性ペニシリウム・マルネフェイ、フェオフィオ真菌症、リノスポリジウム症、スポロトリクム症および接合菌症が挙げられる。
他の医学的に関連のある微生物は、文献に広く記載されている。例えば、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれるC.G.A Thomas、Medical Microbiology、Bailliere Tindall、Great Britain 1983年参照のこと。上記で列挙された各々は、例示であり、限定しようとするものではない。
本明細書において用いる場合、用語「癌抗原」および「腫瘍抗原」は、腫瘍または癌細胞と関係しており、主要組織適合抗原複合体(MHC)分子との関連で、抗原提示細胞の表面に発現されると免疫応答を誘発できる化合物、例えば、ペプチド、タンパク質または糖タンパク質を指すよう同義的に用いられる。癌細胞によって差次的に発現される癌抗原は、そのために、癌細胞を標的とするために利用できる。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を刺激できる可能性がある抗原である。これらの抗原の中にはコードされているものもあるが、必ずしも、正常な細胞によって発現されるわけではない。これらの抗原は、正常細胞では、通常、サイレントである(すなわち、発現されない)もの、特定の分化ステージでのみ発現されるものおよび胚抗原および胎児抗原などの一時的に発現されるものと特徴付けることができる。他の癌抗原は、突然変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子(例えば、活性化ras癌遺伝子)、サプレッサー遺伝子(例えば、突然変異p53)、内部欠失または染色体転位置に起因する融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、RNAおよびDNA腫瘍ウイルスで運ばれるものなど、ウイルス遺伝子によってコードされる場合もある。
癌抗原は、例えば、Cohen PAら(1994年)Cancer Res 54:1055〜8頁に記載されるように、癌細胞の粗抽出物を調製することによって、抗原を部分精製することによって、組換え技術によってまたは既知抗原のde novo合成によってのいずれかで癌細胞から調製できる。癌抗原は、それだけには限らないが、組換え発現される抗原、腫瘍または癌またはその細胞の免疫原性部分または全体を含む。このような抗原は、単離、または組換えによって、もしくは当技術分野で公知の任意の他の手段によって調製できる。
腫瘍抗原の例として、MAGE、MART−1/Melan−A、gp100、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADAbp)、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原(CRC)−−C017−1A/GA733、癌胎児性抗原(CEA)およびその免疫原性エピトープCAP−1およびCAP−2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原(PSA)およびその免疫原性エピトープPSA−1、PSA−2およびPSA−3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、T細胞受容体/CD3−ζ鎖、MAGEファミリーの腫瘍抗原(例えば、MAGE−A1、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A5、MAGE−A6、MAGE−A7、MAGE−A8、MAGE−A9、MAGE−A10、MAGE−A11、MAGE−A12、MAGE−Xp2(MAGE−B2)、MAGE−Xp3(MAGE−B3)、MAGE−Xp4(MAGE−B4)、MAGE−C1、MAGE−C2、MAGE−C3、MAGE−C4、MAGE−C5)、GAGEファミリーの腫瘍抗原(例えば、GAGE−1、GAGE−2、GAGE−3、GAGE−4、GAGE−5、GAGE−6、GAGE−7、GAGE−8、GAGE−9)、BAGE、RAGE、LAGE−1、NAG、GnT−V、MUM−1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α−フェトプロテイン、E−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY−ESO−1、cdc27、大腸腺腫症タンパク質(APC)、フォドリン、コネキシン37、Ig−イディオタイプ、p15、gp75、GM2およびGD2 ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、Smadファミリーの腫瘍抗原、lmp−1、P1A、EBVによってコードされる核抗原(EBNA)−1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX−1、SSX−2(HOM−MEL−40)、SSX−1、SSX−4、SSX−5、SCP−1およびCT−7およびc−erbB−2が挙げられる。この羅列は限定しようとするものではない。
「アレルゲン」とは、本明細書において用いる場合、IgEの生成を特徴とする免疫応答を誘発できる分子である。アレルゲンはまた、感受性対象においてアレルギー反応または喘息症状を誘導し得る物質である。したがって、この発明との関連では、用語「アレルゲン」とは、IgE抗体によって媒介されるアレルギー反応の誘引となり得る特定の種類の抗原を意味する。
アレルゲンの羅列は、膨大なものであり、花粉、昆虫毒液、動物のフケ粉塵、真菌胞子および薬物(例えば、ペニシリン)を含み得る。天然の動物および植物アレルゲンの例として、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる:イヌ属(Canis)(ケイネス・ファミリアリス(Canis familiaris));ヒョウヒダニ属(Dermatophagoides)(例えば、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae));ネコ属(felis)(フェリス・ドメスティカス(Felis domesticus));ブタクサ属(Ambrosia)(ブタクサ(Ambrosia artemisiifolia));ドクムギ属(Lolium)(例えば、ホソムギ(Lolium perenne)およびイタリアンライグラス(Lolium multiflorum));スギ属(Cryptomeria)(スギ(Cryptomeria japonica));アルテルナリア属(Alternaria)(アルテルナリア・アルテナータ(Alternaria alternata));アルダー(Alder);ハンノキ属(Alnus)(アルヌス・グルティノサ(Alnus gultinosa));カバノキ属(Betula)(ビーチ(Betula verrucosa));カシ属(Quercus)(ホワイトオーク(Quercus alba));オリーブ属(Olea)(オレア・ユーロパ(Olea europa));ヨモギ属(Artemisia)(オウシュウヨモギ(Artemisia vulgaris));オオバコ属(Plantago)(例えば、ヘラオオバコ(Plantago lanceolata));ヒカゲミズ属(Parietaria)(例えばパリエタリア・オフィチナリス(Parietaria officinalis)およびパリエタリア・ユダイカ(Parietaria judaica));チャバネゴキブリ属(Blattella)(例えば、チャバネゴキブリ(Blattella germanica));ミツバチ属(Apis)(例えば、アピス・ムルティフロルム(Apis multiflorum));イトスギ属(Cupressus)(例えば、クプレッサス・センペルビレンス(Cupressus sempervirens)、クプレッサス・アリゾニカ(Cupressus arizonica)およびモントレーイトスギ(Cupressus macrocarpa));ビャクシン属(Juniperus)(例えば、ジュニペラス・サビノイデス(Juniperus sabinoides)、ジュニペラス・ビルギニアナ(Juniperus virginiana)、ジュニペラス・コムニス(Juniperus communis)およびジュニペラス・アシェイ(Juniperus ashei));クロベ属(Thuya)(例えばツヤ・オリエンタリス(Thuya orientalis));ヒノキ属(Chamaecyparis)(例えば、ヒノキ(Chamaecyparis obtusa));ゴキブリ属(Periplaneta)(例えば、ワモンゴキブリ(Periplaneta americana));カモジグサ属(Agropyron)(例えば、シバムギ(Agropyron repens));ライムギ属(Secale)(例えば、ライムギ(Secale cereale));コムギ属(Triticum)(例えば、コムギ(Triticum aestivum));カモガヤ属(Dactylis)(例えば、オーチャードグラス(Dactylis glomerata));ウシノケグサ属(Festuca)(例えば、ヒロハノウシノケグサ(Festuca elatior));イチゴツナギ属(Poa)(例えば、ナガハグサ(Poa pratensis)およびコイチゴツナギ(Poa compressa));カラスムギ属(Avena)(例えば、マカラスムギ(Avena sativa));シラゲガヤ属(Holcus)(例えば、シラゲガヤ(Holcus lanatus));ハルガヤ属(Anthoxanthum)(例えば、ハルガヤ(Anthoxanthum odoratum));オオカニツリ属(Arrhenatherum)(例えば、オオカニツリ(Arrhenatherum elatius));コヌカグサ属(Agrostis)(例えば、コヌカグサ(Agrostis alba));アワガエリ属(Phleum)(例えば、オオアワガエリ(Phleum pratense));クサヨシ属(Phalaris)(例えば、クサヨシ(Phalaris arundinacea));スズメノヒエ属(Paspalum)(例えば、アメリカスズメノヒエ(Paspalum notatum));モロコシ属(Sorghum)(例えば、セイバンモロコシ(Sorghum halepensis));およびスズメノチャヒキ属(Bromus)(例えば、コスズメノチャヒキ(Bromus inermis))。
本発明は、一態様では、本発明の免疫刺激性ORNおよび抗原のコンジュゲートを提供する。一実施形態では、本発明の免疫刺激性ORNは、抗原と共有結合によって連結している。免疫刺激性ORNと抗原との間の共有結合は、免疫刺激性ORNおよび抗原が、そのようにつながる場合に、各々個々の成分の測定可能な機能活性を保持するという条件で、任意の適した種類の共有結合であり得る。一実施形態では、共有結合は直接である。別の実施形態では、共有結合は、例えば、リンカー部分を介して間接である。共有結合によって連結している免疫刺激性ORNおよび抗原は、一方が他方から放出されるよう細胞内で処理され得る。このようにして、いずれかの成分の細胞への送達は、別個の調製物または別個の成分として投与される場合のその送達と比較して増強され得る。一実施形態では、抗原は、それ自体抗原である、すなわち、前もって作られた抗原である。
一態様では、本発明は、本発明の組成物を、送達ビヒクルと関連して含む医薬組成物を提供する。種々の実施形態では、送達ビヒクルは、カチオン性脂質、リポソーム、コクリート(cochleate)、ビロソーム、免疫刺激複合体(ISCOM(登録商標))、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層リポソーム(LUV)、多重膜ベシクル、エマルソーム(emulsome)およびポリカチオン性ペプチド、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、油中水型(W/O)エマルジョン、水中油型(O/W)エマルジョン、水中油中水型(W/O/W)マルチプルエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミセル、デンドリマー、ビロソーム、ウイルス様粒子、ポリマーナノ粒子(例えば、ナノスフェアまたはナノカプセル)、ポリマー微粒子(例えば、ミクロスフェアまたはマイクロカプセル)、キトサン、シクロデキストリン、ニオソームまたはISCOM(登録商標)および任意選択により、薬学的に許容できる担体から選択され得る。
薬学的に許容できる担体は、以下に論じられている。本発明の医薬組成物は、抗原を、任意選択によりさらに含み得る。本発明の組成物を、任意の適した方法を用いて、存在する場合抗原とともに、送達ビヒクルと物理的に関連させる。免疫刺激性組成物は、送達ビヒクル内に含有されてもよく、または、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に、もしくは表面と結合して存在してもよい。一実施形態では、免疫刺激性ORNは、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に存在するか、表面と結合しており、抗原は、存在する場合、送達ビヒクル内に含有される。別の実施形態では、免疫刺激性ORNおよび抗原は両方とも、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に存在するか、表面と結合している。さらに別の実施形態では、抗原は、送達ビヒクルの溶媒にさらされる表面上に存在するか、表面と結合しており、免疫刺激性ORNは、送達ビヒクル内に含有されている。さらに別の実施形態では、抗原が含まれる場合、免疫刺激性ORNおよび抗原の両方とも、送達ビヒクル内に含有される。
本発明はまた、本発明の免疫刺激性組成物を使用する方法を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞を活性化する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、免疫細胞を、in vitroまたはin vivoで有効量の本発明の組成物と接触させて、免疫細胞を活性化するステップを含む。本発明の組成物は、抗原を任意選択により含み得る。「免疫細胞」とは、本明細書において用いる場合、自然または獲得免疫応答に関与し得る任意の骨髄由来細胞を指す。免疫系の細胞として、限定されるものではないが、樹状細胞(DC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、Bリンパ球、血漿細胞、Tリンパ球およびその前駆体細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫細胞はTLR7発現細胞である。
本明細書において用いる場合、用語「有効量」とは、所望の生物学的効果を引き起こすのに必要であるか、十分である物質の量を指す。有効量は、単回投与で投与される量であり得るが、これに限定される必要はない。
本明細書において用いる場合、用語「免疫細胞を活性化する」とは、免疫細胞が、免疫応答と関連している活性化された状態に入るのを誘導することを指す。用語「免疫細胞を活性化する」とは、免疫応答を誘導および増強することの両方を指す。本明細書において用いる場合、用語「免疫応答」とは、増殖し、エフェクター免疫機能を発揮し、または免疫応答に関与する遺伝子産物を産生するための免疫細胞の活性化を反映する、自然または獲得免疫応答の任意の側面を指す。免疫応答に関与する遺伝子産物として、免疫機能に特有の、分泌産物(例えば、抗体、サイトカインおよびケモカイン)ならびに細胞内および細胞表面分子(例えば、特定の表面抗原分類(CD)抗原、転写因子および遺伝子転写物)が挙げられる。用語「免疫応答」は、単細胞に、または細胞の集団に当てはまり得る。
サイトカインの産生は、当技術分野で周知のいくつかの方法、例えば、生物学的応答アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、細胞内蛍光活性化細胞選別(FACS)分析および逆転写酵素/ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)のいずれかによって評価できる。一実施形態では、免疫応答は、IFN−αの産生を伴う。
一実施形態では、免疫応答は、免疫細胞活性化の細胞表面マーカー、例えば、CD25、CD80、CD86およびCD154のアップレギュレーションを伴う。このようなマーカーの細胞表面発現を測定する方法は、当技術分野で周知であり、FACS分析が挙げられる。
細胞または細胞集団における免疫応答の測定のために、一実施形態では、細胞または細胞集団はTLR7を発現する。細胞が、TLRを天然に発現する場合もあり、またはTLRの適した発現ベクターを細胞に導入することによってTLRを発現するよう操作してもよい。一実施形態では、細胞または細胞集団は、末梢血単核細胞(PBMC)として得られる。一実施形態では、細胞または細胞集団は、TLRを発現する細胞株として得られる。一実施形態では、細胞または細胞集団は、TLRを発現する一時的な形質転換体として得られる。一実施形態では、細胞または細胞集団は、TLRを発現する安定な形質転換体として得られる。
また、細胞または細胞集団における免疫応答の測定において使用するには、細胞または細胞集団に、TLRによる細胞内シグナル伝達に反応性であるリポーター構築物を導入することが好都合であり得る。一実施形態では、このようなリポーターは、NF−κBプロモーターの制御下に置かれた遺伝子である。一実施形態では、プロモーターの制御下に置かれた遺伝子はルシフェラーゼである。活性化の適した条件下では、ルシフェラーゼリポーター構築物が発現され、検出可能な光シグナルを放射し、これはルミノメーターを用いて定量的に測定できる。このようなリポーター構築物および他の適したリポーター構築物は、市販されている。
本発明はまた、細胞を含まないTLR活性化を検出する方法の使用を考慮する。
本発明は、特定の態様では、治療において使用するための組成物および方法に関する。本発明の免疫刺激性組成物は、単独で使用してもよく、他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。免疫刺激性組成物および他の治療薬は、同時に投与してもよく、逐次投与してもよい。本発明の免疫刺激性組成物および他の治療薬を同時に投与する場合、それらは同一の製剤で投与してもよく、別個の製剤で投与してもよいが、それらは同時に投与される。さらに、本発明の免疫刺激性組成物および他の治療薬が同時に投与される場合、それらは同一の投与経路によって投与されてもよく、別個の投与経路によって投与されてもよいが、それらは同時に投与される。本発明の免疫刺激性組成物および別の治療薬は、本発明の免疫刺激性組成物の投与が、他の治療薬の投与と時間的に離れている場合逐次投与される。これらの化合物の投与間の時間の分離は、ほんの数分である場合もあるし、より長い場合もある。一実施形態では、本発明の免疫刺激性組成物は、他の治療薬の投与の前に投与される。一実施形態では、本発明の免疫刺激性組成物は、他の治療薬の投与の後に投与される。さらに、本発明の免疫刺激性組成物および他の治療薬が逐次投与される場合、それらは、同一の投与経路によって投与されてもよく、別個の投与経路によって投与されてもよい。他の治療薬として、それだけには限らないが、アジュバント、抗原、ワクチンならびに感染、癌、アレルギーおよび喘息の治療に有用な医薬が挙げられる。
