WO2017065369A1 - Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제 - Google Patents

Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제 Download PDF

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WO2017065369A1
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seq
rna oligonucleotide
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nucleotide sequence
rna
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최병석
이미경
이장현
강석조
박은별
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한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to RNA oligonucleotides having a specific sequence and structure and immunoactive agents comprising the same.
  • Interferon is a glycoprotein derived from most cells in the nucleus and regulates immune responses. Interferons bind to specific receptors on cell surface cell membranes, resulting in a series of intracellular and immune regulatory responses. Such intracellular responses include induction of activation of specific enzymes, and immunomodulatory responses include increased phagocytic activity of macrophages and increased cytotoxicity of lymphocytes to target cells.
  • Interferons are classified into types 1 and 2 according to their physicochemical and functional characteristics.
  • Type 1 interferons include interferon- ⁇ , - ⁇ , - ⁇ and - ⁇
  • type 2 interferons have interferon- ⁇ .
  • Interferon- ⁇ is a single chain protein of about 20 kDa in molecular weight, containing about 20% sugar and composed of 166 amino acids.
  • Recombinant interferon- ⁇ is currently used as a therapeutic agent or adjuvant of various diseases, and a representative disease that uses the therapeutic agent is an autoimmune multiple sclerosis (Airas L. et al. , Ann NY Acad Sci. , 2007, Sep 1110: 641-8).
  • U.S. Patent Application Publication No. 2012/0288476 discloses that oligonucleotides in which a phosphate group is bound to the 5'-end and a cap-free oligonucleotide expresses type 1 interferon, interleukin-18, interleukin-1 ⁇ , and the like. It is disclosed that it can increase.
  • RNA consisting of four nucleotides induces the activity of interferon- ⁇ to promote an immune response.
  • RNAs have in common that they contain a triphosphate group at the 5'-end. As described above, it is known that RNA does not have a cap at its 5'-end and contains a triphosphate group to bind to a retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) protein in a cell to activate expression of interferon.
  • RAG-I retinoic acid-inducible gene I
  • the inventors of the present invention have been studying a substance capable of increasing the expression of interferon-activated factor 56 (ISG56) expressed by interferon- ⁇ or interferon- ⁇ , and, as previously known, at the 5'-end
  • the present invention has been completed by confirming that RNA oligonucleotides having a specific sequence and structure increase the expression of interferon- ⁇ or ISG56 even without a triphosphate group, thereby confirming that the RNA oligonucleotide can be used as an immunoactivator.
  • RNA activator having a specific sequence and structure and an immunoactive agent comprising the RNA oligonucleotide as an active ingredient.
  • the present invention is a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 3 ') are coupled to each other complementarily and form a double strand, having the double-stranded helical bent (bend helical) structure, the nucleotide sequence represented by the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 5'thereof An RNA oligonucleotide having a hydroxyl group (OH) at its end is provided.
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 2 5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 3 '
  • the present invention also provides a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') are coupled to each other complementarily and form a double strand, the double strand has a spiral bend (bend helical) structure, the base represented by SEQ ID NO: 1 sequence and the 3'-end of SEQ ID NO:
  • the 5'-terminus of the nucleotide sequence represented by 2 is connected in a loop, and has a hairpin structure, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-terminus.
  • RNA oligonucleotides are provided.
  • the present invention also provides a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is linked to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') complementary to each other to form a double strand,
  • the double strand has a helical bend structure
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end, provides an RNA oligonucleotide.
  • the present invention also provides a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is linked to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') complementary to each other to form a double strand,
  • the double strand has a helical bend structure, and the 3'-end of one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and the 5'-end of the other nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 are looped.
  • It provides an RNA oligonucleotide linked to (loop) and having a hairpin structure, wherein one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5′-end.
  • the present invention provides an immune activator comprising the RNA oligonucleotide as an active ingredient.
  • RNA oligonucleotides having a specific sequence and helical bent structure increases the expression of interferon- ⁇ or ISG56, so that the composition comprising the RNA oligonucleotides can be usefully used as an immune activator.
