CN115976109A - 一种靶向降解gbp蛋白的hsv-1溶瘤病毒及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向降解GBP蛋白的HSV‑1溶瘤病毒及其制备与应用，属于基因工程治疗领域。本发明提供了提高溶瘤病毒复制能力的方法，通过靶向抑制GBP蛋白家族实现。本发明提供了复制能力强的HSV‑1溶瘤病毒，其为表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV‑1，其通过在HSV‑1Δ34.5/Δ47(敲除了ICP34.5及ICP47基因的HSV‑1)的原ICP34.5基因位点插入IpaH9.8基因片段获得。本发明的溶瘤病毒可用于制备肿瘤治疗药物，其能促进淋巴细胞浸润及杀伤活性，抑制肿瘤生长，具有更好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于基因工程治疗领域，具体涉及一种靶向降解GBP蛋白的HSV-1溶瘤病毒及其制备与应用。
技术背景
溶瘤病毒是一类可以特异性感染并杀死肿瘤细胞的病毒，目前溶瘤病毒开发是癌症免疫治疗的研究热点之一。溶瘤病毒可以通过多种方式发挥肿瘤治疗效果。首先，病毒可以直接在肿瘤细胞中复制从而裂解杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长；其次，溶瘤病毒感染裂解肿瘤细胞后，释放的肿瘤相关抗原及危险信号能够刺激抗原呈递并有效激活抗肿瘤免疫反应；病毒感染刺激细胞释放细胞因子、趋化因子等，从而改善肿瘤抑制性微环境，促进免疫细胞浸润，增强肿瘤免疫反应。近些年研究发现，溶瘤病毒结合放化疗以及免疫检查点抑制剂治疗，均能明显提升肿瘤治疗效果。
此外，溶瘤病毒作为可复制的病毒载体，可以在肿瘤内高表达外源效应基因，进一步增强溶瘤病毒的治疗效果。目前溶瘤病毒携带的外源分子可分为肿瘤抗原、免疫刺激因子、免疫激活的配体以及趋化因子等。免疫刺激因子是目前溶瘤病毒重组表达最主要的外源效应分子，如GG-CSF、IL-12等。首个FDA批准的溶瘤病毒T-VEC即在HSV-1的ICP34.5位点插入GG-CSF，在临床治疗黑色素瘤中获得良好效果。
单纯疱疹病毒1型(Herpes Simplex Virus Type 1,HSV-1)是疱疹病毒科α病毒亚科，大小约180纳米，人是其唯一的自然宿主，70％～90％的成人感染过HSV-1，该病毒感染后会在人体内终身潜伏，引起的主要症状为口唇疱疹，对人类危害较小。此外，HSV-1抗病毒治疗有成熟的临床药物。HSV-1作为溶瘤病毒载体具有载量大、免疫刺激活性强等优点，因而HSV-1非常适合作为溶瘤病毒载体，除已被FDA批准的T-VEC外，在研的多种溶瘤病毒都基于HSV-1，广泛地用于尝试治疗膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤以及肝癌等。
鸟苷酸结合蛋白家族(GBP)属于干扰素诱导的动力蛋白GTP酶超家族成员，这些蛋白可以在免疫细胞和非免疫细胞中限制胞内病原体的复制。GBP的GTP酶可以靶向并裂解含有病原体的液泡膜，从而杀死液泡内的原生动物和细菌病原体。GBP还可以靶向核糖核酸病毒的复制复合物，从而抑制病毒复制。IpaH9.8为鼠伤寒沙门氏杆菌编码的E3泛素连接酶，已有研究发现IpaH9.8可以通过降解GBP1在内的多种GBP蛋白，帮助沙门氏杆菌逃避细胞免疫的监测。
目前改造溶瘤病毒的主要方向是通过重组表达外源基因，实现增强肿瘤免疫的目的，但很少有研究关注通过提高病毒自身复制能力，从而进一步提升溶瘤病毒治疗效果。本发明通过在HSV-1基因组中插入IpaH9.8，靶向降解病毒限制因子GBP，促进病毒复制，增强治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于解决HSV-1在瘤内复制不佳的问题，提供一种提高HSV-1溶瘤病毒复制能力的方法。本发明的目的还在于提供一种复制能力强的HSV-1溶瘤病毒，以及所述HSV-1溶瘤病毒的制备方法和应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供的提高溶瘤病毒复制能力的方法，通过靶向抑制GBP蛋白家族实现，具体为在溶瘤病毒基因组中插入降解GBP蛋白的基因，以重组表达靶向抑制或降解GBP蛋白的因子，促进溶瘤病毒复制。所述的溶瘤病毒为HSV-1溶瘤病毒。