一態様では、本発明は、対象にワクチン接種する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、対象に、抗原および本発明の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、抗原を投与することは、抗原をコードする核酸を投与することを含む。
「対象」とは、本明細書において用いる場合、脊椎動物を指す。種々の実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳類である。特定の実施形態では、対象は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマである。
対象にワクチン接種する方法において使用するには、本発明の組成物は、一実施形態では、抗原を含む。抗原は、本発明のORNと分離していてもよく、共有結合によって連結していてもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、それ自体抗原を含まない。この実施形態では、抗原は対象に、本発明の組成物と別個に投与してもよく、本発明の組成物と一緒に投与してもよい。別個である投与として、時間において別個である、投与位置または経路において別個である、または時間において、および、投与位置または経路においての両方で別個であることを含む。本発明の組成物および抗原が、時間において別個で投与される場合、抗原は本発明の組成物の前に投与してもよく、後に投与してもよい。一実施形態では、抗原は、本発明の組成物の投与の48時間〜4週間後に投与される。本方法はまた、抗原および組成物の最初の投与後の、抗原単独、組成物単独または抗原および組成物の1つまたは複数のブースター用量の投与を考慮する。
また、対象に、抗原を含まない本発明の組成物を投与することによって、対象に、未知抗原との将来の遭遇に対して準備させることができるということも本発明によって考慮される。この実施形態によれば、対象の免疫系は、例えば、環境性曝露または職業性曝露によって対象によって後で遭遇される抗原に対してより活発な反応を開始するよう準備される。このような方法は、例えば、微生物因子に対して曝露される可能性のある旅行者、医療労働者および兵士に対して使用できる。
一態様では、本発明は、免疫系不全の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。「免疫系不全」とは、本明細書において用いる場合、抗原に対する免疫応答を開始するための免疫系の異常に低下した能力を指す。一実施形態では、免疫系不全とは、対象の免疫系が正常な能力で機能していないか、例えば、対象において腫瘍または癌または感染症を排除するのに、対象の免疫応答をブーストすることが有用である疾患または障害である。「免疫不全症の対象」とは、本明細書において用いる場合、抗原に対する免疫応答を開始するための対象の免疫系の能力の低下がある対象を指す。免疫不全症の対象として、後天性免疫不全症の対象ならびに先天性免疫系不全の対象が挙げられる。後天性免疫不全症の対象として、限定されるものではないが、慢性炎症状態の対象、慢性腎機能不全または腎不全の対象、感染症の対象、癌の対象、免疫抑制薬を摂取している対象、他の免疫抑制治療を受けている対象および栄養障害の対象が挙げられる。一実施形態では、対象は、抑制されたCD4+T細胞集団を有する。一実施形態では、対象は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)による感染症であるか、または後天性免疫不全症候群(AIDS)である。したがって、本発明のこの態様による方法は、より活発な免疫応答を必要とする対象において免疫応答をブーストする、または免疫応答を開始する能力をブーストする方法を提供する。
本発明の組成物および方法は単独で使用してもよく、感染症の治療に有用な他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、感染症の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、感染症の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、感染症の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、感染症の対象に有効量の本発明の組成物および感染症医薬を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、対象において感染症を治療するための医薬の調製のための本発明の免疫刺激性ORNの使用を提供する。
一態様では、本発明は、感染症の治療に有用な組成物を提供する。この態様による組成物は、本発明の免疫刺激性ORNおよび感染症医薬を含む。
本明細書において用いる場合、用語「治療する」とは、疾患または状態の対象に対して用いられる場合、対象において疾患または状態の少なくとも1つの徴候または症状を予防、寛解または排除することを意味するものとする。
「感染症の対象」とは、感染性微生物による、表在的な、局所的な、または全身的な対象の侵入に起因する障害の対象である。感染性微生物は、上記のように、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であり得る。
感染症医薬として、それだけには限らないが、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤および駆虫剤が挙げられる。「抗感染剤」、「抗生物質」、「抗菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「駆虫剤」および「寄生虫駆除剤」などの語句は、当業者にとって十分に確立された意味を有し、標準的な医療テキストに定義されている。手短には、抗菌剤は、細菌を死滅させる、または阻害し、抗生物質ならびに同様の機能を有する他の合成または天然化合物を含む。抗ウイルス剤は、天然供給源から単離でき、または合成でき、ウイルスを死滅させる、または阻害するのに有用である。抗真菌剤は、表在性真菌感染症ならびに日和見性および一次全身性真菌感染症を治療するために用いられる。駆虫剤は、寄生生物を死滅させる、または阻害する。多数の抗生物質は、微生物などの細胞によって二次代謝産物として生成される低分子量分子である。通常、抗生物質は、微生物に特異的であり、宿主細胞には存在しない1つまたは複数の機能または構造を干渉する。
抗感染薬治療に伴う問題の1つとして、抗感染薬で治療されている宿主に生じる副作用がある。例えば、多数の抗感染剤は、広範囲の微生物を死滅させる、または阻害することができ、特定の種類の種に特異的ではない。これらの種類の抗感染剤を用いる治療は、宿主中で生存している正常な微生物叢ならびに感染性微生物の死滅をもたらす。微生物叢は感染性病原体と競合し、障壁として機能するために、その喪失は、疾患合併症につながり、宿主を他の病原体による感染症にさせ得る。他の副作用が、これらの化学物質の微生物でない、宿主の細胞または組織に対する特異的または非特異的効果の結果として起こり得る。
抗感染物質の広範な使用に伴うもう1つの問題として、微生物の抗生物質耐性株の発生がある。すでに、バンコマイシン耐性腸球菌、ペニシリン耐性肺炎球菌、多剤耐性黄色ブドウ球菌および多剤耐性結核株が発生しており、大変な臨床的問題となっている。抗感染物質の広範な使用は、多数の抗生物質耐性株の細菌を生じさせる可能性がある。結果として、これらの微生物と闘うために、新規抗感染症戦略が必要となる。
広範な細菌を死滅させる、または阻害するのに有効である抗菌抗生物質は、広域スペクトル抗生物質と呼ばれる。他の種類の抗菌抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性クラスの細菌に対して主に有効である。これらの種類の抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質と呼ばれる。単一の生物または疾患に対して有効であり、他の種類の細菌に対しては有効でない他の抗生物質は、限定スペクトルの抗生物質と呼ばれる。
抗菌剤は、その主な作用様式に基づいて分類されることがある。通常、抗菌剤は、細胞壁合成阻害剤、細胞膜阻害剤、タンパク質合成阻害剤、核酸合成または機能阻害剤および競合阻害剤である。細胞壁合成阻害剤は、細胞壁合成のプロセスにおける、通常、細菌ペプチドグリカンの合成における一段階を阻害する。細胞壁合成阻害剤として、β−ラクタム抗生物質、天然ペニシリン、半合成ペニシリン、アンピシリン、クラブラン酸、セファロスポリンおよびバシトラシンが挙げられる。
β−ラクタムは、ペプチドグリカン合成の最後の段階を阻害する4員のβ−ラクタム環を含有する抗生物質である。β−ラクタム抗生物質は、合成してもよく、天然であってもよい。アオカビ属によって産生されるβ−ラクタム抗生物質は、天然ペニシリン、例えば、ペニシリンGまたはペニシリンVである。これらは、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)の発酵によって産生される。天然ペニシリンは、狭域スペクトルの活性を有し、通常、ストレプトコッカス、淋菌およびブドウ状球菌に対して有効である。グラム陽性菌に対しても有効である、他の種類の天然ペニシリンとして、ペニシリンF、X、KおよびOが挙げられる。
半合成ペニシリンは、通常、カビによって産生された分子6−アミノペニシラン酸の修飾物である。6−アミノペニシラン酸は、側鎖の付加によって修飾でき、これによって、天然ペニシリンよりも広いスペクトルの活性または種々の他の有利な特性を有するペニシリンが得られる。いくつかの種類の半合成ペニシリンは、グラム陽性およびグラム陰性菌に対して広域スペクトルを有するが、ペニシリナーゼによって不活化される。これらの半合成ペニシリンとして、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリンが挙げられる。他の種類の半合成ペニシリンは、グラム陽性菌に対してより狭い活性を有するが、ペニシリナーゼによって不活化されないような発展した特性を有する。これらとして、例えば、メチシリン、ジクロキサシリンおよびナフシリンが挙げられる。いくつかの広域スペクトル半合成ペニシリンはβ−ラクタマーゼ阻害剤、例えば、クラブラン酸およびスルバクタムと組み合わせて使用できる。β−ラクタマーゼ阻害剤は、抗微生物作用を有さないが、それらはペニシリナーゼを阻害するよう機能し、したがって、半合成ペニシリンを分解から保護する。
別の種類のβ−ラクタム抗生物質として、セファロスポリンがある。それらは、細菌β−ラクタマーゼによる分解に対して感受性であり、したがって、単独では常に有効ではない。しかし、セファロスポリンは、ペニシリナーゼに対しては耐性である。それらは種々のグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である。セファロスポリンとして、それだけには限らないが、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セファマンドール、セファクロル、セファゾリン、セフロキシン(cefuroxine)、セフォキシチン、セフォタキシム、セフスロジン、セファタメト、セフィキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジンおよびモキサラクタムが挙げられる。
バシトラシンは、サブユニットを膜の外側に送達する分子からのムロペプチドサブユニットまたはペプチドグリカンの放出を阻害することによって細胞壁合成を阻害する、もう1つのクラスの抗生物質である。バシトラシンは、グラム陽性菌に対して有効であるが、その使用は、その高い毒性のために、通常、局所投与に限定される。
カルバペネムは、細胞壁合成を阻害できる、もう1つの広域スペクトルβ−ラクタム抗生物質である。カルバペネムの例として、それだけには限らないが、イミペネムが挙げられる。モノバクタムもまた、広域スペクトルβ−ラクタム抗生物質であり、ユーズトレオナム(euztreonam)を含む。ストレプトマイセスによって産生される抗生物質、バンコマイシンもまた、細胞膜合成を阻害することによってグラム陽性菌に対して有効である。
別のクラスの抗菌剤として、細胞膜阻害剤である抗菌剤がある。これらの化合物は、細菌膜の構造を壊す、またはその機能を阻害する。細胞膜阻害剤である抗菌剤に伴う1つの問題として、細菌および真核細胞の膜におけるリン脂質の類似性のために、真核細胞ならびに細菌において効果を生じ得るということがある。したがって、これらの化合物が、これらの化合物を全身に使用できるほど十分に特異的であることは稀であり、局所投与のための高用量の使用もなされない。
1種の臨床上有用な細胞膜阻害剤としてポリミキシンがある。ポリミキシンは、膜リン脂質と結合することによって膜機能を干渉する。ポリミキシンは、主にグラム陰性菌に対して有効であり、通常、重篤なシュードモナス感染症または毒性の低い抗生物質に対して耐性であるシュードモナス感染症において用いられる。この化合物の全身投与と関連する重い副作用として、腎臓および他の臓器の損傷が挙げられる。
他の細胞膜阻害剤として、全身性真菌感染症およびカンジダ酵母感染症の治療において主に用いられる抗真菌剤である、アムホテリシンBおよびナイスタチンが挙げられる。イミダゾールは、細胞膜阻害剤である別のクラスの抗生物質である。イミダゾールは、抗菌剤ならびに抗真菌剤として用いられ、例えば、酵母感染症、皮膚糸状菌感染症および全身性真菌感染症の治療のために用いられる。イミダゾールとして、それだけには限らないが、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾールが挙げられる。
多数の抗菌剤は、タンパク質合成阻害剤である。これらの化合物は、細菌が構造タンパク質および酵素を合成するのを妨げ、このようにして、細菌細胞増殖もしくは機能の阻害または細胞死を引き起こす。一般に、これらの化合物は、転写または翻訳のプロセスを干渉する。転写を遮断する抗菌剤として、それだけには限らないが、リファンピンおよびエタンブトールが挙げられる。酵素RNAポリメラーゼを阻害するリファンピンは、広域スペクトルの活性を有し、グラム陽性およびグラム陰性菌ならびに結核菌に対して有効である。エタンブトールは、結核菌に対して有効である。
翻訳を遮断する抗菌剤は、細菌リボソームを干渉して、mRNAがタンパク質に翻訳されるのを妨げる。一般に、このクラスの化合物として、それだけには限らないが、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド(例えば、エリスロマイシン)およびアミノグリコシド(例えば、ストレプトマイシン)が挙げられる。
アミノグリコシドは、細菌ストレプトマイセスによって産生される抗生物質のクラスであり、例えば、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシンおよびゲンタマイシンなどがある。アミノグリコシドは、グラム陽性およびグラム陰性菌によって引き起こされるさまざまな細菌感染症に対して用いられている。ストレプトマイシンは、結核の治療において第一次薬として広く用いられている。ゲンタマイシンは、グラム陽性およびグラム陰性菌の多数の株、例えば、シュードモナス感染に対して、特に、トブラマイシンと組み合わせて用いられる。カナマイシンは、多数のグラム陽性菌、例えば、ペニシリン耐性ブドウ球菌に対して用いられる。アミノグリコシドの臨床的な使用を制限している1つの副作用として、有効性にとって必須である投与量では、長期使用が腎臓機能を損ない、聴神経に損傷を引き起こし聴覚消失につながることがわかっている。
別の種類の翻訳阻害剤抗菌剤として、テトラサイクリンがある。テトラサイクリンは、広域スペクトルであり、種々のグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である抗生物質の一クラスである。テトラサイクリンの例として、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリンおよびクロルテトラサイクリンが挙げられる。それらは、多数の種類の細菌の治療にとって重要であるが、特に、ライム病の治療において重要である。テトラサイクリンは、それらの毒性が低いことおよび直接的な副作用が最小であることの結果として、医学界によって過剰使用および誤用され、これが問題につながっている。例えば、その過剰使用が、耐性の広い発生をもたらした。
マクロライドなどの抗菌剤は、50Sリボソームサブユニットと可逆的に結合し、ペプチジルトランスフェラーゼによるタンパク質の伸長を阻害する、もしくは細菌リボソームからの無電荷のtRNAの放出を妨げるか、その両方である。これらの化合物として、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシンおよびアジスロマイシンが挙げられる。エリスロマイシンは、ほとんどのグラム陽性菌、ナイセリア、レジオネラおよびヘモフィルスに対して活性であるが、腸内細菌科に対しては活性でない。リンコマイシンおよびクリンダマイシンは、タンパク質合成の際にペプチド結合形成を遮断し、グラム陽性菌に対して用いられる。
別の種類の翻訳阻害剤として、クロラムフェニコールがある。クロラムフェニコールは、70Sリボソームと結合して細菌酵素ペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、それによってタンパク質合成の際のポリペプチド鎖の伸長を妨げる。クロラムフェニコールに伴われる1つの重大な副作用として、再生不良性貧血がある。再生不良性貧血は、小集団(1/50,000)の患者では、細菌を治療するのに有効であるクロラムフェニコールの用量で発生する。クロラムフェニコールは、以前はよく処方された抗生物質であったが、貧血に起因する死亡の結果として今ではめったに使用されない。その有効性のために、命にかかわる状況(例えば、腸チフス)ではまだ使用されている。
いくつかの抗菌剤は、核酸合成または機能を混乱させる。例えば、DNAまたはRNAと結合し、その結果、そのメッセージが読み取られなくなる。これらとして、それだけには限らないが、キノロンおよびコトリモキサゾール(両方とも合成化学物質)およびリファマイシン(天然または半合成化学物質)が挙げられる。キノロンは、DNAジャイレース、細菌によって、その環状DNAを生成するために必要とされる酵素を阻害することによって細菌DNA複製を遮断する。それらは、広域スペクトルであり、例として、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジクス酸およびテマフロキサシンが挙げられる。ナリジクス酸は、殺菌剤であり、これはDNA複製に必須であり、スーパーコイルが解かれ、再編成されるのを可能にするDNAジャイレース酵素(トポイソメラーゼ)と結合し、DNAジャイレース活性を阻害する。ナリジクス酸の主な用途は、下部尿路感染症(UTI)の治療においてであるが、これは、UTIのよくある原因である、大腸菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌およびプロテウス種などのいくつかの種類のグラム陰性菌に対して有効であるためである。コトリモキサゾールは、スルファメトキサゾールおよびトリメトプリムの組合せであり、DNAヌクレオチドを作製するのに必要である葉酸の細菌による合成を遮断する。リファンピシンは、グラム陽性菌(例えば、結核菌および髄膜炎菌によって引き起こされる髄膜炎)およびいくつかのグラム陰性菌に対して活性であるリファマイシンの誘導体である。リファンピシンは、ポリメラーゼのβサブユニットと結合し、ポリメラーゼを活性化するのに必要な第1のヌクレオチドの付加を遮断し、それによって、mRNA合成を遮断する。