  • RNA oligonucleotides prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram confirming the structure of 5'-OH-iav or 5'-PPP-iav RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph confirming the increase in the expression of interferon- ⁇ by the RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a graph confirming the increased expression of interferon- ⁇ by 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimun RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is an RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double Bend It is a graph confirming the increased expression of ISG56 by.
  • Figure 7 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') Complementarily bonded to form a double strand, the double strand has a helical bend structure, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is a hydroxyl group (OH) at its 5'-end RNA oligonucleotides are provided.
  • RNA oligonucleotides according to the present invention are 8 to 100, 8 to 50, 8 to 30, 8 to 20, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 30, 20 to 500, 20 to It may have 300, 10 to 200, 10 to 100, 20 to 50 bases. In one embodiment according to the invention RNA oligonucleotides may be 8 to 16 single-stranded, 16 to 32 double-stranded.
  • complementary binding refers to the formation of a duplex structure in which one or two oligonucleotides form a hairpin or double helix, with complementary base sequences paired together. Complementary bonds can be formed even when the complementarity between paired nucleotide sequences forms a Watson-Crick pair or some non-Watson-Crick base pair is present.
  • N 1 to N 6 may be any one selected from the group consisting of A, G, C and U, specifically, G or C Can be.
  • N 1 may be G
  • N 2 is C
  • N 3 may be G (corresponding to SEQ ID NO: 3)
  • SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence of N 4 may be a C
  • 5 N is G
  • N 6 is a C (corresponding to SEQ ID NO: 4).
  • each of the sixth base sequence of the third base (U) and the fifth base (G) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is represented by SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Wobble base pairs i.e., non-Watson-Crick base pairs, are formed with the first base (G) and the fourth base (U).
  • RNA oligonucleotide according to the present invention has a helical bend structure between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Characterized in that form.
  • the helical bending structure, the third base (U) and the fifth base (G) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 each of the sixth base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) and the fourth base (U) and wobble base pairs, respectively, formed at the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 do.
  • the helical bending structure has a shape bent 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees based on the plane of the double-stranded RNA.
  • RNA oligonucleotide according to the present invention is at least one or more of the phosphodiester bond (phosphodiester bond) forming the RNA oligonucleotide in order to inhibit degradation by the endonuclease (improving in vivo stability)
  • One or more bonds selected from the group consisting of phosphorothioate bonds, boranophosphate bonds and methyl phosphonate bonds.
  • said modification is at least one phosphorothioate linkage.
  • the present invention is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3')
  • SEQ ID NO: 1 The complementary bonds to each other form a double strand, the double strand has a helical bend structure, the 3'-terminal of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • RNA oligonucleotides having a hairpin structure of the present invention may have the characteristics as described above.
  • the phosphodiester bonds that form it in the RNA oligonucleotide may be substituted with other bonds as described above.
  • Loops in the hairpin RNA structure are 4 to 80, 4 to 75, 4 to 70, 4 to 65, 4 to 60, 4 to 55, 4 to 50, 4 to 45, 4 to 40 Dog, 4 to 35, 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15 or 4 to 10 bases, in one embodiment according to the invention the loop is 4 , 15, 16, 64 or 73 bases.
  • a part of the base sequence constituting it in the loop when a part of the base sequence constituting it in the loop is complementary to each other to form a Watson-Crick base pair may have a stem (stem) structure.
  • the stem structure may comprise an AU motif with a Watson-Crick base pair formed between A and U.
  • the four base sequences constituting the loop are UUCG.
  • the oligonucleotide having a hairpin RNA structure may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19.
  • the present invention is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3')
  • SEQ ID NO: 17 Two nucleotide sequences represented by the linked SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') are complementary to each other to form a double strand, the double strand is a spiral bend It provides an RNA oligonucleotide having a helical bend structure, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5′-end.