在一些实施方案中，所述的HSV-1敲除了ICP34.5基因和ICP47基因。所述的提高HSV-1溶瘤病毒复制能力的方法为在HSV-1基因组的原ICP34.5处插入降解GBP蛋白的基因。
在一些实施方案中，所述的提高HSV-1溶瘤病毒复制能力的方法中，所述的降解GBP蛋白的基因为沙门氏杆菌IpaH9.8基因，所述的沙门氏杆菌IpaH9.8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种复制能力强的溶瘤病毒，其通过所述的提高溶瘤病毒复制能力的方法获得。
在一些实施方案中，所述的复制能力强的溶瘤病毒为HSV-1溶瘤病毒，为表达降解GBP蛋白的重组HSV-1。
在一些实施方案中，所述的HSV-1溶瘤病毒，为表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV-1。
一种表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV-1的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)RED重组第一步，利用电转在HSV-1Δ34.5/Δ47BAC原ICP34.5处插入核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的重组片段，利用Kana抗性筛选，挑取单克隆鉴定。核苷酸序列如SEQID NO.2所示的重组片段的示意图如图1所示，其含同源臂、IpaH9.8、部分EGFP、Kana及全长EGFP。
(2)RED重组第二步，利用重组片段中部分EGFP片段，重组删除Kana抗性基因，获取只插入IpaH9.8及GFP的HSV-1BAC，挑取单克隆进行鉴定。
(3)转染获得的重组BAC，获得表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV-1，命名为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8。
本发明还提供了所述的复制能力强的溶瘤病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用。
进一步地，所述的溶瘤病毒能够单独用于制备肿瘤治疗药物。此外，该溶瘤病毒可以联合其他肿瘤治疗药物或治疗手段用于制备肿瘤治疗药物或肿瘤联合治疗。其他治疗药物或手段包括但不限于放化疗、外科手术治疗、免疫检查点抑制剂、CAR-T等治疗药物。
一种肿瘤治疗药物，包含所述的溶瘤病毒，还可以包含其他肿瘤治疗药物，如放化疗、外科手术治疗、免疫检查点抑制剂、CAR-T等治疗药物。
Guanylate-binding proteins(GBP)蛋白家族在细菌及病毒感染过程中均发挥抑制作用，本发明通过靶向降解GBP蛋白从而提高HSV-1溶瘤病毒活性，提高溶瘤治疗效果。以HSV-1细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)为基础，利用RED重组技术敲除ICP34.5及ICP47基因，在原ICP34.5基因位点插入细菌IpaH9.8基因片段。在VERO细胞中转染HSV-1重组BAC，获取表达IpaH9.8的HSV-1溶瘤病毒。IpaH9.8可有效降解GBP家族成员，抑制细胞抗病毒免疫，从而有效提高病毒复制水平。溶瘤病毒可以选择性在肿瘤细胞中复制，释放的病毒进一步感染周围肿瘤细胞。裂解后的肿瘤细胞可以释放肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，激活树突状细胞，促进肿瘤抗原呈递，激活杀伤T细胞，溶瘤病毒感染产生的细胞因子及趋化因子能够促进淋巴细胞浸润，激活抗肿瘤免疫。因此，本发明采用抑制GBP蛋白家族的方法促进溶瘤病毒复制，在溶瘤疱疹病毒中重组表达细菌蛋白IpaH9.8，能够显著提高溶瘤疱疹病毒滴度，促进淋巴细胞浸润及杀伤活性，抑制肿瘤生长。
与现有技术相比，本发明的溶瘤病毒有以下优点和有益效果：
(1)本发明基于单纯疱疹病毒HSV-1，在人群中感染广泛，并有成熟的抗病毒治疗手段；
(2)溶瘤疱疹病毒HSV-1可以选择性裂解杀死肿瘤细胞，并且可以有效刺激免疫，释放肿瘤抗原及危险信号等，促进抗原呈递，改善肿瘤免疫微环境；
(3)IpaH9.8作为E3泛素连接酶，可以有效降解GBP蛋白，而GBP蛋白可以抑制病毒复制，本发明可以有效促进溶瘤病毒复制，获得更好的治疗效果。
附图说明