別のクラスの抗菌剤として、細菌酵素の競合阻害剤として機能する化合物がある。競合阻害剤は、細菌増殖因子とほとんどすべて構造的に類似しており、結合について競合するが、細胞において代謝機能を発揮しない。これらの化合物として、スルホンアミドおよびさらに高い、広い抗菌活性を有するスルファニルアミドの化学修飾された形が挙げられる。スルホンアミド(例えば、ガントリシンおよびトリメトプリム)は、肺炎連鎖球菌、β−溶血性連鎖球菌および大腸菌の治療にとって有用であり、大腸菌によって引き起こされた無併発性UTIの治療において、および髄膜炎菌性髄膜炎の治療において使用されている。
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内でのウイルスの複製を防ぐ化合物である。抗ウイルス薬は抗菌薬よりもずっと少ないが、これは、ウイルス複製のプロセスが、宿主細胞内のDNA複製と密接に関連しており、非特異的抗ウイルス剤が宿主にとって毒性であることが多いためである。ウイルス感染のプロセス内には、抗ウイルス剤によって遮断または阻害できるいくつかの段階がある。これらの段階として、ウイルスの宿主細胞との結合(免疫グロブリンまたは結合性ペプチド)、ウイルスの脱外被(例えば、アマンタジン)、ウイルスmRNAの合成または翻訳(例えば、インターフェロン)、ウイルスRNAまたはDNAの複製(例えば、ヌクレオシド類似体)、新規ウイルスタンパク質の成熟(例えば、プロテアーゼ阻害剤)ならびにウイルスの出芽および放出が挙げられる。
別のカテゴリーの抗ウイルス剤として、ヌクレオシド類似体がある。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドと類似しているが、不完全または異常なデオキシリボースまたはリボース基を有する合成化合物である。ヌクレオシド類似体は細胞中にあると、リン酸化され、三リン酸の形を生じ、これが、ウイルスDNAまたはRNA中への組み込みについて正常なヌクレオチドと競合する。三リン酸の形のヌクレオシド類似体が、伸長している核酸鎖中に組み込まれると、ウイルスポリメラーゼと不可逆的な結合を引き起こし、このようにして鎖が停止する。ヌクレオシド類似体として、それだけには限らないが、アシクロビル(単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの治療に用いられる)、ガンシクロビル(サイトメガロウイルスの治療にとって有用)、イドクスウリジン、リバビリン(呼吸器多核体ウイルスの治療にとって有用)、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジンおよびジドブジン(アジドチミジン)が挙げられる。
別のクラスの抗ウイルス剤として、インターフェロンなどのサイトカインが挙げられる。インターフェロンは、ウイルスに感染した細胞ならびに免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞上の特異的受容体と結合し、その細胞において、ウイルスによる感染から保護する変化を引き起こすことによって機能する。αおよびβ−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上でクラスIおよびクラスII MHC分子の発現を誘導し、宿主免疫細胞認識のための抗原提示の増大をもたらす。αおよびβ−インターフェロンは、組換え型として入手可能であり、慢性B型およびC型肝炎感染症の治療のために用いられている。インターフェロンは、抗ウイルス治療にとって有効である投与量で、発熱、倦怠および体重減少などの重大な副作用を有する。
免疫グロブリン療法は、ウイルス感染の予防のために用いられる。ウイルス感に対する免疫グロブリン療法は、細菌感染とは異なっているが、これは、むしろ抗原特異的であるためであり、免疫グロブリン療法は、細胞外ウイルス粒子と結合し、それらが、ウイルス感染に感受性である細胞と結合し、侵入することを妨げることによって機能する。この療法は、宿主中に抗体が存在する期間のウイルス感染の予防にとって有用である。概して、2種類の免疫グロブリン療法、標準免疫グロブリン療法および高度免疫グロブリン療法がある。標準免疫グロブリン療法は、正常血液ドナーの血清から調製され、プールされている抗体製剤を使用する。このプールされた製剤は、A型肝炎、パルボウイルス、エンテロウイルス(特に、新生児において)などの広範なヒトウイルスに対する低力価の抗体を含有する。高度免疫グロブリン療法は、特定のウイルスに対する高力価の抗体を有する個体の血清から調製されている抗体を使用する。そのようにして、それらの抗体を特定のウイルスに対して用いる。高度免疫グロブリンの例として、帯状疱疹免疫グロブリン(免疫無防備状態の小児および新生児における水痘の予防にとって有用な)、ヒト狂犬病免疫グロブリン(狂犬病の動物によって噛まれた対象の曝露後予防において有用な)、B型肝炎免疫グロブリン(特に、ウイルスにさらされた対象における、B型肝炎ウイルスの予防において有用な)およびRSV免疫グロブリン(呼吸器多核体ウイルス感染症の治療において有用な)が挙げられる。
抗真菌剤は、感染性真菌の治療および予防にとって有用である。抗真菌剤は、その作用機序によって分類されることがある。抗真菌剤の中には、グルコースシンターゼを阻害することによって細胞壁阻害剤として機能するものがある。これらとして、それだけには限らないが、バシウリジン(basiungin)/ECBが挙げられる。他の抗真菌剤は、膜完全性を不安定にすることによって機能する。これらとして、それだけには限らないが、イミダゾール類、例えば、クロトリマゾール、セルタコンゾール(sertaconzole)、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾールおよびボリコナコール(voriconacole)ならびにFK463、アムホテリシンB、BAY38−9502、MK991、プラディマイシン、UK292、ブテナフィンおよびテルビナフィンが挙げられる。他の抗真菌剤は、キチンを分解することによって(例えば、キチナーゼ)または免疫抑制によって(501クリーム)機能する。
寄生虫駆除剤は、寄生生物を直接死滅させる薬剤である。このような化合物は、当技術分野では公知であり、通常、市販されている。ヒト投与にとって有用な寄生虫駆除剤の例としてそれだけには限らないが、アルベンダゾール、アムホテリシンB、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、フロ酸ジロキサニド、エフロールニチン、フラゾリダオン(furazolidaone)、グルココルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタンミン(pyrimethanmine)−スルホンアミド、ピリメタンミン(pyrimethanmine)−スルファドキシン、塩酸キナクリン、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム(グルコン酸アンチモンナトリウム)、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトロプリム(trimethroprim)−スルファメトキサゾールおよびトリパルサミドが挙げられる。
ORNはまた、自己免疫疾患を治療および予防するのに有用である。自己免疫疾患は、対象自身の抗体が宿主組織と反応する、または免疫エフェクターT細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であり、組織の破壊を引き起こす疾患の一クラスである。したがって、免疫応答が、自己抗原と呼ばれる対象自身の抗原に対して開始される。自己免疫疾患として、それだけには限らないが、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症(MG)、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天然痘(例えば、尋常性天疱瘡)、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合性結合組織疾患、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎(例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎)、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性および自己免疫糖尿病が挙げられる。
「自己抗原」とは、本明細書において用いる場合、正常な宿主組織の抗原を指す。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。したがって、自己抗原に対して開始される免疫応答は、自己免疫疾患との関連で、望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷の一因となっているのに対し、癌抗原に対して開始される免疫応答は、望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊の一因となっている。したがって、自己免疫障害を治療することを目的とする本発明のいくつかの態様では、ORNが、自己抗原、特に、自己免疫障害の標的であるものとともに投与されることは推奨されない。
他の例では、ORNは、低用量の自己抗原とともに送達されてもよい。いくつかの動物研究によって、低用量の抗原の粘膜投与が、免疫反応低下または「耐性」という状態をもたらし得ることが実証された。活性機構は、Th1から主にTh2およびTh3反応(すなわち、TGF−β支配された)への、サイトカイン媒介性免疫偏向であると思われる。低用量抗原送達を用いる活性抑制はまた、無関係な、免疫応答を抑制する場合があり(傍観者抑制)、これは自己免疫疾患、例えば、関節リウマチおよびSLEの治療においてかなり注目される。傍観者抑制は、炎症誘発性およびTh1サイトカインが、抗原特異的または抗原非特異的のいずれかで放出される局所環境におけるTh1−対抗制御的サプレッサー、サプレッサーサイトカインの分泌を伴う。「耐性」とは、本明細書において用いる場合、この現象を指すよう用いられる。実際、経口耐性は、動物におけるいくつかの自己免疫疾患、例えば、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)、実験的自己免疫重症筋無力症、コラーゲン誘導性関節炎(CIA)およびインスリン依存性糖尿病の治療において有効であった。これらのモデルでは、自己免疫疾患の予防および抑制は、Th1からTh2/Th3反応への抗原特異的体液性および細胞性反応のシフトと関連している。
本発明の組成物および方法は、単独で使用してもよく、癌の治療にとって有用である他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、癌の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、癌の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、癌の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、癌の対象に有効量の本発明の組成物および抗癌療法を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、対象において癌を治療する医薬を調製するための、本発明の免疫刺激性ORNの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌の治療にとって有用な組成物を提供する。この態様の組成物は、本発明の免疫刺激性ORNおよび癌医薬を含む。
癌の対象とは、検出可能な癌性細胞の対象である。癌は、悪性である場合も、非悪性癌である場合もある。「癌」とは、本明細書において用いる場合、身体の臓器および系が正常に機能することを干渉する、細胞の制御されない増殖を指す。その本来の位置から移動し、重要臓器に播種する癌は、罹患した臓器の機能低下によって、最終的に対象の死亡を導き得る。白血病などの造血系癌は、対象中の正常な造血区画を打ち負かすことができ、それによって、造血不全(貧血、血小板減少症および好中球減少症の形)をもたらし、最終的に、死亡を引き起こす。
転移は、原発腫瘍から身体の他の部分への癌細胞の播種に起因する、原発腫瘍位置とは別個の癌細胞の領域である。原発腫瘍量の診断時に、対象は、転移の存在についてモニターされ得る。転移は、核磁気共鳴画像(MRI)スキャン、コンピュータ断層撮影法(CT)スキャン、血液および血小板カウント、肝臓機能検査、胸部X線および骨スキャンならびに特定の症状のモニタリングの単独または併用使用で最も多く検出される。
癌として、それだけには限らないが、基底細胞癌、胆道癌;膀胱癌;骨癌;脳および中枢神経系(CNS)癌;乳癌;子宮頸癌;絨毛癌;結腸および直腸癌;結合組織癌;消化系の癌;子宮内膜癌;食道癌;眼の癌;頭頸部の癌;上皮内新生物;腎臓癌;喉頭癌;白血病;肝臓癌;肺癌(例えば、小細胞および非小細胞);リンパ腫、例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫;黒色腫;骨髄腫;神経芽細胞腫;口腔癌(例えば、口唇、舌、口腔および咽頭);卵巣癌;膵臓癌;前立腺癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;直腸癌;呼吸器系の癌;肉腫;皮膚癌;胃癌;精巣癌;甲状腺癌;子宮癌;尿路系の癌ならびに他の癌腫、腺癌および肉腫が挙げられる。
本発明の免疫刺激性組成物はまた、抗癌療法とともに投与してもよい。抗癌療法として、癌医薬、放射線および外科手術が挙げられる。本明細書において用いる場合、「癌医薬」とは、癌を治療する目的で対象に投与される薬剤を指す。本明細書において用いる場合、「癌を治療する」とは、癌の発生を予防すること、癌の症状を低減すること、および/または確立した癌の成長を阻害することを含む。他の態様では、癌医薬は、癌を発症するリスクがある対象に、癌を発症するリスクを低減する目的で投与される。癌の治療のための種々の種類の医薬が本明細書に記載されている。この明細書の目的上、癌医薬は、化学療法薬、免疫治療薬、癌ワクチン、ホルモン療法および生物反応修飾物質として分類される。
化学療法薬は、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含有しないクロロエチルニトロソウレア、5−フルオロウラシル、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン(fragyline)、メグラミン(Meglamine)GLA、バルルビシン、カルムスタイン(carmustaine)およびポリフェルポサン(poliferposan)、MMI270、BAY12−9566、RASファメシル(famesyl)トランスフェラーゼ阻害剤、ファメシル(famesyl)トランスフェラーゼ阻害剤、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメテキソール(Lometexol)、グラモレック(Glamolec)、CI−994、TNP−470、ハイカムチン/トポテカン、PKC412、バルスポダール(Valspodar)/PSC833、ノバントロン(Novantrone)/ミトロキサントロン(Mitroxantrone)、メタレット(Metaret)/スラミン、バチマスタット、E7070、BCH−4556、CS−682、9−AC、AG3340、AG3433、インセル(Incel)/VX−710、VX−853、ZD0101、ISI641、ODN698、TA2516/マルミスタット(Marmistat)、BB2516/マルミスタット(Marmistat)、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、レモナール(Lemonal)DP2202、FK317、ピシバニール/OK−432、AD32/バルルビシン、メタストロン(Metastron)/ストロンチウム誘導体、テモダール(Temodal)/テモゾロミド、エバセット(Evacet)/リポソームドキソルビシン、ユータキサン(Yewtaxan)/パクリタキセル、タキソール/パクリタキセル、キセロード(Xeload)/カペシタビン、フルツロン/ドキシフルリジン、シクロパックス(Cyclopax)/経口パクリタキセル、経口タキソイド、SPU−077/シスプラチン、HMR1275/フラボピリドール、CP−358(774)/EGFR、CP−609(754)/RAS癌遺伝子阻害剤、BMS−182751/経口白金、UFT(テガフール/ウラシル)、エルガミゾール(Ergamisol)/レバミソール、エニルウラシル/776C85/5FUエンハンサー、カンプト(campto)/レバミソール、カンプトサル(camptosar)/イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)/ラリトレキセド(Ralitrexed)、ロイスタチン/クラドリビン、パキセックス(Paxex)/パクリタキセル、ドキシル/リポソームドキソルビシン、カエリクス(Caelyx)/リポソームドキソルビシン、フルダラ/フルダラビン、ファルマルビシン(Pharmarubicin)/エピルビシン、デポサイト、ZD1839、LU79553/ビス−ナフタリミド(Naphtalimide)、LU103793/ドラスタイン(Dolastain)、カエチクス(Caetyx)/リポソームドキソルビシン、ジェムザール/ゲムシタビン、ZD0473/アノルメド(Anormed)、YM116、ヨウ素シード、CDK4およびCDK2阻害剤、PARP阻害剤、D4809/デキシフォサミド(Dexifosamide)、イフェス(Ifes)/メスネックス(Mesnex)/イフォサミド(Ifosamide)、ブモン(Vumon)/テニポシド、パラプラチン/カルボプラチン、プランチノール(Plantinol)/シスプラチン、ベプシド/エトポシド、ZD9331、タキソテール/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェラン(melphelan)およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル(Chlorombucil)、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド(VP16−213)、フロクスウリジン、フルオロウラシル(5−FU)、フルタミド、ヒドロキシ尿素(ヒドロキシカルバミド)、イホスファミド、インターフェロンα−2a、α−2b、酢酸ロイプロリド(LHRH放出因子類似体)、ロムスチン(CCNU)、塩酸メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン(o.p’−DDD)、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン(m−AMSA)、アザシチジン、エルスロポエチン(Erthropoietin)、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン2、ミトグアゾン(メチル−GAG;メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン;MGBG)、ペントスタチン(2’デオキシコホルマイシン)、セムスチン(メチル−CCNU)、テニポシド(VM−26)および硫酸ビンデシンからなる群から選択され得るが、そのように限定されるものではない。