  • the RNA oligonucleotide is characterized in that the two nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 17 has a regressive structure.
  • the term "palindromic structure" refers to a structure in which two nucleotide sequences forming a double strand are composed of nucleotide sequences of the same order in the direction of 5'-end to 3'-end.
  • the regressive structure is 3'-terminal in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 5'-terminal in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 to form a single strand, the two formed single strands are complementary to each other It can be formed by the double strand.
  • the single strand may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the spiral bending structure may be two.
  • RNA oligonucleotide having the regressive structure may have the characteristics as described above.
  • the phosphodiester bonds that form it in the RNA oligonucleotide may be substituted with other bonds as described above.
  • the present invention is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3')
  • Two nucleotide sequences represented by the linked SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') are complementary to each other to form a double strand, the double strand is a spiral bend (helical bend) structure
  • the 3'-terminal end of one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and the 5'-terminal end of the other nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 are connected in a loop
  • An RNA oligonucleotide having a hairpin structure and having one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 having a hydroxyl group (OH) at its 5′-end is provided.
  • the RNA oligonucleotide of the hairpin structure may have a recursive structure as described above, and may have two helical bent structures.
  • the RNA oligonucleotide may have the characteristics as described above.
  • the phosphodiester bonds that form it in the RNA oligonucleotide may be substituted with other bonds as described above.
  • RNA oligonucleotides according to the present invention can be used as immune activators by increasing the expression of interferon- ⁇ or ISG56 in the body, thereby enhancing immunity.
  • the immune activator according to the present invention may include 10 to 95% by weight of the RNA oligonucleotide according to the present invention as an active ingredient based on the total weight of the composition.
  • the immune activator of the present invention may further include one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above active ingredients.
  • the immunoactive agent of the present invention may be formulated into a pharmaceutical composition comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • the dosage of the immunoactive agent according to the present invention may vary depending on the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients included in the composition, the type of formulation and the age, weight, general state of health, sex and diet of the patient, It may be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration and the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used simultaneously.
  • the effective amount of the RNA oligonucleotide according to the present invention is such that the intracellular concentration is 1 to 1,000 nM, specifically 100 to 500 nM. In this case, the administration may be administered once a day, may be divided into several times.
  • the immune activators of the invention can be administered to a subject in a variety of ways known in the art.
  • the route of administration may be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the method of administration, the volume of body fluid, viscosity, and the like.
  • RNA oligonucleotides having double stranded RNA or hairpin RNA structures (FIG. 1), wherein 5'-OH-iav or 5'-PPP-iav has a helical bending structure (FIG. 2).
  • RNA oligonucleotides with a helical bent structure were found to increase the expression of interferon- ⁇ and ISG56 (FIGS. 3-7).
  • RNA oligonucleotide having a helical bent structure increases the expression of interferon- ⁇ and ISG56, so that the composition containing it as an active ingredient can be usefully used as an immunoactive agent.
  • RNA oligonucleotides were constructed that could increase the expression of interferon- ⁇ or ISG56.
  • RNA oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and having triphosphate at the 5'-end were prepared using techniques known in the art.
  • RNA oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 10 and SEQ ID NOs: 18 to 19 and which have a hydroxyl group at the 5'-end or whose phosphodiester bonds are substituted with phosphorothioate bonds are integrated. It was customized to Integrated DNA Technologies or Dharmacon.
  • 5'-OH-Int-NS1 and 5'-OH-Bend-GC RNA oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 and having a hydroxyl group at the 5'-end were prepared.
  • a 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and having a hydroxyl group at the 5'-end was prepared.
  • RNA oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and having a hydroxyl group at the 5'-end, and an RNA oligonucleotide in which a phosphodiester bond forming the RNA oligonucleotide is substituted with a phosphorothioate bond Prepared.
  • these bases consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, these bases are complementary to each other to form a double strand, 5'-OH-8bp-Bend-GC having a hydroxyl group at the 5'-end -Minimum RNA oligonucleotides were prepared.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NO: 18 are complementary to each other to form a double strand, to prepare a 5'-OH-16mer-Double Bend RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at its 5'-end. Furthermore, a 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and having a hydroxyl group at the 5'-end thereof was prepared.