图1为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的重组片段的示意图。
图2为本发明中表达IpaH9.8的HSV-1病毒基因组结构示意图。
图3为EGFP-N1-for Kana质粒图谱。
图4为检测重组HSV-1是否表达IpaH9.8，以及IpaH9.8是否可以有效降解GBP蛋白。
其中图A是通过RT-qPCR检测IpaH9.8 mRNA水平；
图B表示分别用HSV-1Δ34.5/Δ47及HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8分别感染HT1080细胞，GBP1蛋白可被IpaH9.8降解。
图5为IpaH9.8表达促进HSV-1复制。
图A为HSV-1在共表达IpaH9.8及GBP1的HEK293T细胞中，比单独表达GBP1具有更好的复制能力；
图B为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8感染可有效降解GBP1，促进病毒蛋白表达；
图C为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8感染HT1080后具有更高的病毒滴度。
图6为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8对小鼠GC38皮下肿瘤具有更好的治疗效果。
图A为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8治疗小鼠GC38皮下瘤实验流程图；
图B为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8及对照组治疗后肿瘤体积变化曲线，证明HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8治疗效果显著优于HSV-1Δ34.5/Δ47；
图C-E为流式分析显示HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8感染下，肿瘤内T细胞浸润及细胞耗竭情况，表明HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8显著促进T细胞浸润；
图F-I为流式分析显示HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8感染下，脾脏内T细胞数及杀伤性，表明HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8与HSV-1Δ34.5/Δ47相比，脾脏T细胞数量及活性没有显著变化。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例中，引物均由生工生物公司合成。Phanta Gax Super-Fidelity DNAPolymerase(货号：P505-d1)购自南京诺唯赞公司。整合HSV-1F毒株细菌人工染色体的大肠杆菌工程菌株GS1783来自NTCC；DGEG高糖培养基、胰酶细胞消化液购自Sigma公司，100×青链霉素溶液购自Gibco公司，Fugene HD购自Promega公司；NheI、EcoRI及T4连接酶均购自NEB公司；qPCR GIX购自莫纳生物；FLAG及β-actin抗体购自武汉戴安生物公司，ICP5和ICP8抗体购自Santa Cruz公司；流式抗体均购自Biolegend；Gatrigel购自Corning公司；逆转录试剂盒购自北京艾德莱生物科技公司。
实施例1
1.构建HSV-1Δ34.5BAC
1)PCR获取敲除HSV-1ICP34.5的RED2同源重组片段
根据HSV-1ICP34.5基因两端序列设计RED2同源重组引物，敲除ICP34.5两端引物如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。
ICP34.5-KO-F：CGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGCGCCGTCCCAATGCCCGGGCCCTGGCCCGCGAGGATGACGACGATAAGTAGGG(SEQ ID NO.3)，
ICP34.5-KO-R：CGAGTTCGCCGGGCCGGCTCCGCGGGCCAGGGCCCGGGCATTGGGACGGCGCCCGTGGGCAACCAATTAACCAATTCTGATTAG(SEQ ID NO.4)。