免疫治療薬は、3622W94、4B5、ANA Ab、抗FLK−2、抗VEGF、ATRAGEN、AVASTIN(ベバシズマブ;Genentech)、BABS、BEC2、BEXXAR(トシツモマブ;GlaxoSmithKline)、C225、CAMPATH(アレムツズマブ;Genzyme Corp.)、CEACIDE、CMA676、EMD−72000、アービタックス(セツキシマブ;ImClone Systems、Inc.)、グリオマブ(Gliomab)−H、GNI−250、ヘルセプチン(トラスツズマブ;Genentech)、IDEC−Y2B8、ImmuRAIT−CEA、ior c5、ior egf.r3、ior t6、LDP−03、リンホシド(LymphoCide)、MDX−11、MDX−22、MDX−210、MDX−220、MDX−260、MDX−447、MELIMMUNE−1、MELIMMUNE−2、モノファーム(Monopharm)−C、NovoMAb−G2、オンコリム(Oncolym)、OV103、オバレックス(Ovarex)、パノレックス(Panorex)、プレターゲット(Pretarget)、クアドラメット、リブタキシン(Ributaxin)、リツキサン(リツキシマブ;Genentech)、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、SMART M195、TNTおよびZENAPAX(ダクリズマブ;Roche)からなる群から選択され得るが、そのように限定されるものではない。
癌ワクチンは、EGF、抗イディオタイプ癌ワクチン、Gp75抗原、GMK黒色腫ワクチン、MGVガングリオシドコンジュゲートワクチン、Her2/neu、Ovarex、M−Vax、O−Vax、L−Vax、STn−KHLセラトープ(theratope)、BLP25(MUC−1)、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン(Melacine)、ペプチド抗原ワクチン、毒素/抗原ワクチン、MVAベースのワクチン、PACIS、BCGワクチン、TA−HPV、TA−CIN、DISCウイルスおよびイムシスト/テラシス(TheraCys)からなる群から選択され得るが、そのように限定されるものではない。
本発明の組成物および方法は、単独で使用してもよく、アレルギーの治療にとって有用な他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、アレルギー状態の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、アレルギー状態の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、アレルギー状態の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、アレルギー状態の対象に有効量の本発明の組成物および抗アレルギー療法を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、対象においてアレルギー状態を治療する医薬を調製するための、本発明の免疫刺激性ORNの使用を提供する。
一態様では、本発明は、アレルギー状態の治療にとって有用な組成物を提供する。この態様の組成物は、本発明の免疫刺激性ORNおよびアレルギー医薬を含む。
「アレルギー状態の対象」とは、アレルゲンに応じてアレルギー反応を現在起こしている、またはかつて起こした対象を指すものとする。「アレルギー状態」または「アレルギー」とは、物質(アレルゲン)に対する後天性の過敏症を指す。アレルギー状態として、それだけには限らないが、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、じんま疹(urticaria)(じんま疹(hives))および食物アレルギー、他のアトピー状態、例えば、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、薬物アレルギーおよび血管性浮腫が挙げられる。
アレルギーは、通常、アレルゲンに対する、特定のクラスの免疫グロブリン、IgEからの抗体の産生を伴う一時的な状態である。一般的な空気アレルゲンに対するIgE媒介性応答の発生もまた、喘息の発生に向けての素因を示す因子である。アレルゲンが、好塩基球(血液中を循環している)または肥満細胞(固体組織中に分散している)の表面上のIgE Fc受容体(FcεR)と結合している特異的IgEと遭遇すると、この細胞は活性化となり、ヒスタミン、セロトニンおよび脂質性メディエーターなどのメディエーターの産生および放出をもたらす。
アレルギー反応は、組織を感作するIgE型の免疫グロブリンが、外来アレルゲンと反応すると起こる。IgE抗体は、肥満細胞および/または好塩基球と結合しており、これらの特殊化した細胞は、アレルゲンが抗体分子の末端を架橋することによって放出するよう刺激されると、アレルギー反応のケミカルメディエーター(血管作動性アミン)を放出する。ヒスタミン、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝産物およびセロトニンは、中でも、ヒトにおけるアレルギー反応の最も知られたメディエーターである。ヒスタミンおよび他の血管作動性アミンは、通常、肥満細胞および好塩基球白血球に貯蔵されている。肥満細胞は、動物組織中に分散しており、好塩基球は脈管系内を循環している。これらの細胞はヒスタミンを製造し、IgE結合を伴う特定化された一連の事象が生じて、その放出を引き起こさない限り細胞内に貯蔵する。
アレルギー反応の症状は、IgEが抗原と反応する身体内の位置に応じて変わる。反応が、呼吸器上皮に沿って起こる場合、症状は、通常、くしゃみ、咳および喘息性反応である。食物アレルギーの場合におけるように、消化管において相互作用が起こる場合、腹痛および下痢が一般的である。例えば、蜂刺傷またはアレルギー性対象へのペニシリンの投与後の全身性アレルギー反応は、重篤である場合があり、命にかかわることも多い。
アレルギーは、少なくとも幾分かは、Th2サイトカインIL−4およびIL−5ならびにIgEへの抗体アイソタイプ転換を特徴とするTh2型の免疫応答と関連している。Th1およびTh2免疫応答は、相互に対抗制御的であり、その結果、Th1型の免疫応答に向けた免疫応答の歪みは、アレルギーを含むTh2型免疫応答を予防または寛解し得る。したがって、本発明の免疫刺激性ORNは、アレルギー状態の対象を治療するのにそれ自体で有用であるが、これは、免疫刺激性ORNが、免疫応答を、Th1型の免疫応答に向けて歪めることができるからである。あるいは、またはさらに、本発明の免疫刺激性ORNは、アレルギー状態の対象を治療するために、アレルゲンと組み合わせて使用してもよい。
本発明の免疫刺激性組成物はまた、抗アレルギー療法とともに投与してもよい。アレルギーを治療または予防するための従来法は、アレルギー医薬の使用または脱感作療法を伴うものであった。アレルギーを治療または予防するための発展的療法の中には、抗IgE抗体の中和の使用が含まれる。抗ヒスタミン剤およびアレルギー反応のケミカルメディエーターの効果を遮断する他の薬物は、アレルギー症状の重篤度を調節するのに役立つが、アレルギー反応を予防することはなく、その後のアレルギー反応に対して効果がない。脱感作療法は、アレルゲンに対するIgG型反応を誘導するために、小用量のアレルゲンを、通常、注射によって皮膚下に投与することによって実施される。IgG抗体の存在は、IgE抗体の誘導に起因するメディエーターの産生を中和するのに役立つと考えられている。最初に、対象は、重篤な反応を誘導することを避けるために極めて低用量のアレルゲンで治療され、この用量をゆっくりと増大させる。この種の治療は、対象が、アレルギー反応を引き起こす化合物を実際に投与され、重大なアレルギー反応が結果として起こり得るので危険である。
アレルギー医薬として、それだけには限らないが、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイドおよびプロスタグランジン誘導因子が挙げられる。抗ヒスタミン剤は、肥満細胞または好塩基球によって放出されるヒスタミンに対抗する化合物である。これらの化合物は、当技術分野で周知であり、アレルギーの治療のためによく用いられる。抗ヒスタミン剤として、それだけには限らないが、アクリバスチン、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、ベタタスチン(betatastine)、ブロムフェニラミン、ブクリジン、セチリジン、セチリジン類似体、クロルフェニラミン、クレマスチン、CS560、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスクロルフェニラミン、エバスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、HSR609、ヒドロキシジン、レボカバスチン、ロラチジン(loratidine)、メトスコポラミン、ミゾラスチン、ノラステミゾール(norastemizole)、フェニンダミン、プロメタジン、ピリラミン、テルフェナジンおよびトラニラストが挙げられる。
コルチコステロイドとして、それだけには限らないが、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾンおよびトリアムシノロンが挙げられる。デキサメタゾンは、抗炎症作用を有するコルチコステロイドであるが、通常は、吸入型ではアレルギーまたは喘息の治療に用いられないが、これは、高度に吸収され、有効用量で長期の抑制性副作用を有するためである。しかし、デキサメタゾンは、アレルギーまたは喘息を治療するために本発明に従って使用してよいが、これは、本発明の組成物と組み合わせて投与される場合に、副作用を低減するために低用量で投与できるからである。コルチコステロイド使用に伴う副作用の中には、咳、発声障害、経口口腔カンジダ症(カンジダ症)、および高用量では、副腎抑制、グルコース不耐性、骨粗しょう症、骨の無菌性壊死、白内障形成、成長抑制、高血圧症、筋力低下、皮膚菲薄化およびあざができやすいことなどの全身性効果がある。Barnes&Peterson(1993年)Am Rev Respir Dis148:S1〜S26;およびKamada AKら(1996年)Am J Respir Crit Care Med 153:1739〜48頁。
本発明の組成物および方法は単独で使用してもよく、喘息の治療にとって有用である他の薬剤および方法とともに使用してもよい。一態様では、本発明は、喘息の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、喘息の対象に有効量の本発明の組成物を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、喘息の対象を治療する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、喘息の対象に有効量の本発明の組成物および抗喘息療法を投与して対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、対象において喘息を治療する医薬を調製するための、本発明の免疫刺激性ORNの使用を提供する。
一態様では、本発明は、喘息の治療にとって有用な組成物を提供する。この態様による組成物は、本発明の免疫刺激性ORNおよび喘息医薬を含む。
「喘息」とは、本明細書において用いる場合、気道の炎症および狭小化、および吸入物質に対する気道の反応性の増大を特徴とする、呼吸器系の障害を指す。喘息は、アトピーまたはアレルギー状態と関連していることが多いが、それに限らない。喘息の症状として、気流閉塞に起因する、喘鳴音の再発性エピソード、息切れ、胸部絞扼感および咳が挙げられる。喘息と関連する気道炎症は、気道上皮の裸出、基底膜の真下のコラーゲン沈着、浮腫、肥満細胞活性化、好中球、好酸球およびリンパ球を含む炎症細胞浸潤などのいくつかの生理学的変化の観察によって検出できる。気道炎症の結果として、喘息患者は、気道応答性亢進、気流制限、呼吸器症状および疾患慢性化を起こすことが多い。気流制限は、急性気管支収縮、気道浮腫、粘液栓形成および気道リモデリング、気管支閉塞につながることが多い特徴を含む。喘息の症例の中には、基底膜下繊維症が起こり、肺機能の持続性の異常につながる場合がある。
過去数年にわたる研究によって、喘息は、炎症細胞、メディエーターならびに気道中に常在する他の細胞および組織間の複雑な相互作用に起因する可能性があるということが示された。肥満細胞、好酸球、上皮細胞、マクロファージおよび活性化されたT細胞はすべて、喘息と関連する炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。Djukanovic Rら(1990年)Am Rev Respir Dis142:434〜457頁。これらの細胞は、局所組織に直接または間接的に作用し得る、前もって作られた、および新規に合成されたメディエーターの分泌によって気道機能に影響を及ぼし得ると考えられている。また、Tリンパ球の部分集団(Th2)が、選択的サイトカインを放出することによる気道におけるアレルギー性炎症の調節および疾患慢性化の確立において重要な役割を果たしていることが認識されている。Robinson DSら(1992年)N Engl J Med326:298〜304頁。
喘息は、発達の種々の段階で生じる複合障害であり、症状の程度に基づいて、急性、亜急性または慢性として分類できる。急性炎症反応は、気道への細胞の初期動員と関連している。亜急性炎症反応は、より持続的な炎症パターンを引き起こす、細胞の動員ならびに常在する細胞の活性化を伴う。慢性炎症反応は、持続レベルの細胞損傷と進行中の修復プロセスを特徴とし、これは気道に永続的な異常をもたらし得る。
「喘息の対象」とは、炎症および気道の狭小化および吸入物質に対する気道の反応性の増大を特徴とする呼吸器系の障害の対象である。喘息の開始と関連する因子として、それだけには限らないが、アレルゲン、低温、運動、ウイルス感染およびSO2が挙げられる。
上記のように、喘息は、少なくとも幾分かは、Th2サイトカインIL−4およびIL−5ならびにIgEへの抗体アイソタイプ転換を特徴とする、Th2型の免疫応答と関連している可能性がある。Th1およびTh2免疫応答は、相互に対抗制御的であり、その結果、Th1型の免疫応答に向けた免疫応答の歪みは、アレルギーを含むTh2型の免疫応答を予防または寛解し得る。したがって、本発明の修飾されたオリゴリボヌクレオチド類似体は、喘息の対象を治療するのにそれ自体で有用であるが、これは、類似体が、免疫応答を、Th1型の免疫応答に向けて歪めることができるからである。あるいは、またはさらに、本発明の修飾されたオリゴリボヌクレオチド類似体は、喘息の対象を治療するために、アレルゲンと組み合わせて使用してもよい。
本発明の免疫刺激性組成物はまた、喘息治療とともに投与してもよい。喘息を治療または予防するための従来法は、抗アレルギー療法(上記)およびいくつかの他の薬剤、例えば、吸入物質の使用を伴うものであった。
喘息の治療のための薬物は、通常、2つのカテゴリー、急速解放薬物および長期制御薬物に分けられる。喘息患者は、長期制御薬物を毎日のように服用して、持続的喘息の制御を達成および維持する。長期制御薬物として、コルチコステロイド、クロモリン(chromolyn)ナトリウムおよびネドクロミルなどの抗炎症薬、長期作用性β2−アゴニストおよびメチルキサンチンなどの長期作用性気管支拡張薬およびロイコトリエンモディファイヤーが挙げられる。急速救援薬物として、短期作用性β2−アゴニスト、抗コリン作動薬および全身性コルチコステロイドが挙げられる。これらの薬物の各々に伴う多数の副作用があり、単独または組み合わせたこれらの薬物のうち、喘息を予防または完全に治療できるものはない。
喘息医薬として、それだけには限らないが、PDE−4阻害剤、気管支拡張薬/β−2アゴニスト、K+チャネルオープナー、VLA−4アンタゴニスト、ニューロキンアンタゴニスト、トロンボキサンA2(TXA2)合成阻害剤、キサンチン、アラキドン酸アンタゴニスト、5リポキシゲナーゼ阻害剤、TXA2受容体アンタゴニスト、TXA2アンタゴニスト、5−リポックス(lipox)活性化タンパク質の阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
気管支拡張薬/β2アゴニストは、気管支拡張または平滑筋弛緩を引き起こす化合物の一クラスである。気管支拡張薬/β2アゴニストとして、それだけには限らないが、サルメテロール、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、D2522/フォルモテロール、フェノテロール、ビトルテロール、ピルブエロール(pirbuerol)メチルキサンチンおよびオルシプレナリンが挙げられる。長期作用性β2アゴニストおよび気管支拡張薬は、抗炎症治療に加えて症状の長期予防のために用いられる化合物である。長期作用性β2アゴニストとして、それだけには限らないが、サルメテロールおよびアルブテロールが挙げられる。これらの化合物は、通常、コルチコステロイドと組み合わせて用いられ、一般に、炎症治療を全く伴わずには用いられない。それらは、頻脈、骨格筋振戦、低カリウム血症および過剰摂取におけるQTc間隔の延長などの副作用を伴うことがあった。
例えば、テオフィリンをはじめとするメチルキサンチンは、症状の長期制御および予防のために用いられてきた。これらの化合物は、ホスホジエステラーゼ阻害およびおそらくはアデノシン拮抗作用に起因する気管支拡張を引き起こす。用量関連性急性毒性は、これらの種類の化合物に伴う個々の問題である。結果として、日常的な血清濃度をモニターして、毒性および代謝クリアランスにおける個々の相違から生じる狭い治療範囲を明らかにしなくてはならない。副作用として、頻脈、頻脈性不整脈、悪心および嘔吐、中枢神経系刺激、頭痛、発作、吐血、高血糖症および低カリウム血症が挙げられる。短期作用性β2アゴニストとして、それだけには限らないが、アルブテロール、ビトルテロール、ピルブテロールおよびテルブタリンが挙げられる。短期作用性β2アゴニストの投与と関連する有害作用の中には、頻脈、骨格筋振戦、低カリウム血症、乳酸増加、頭痛および高血糖症が含まれる。
クロモリン(Chromolyn)ナトリウムおよびネドクロミルは、主として、運動から生じる喘息症状またはアレルゲンから生じるアレルギー症状を予防するために長期制御薬物として用いられる。これらの化合物は、クロライドチャネル機能を干渉することによって、アレルゲンに対する初期および後期反応を遮断すると考えられている。それらはまた、肥満細胞膜を安定化し、イノシネオフィル(inosineophils)および上皮細胞の活性化およびそれらからのメディエーターの放出を阻害する。通常、最大の利益を達成するのに4〜6週の投与期間が必要である。