  • RNA oligonucleotide prepared in Example 1 was dissolved in a buffer containing 10 mM sodium phosphate (pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v / v)% D 2 O, to prepare a sample in the art
  • Various spectroscopic experiments were carried out by known methods.
  • NOESY two-dimensional NOE spectroscopy
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • 1 H- 13 C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY and 3D HCCH-TOCSY spectroscopy were performed.
  • the ⁇ dihedral angle was obtained from 3 J H1 ', H2' values obtained from DQF-COSY, and all ⁇ back angles were fixed at -158 ⁇ 15 degrees.
  • Other dihedral angles eg, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇
  • the bulge portion did not limit the other back angles, except for some ⁇ and ⁇ back angles.
  • Residual dipolar coupling values were measured by HSQC experiments with increased sensitivity with an accuracy of ⁇ 1 dB.
  • the alignment tensor was analyzed by singular value decomposition to obtain anisotropy value of -8.0 ⁇ and rhombicity value of 0.32.
  • 5'-PPP-iav and 5'-OH-iav RNA oligonucleotides were forming a spiral bent structure.
  • Such a helical bending structure is composed of two single strands consisting of 5'-GUAGA-3 'and 5'-UUUGC-3' sequences of the 5'-PPP-iav and 5'-OH-iav sequences. It was confirmed that the structure formed by forming double strands through Watson-Crick bond.
  • 5'-OH-Int-NS1, 5'-OH-Bend-GC, 5 ' which is the RNA oligonucleotide of the present invention comprising the sequences of 5'-GUAGA-3' and 5'-UUUGC-3 ' -OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double Bend and 5'-OH- It can be seen that the Long_Bend RNA oligonucleotide also forms a helical bent structure.
  • RNA oligonucleotides having a helical bent structure prepared in Example 1 was confirmed to increase the expression of interferon- ⁇ .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • RNA oligonucleotide prepared in Example 1 was treated with the cell line prepared in Experimental Example 1.1.
  • the cultured cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco, USA) to remove the cells, and counted and divided into 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates. Thereafter, it was incubated for 42 hours at 37 ° C., 5% CO 2 , and after removing the medium, 400 ⁇ l of OPTI-MEM and RNA oligonucleotides without FBS were treated.
  • trypsin-EDTA Gibco, USA
  • RNA oligonucleotides Treatment of RNA oligonucleotides was carried out at 1 ⁇ M of 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Int-NS1 and 5'-.
  • Each of OH-Bend-GC was mixed with 4 ⁇ l of lipofectamine LTX, and 1.6 ⁇ l of plus-reagent, which was treated with 200 ⁇ l of cells. Thereafter, the cells were incubated for 4 hours at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • poly (I: C) [poly (I: C)] known as RIG-I ligand was used as a positive control group.
  • RIG-I ligand As a negative control, only the embryos were treated. After 4 hours, the medium was removed, and 2 ml of DMEM medium containing 10% FBS was added thereto, followed by further incubation for 2 hours at 37 ° C.
  • RNA was isolated by the following method.
  • RNA was removed and the cells were recovered with 500 ⁇ l of TRI-reagent (Ambion, USA), and then the chloroform was added to the collected cells to separate the RNA layer. Isopropanol was added thereto to make pellets. The pellets were washed with 75% ethanol and dried, and then dissolved in sterile distilled water. DNase (Promega, USA) was added to the separated RNA and treated at room temperature for 30 minutes to remove contaminated DNA, and then inactivated with a stop solution. Subsequently, cDNA was synthesized from RNA by using SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen, USA) for 1 hour at 50 ° C.