以EGFP-N1-for Kana(其图谱如图3，序列如SEQ ID NO.21所示)为模板，以ICP34.5-KO引物PCR获取RED2重组片段。
表1 PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 18 |
| 2×Phanta Gax Buffer | 25 |
| dNTP Gix(10mG) | 1 |
| ICP34.5-KO-F(10μG) | 2 |
| ICP34.5-KO-R(10μG) | 2 |
| Phanta Gax Super-Fidelity DNA Polymerase | 1 |
| 质粒模板(20ng) | 1 |
将上述组分混匀，在PCR仪上进行以下反应：预变性95℃30s，变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃1min，彻底延伸72℃2min，25cycles。
1％琼脂糖胶150V电泳20min，于紫外灯下切取约1Kb单一条带。OGEGA GelExtractionKit(D2500)胶回收。
2)Red2重组获取HSV-1Δ34.5BAC
a)第一步重组：取HSV-1BAC GS1783菌株，于氯霉素平板划线，30℃培养箱培养；挑单克隆30℃摇菌；14h后转接到25mL培养基中，培养至OD＝0.6，取15mL菌液于50mL锥形瓶里，42℃搅拌水浴15min；将锥形瓶转移至冰水混合物中搅拌冰浴20min；将菌液转移到50mL离心管中0℃4500g 5-10min集菌；超净台及冰上操作，完全弃去培养基，先缓慢加入5mL预冷的ddH2O，轻轻吹打混匀，再加入5mL ddH2O，离心10min，重复2-3次；弃上清，加入75μLH2O，吹打混匀，加入1.5mL EP管中，随后加入100ng ICP34.5同源重组片段，混匀后加入电击杯进行电转，电压1.7kV，电击后电击常数值不小于4；完成后于电击杯中加入1mL新鲜LB，混匀后转移到1.5mL EP管中，摇床30℃、240rpm 1h；取菌液涂氯霉素(chloramphenicol)及卡那霉素(Kanamycin)双抗平板，30℃培养1d，Day2挑取单克隆，5mL氯霉素和卡那霉素双抗LB培养基30℃过夜后提BAC，根据HSV-1ICP34.5插入位点上下游设计PCR引物，引物序列分别如SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示，根据PCR片段大小验证同源重组片段是否插入HSV-1基因组中。
上游引物：ccagattacgctgcagctagcCGGGCCCCCCCCGAAACA(SEQ ID NO.5)，
下游引物：agatgcacgcgtagcgaattcCGGGAAGCGGAACAAGGC(SEQ ID NO.6)。
细菌人工染色体(BAC)提取步骤：8000rpm 2min收集GS1783菌株；600μL P1buffer(Tris-HCl 25mG pH8.0，EDTA 10mG，RNaseA 10μg/mL，Glucose 50mG)彻底重悬细菌，加600μL P2 buffer(NaOH 0.2G，SDS 1％)，颠倒混匀8次，RT 3min；加600μL P3 buffer(乙酸钾(CH3COOK)5G，乙酸(CH3COOH)5.75mL，H2O 14.25mL)，颠倒混匀8次，冰上10min，4℃13000rpm离心15min；取上清再次4℃离心10min；取上清加入0.7倍体积异丙醇,静置10min；4℃13000rpm离心20min；70％无水乙醇洗涤沉淀2次；干燥10min，加40μl TE buffer(Tris-HCl 10mG pH 8.0，EDTA 1mG)过夜重溶。
b)第二步重组：取第一步重组正确的单克隆菌液，转接到氯霉素抗性的2mL LB液体培养基中，32℃过夜培养；菌液按1:50转接到3mL LB中，培养至OD＝0.5-0.7；取2mL对数生长期菌液混合1.6mL LB及400μL 20％阿拉伯糖(终浓度为2％)，30℃培养45min，诱导I-Scel内切酶表达；42℃热激12min，32℃摇菌1-2h，取5-10μL菌液稀释涂板挑取菌落，分别于氯霉素及卡那霉素划线鉴定及PCR鉴定。仅于氯霉素LB固体培养板上生长的菌落说明第二步重组删除HSV-1基因组中卡那霉素基因；根据PCR片段产物大小验证HSV-1中卡那霉素基因是否被删除，PCR引物序列分别同SEQ NO.3及SEQ NO.4，此步验证正确的BAC命名为HSV-1Δ34.5。