抗コリン作動薬は、通常、急性気管支痙攣の解放のために用いられる。これらの化合物は、ムスカリン性コリン受容体の競合阻害によって機能すると考えられている。抗コリン作動薬として、それだけには限らないが、臭化イプラトロピウムが挙げられる。これらの化合物は、コリン作動性に媒介される気管支痙攣のみを逆転させるが、抗原に対する反応は全く改変しない。副作用として、口腔および呼吸器分泌物の乾燥、個体によっては喘鳴音の増大および眼に噴霧された場合のかすみ目が挙げられる。
本発明の免疫刺激性ORNはまた、気道リモデリングを治療するのに有用であり得る。気道リモデリングは、平滑筋細胞増殖および/または気道における粘膜下肥厚に起因し、最終的に、気道の狭小化を引き起こし、気流の制限につながる。本発明の免疫刺激性ORNは、さらなるリモデリングを防ぐことができ、リモデリングプロセスに起因する組織発達をさらに低減する可能性がある。
本発明の免疫刺激性ORNはまた、樹状細胞の生存、分化、活性化および成熟を改善するのに有用である。免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドは、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化および成熟を促進する独特の能力を有する。
本発明の免疫刺激性ORNはまた、ナチュラルキラー細胞溶解活性および抗体依存性細胞傷害(ADCC)を増加させる。ADCCは、免疫刺激性ORNを、細胞標的、例えば、癌細胞に対して特異的な抗体と組み合わせて用いて実施できる。免疫刺激性ORNが対象に抗体とともに投与される場合、対象の免疫系は、腫瘍細胞を死滅させるよう誘導される。ADCC手順において有用な抗体として、身体中の細胞と相互作用する抗体が挙げられる。細胞標的に対して特異的な多数のこのような抗体は、当技術分野では記載されており、多くが市販されている。一実施形態では、抗体は、IgG抗体である。
特定の態様では、本発明は、エピトープ拡散を増強する方法を提供する。「エピトープ拡散」とは、本明細書において用いる場合、自己または外来タンパク質に対して向けられた、最初に焦点が当てられたドミナントエピトープ特異的免疫応答から、サブドミナントおよび/またはそのタンパク質上の(分子内拡散)または他のタンパク質上の(分子間拡散)潜在性エピトープへのエピトープ特異性の多様化を指す。エピトープ拡散は、多重エピトープ特異的免疫応答をもたらす。
免疫応答は、自己免疫疾患におけるように有害であり得る、または、ワクチン接種におけるように有益であり得る最初の拡大相と、免疫系をホメオスタシスに戻し、記憶を作製する後のダウンレギュレート相とからなる。エピトープ拡散は、両相の重要な成分であり得る。腫瘍の環境におけるエピトープ拡散の増強によって、対象の免疫系が、元の治療プロトコールに応じてでは、免疫系によって最初に認識されていない、さらなる標的エピトープを決定することが可能となり、腫瘍集団中のエスケープ変異体の可能性を低減し、このようにして疾患の進行に影響を及ぼす。
本発明のオリゴリボヌクレオチドは、治療上有益な適応症、例えば、癌、ウイルスおよび細菌感染症ならびにアレルギーにおいてエピトープ拡散を促進するのに有用であり得る。本方法は、一実施形態では、対象に、抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与し、続いて、対象に、少なくとも2用量の、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。本方法は、一実施形態では、対象に、腫瘍抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与し、続いて、対象に、少なくとも2用量の、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導するのに有効な量の本発明の免疫刺激性ORNを投与するステップを含む。本方法は、一実施形態では、対象における免疫系抗原曝露と、それに続く、本発明の免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドの少なくとも2回の投与をもたらし、多重エピトープ特異的免疫応答を誘導する、すなわち、エピトープ拡散を促進する治療プロトコールを適用することを伴う。種々の実施形態では、治療プロトコールは、手術、放射線、化学療法、他の癌医薬、ワクチンまたは癌ワクチンである。
治療プロトコールは、免疫賦活薬、さらにその後の免疫賦活薬治療とともに実施され得る。例えば、治療プロトコールがワクチンである場合、アジュバントとともに投与してもよい。ワクチンとアジュバントの組合せは、混合物であってもよく、別個の投与、すなわち、注射(すなわち、同一のドレナージ領域)であってもよい。投与は、必ずしも同時でなくてもよい。非同時注射を用いる場合、タイミングは、アジュバントのプレ注射と、それに続くワクチン製剤の注射を伴い得る。
治療プロトコールが実施された後に、免疫賦活薬単剤療法が始まる。投与の最適化された頻度、期間および部位は、標的および他の因子に応じて変わるが、例えば、6カ月から2年の間の、1カ月に一度から2カ月に一度の投与であり得る。あるいは、投与は1日1回、週1回または2週間に1回であってもよく、または投与は、1日、1週または1カ月に複数回であってもよい。いくつかの例では、投与期間は、治療の長さに応じて変わる場合があり、例えば、1週間後、1カ月後、1年後、または複数年後に終了する場合がある。他の例では、単剤療法は、静脈内点滴を用いた場合のように連続であり得る。免疫賦活薬は、標的と共通するドレナージ領域に投与してもよい。
治療において使用するには、化合物の活性、投与方法、免疫化の目的(すなわち、予防または治療)、障害の性質および重篤度、対象の年齢および体重に応じて、対象の治療のために種々の用量が必要であり得る。所与の用量の投与は、個々の用量単位、あるいは数回の、より少ない用量単位の形での単独投与の両方によって実施できる。数週間または数カ月離れた指定の間隔での用量の複数回投与は、抗原特異的免疫応答をブーストするために、よくあることである。
種々の活性化合物の中から選択することおよび効力、相対バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤度−効果および好ましい投与様式などの因子を検討することによって、本明細書に提供される教示を組み合わせると、実質的な毒性を引き起こさないが、特定の対象を治療するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的治療計画を計画できる。任意の特定の適用にとって有効な量は、治療されている疾患もしくは状態、投与されている特定の治療薬、対象の大きさまたは疾患もしくは状態の重篤度のような因子に応じて変わり得る。当業者ならば、過度の実験を必要とすることなく、特定の核酸および/または他の治療薬の有効量を経験的に決定することができる。
本明細書に記載される化合物の対象用量は、通常、約0.1μg〜10,000mg、より通常は、約1μg/日〜8000mg、最も通常は、約10mg〜100mgの範囲である。対象の体重でいうと、通常の投与量は、約0.1μg〜20mg/kg/週(投与は、普通、週1回与えられてもよく、数日離れて与えられる2つ以上の用量に分割されてもよい)、より通常は、約0.1〜10mg/kg/週、最も通常は、約1〜5mg/kg/週の範囲である。
核酸および/または他の化合物を含有する医薬組成物は、薬物を投与するための任意の適した投与経路によって投与してよい。種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、もちろん、選択された特定の薬剤または複数の薬剤、治療されている特定の状態および治療効力に必要な投与量に応じて変わる。本発明の方法は、一般的に言えば、臨床上許容されない有害作用を引き起こさずに有効なレベルの免疫応答を生じさせる任意の様式を意味する、医学的に許容される任意の投与様式を用いて実施できる。好ましい投与様式は、本明細書に開示されている。治療において使用するために、薬剤を所望の表面、例えば、粘膜、全身に送達する任意の様式によって、核酸および/または他の治療薬の有効量を対象に投与できる。
本発明の医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段によって達成してよい。投与経路として、それだけには限らないが経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼、経膣および直腸が挙げられる。喘息またはアレルギーの治療または予防には、このような化合物は全身経路によって吸入、経口摂取または投与されることが好ましい。全身経路として、経口および非経口が挙げられる。いくつかの実施形態では、肺、主として喘息患者における炎症部位への直接送達のために吸入薬物が好ましい。吸入による投与には、いくつかの種類の装置が普通は使用される。こういった種類の装置として、定量吸入器(MDI)、呼吸作動性(breath−actuated)MDI、乾燥粉末吸入器(DPI)、MDIと組み合わせたスペーサー/ホールディングチャンバーおよび噴霧器が挙げられる。
本発明の治療薬は、ベクターを頼りに、特定の組織、細胞種に、または免疫系に、またはその両方に送達できる。広い意味では、ベクターは、組成物の標的細胞への輸送を促進することが可能な任意のビヒクルである。ベクターは、一般に、免疫刺激性核酸、抗体、抗原、および/または障害特異的医薬を、ベクターの不在下でもたらす分解の程度と比較して少ない分解で標的細胞に輸送する。
一般に、本発明において有用なベクターは、2つのクラス:生物学的ベクターおよび化学的/物理的ベクターに分けられる。生物学的ベクターおよび化学的/物理的ベクターは、本発明の治療薬の送達および/または取り込みにおいて有用である。
ほとんどの生物学的ベクターは、核酸の送達のために用いられ、これは、免疫刺激性核酸である、または免疫刺激性核酸を含む治療薬の送達において最も適当である。
本明細書に論じられる生物学的ベクターに加え、化学的/物理的ベクターを使用して、免疫刺激性核酸、抗体、抗原および障害特異的医薬をはじめとする治療薬を送達できる。本明細書において用いる場合、化学的/物理的ベクターは、細菌学的またはウイルス供給源に由来するもの以外の、核酸および/または他の医薬を送達できる天然または合成分子を指す。
本発明の好ましい化学的/物理的ベクターは、コロイド分散系である。コロイド分散系として、脂質ベースの系、例えば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームが挙げられる。本発明の好ましいコロイド系として、リポソームがある。リポソームは、in vivoまたはin vitroにおいて送達ベクターとして有用である人工膜容器である。大きさが0.2〜4.0μmの範囲である大きな単層リポソーム(LUV)は、大きな高分子を被包できることがわかっている。RNA、DNAおよび無傷のウイルス粒子は、水性内部に被包され、生物学的に活性な形で細胞に送達され得る。Fraleyら(1981年)Trends Biochem Sci6:77頁。
リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドとカップリングすることによって、リポソームを特定の組織にターゲッティングできる。リポソームを免疫細胞にターゲッティングするのに有用であり得るリガンドとして、それだけには限らないが以下が挙げられる:免疫細胞特異的受容体と相互作用する無傷の分子または分子の断片および免疫細胞の細胞表面マーカーと相互作用する抗体などの分子。このようなリガンドは、当業者に周知の結合アッセイによって容易に同定できる。さらに他の実施形態では、リポソームは、上記で論じたリポソームを免疫治療用抗体の1種とカップリングすることによって癌をターゲッティングできる。さらに、ベクターは、核ターゲッティングペプチドとカップリングさせてもよく、これによってベクターは宿主細胞の核に向かう。
トランスフェクションのための脂質製剤は、例えば、EFFECTENE(商標)(特定のDNA濃縮エンハンサーを含む非リポソーム脂質)およびSUPERFECT(商標)(新規作用性デンドリマー技術)としてQIAGENから市販されている。
リポソームは、例えば、N−[1−(2,3ジオレイルオキシ)−プロピル]−N、N、N−トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)などのカチオン性脂質から形成される、LIPOFECTIN(商標)およびLIPOFECTACE(商標)としてGibco BRLから市販されている。リポソームを作製する方法は、当技術分野で周知であり、多数の刊行物に記載されている。リポソームはまた、Gregoriadis G(1985年)Trends Biotechnol3:235〜241頁に概説されている。
特定のカチオン性脂質、例えば、特に、N−[1−(2,3ジオレオイルオキシ)−プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチル−硫酸塩(DOTAP)は、本発明の修飾されたオリゴリボヌクレオチド類似体と組み合わせた場合に、特に有利であると思われる。
一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類レシピエントへの移植または投与に適している生体適合性微粒子またはインプラントである。この方法に一致して有用である例示的生体内分解性インプラントが、PCT国際出願番号PCT/US/03307(「Polymeric Gene Delivery System」と題された公開番号WO95/24929、に記載されている。PCT/US/0307には、外因性遺伝子を適当なプロモーターの制御下に含有するための、生体適合性、好ましくは、生分解性ポリマーマトリックスが記載されている。ポリマーマトリックスを使用して、対象において、治療薬の持続放出を達成できる。
ポリマーマトリックスは、ミクロスフェア(これでは、核酸および/または他の治療薬は固体ポリマーマトリックス中に分散されている)またはマイクロカプセル(これでは、核酸および/または他の治療薬が、ポリマーシェルのコア中に保存されている)などの微粒子の形であることが好ましい。治療薬を含有するためのポリマーマトリックスの他の形として、フィルム、コーティング、ゲル、インプラントおよびステントが挙げられる。ポリマーマトリックス装置の大きさおよび組成は、マトリックスが導入される組織において好都合な放出速度論をもたらすよう選択される。ポリマーマトリックスの大きさは、用いられる予定の送達の方法、通常、組織への注射または鼻腔および/または肺領域へのエアゾールによる懸濁液の投与に従ってさらに選択される。エアゾール経路が用いられる場合、ポリマーマトリックスならびに核酸および/または他の治療薬は界面活性剤ビヒクル中に包含されることが好ましい。ポリマーマトリックス組成物は、損傷を受けた鼻腔および/または肺表面にマトリックスが投与された場合に輸送の有効性をさらに増大するために、好都合な分解速度を有し、また生体接着性である材料から形成されるよう選択できる。マトリックス組成物はまた、分解せず、むしろ、長期間にわたる拡散によって放出するよう選択してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、核酸は、インプラントによって対象に投与され、他方、他の治療薬は急性に投与される。経口または粘膜送達などの送達に適している生体適合性ミクロスフェアは、Chickeringら(1996年)Biotech Bioeng 52:96〜101頁およびMathiowitz Eら(1997年)Nature 386:410〜414頁およびPCT特許出願WO97/03702に開示されている。
非生分解性および生分解性ポリマーマトリックスの両方とも、対象に核酸および/または他の治療薬を送達するために使用できる。生分解性マトリックスが好ましい。このようなポリマーは、天然ポリマーであってもよく、合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が望まれる期間、通常、数時間から1年以上という程度に基づいて選択される。通常、特に、核酸物質については、数時間と3〜12カ月の間の範囲の期間にかけての放出が最も望ましい。ポリマーは、任意選択により、水中で最大その重量の約90%を吸収し得るヒドロゲルの形であってもよく、さらに、任意選択により、多価イオンまたは他のポリマーと架橋していてもよい。
特に注目される生体接着性ポリマーとして、H.S.Sawhney、C.P.PathakおよびJ.A.Hubellの、Macromolecules、(1993年)26:581〜587頁に記載される、生体内分解性ヒドロゲルが挙げられ、その教示は本明細書に組み込まれる。これらは、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)およびポリ(オクタデシルアクリレート)を含む。
治療薬が核酸である場合、凝縮剤の使用が望ましい場合もある。凝縮剤はまた、単独で使用してもよく、生物学的または化学的/物理的ベクターと組み合わせて使用してもよい。「凝縮剤」とは、本明細書において用いる場合、核酸上の負の電荷を中和し、それによって、核酸の細粒への凝縮を可能にするヒストンなどの物質を指す。核酸の凝縮によって、標的細胞による核酸の取り込みが容易になる。凝縮剤は単独で、すなわち、核酸を、細胞によってより効率的に取り込まれる形で送達するために使用してもよく、より好ましくは、1つまたは複数の上記のベクターと組み合わせて使用してもよい。
核酸の取り込みを容易にするために使用できる他の例示的組成物として、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他のケミカルメディエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え組成物(例えば、核酸を予め選択された標的細胞染色体内の位置に組み込むための)が挙げられる。
本化合物は、単独で(例えば、生理食塩水またはバッファー中)投与してよく、または当技術分野で公知の任意の送達ビヒクルを用いて投与してもよい。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている:コクリート(cochleate);Emulsome(登録商標);ISCOM(登録商標);生細菌ベクター(例えば、サルモネラ菌、大腸菌、バチルスカルメット−ゲラン(Bacillus Calmette−Guerin)、赤痢菌、乳酸桿菌);生ウイルスベクター(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス);ミクロスフェア;核酸ワクチン;ポリマー(例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン);ポリマー環;プロテオソーム;フッ化ナトリウム;トランスジェニック植物。本発明のいくつかの実施形態では、送達ビヒクルはリポソーム、pH感受性リポソーム(例えば、OctoPlus(登録商標))、融合性リポソーム、ニオソーム、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、油中水型(W/O)エマルジョン、水中油型(O/W)エマルジョン、水中油中水型(W/O/W)マルチプルエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミセル、デンドリマー、ビロソーム、ウイルス様粒子、ナノスフェアまたはナノカプセルのようなポリマーナノ粒子、ミクロスフェアまたはマイクロカプセルのようなポリマー微粒子。本発明の製剤は、薬学的に許容できる溶液中で投与され、この溶液は薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性担体、アジュバント、および任意選択により、他の治療成分を日常的に含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は無菌である。