  • Real-time PCR was performed using the thus synthesized cDNA as a template. Specifically, real-time PCR was performed on h-tag DNA polymerase (solgent, Korea), dNTP, tetraethylammonium chloride, evagreen dye (Biogreen dye, Biotium, USA), and the target gene interferon- ⁇ and the control. The primers for the gene GAPDH were mixed. Real-time PCR was fixed at 95 ° C. for 15 minutes and then repeated 40 times at 95 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 40 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds. In this case, primers targeting interferon- ⁇ and GAPDH are shown in Table 1 below.
  • RNA oligonucleotides having a triphosphate at the 5′-end but also RNA oligonucleotides having a bent structure even though having a hydroxyl group at the 5′-end have significantly increased expression of interferon- ⁇ . It was confirmed that.
  • RNA oligonucleotide having a bent structure increased the expression of interferon- ⁇ .
  • the same method as Experimental Example 1 using 5'-OH-Bend-GC-8bp, which is a shorter hairpin RNA including a bending structure, to identify the RNA oligonucleotide portion affecting the expression of interferon- ⁇ Real time PCR was performed.
  • the negative control was treated only with a medium or 5'-OH-control
  • the positive control was treated with poly (I: C) [poly (I: C)].
  • the experimental group was treated with 5'-OH-Bend-GC-8bp and 5'-OH-Bend-GC RNA oligonucleotide, and 5'-OH-Bend-GC-8bp was performed three times.
  • the smallest double-stranded RNA oligonucleotide to which the base sequence consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is complementarily bound expresses ISG56 expression. Increased to a significant level.
  • RNA oligonucleotides having the bent structure produced in the present invention the phosphodiester bonds forming the RNA oligonucleotides are replaced by phosphorothioate bonds, or the RNA oligonucleotides of the minimum length having the bent structure are linked by a recursive structure.
  • the expression change of ISG56 induced by the expression of interferon- ⁇ was confirmed.
  • the bond forming the RNA oligonucleotide is replaced with a phosphorothioate bond and is resistant to endonuclease among the RNA oligonucleotides injected into the cell, and has a 5 'helical bending structure.
  • -OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double Bend RNA oligonucleotides increased the expression of ISG56 to significant levels.
  • RNA oligonucleotides having a bent structure produced in the present invention in order to confirm whether long-length hairpin RNA oligonucleotides have increased interferon- ⁇ expression activity, expression changes of ISG56 induced by the expression of interferon- ⁇ are examined. Confirmed.
  • RNA oligonucleotide As shown in FIG. 7, 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide, a long hairpin RNA with a helical bending structure, increased the expression of ISG56.
  • the RNA oligonucleotide having the helical bent structure of the present invention shows excellent expression increasing activity of interferon- ⁇ and ISG56, and can be used as an immunoactivator.

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Abstract

본 발명은 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 두 개의 서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시킴으로써, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 면역 활성제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

RNA 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제
본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제에 관한 것이다.
인터페론은 핵이 존재하는 대부분의 세포로부터 유래하는 당단백질로, 면역반응을 조절한다. 인터페론은 세포 표면 세포막의 특정 수용체와 결합하여 일련의 세포 내 반응과 면역 조절 반응을 나타낸다. 이러한 세포 내 반응에는 특정 효소들의 활성화 유도 등이 있고, 면역 조절 반응으로는 대식세포의 식세포작용 활성 증가, 표적 세포에 대한 임파구의 세포독성 증가 등이 있다.
인터페론은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형으로 분류된다. 1형 인터페론에는 인터페론-α, -β, -τ 및 -ω가 있고, 2형 인터페론에는 인터페론-γ가 있다. 이 중 인터페론-β는 분자량이 약 20 kDa이고, 약 20%의 당을 함유하며 166개의 아미노산으로 구성된 단일 사슬의 단백질이다.
현재 재조합 인터페론-β는 다양한 질병의 치료제 또는 보조제로 사용되고 있으며, 이를 치료제로 사용하는 대표적인 질병으로는 자가면역 질환인 다발성 경화증이 있다(Airas L. et al., Ann N Y Acad Sci., 2007, Sep:1110:641-8).