用語薬学的に許容できる担体とは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適している、1つまたは複数の適合性固体または液体増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。用語担体は、天然または合成の有機または無機成分を表し、それと有効成分が組み合わされ、適用を容易にする。医薬組成物の成分はまた、本発明の化合物と、互いに、所望の薬学的効率性を実質的に損なう相互作用がないような方法で混合され得る。
経口投与には、化合物(すなわち、核酸、抗原、抗体および他の治療薬)は、活性化合物(類)を、当技術分野で周知の薬学的に許容できる担体と組み合わせることによって容易に製剤できる。このような担体は、本発明の化合物が、治療されるべき対象による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして製剤されるのを可能にする。経口使用のための医薬品は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要に応じて、任意選択により、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理し、適した助剤を加え、固体賦形剤として得ることができる。適した賦形剤として、特に、糖類、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの増量剤;例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび/またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物がある。必要に応じて、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を加えてもよい。任意選択により、経口製剤はまた、内部酸性条件を中和するために生理食塩水またはバッファー中に製剤してもよく、または担体を全く伴わずに投与してもよい。
糖衣錠コアは、適したコーティングとともに提供される。この目的上、濃縮糖溶液を用いてもよく、これは任意選択により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液および適した有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。識別のため、または活性化合物用量の種々の組合せを特徴付けるために染料または色素も錠剤または糖衣錠コーティングに添加してよい。
経口によって使用できる医薬品として、ゼラチンで作製された押し込み型のカプセル剤ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とで作製されたソフト密閉カプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、有効成分を、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意選択により安定化剤との混合物中に含有し得る。ソフトカプセル剤では、活性化合物は、脂肪オイル、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適した液体に溶解または懸濁してよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用に製剤されたミクロスフェアも使用してよい。このようなミクロスフェアは、当技術分野で十分に規定されている。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適した投与量でなくてはならない。
口内投与には、組成物は、従来法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形をとり得る。
吸入による投与には、本発明による使用のための化合物は、適した加圧パックまたはネブライザーから、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスの使用によって、エアゾールスプレー調製物の形で送達され得ることが好都合である。加圧エアゾールの場合、定量を送達するためのバルブを提供することによって投与量単位を決定できる。吸入器(inhaer)または吸入器(insufflator)において使用するために、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、本化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤を含めて製剤され得る。
本化合物は、全身に送達するよう望まれる場合、注射による、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤できる。注射用製剤は、例えば、保存料が添加された、アンプル中または複数回用量容器中の単位投与形で提示され得る。本組成物は、油性または水性ビヒクル中の溶液またはエマルジョンような形をとることができ、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの製薬物質を含有し得る。
非経口投与用の医薬製剤として、水溶性の形の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液剤は、適当な油性注射用懸濁液として調製できる。適した親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪オイルまたはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステルまたはトリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液剤は、懸濁液剤の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。任意選択により、懸濁液はまた、適した安定化剤または化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする物質を含有し得る。
あるいは、活性化合物は、使用前に、適したビヒクル、例えば、無菌発熱物質不含水を用いて構成する散剤の形であり得る。
本化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または保留浣腸などの直腸用または膣用組成物に製剤できる。
本化合物はまた、先に記載した製剤に加え、デポー製剤として製剤できる。このような長期作用性製剤は、適したポリマーまたは疎水性材料(例えば、許容されるオイル中のエマルジョンのような)またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤できる。
本医薬組成物はまた、適した固体またはゲル相担体または賦形剤を含み得る。このような担体または賦形剤の例として、それだけには限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる。
適した液体または固体医薬品の形として、例えば、吸入のための水溶液または生理食塩水、マイクロカプセル化されたもの、コクリート化(encochleated)されたもの、微視的金粒子上にコーティングされたもの、リポソーム中に含有されたもの、噴霧されたもの、エアゾール、皮膚中に移植するためのペレットまたは皮膚を引っかくための尖ったもの上の乾燥されたものがある。本医薬組成物はまた、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、(マイクロ)カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルジョン、懸濁液剤、クリーム剤、ドロップ剤または活性化合物を長期間放出する調製物を含み、その調製では、賦形剤および添加剤および/または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、矯味剤、甘味料または可溶化剤が、上記と同様、習慣的に用いられる。本医薬組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に適している。薬物送達の方法の簡潔な概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Langer R(1990年)Science 249:1527〜1533頁参照のこと。
核酸、および任意選択により、他の治療薬および/または抗原は、それ自体で(ニート)投与してもよく、または薬学的に許容できる塩の形で投与してもよい。医薬中に用いられる場合、塩は薬学的に許容されなくてはならないが、その薬学的に許容できる塩を調製するために薬学的に許容できない塩も使用できることが好都合である。このような塩として、それだけには限らないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−2−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製できる。
適した緩衝剤として以下が挙げられる:酢酸および塩(1〜2%w/v);クエン酸および塩(1〜3%w/v);ホウ酸および塩(0.5〜2.5%w/v);ならびにリン酸および塩(0.8〜2%w/v)。適した保存料として、塩化ベンズアルコニウム(0.003〜0.03%w/v);クロロブタノール(0.3〜0.9%w/v);パラベン(0.01〜0.25%w/v)およびチメロサール(0.004〜0.02%w/v)が挙げられる。
本組成物は、単位投与形で提示でき、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製できることが好都合である。すべての方法は、化合物を、1つまたは複数の副成分を構成する担体と関係させるステップを含む。一般に、組成物は、化合物を液体担体、微粉化した固体担体または両方と、均一に、密接に関係させること、次いで、必要に応じて製剤を成形することによって調製される。液体用量単位は、バイアルまたはアンプルである。固体用量単位は、錠剤、カプセル剤および坐剤である。
他の送達システムとして、持続放出型、遅延放出型または徐放性送達システムを挙げることができる。このようなシステムは、化合物の反復投与を避けることができ、対象および医師にとって利便性が増す。多数の種類の放出送達システムが入手可能であり、当業者には公知である。それらとして、ポリマー塩基システム、例えば、ポリ(ラクチド−グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ酸無水物が挙げられる。薬物を含有する上記のポリマーのマイクロカプセル剤は、例えば、米国特許第5,075,109号に記載されている。送達システムとしてまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロールおよび脂肪酸またはモノ、ジ、トリグリセリドなどの中性脂肪をはじめとする脂質;ヒドロゲル放出システム;シラスティックシステム;ペプチドベースのシステム;ワックスコーティング;従来の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠;部分融合インプラントなどである非ポリマーシステムが挙げられる。具体的な例として、それだけには限らないが以下が挙げられる:(a)米国特許第4,452,775号、同4,675,189号および同5,736,152号に記載されるものなどの本発明の薬剤がマトリックス内の形で含有される浸食システムおよび(b)米国特許第3,854,480号、同5,133,974号および同5,407,686号に記載されるものなどの、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システム。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用でき、そのいくつかは移植に適している。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、決してさらなる制限と解釈されるべきではない。本出願を通じて引用された参照文献(参照文献、交付済み特許、公開特許出願および同時係属特許出願を含む)のすべての全内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
材料および方法:
オリゴリボヌクレオチド
すべてのORNは、Biospring(Frankfurt、Germany)から購入するか、Coley Pharmaceutical GmbH(Duesseldorf、Germany)によって提供され、Coley Pharmaceutical GmbHによって同一性および純度について管理され、検出不能なエンドトキシンレベル(<0.1EU/ml)しか有していないとリムルスアッセイ(BioWhittaker、Verviers、Belgium)によって測定された。ORNを、滅菌DNアーゼおよびRNアーゼ不含dH2O(Life Technologies、Eggenstein、Germany)に懸濁し、保存し、微生物およびエンドトキシン混入の両方を防ぐために無菌状態下で取り扱った。すべての希釈は、エンドトキシン不含Tris−EDTAまたはDNアーゼおよびRNアーゼ不含dH2Oを用いて実施した。ORN配列は、以下の表1に提供されている。
オリゴリボヌクレオチド
すべてのORNは、Biospring(Frankfurt、Germany)から購入するか、Coley Pharmaceutical GmbH(Duesseldorf、Germany)によって提供され、Coley Pharmaceutical GmbHによって同一性および純度について管理され、検出不能なエンドトキシンレベル(<0.1EU/ml)しか有していないとリムルスアッセイ(BioWhittaker、Verviers、Belgium)によって測定された。ORNを、滅菌DNアーゼおよびRNアーゼ不含dH2O(Life Technologies、Eggenstein、Germany)に懸濁し、保存し、微生物およびエンドトキシン混入の両方を防ぐために無菌状態下で取り扱った。すべての希釈は、エンドトキシン不含Tris−EDTAまたはDNアーゼおよびRNアーゼ不含dH2Oを用いて実施した。ORN配列は、以下の表1に提供されている。
細胞精製
実施例1〜7および10:健常なヒトドナーから得た末梢血軟膜調製物を、デュッセルドルフ大学(ドイツ)の血液銀行から入手し、フィコール−ハイパック(Ficoll−Hypaque)(Sigma)上で遠心分離することによってPBMCを精製した。細胞を、37℃の加湿したインキュベーター中、5%(v/v)熱不活化ヒトAB血清(BioWhittaker)または10%(v/v)熱不活化FCS、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(すべてSigma製)を補給したRPMI1640培地で培養した。PDCおよび単球を、BDCA−4 pDCまたはCD14単球単離キット(Miltenyi)を用いて単離した。
実施例1〜7および10:健常なヒトドナーから得た末梢血軟膜調製物を、デュッセルドルフ大学(ドイツ)の血液銀行から入手し、フィコール−ハイパック(Ficoll−Hypaque)(Sigma)上で遠心分離することによってPBMCを精製した。細胞を、37℃の加湿したインキュベーター中、5%(v/v)熱不活化ヒトAB血清(BioWhittaker)または10%(v/v)熱不活化FCS、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(すべてSigma製)を補給したRPMI1640培地で培養した。PDCおよび単球を、BDCA−4 pDCまたはCD14単球単離キット(Miltenyi)を用いて単離した。
実施例8:脾臓を未処理のsv129マウスから採取した。樹状細胞(DC)を、Myltenyi製の磁性ビーズ(CD11c+)を用いて精製した。細胞を37℃の加湿したインキュベーター中で20時間培養した。
サイトカイン検出
実施例1〜6および10:PBMCを、約5×106個細胞/mlの濃度で再懸濁し、96ウェル丸底プレートに加えた(250μl/ウェル)。PBMCを、種々のORN濃度とともにインキュベートし(DOTAPの存在下:2μMのORNを含む50mg/ml)、24時間後に培養上清(SN)を回収した。すぐに用いない場合、SNを必要とされるまで−20℃で保存した。
実施例1〜6および10:PBMCを、約5×106個細胞/mlの濃度で再懸濁し、96ウェル丸底プレートに加えた(250μl/ウェル)。PBMCを、種々のORN濃度とともにインキュベートし(DOTAPの存在下:2μMのORNを含む50mg/ml)、24時間後に培養上清(SN)を回収した。すぐに用いない場合、SNを必要とされるまで−20℃で保存した。
実施例7:ヒトPBMC(n=2)、単球またはpDCを、DOTAP(20μg/ml]の存在下、配列番号14(4μM)、配列番号28(0.5μM)または配列番号12(0.5μM)を用いて24時間刺激し、IFN−αを測定した。
実施例8:96ウェルプレートに、精製したDCを、3×105個細胞/ウェルで播種し、200μLの容積中、DOTAPとともに製剤した5μM、1μM、200nM、40nM、8nMまたは1.6nMの指定の試薬を用いて活性化した。細胞を、37℃の加湿したインキュベーター中で20時間インキュベートし、SNを回収した。
SN中のサイトカイン(IFN−α、IFN−γ_またはIL−12p40)の量を、IL−12p40のための(BD Biosciences、Heidelberg、Germany製)、IFN−γのための(Diaclone、Besancon、France製)市販のELISAキット、または市販の抗体(PBL、New Brunswick、NJ、USA)を用いて開発したIFN−αのための自家ELISAを用いて評価した。広範なセットのサイトカインおよびケモカインの分析のために、Bio−Rad(Munich、Germany)製のluminexシステムおよびBiosource(Solingen、Germany)製のマルチプレックスキットを用いるマルチプレックス分析を実施した。
In vivoサイトカイン誘導
sv129マウス(群あたり3匹)に、2:1(w/w)比でDOTAPとともに製剤した、ORNまたは小分子を静脈内に注射した。血漿を注射の3時間後に回収し、ELISAアッセイを実施した。
sv129マウス(群あたり3匹)に、2:1(w/w)比でDOTAPとともに製剤した、ORNまたは小分子を静脈内に注射した。血漿を注射の3時間後に回収し、ELISAアッセイを実施した。