한편, 최근 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 면역반응을 증가시키고자 하는 연구가 진행되고 있다. 미국 특허공개 제2012/0288476호는 5'-말단에 포스페이트기(phosphate group)가 결합되고, 캡(cap)이 없는 상태의 올리고뉴클레오티드가 1형 인터페론, 인터루킨-18, 인터루킨-1β 등의 발현을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다.
또한, 미국 특허공개 제2012/0121551호는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 RNA가 인터페론-α의 활성을 유도하여 면역반응을 촉진함을 개시하고 있다.
상기 공개된 RNA들은 모두 5'-말단에 트리포스페이트기를 포함한다는 공통점이 있다. 이와 같이 RNA가 이의 5'-말단에 캡이 존재하지 않고, 트리포스페이트기를 포함하면 세포 내의 RIG-I(retinoic acid-inducible gene I) 단백질과 결합하여 인터페론의 발현을 활성화시키는 것이 알려져 있다.
본 발명자들은 인터페론-β 또는 인터페론-β에 의해 발현되는 인터페론 활성인자 56(interferon stimulated gene 56; ISG56)의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 연구하던 중, 기존에 알려진 바와 달리, 5'-말단에 트리포스페이트기가 없어도 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시켜, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 면역 활성제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제를 제공한다.
본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 면역 활성제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav의 구조를 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimun에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개, 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 단일가닥으로는 8개 내지 16개, 이중가닥으로는 16개 내지 32개일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상보적 결합"은 1개 또는 2개의 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 또는 이중나선을 형성하면서 상보적인 염기 서열들이 쌍(pair)을 이루어 이합체(duplex) 구조를 형성하는 것을 나타낸다. 상보적 결합은 쌍을 이루는 뉴클레오티드 서열 간의 상보성이 왓슨-크릭 결합(Watson-Crick pair)을 이루거나, 일부 비 왓슨-크릭 결합(Non-Watson-Crick base pair)이 존재하여도 형성될 수 있다.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).
상기 염기서열을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥을 형성할 때, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 워블 염기쌍(wobble base pair), 즉, 비 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다.
또한, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester bond) 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 헤어핀 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있고, 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개, 15개, 16개, 64개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG이다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 헤어핀 RNA 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 19로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
구체적으로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 2개가 회귀성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 "회귀성(palindromic) 구조"는 이중가닥을 형성하는 2개의 염기서열이 5'-말단에서 3'-말단의 방향으로 동일한 순서의 염기서열로 구성되는 구조를 나타낸다. 본 발명에서 상기 회귀성 구조는 서열번호 1의 염기서열에서 3'-말단이 서열번호 2의 염기서열에서 5'-말단과 결합하여 단일가닥을 형성하고, 상기 형성된 단일가닥 2개가 서로 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 단일가닥은 서열번호 18로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 이중가닥에서 나선형 굽힘 구조는 2개일 수 있다.
또한, 상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 헤어핀 구조의 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 회귀성 구조를 갖고, 2개의 나선형 굽힘 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 체내에서 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시켜, 면역을 강화시킴으로써 면역 활성제로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성제는 조성물 총 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 활성제는 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 면역 활성제는 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드의 유효량은 세포내 농도가 1 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 면역 활성제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명자들은 이중가닥 RNA 또는 헤어핀 RNA 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하여(도 1), 그 중 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav가 나선형 굽힘 구조를 갖고(도 2), 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 7).
따라서, 본 발명에 따른 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시킴으로써, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역 활성제로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조
인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.
먼저, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 3 내지 10 및 서열번호 18 내지 19의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.
이에 따라, 도 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 5의 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-control 및 5'-PPP-control RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6의 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 9의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 10의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 구성되고, 이들 염기가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하며, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 아울러, 서열번호 18의 염기서열 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-16mer-Double Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 나아가, 서열번호 19의 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인
상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D2O를 포함하는 완충액에 용해시켜 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800 ㎒의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200 ㎳의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 1H-15H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125 ㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30 ㎳ 믹싱시간에서 1H-31P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 1H-31P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250 ㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.
NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4 Å, 1.8 내지 5.0 Å 및 3.8 내지 7.0 Å, 또는 1.8 내지 3.4 Å, 2.5 내지 4.5 Å, 3.5 내지 6.0 Å 및 4.0 내지 7.0Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 3JH1 ',H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최적화(restained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'의 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'의 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Int-NS1, 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double Bend 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있다.
실험예 1. RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현 확인
상기 실시예 1에서 제조된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다.
1.1. 세포주의 준비
먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3×106개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.
1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리
상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 실시예 1에서 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1×103개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX, 및 1.6 ㎕의 플러스-시약을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.
1.3. 인터페론-β의 발현 확인
상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 인터페론-β의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.
먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만든 뒤, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, 인터페론-β 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 이름 서열
서열번호 11 인터페론-β forward 5'-ggaggacgccgcattgac-3'
서열번호 12 인터페론-β reverse 5'-caatagtctcattccagccagtgc-3'
서열번호 13 GAPDH forward 5'-gcattgccctcaacgaccac-3'
서열번호 14 GAPDH reverse 5'-gaggccatgtgggccatgag-3'
서열번호 15 ISG56 forward 5'-gcctccttgggttcgtctacaa-3'
서열번호 16 ISG56 reverse 5'-tcaaagtcagcagccagtctca-3'
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 5'-말단에 하이드록시기를 갖더라도 굽힘 구조가 있는 RNA 올리고뉴클레오티드도 인터페론-β의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 2. 짧은 길이의 헤어핀 RNA에 의한 인터페론-β의 발현 확인
상기 실험예 1에서 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이때 인터페론-β의 발현에 영향을 미치는 RNA 올리고뉴클레오티드 부분의 확인을 위하여 굽힘 구조를 포함하는 더 짧은 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Bend-GC-8bp를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
단, 이때 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-control을 처리하였고, 양성 대조군은 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리하였다. 실험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC의 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였고, 5'-OH-Bend-GC-8bp는 3번 실험을 수행하였다.
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC를 처리한 경우 유의미한 수준으로 인터페론-β의 발현을 증가시켰다.
실험예 3. 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인
상기 실험예 2에서 확인된 5'-OH-Bend-GC-8bp 헤어핀 RNA에서 루프 부분을 제외한 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중나선 RNA인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum을 이용하여 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-Control을 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 5에 그래프로 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 염기서열이 상보적으로 결합된 최소 길이의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum이 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰다.
실험예 4. 포스포로티오에이트 결합 또는 회귀성 구조로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되거나, 굽힘 구조를 갖는 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 회귀성 구조로 연결되어 2개의 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않은 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 6에 그래프로 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 치환하여 세포 내로 주입된 RNA 올리고뉴클레오티드 중 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 대해 저항성을 갖고, 나선형 굽힘 구조를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰다.
실험예 5. 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 7에 그래프로 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰다.
따라서, 본 발명의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인터페론-β 및 ISG56의 우수한 발현 증가 활성을 나타내어, 면역 활성제로 사용할 수 있다.

Claims (26)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  4. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  7. 제4항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  8. 제4항에 있어서, 상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  9. 제4항에 있어서, 상기 루프가 4개 내지 50개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 루프가 UUGG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  11. 제4항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 19로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나선형 굽힘 구조는, 상기 이중가닥에서 서열번호 1의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)와 서열번호 2의 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)가 각각 워블 염기쌍(wobble base pair)일 때 서열번호 1의 네 번째 염기(A) 및 서열번호 2의 다섯 번째 염기(U)에서 형성되는 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
  15. 제12항의 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
  16. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G, N4는 C, N5는 G, 및 N6는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  19. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G, N4는 C, N5는 G, 및 N6는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  22. 제19항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 루프가 UUGG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  25. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
  26. 제24항의 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
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