誘導
本発明は、いくつかの態様では、特定の配列特異的RNAモチーフが免疫刺激性であり、TLR7およびTLR8に対して(ポリG末端を欠くGUリッチおよびCUリッチモチーフ)またはTLR8のみに対して(ポリG末端を欠くAUリッチモチーフ)作用する他のモチーフとは対照的に、TLR7を介して作用するという発見を伴う。ポリGモチーフ(複数可)が直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ORNモチーフを含有することが好ましいORNは、TLR7を介して免疫応答を刺激し、TLR8を介さない。これらの別個のクラスのORN、例えば、AUおよびGU含有反復配列を含有するが、ポリG末端を欠くORNならびに本発明のORNにおいて、IFN−α、TNF−α、IFN−γおよびIL−12産生間の相違を観察した。興味深いことに、本発明の免疫刺激性ORNは、強力なIFN−α応答を生じさせるが、他の通常のサイトカイン、例えば、TLR8刺激に応じて誘導されるものは刺激しないことがわかった。全く驚くべきことに、本発明によれば、TLR7/8およびTLR8応答を媒介するものなどの免疫刺激性ORNモチーフが、ORN中に1つまたは複数のポリGモチーフが組み込まれている場合にTLR7免疫プロフィールを生じさせるということも発見された。
本発明は、いくつかの態様では、特定の配列特異的RNAモチーフが免疫刺激性であり、TLR7およびTLR8に対して(ポリG末端を欠くGUリッチおよびCUリッチモチーフ)またはTLR8のみに対して(ポリG末端を欠くAUリッチモチーフ)作用する他のモチーフとは対照的に、TLR7を介して作用するという発見を伴う。ポリGモチーフ(複数可)が直接的または間接的に隣接する免疫刺激性ORNモチーフを含有することが好ましいORNは、TLR7を介して免疫応答を刺激し、TLR8を介さない。これらの別個のクラスのORN、例えば、AUおよびGU含有反復配列を含有するが、ポリG末端を欠くORNならびに本発明のORNにおいて、IFN−α、TNF−α、IFN−γおよびIL−12産生間の相違を観察した。興味深いことに、本発明の免疫刺激性ORNは、強力なIFN−α応答を生じさせるが、他の通常のサイトカイン、例えば、TLR8刺激に応じて誘導されるものは刺激しないことがわかった。全く驚くべきことに、本発明によれば、TLR7/8およびTLR8応答を媒介するものなどの免疫刺激性ORNモチーフが、ORN中に1つまたは複数のポリGモチーフが組み込まれている場合にTLR7免疫プロフィールを生じさせるということも発見された。
(実施例1)
本発明のORNは、多量のIFN−αを誘導するが、IL−12p40は誘導しない
本発明のORNの免疫刺激能力を調べるために、PBMCを、DOTAPの存在下、ORNとともにインキュベートした。24時間後、上清を、IFN−α(図1A)またはIL−12p40(図1B)の存在についてアッセイした。本発明のORN、配列番号4、配列番号8および配列番号5(表1)は、極めて多量のTLR7関連サイトカインIFN−αを誘導したが、TLR8関連サイトカインIL−12−p40は実質的に誘導しなかった。対照的に、対照配列番号1および2、TLR7およびTLR8関連応答の既知アクチベーターは、多量のIFN−αおよび多量のIL−12p40を誘導した。
本発明のORNは、多量のIFN−αを誘導するが、IL−12p40は誘導しない
本発明のORNの免疫刺激能力を調べるために、PBMCを、DOTAPの存在下、ORNとともにインキュベートした。24時間後、上清を、IFN−α(図1A)またはIL−12p40(図1B)の存在についてアッセイした。本発明のORN、配列番号4、配列番号8および配列番号5(表1)は、極めて多量のTLR7関連サイトカインIFN−αを誘導したが、TLR8関連サイトカインIL−12−p40は実質的に誘導しなかった。対照的に、対照配列番号1および2、TLR7およびTLR8関連応答の既知アクチベーターは、多量のIFN−αおよび多量のIL−12p40を誘導した。
(実施例2)
U−リッチ配列は、サイトカイン産生に必要である
ポリG領域が隣接するORNの領域の配列必要条件を調べるために、5’および3’末端でオリゴ(rG)ストレッチ内に組み込まれているU−リッチ配列(ホスホジエステル(PO)またはホスホロチオエート(PS)主鎖のいずれかを含む)を含有するORNを、サイトカイン産生を誘導するその能力について調べた(図2)。Gストレッチが隣接するUリッチ配列を含むORN、配列番号6は、多量のIFN−αを誘導したが(図2A)、実質的な量のIL−12p40を誘導しなかった(図2B)。その配列内にUを含まないORN、配列番号3および7は、サイトカイン産生を誘導しなかった。
U−リッチ配列は、サイトカイン産生に必要である
ポリG領域が隣接するORNの領域の配列必要条件を調べるために、5’および3’末端でオリゴ(rG)ストレッチ内に組み込まれているU−リッチ配列(ホスホジエステル(PO)またはホスホロチオエート(PS)主鎖のいずれかを含む)を含有するORNを、サイトカイン産生を誘導するその能力について調べた(図2)。Gストレッチが隣接するUリッチ配列を含むORN、配列番号6は、多量のIFN−αを誘導したが(図2A)、実質的な量のIL−12p40を誘導しなかった(図2B)。その配列内にUを含まないORN、配列番号3および7は、サイトカイン産生を誘導しなかった。
(実施例3)
3’末端にオリゴ(dG)ストレッチを含むORNは、TLR−7関連サイトカインを誘導する
TLR7様免疫応答を誘導するのに5’オリゴ(rG)ストレッチが必要であるかどうかを決定するために、オリゴ(rA)3’末端(配列番号9)、オリゴ(dG)3’末端(配列番号10)、3’コレステロールタグ(配列番号11)を含むORNおよびテールのないORN(配列番号12)を、TLR7様およびTLR8様サイトカイン応答を誘導するその能力について試験した。図3に示されるように、3’オリゴ(dG)(配列番号10)ストレッチのみを含有するORNは、TLR7様免疫応答を誘導した。配列番号10は、多量のIFN−αを誘導したが(図3A)、IFN−γは誘導しなかった(図3B)。陽性対照(配列番号1)および配列番号9は、TLR7/8様免疫応答を誘導したのに対し、配列番号11および12はTLR8様免疫応答を誘導した。
3’末端にオリゴ(dG)ストレッチを含むORNは、TLR−7関連サイトカインを誘導する
TLR7様免疫応答を誘導するのに5’オリゴ(rG)ストレッチが必要であるかどうかを決定するために、オリゴ(rA)3’末端(配列番号9)、オリゴ(dG)3’末端(配列番号10)、3’コレステロールタグ(配列番号11)を含むORNおよびテールのないORN(配列番号12)を、TLR7様およびTLR8様サイトカイン応答を誘導するその能力について試験した。図3に示されるように、3’オリゴ(dG)(配列番号10)ストレッチのみを含有するORNは、TLR7様免疫応答を誘導した。配列番号10は、多量のIFN−αを誘導したが(図3A)、IFN−γは誘導しなかった(図3B)。陽性対照(配列番号1)および配列番号9は、TLR7/8様免疫応答を誘導したのに対し、配列番号11および12はTLR8様免疫応答を誘導した。
(実施例4)
効率的なIFN−α誘導は、三次構造の形成と相関している
オリゴヌクレオチド中の(G)nストレッチ(ここで、n≧4)は分子間凝集体形成につながることがわかっている。(G)nストレッチを含むオリゴヌクレオチドの取り込みは、非凝集オリゴヌクレオチドよりも約20〜40倍高く、細胞内局在性も異なると思われる。これらの知見が生物活性とどのように相関するかは理解されてない。凝集体形成が、ORNによるTLR7様免疫応答の活性化において役割を果たしたかどうかを調べるために、ヒトPBMCを、DOTAPの不在下または存在下で、配列番号10および13とともにインキュベートし、IFN−αを測定した。配列番号13は、1つの7−デアザ−rG介在ポリdGストレッチを含む以外は配列番号10と同一配列である。取り込みエンハンサーの存在下および不在下の両方で、修飾されたORNはサイトカイン産生の低下をもたらした。配列番号10によるIFN−αの誘導は、修飾された配列番号13よりもかなり強力であり、このことは、凝集体形成は、TLR7誘導性IFN−α産生の活性化において役割を果たすということを示唆する。
効率的なIFN−α誘導は、三次構造の形成と相関している
オリゴヌクレオチド中の(G)nストレッチ(ここで、n≧4)は分子間凝集体形成につながることがわかっている。(G)nストレッチを含むオリゴヌクレオチドの取り込みは、非凝集オリゴヌクレオチドよりも約20〜40倍高く、細胞内局在性も異なると思われる。これらの知見が生物活性とどのように相関するかは理解されてない。凝集体形成が、ORNによるTLR7様免疫応答の活性化において役割を果たしたかどうかを調べるために、ヒトPBMCを、DOTAPの不在下または存在下で、配列番号10および13とともにインキュベートし、IFN−αを測定した。配列番号13は、1つの7−デアザ−rG介在ポリdGストレッチを含む以外は配列番号10と同一配列である。取り込みエンハンサーの存在下および不在下の両方で、修飾されたORNはサイトカイン産生の低下をもたらした。配列番号10によるIFN−αの誘導は、修飾された配列番号13よりもかなり強力であり、このことは、凝集体形成は、TLR7誘導性IFN−α産生の活性化において役割を果たすということを示唆する。
(実施例5)
3’末端のオリゴ(rG)およびオリゴ(dG)は、TLR7様免疫応答を誘導するのに十分である
種々の3’タグで修飾された場合の、ORNのIFN−αを誘導する能力を比較するために、配列番号12の活性を、3’ポリrAストレッチ(配列番号9)、3’ポリdGストレッチ(配列番号10)、3’コレステロールタグ(配列番号11)、3’トリエチレングリコール(配列番号14)、3’アクリジンタグ(配列番号16)、3’フルオレセインタグ(配列番号17)、3’ビオチンタグ(配列番号18)、3’ヘキサデシルグリセロールタグ(配列番号20)および3’ポリrGストレッチ(配列番号21)を含む同一配列のものと比較した。ヒトPBMCを、DOTAPの不在下で、示したORNとともに24時間インキュベートし、IFN−αを測定した。用いた3’修飾のうち、オリゴ(rG)およびオリゴ(dG)を含むORNのみが、ポリrAはある程度まで、DOTAPの不在下でのIFN−α産生に至った。
3’末端のオリゴ(rG)およびオリゴ(dG)は、TLR7様免疫応答を誘導するのに十分である
種々の3’タグで修飾された場合の、ORNのIFN−αを誘導する能力を比較するために、配列番号12の活性を、3’ポリrAストレッチ(配列番号9)、3’ポリdGストレッチ(配列番号10)、3’コレステロールタグ(配列番号11)、3’トリエチレングリコール(配列番号14)、3’アクリジンタグ(配列番号16)、3’フルオレセインタグ(配列番号17)、3’ビオチンタグ(配列番号18)、3’ヘキサデシルグリセロールタグ(配列番号20)および3’ポリrGストレッチ(配列番号21)を含む同一配列のものと比較した。ヒトPBMCを、DOTAPの不在下で、示したORNとともに24時間インキュベートし、IFN−αを測定した。用いた3’修飾のうち、オリゴ(rG)およびオリゴ(dG)を含むORNのみが、ポリrAはある程度まで、DOTAPの不在下でのIFN−α産生に至った。
(実施例6)
G残基の数が、IFN−αの増加対TNF−αおよび他のサイトカイン産生の減少を決定する
種々の数の3’G残基を含むORNの、IFN−αおよびTNF−αを誘導する能力を比較するために、配列番号21の活性を、1つの3’rGを付加した同配列(配列番号23)、1つの3’rGを欠失した同配列(配列番号24)および3個の3’rGが欠失した同配列(配列番号25)のものと比較した(図6)。3’ポリrGストレッチを含む免疫刺激性モチーフ(UUGU)を含むORN(配列番号26)および3’ポリrGストレッチを含むUUUUモチーフを含むORN(配列番号27)も試験した。
G残基の数が、IFN−αの増加対TNF−αおよび他のサイトカイン産生の減少を決定する
種々の数の3’G残基を含むORNの、IFN−αおよびTNF−αを誘導する能力を比較するために、配列番号21の活性を、1つの3’rGを付加した同配列(配列番号23)、1つの3’rGを欠失した同配列(配列番号24)および3個の3’rGが欠失した同配列(配列番号25)のものと比較した(図6)。3’ポリrGストレッチを含む免疫刺激性モチーフ(UUGU)を含むORN(配列番号26)および3’ポリrGストレッチを含むUUUUモチーフを含むORN(配列番号27)も試験した。
3’Gの減少は、IFN−αレベルの、未修飾ORN配列番号1と比較して、わずかに増強されただけのレベルへの低下につながる。さらに、ポリGテールの減少はまた、TLR8関連サイトカインTNF−αの発現にもつながり、この効果は、ポリrGの数に応じて異なった。IFN−αを増大し、他の効果を低下させるには、最小2個のGで十分であると思われる。
(実施例7)
ポリrGを含むORNは、TLR8を欠くpDCにおいてTLR7依存性IFN−α産生を刺激する
3’ポリrGストレッチを含むORNが、TLR7を介して作用していることを実証するために、ヒトPBMC、単球またはpDCを、DOTAP(20μg/ml)の存在下、配列番号14(4μM)、配列番号28(0.5μM)または配列番号12(0.5μM)を用いて24時間刺激し、IFN−αを測定した。ORNおよびCpG ODNは、PBMCからのIFN−αを刺激することがわかった。この応答は、あったとしても最小のレベルのTLR7を発現する単球では、大幅に低減された。しかし、TLR7発現pDCからの強力なIFN−α産生が、レベルは、CpG ODNよりも幾分か低いものの観察された。しかし、それにもかかわらず、レベルはPBMCにおいて観察されたものの約5倍高かった。
ポリrGを含むORNは、TLR8を欠くpDCにおいてTLR7依存性IFN−α産生を刺激する
3’ポリrGストレッチを含むORNが、TLR7を介して作用していることを実証するために、ヒトPBMC、単球またはpDCを、DOTAP(20μg/ml)の存在下、配列番号14(4μM)、配列番号28(0.5μM)または配列番号12(0.5μM)を用いて24時間刺激し、IFN−αを測定した。ORNおよびCpG ODNは、PBMCからのIFN−αを刺激することがわかった。この応答は、あったとしても最小のレベルのTLR7を発現する単球では、大幅に低減された。しかし、TLR7発現pDCからの強力なIFN−α産生が、レベルは、CpG ODNよりも幾分か低いものの観察された。しかし、それにもかかわらず、レベルはPBMCにおいて観察されたものの約5倍高かった。
(実施例8)
ネズミ樹状細胞におけるサイトカイン産生の刺激
本発明のORNを、ネズミ樹状細胞(DC)において、サイトカイン産生を誘導するその能力について試験した。ネズミCD11+脾細胞を回収し、ORNで20時間処理した。上清をELISAによってIFN−α(図8A)、IL−6(図8B)、IL−12p40(図8C)およびIP−10(図8D)濃度について分析した。細胞を、DOTAP(DO)を伴う既知TLR7/8刺激性ORN(配列番号48)、TLR7/8を刺激する小分子R−848、配列番号12のコレステロールタグを付け、3’Gストレッチで修飾されたORN(DOTAPを伴うおよび伴わないの両方で、それぞれ、配列番号11および12)、およびDOTAPを伴う配列番号12で処理した。配列番号21および48(両方ともDOTAPを伴って製剤された)は、多量のIFN−αを誘導した。製剤されていない配列番号21は、多量のIFN−αを、わずかに多い用量で誘導した。DOTAPとともに製剤した場合、配列番号21および配列番号48は両方とも、IL−12p40、IL−6およびIP−10を誘導した。これは、マウスが、ヒトTLR8の既知機能的TLR8等価物を有していないので予測されたことであり、マウスTLR7単独によって誘導されたサイトカインプロフィールは、ヒトにおいてTLR7/8アクチベーターによって誘導されるものと類似している。
ネズミ樹状細胞におけるサイトカイン産生の刺激
本発明のORNを、ネズミ樹状細胞(DC)において、サイトカイン産生を誘導するその能力について試験した。ネズミCD11+脾細胞を回収し、ORNで20時間処理した。上清をELISAによってIFN−α(図8A)、IL−6(図8B)、IL−12p40(図8C)およびIP−10(図8D)濃度について分析した。細胞を、DOTAP(DO)を伴う既知TLR7/8刺激性ORN(配列番号48)、TLR7/8を刺激する小分子R−848、配列番号12のコレステロールタグを付け、3’Gストレッチで修飾されたORN(DOTAPを伴うおよび伴わないの両方で、それぞれ、配列番号11および12)、およびDOTAPを伴う配列番号12で処理した。配列番号21および48(両方ともDOTAPを伴って製剤された)は、多量のIFN−αを誘導した。製剤されていない配列番号21は、多量のIFN−αを、わずかに多い用量で誘導した。DOTAPとともに製剤した場合、配列番号21および配列番号48は両方とも、IL−12p40、IL−6およびIP−10を誘導した。これは、マウスが、ヒトTLR8の既知機能的TLR8等価物を有していないので予測されたことであり、マウスTLR7単独によって誘導されたサイトカインプロフィールは、ヒトにおいてTLR7/8アクチベーターによって誘導されるものと類似している。
(実施例9)
In vivoサイトカイン誘導
本発明のORNを、in vivoにおいてサイトカイン産生を誘導するその能力について試験した(図9)。sv129マウスに、未修飾ORN(配列番号12)、同配列のコレステロール修飾されたORN(配列番号11)、同配列および3’ポリGストレッチを含むORN(配列番号21)またはR−848を用いて静脈内に注射した。すべてのORNは、2:1(w/w)比でDOTAPとともに製剤した。マウスを出血させ、血清を、ELISAによって、IFN−α(図9A)、IL−12p40(図9B)、IP−10(図9C)およびTNF−α(図9D)濃度について分析した。配列番号21は、コレステロール−修飾されたORNまたは未修飾ORNよりも高い程度にIFN−αを誘導した。配列番号21は、より高い用量で、IP−10を誘導し、IFN−αをR−848よりも高い程度に誘導した(単独またはDOTAPとともにいずれか)。配列番号21は、in vivoでの応答はin vitroでの応答よりもわずかに弱かったので、このアッセイでは、実質的な量のIL−12p40またはTNF−αを誘導しなかった(図10)。血清は、注射の3時間後に、IP−10濃度について試験した。図10Aに示されるように、DOTAPとともに製剤された配列番号21は、IP−10を、配列番号21単独よりも高い程度に誘導した。しかし、図10Bに示されるように、配列番号21は、コレステロールで修飾されたORN配列番号11よりもわずかに少ない量のIP−10を誘導した。
In vivoサイトカイン誘導
本発明のORNを、in vivoにおいてサイトカイン産生を誘導するその能力について試験した(図9)。sv129マウスに、未修飾ORN(配列番号12)、同配列のコレステロール修飾されたORN(配列番号11)、同配列および3’ポリGストレッチを含むORN(配列番号21)またはR−848を用いて静脈内に注射した。すべてのORNは、2:1(w/w)比でDOTAPとともに製剤した。マウスを出血させ、血清を、ELISAによって、IFN−α(図9A)、IL−12p40(図9B)、IP−10(図9C)およびTNF−α(図9D)濃度について分析した。配列番号21は、コレステロール−修飾されたORNまたは未修飾ORNよりも高い程度にIFN−αを誘導した。配列番号21は、より高い用量で、IP−10を誘導し、IFN−αをR−848よりも高い程度に誘導した(単独またはDOTAPとともにいずれか)。配列番号21は、in vivoでの応答はin vitroでの応答よりもわずかに弱かったので、このアッセイでは、実質的な量のIL−12p40またはTNF−αを誘導しなかった(図10)。血清は、注射の3時間後に、IP−10濃度について試験した。図10Aに示されるように、DOTAPとともに製剤された配列番号21は、IP−10を、配列番号21単独よりも高い程度に誘導した。しかし、図10Bに示されるように、配列番号21は、コレステロールで修飾されたORN配列番号11よりもわずかに少ない量のIP−10を誘導した。
(実施例10)
3’ポリG修飾されたORNは、製剤の不在下でTLR7を刺激する
3’ポリG修飾されたORNが、製剤の不在下でTLR7を刺激することを実証するために、配列番号48の塩基配列の3’変異体を作製した(これでは、3’末端から5個の塩基を除去し、5個のdG残基(配列番号42)、4個のdG残基および3−メチル−dG(配列番号43)、5個のdG残基およびdT(配列番号44)、5個のdG残基および逆方向dT(配列番号45)、4個のdG残基およびホスホロチオエート結合と置き換えてホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む3−メチル−dG(配列番号46)または4個のdG残基およびrG残渣(配列番号47)で置換した)。図11に示されるように、すべての製剤されていない修飾されたポリG ORNは、IFN−αを配列番号48よりも多い程度に誘導したが、配列番号48+DOTAPの程度までではなかった。
3’ポリG修飾されたORNは、製剤の不在下でTLR7を刺激する
3’ポリG修飾されたORNが、製剤の不在下でTLR7を刺激することを実証するために、配列番号48の塩基配列の3’変異体を作製した(これでは、3’末端から5個の塩基を除去し、5個のdG残基(配列番号42)、4個のdG残基および3−メチル−dG(配列番号43)、5個のdG残基およびdT(配列番号44)、5個のdG残基および逆方向dT(配列番号45)、4個のdG残基およびホスホロチオエート結合と置き換えてホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む3−メチル−dG(配列番号46)または4個のdG残基およびrG残渣(配列番号47)で置換した)。図11に示されるように、すべての製剤されていない修飾されたポリG ORNは、IFN−αを配列番号48よりも多い程度に誘導したが、配列番号48+DOTAPの程度までではなかった。
本発明の少なくとも1つの実施形態のいくつかの態様をこのように説明したが、種々の変更、改変および改良は、当業者にとって容易に想到されることは理解されよう。このような変更、改変および改良は、本開示内容の一部であるものとし、本発明の趣旨および範囲内であるものとする。したがって、上記の説明および図面は、ほんの一例にすぎない。
Claims (83)
- GG(R1)n(U)4〜20(R2)mGGGG(配列番号29)[式中、R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Uは、ウリジンまたはその誘導体であり、Gは、グアノシンであり、n=0〜20、m=0〜20である]を含む、10〜100個のリボヌクレオチドの長さのRNAオリゴヌクレオチド(ORN)。
- 5’GGGGUUUUGGGGG3’(配列番号33)または5’GGGGUUUUGGGG3’(配列番号34)でない、請求項1に記載のORN。
- GG(R1)n(U)5〜20(R2)mGGGG(配列番号30)[式中、R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Uは、ウリジンまたはその誘導体であり、Gは、グアノシンであり、n=0〜20、m=0〜20である]を含む、10〜100個のリボヌクレオチドの長さのRNAオリゴヌクレオチド(ORN)。
- GG(R1)n(U)4(R2)mGGGG(配列番号31)[式中、R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Uは、ウリジンまたはその誘導体であり、Gは、グアノシンであり、n=0〜20、m=0〜20であり、ここで、(R1)nがGGである場合、(R2)mはGではないか、m=0ではない]を含む、10〜100個のリボヌクレオチドの長さのRNAオリゴヌクレオチド(ORN)。
- GG(R1)n(U)4〜20(R2)mGGGG(配列番号29)[式中、R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、Uは、ウリジンまたはその誘導体であり、Gは、グアノシンであり、n=0〜20、m=0〜20である]を含み
R1は、水素(H)、COOR、OH、C1〜C18アルキル、C6H5または(CH2)m−NH−R2であり、ここで、Rは、Hまたはメチル、ブチル、メトキシエチル、ピバロイルオキシメチル、ピバロイルオキシベンジルまたはS−ピバロイルチオエチルであり、R2は、H、C1〜C18アルキルまたはC2〜C18アシルであり、mは、1〜17であり、
Xは、酸素(O)または硫黄(S)であり、
NuおよびNu’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体であり、
ただし、R1がHである場合、XはSである]、
Xは、OまたはSであり、
X1は、OH、SH、BH3、OR3またはNHR3であり、ここで、R3は、C1〜C18アルキルであり、
X2およびX3は各々独立に、O、S、CH2またはCF2であり、
NuおよびNu’は各々独立に、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体であり、
ただし、
(a)X、X2およびX3のうち少なくとも1つはOではない、またはX1はOHではなく、
(b)X1がSHである場合、X、X2およびX3のうち少なくとも1つはOではなく、
(c)XおよびX2がOであり、X1がOHである場合、X3はSではなく、Nuは3’Nuであり、Nu’は5’Nu’であり、
(d)X1がBH3である場合、X、X2またはX3のうち少なくとも1つはSである]および
(iii)(i)および(ii)の任意の組合せ
からなる群から選択される修飾されたリン酸結合を含まず、
式IIIAもしくは式IIIBとして示される少なくとも1つのヌクレオチド類似体
R4は、HまたはORであり、ここで、Rは、HまたはC1〜C18アシルであり、
Bは、核酸塩基、修飾された核酸塩基またはHであり、
XおよびX5は各々独立に、OまたはSであり、
X4は、OH、SH、メチルまたはNHR5であり、ここで、R5は、C1〜C18アルキルであり、
破線は各々独立に、隣接する単位、水素または有機基との任意選択の結合を表し、
ただし、XおよびX5の少なくとも一方はOではない、またはX4はOHではない]
を含まない、10〜100個のリボヌクレオチドの長さのRNAオリゴヌクレオチド(ORN)。 - 5’GGGUUUU3’モチーフを含まない、請求項1に記載のORN。
- 滅菌担体をさらに含む、請求項1に記載のORN。
- 脂質担体とともに製剤される、請求項1に記載のORN。
- 一本鎖である、請求項1に記載のORN。
- siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項1に記載のORN。
- 少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項1に記載のORN。
- ORNのすべてのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項1に記載のORN。
- 少なくとも1つのホスホジエステル様結合を含む、請求項1に記載のORN。
- ホスホジエステル様結合が、ホスホジエステル結合である、請求項13に記載のORN。
- 少なくとも1つの5’−5’ヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項1に記載のORN。
- 5’−5’ヌクレオチド間結合が、リンカーを含む、請求項15に記載のORN。
- 少なくとも1つの3’−3’ヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項1に記載のORN。
- 3’−3’ヌクレオチド間結合が、リンカーを含む、請求項17に記載のORN。
- 2’−O−アルキル修飾、2−フルオロ−アラビノ修飾、またはLNA修飾された少なくとも1つのGをさらに含む、請求項1に記載のORN。
- CGジヌクレオチドを含まない、請求項1に記載のORN。
- 少なくとも1つのメチル化されていないCpGジヌクレオチドを含む、請求項1に記載のORN。
- 少なくとも2つの隣接する水素結合した塩基対によって提供される、二次構造を形成できる、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体またはヌクレオシドとヌクレオシド類似体の組合せの配列を含む、請求項1に記載のORN。
- 二次構造が、ステムループ二次構造である、請求項22に記載のORN。
- (R1)nが、GGである、請求項1に記載のORN。
- (R2)mが、GGGである、請求項1に記載のORN。
- (U)4〜20が、UUUUUである、請求項1に記載のORN。
- (U)4〜20が、UUUUUUUである、請求項1に記載のORN。
- (U)4〜20が、UUUUUUUUUU(配列番号32)である、請求項1に記載のORN。
- GGおよび(R1)nが、直接接続している、請求項1に記載のORN。
- GGおよび(R1)nが、3’−3’結合を介して接続している、請求項1に記載のORN。
- GGおよび(R1)nが、スペーサーによって接続している、請求項1に記載のORN。
- スペーサーが、非ヌクレオチドスペーサーである、請求項31に記載のORN。
- 非ヌクレオチドスペーサーが、D−スペーサーである、請求項32に記載のORN。
- 非ヌクレオチドスペーサーが、リンカーである、請求項32に記載のORN。
- rG*rG*rG*rG*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号4)を含むORN。
- rG*rG*rG*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号5)を含むORN。
- rG*rG*rG*rG*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号6)を含むORN。
- rG*rG*rG*rG−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rU−rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(配列番号8)を含むORN。
- rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*dG*dG*dG*dG*dG(配列番号10)を含むORN。
- ポリGモチーフと連結している免疫刺激性RNAオリゴヌクレオチド(ORN)モチーフを含み、ポリGモチーフが、免疫刺激性ORNモチーフの3’側にあり、ポリGモチーフが、少なくとも4個のGを含み、Gがグアノシンである、8〜100個のリボヌクレオチドの長さの免疫刺激性ORN。
- 以下の5’GGGGUUUUGGGGG3’(配列番号33)、5’GGGGUUUUGGGG3’(配列番号34)、GUUUUUG(配列番号35)、GGGGGGGUUGUGUGGGGG(配列番号36)、CCCCUUUUGGGGG(配列番号37)、GUUUGUGUGGGG(配列番号38)、GUUGUGUGGGGG(配列番号39)、UUUUUUGGGGG(配列番号40)、UUUUUGGGGG(配列番号41)、UUUUGGGGG(配列番号19)、またはUUUUGGGG(配列番号15)のうちの1つではない、請求項40に記載のORN。
- 免疫刺激性ORNモチーフが、TLR8モチーフである、請求項40に記載のORN。
- TLR8モチーフが、N−U−R1−R2であり、Nが、リボヌクレオチドであり、NがUを含まず、Uが、ウラシルまたはその誘導体であり、Rが、リボヌクレオチドであり、ここで、R1およびR2の少なくとも一方が、アデノシン(A)またはシトシンまたはその誘導体であり、N−U−R1−R2が、少なくとも2個のAを含まない限り、RがUではない、請求項42に記載のORN。
- Nが、アデノシンまたはシトシン(C)またはその誘導体である、請求項43に記載のORN。
- 第2のN−U−R1−R2モチーフをさらに含む、請求項43に記載のORN。
- 免疫刺激性ORNモチーフが、TLR7/8モチーフである、請求項40に記載のORN。
- TLR7/8モチーフが、
(i)5’−C/U−U−G/U−U−3’、
(ii)5’−R−U−R−G−Y−3’、
(iii)5’−G−U−U−G−B−3’、
(iv)5’−G−U−G−U−G/U−3’、および
(v)5’−G/C−U−A/C−G−G−C−A−C−3’
[式中、C/Uは、シトシン(C)またはウラシル(U)であり、G/Uは、グアニン(G)またはUであり、Rは、プリンであり、Yは、ピリミジンであり、Bは、U、G、またはCであり、G/Cは、GまたはCであり、A/Cは、アデニン(A)またはCである]
からなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を含む、請求項46に記載のORN。 - ポリGモチーフが、6個のGである、請求項40に記載のORN。
- ポリGモチーフが、7個のGである、請求項40に記載のORN。
- 免疫刺激性ORNモチーフおよびポリGモチーフが、直接連結している、請求項40に記載のORN。
- 免疫刺激性ORNモチーフおよびポリGモチーフが、スペーサー、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであるリンカーを介して間接的に連結している、請求項40に記載のORN。
- 少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項40に記載のORN。
- ORNのすべてのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項40に記載のORN。
- 少なくとも1つのホスホジエステル様結合を含む、請求項52に記載のORN。
- 脂質、小分子、ペプチドまたはタンパク質からなる群から選択される分子とコンジュゲートしている、請求項1、3、4、5または35から40のいずれか一項に記載のORN。
- ORNおよび分子が、直接コンジュゲートしている、請求項55に記載のORN。
- ORNおよび分子が、リンカーを介してコンジュゲートしている、請求項55に記載のORN。
- IFN−αの産生を刺激する方法であって、TLR7発現細胞を、IFN−α産生を刺激するのに有効な量の、ポリGモチーフと連結している免疫刺激性RNAオリゴヌクレオチド(ORN)モチーフを含むORNと接触させることを含み、ポリGモチーフは免疫刺激性ORNモチーフの3’側にあり、ポリGモチーフは少なくとも4個のGを含み、Gはグアノシンであるステップを含み、ORNに応じたIFN−γまたはIL−12産生はバックグラウンドと比較して大幅には誘導されない方法。
- ORNが、GG(R1)n(U)4〜20(R2)mGGGG[式中、R1およびR2は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、スペーサーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、n=0〜20であり、m=0〜20であり、Uはウリジンまたはその誘導体であり、Gはグアノシンである]である、請求項57に記載の方法。
- TLR7発現細胞がmDCである、請求項58に記載の方法。
- TLR7発現細胞がin vitroである、請求項58に記載の方法。
- TLR7発現細胞がin vivoである、請求項58に記載の方法。
- 癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、癌を治療するのに有効な量の、請求項1から57のいずれか一項に記載のORNを投与することを含む方法。
- 対象に化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項63に記載の方法。
- 対象に放射線を施すことをさらに含む、請求項64に記載の方法。
- 喘息を治療する方法であって、それを必要とする対象に、喘息を治療するのに有効な量の、請求項1から57のいずれか一項に記載のORNを投与することを含む方法。
- アレルギーを治療する方法であって、それを必要とする対象に、アレルギーを治療するのに有効な量の、請求項1から57のいずれか一項に記載のORNを投与することを含む方法。
- 対象がアレルギー性鼻炎である、請求項67に記載の方法。
- 対象において免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする対象に、免疫応答を調節するのに有効な量の、請求項1から57のいずれか一項に記載のORNを投与することを含む方法。
- 対象において自己免疫疾患を治療するために、ORNが対象に送達される、請求項69に記載の方法。
- 対象において気道リモデリングを治療するために、ORNが対象に送達される、請求項69に記載の方法。
- ORNが、抗原を伴わずに対象に投与される、請求項69に記載の方法。
- ORNが、経口、鼻腔、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射および経皮的からなる群から選択される経路によって送達される、請求項69に記載の方法。
- ORNが、IFNα発現を誘導するのに有効な量で対象に送達される、請求項69に記載の方法。
- ウイルス感染によって悪化した喘息を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ウイルス感染によって悪化した喘息を治療するのに有効な量の、請求項1から54のいずれか一項に記載のORNを投与することを含む方法。
- ウイルス感染がRSVによる、請求項75に記載の方法。
- 感染性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、感染性疾患を治療するのに有効な量の、請求項1から54のいずれか一項に記載のORNを投与することを含む方法。
- 対象がウイルス感染症である、請求項77に記載の方法。
- ウイルス感染症が、B型肝炎である、請求項78に記載の方法。
- ウイルス感染症が、C型肝炎である、請求項78に記載の方法。
- 対象に抗ウイルス薬を投与することをさらに含む、請求項78に記載の方法。
- 抗ウイルス薬が、ORNと連結している、請求項68に記載の方法。
- ORNが、経口、鼻腔、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射および経皮的からなる群から選択される経路によって送達される、請求項77に記載の方法。
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