2.构建HSV-1Δ34.5/Δ47BAC
1)PCR获取敲除HSV-1ICP47 RED2同源重组片段
于上述验证成功的HSV-1Δ34.5BAC基础上，进行ICP47敲除。敲除ICP47两端引物如SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示。
ICP47-KO-F：ccctccgcccagaaacttgggcgatggtcgtacccgggacgctcccccgcccgacgagcaaggatgacgacgataagtaggg(SEQ ID NO.7)，
ICP47-KO-R：ccgttgcgtggaccgcttcctgctcgtcgggcgggggagcgtcccgggtacgaccatcgcaaccaattaaccaattctgattag(SEQ ID NO.8)。
以EGFP-N1-for Kana为模板，ICP47-KO引物PCR获取RED2重组片段。
表2 PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 18 |
| 2×Phanta Gax Buffer | 25 |
| dNTP Gix(10mG) | 1 |
| ICP47-KO-F(10μG) | 2 |
| ICP47-KO-R(10μG) | 2 |
| Phanta Gax Super-Fidelity DNA Polymerase | 1 |
| 质粒模板(20ng) | 1 |
将上述组分混匀，在PCR仪上进行以下反应：预变性95℃30s，变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃1min，彻底延伸72℃2min，25cycles。
1％琼脂糖胶150V电泳20min，于紫外灯下切取约1Kb单一条带。OGEGA GelExtraction Kit(D2500)胶回收。
2)Red2重组获取HSV-1Δ34.5/Δ47BAC
a)第一步重组：取HSV-1Δ34.5菌株，于氯霉素平板划线，30℃培养箱培养；挑单克隆30℃摇菌；14h后转接到25mL培养基中，培养至OD＝0.6，取15mL菌液于50mL锥形瓶里，42℃搅拌水浴15min；将锥形瓶转移至冰水混合物中搅拌冰浴20min；将菌液转移到50mL离心管中0℃4500g 5-10min集菌；超净台及冰上操作，完全弃去培养基，先缓慢加入5mL预冷的ddH2O，轻轻吹打混匀，再加入5mL ddH2O，离心10min，重复2-3次；弃上清，加入75μL H2O，吹打混匀，加入1.5mL EP管中，随后加入100ng ICP47同源重组片段，混匀后加入电击杯进行电转，电压1.7kV，电击后电击常数值不小于4；完成后于电击杯中加入1mL新鲜LB，混匀后转移到1.5mL EP管中，摇床30℃、240rpm 1h；取菌液涂氯霉素(chloramphenicol)及卡那霉素(Kanamycin)双抗平板，30℃培养1d，Day2挑取单克隆，5mL氯霉素和卡那霉素双抗LB培养基30℃过夜后提BAC，根据HSV-1ICP47插入位点上下游设计PCR引物，引物序列分别如SEQ IDNO.9及SEQ ID NO.10所示，根据PCR片段大小验证同源重组片段是否插入HSV-1基因组中。
上游引物：taccggattacggggactgt(SEQ ID NO.9)，
下游引物：ataaaagggggcgtgaggac(SEQ ID NO.10)。
b)第二步重组：取第一步重组正确的单克隆菌液，转接到氯霉素抗性的2mL LB液体培养基中，32℃过夜培养；菌液按1:50转接到3mL LB中，培养至OD＝0.5-0.7；取2mL对数生长期菌液混合1.6mL LB及400μL 20％阿拉伯糖(终浓度为2％)，30℃培养45min，诱导I-Scel内切酶表达；42℃热激12min，32℃摇菌1-2h，取5-10μL菌液稀释涂板挑取菌落，分别于氯霉素及卡那霉素划线鉴定及PCR鉴定。仅于氯霉素LB固体培养板上生长的菌落说明第二步重组删除HSV-1基因组中卡那霉素基因；根据PCR片段产物大小验证HSV-1中卡那霉素基因是否被删除，PCR引物序列分别同SEQ NO.9及SEQ NO.10，此步验证正确的BAC命名为HSV-1Δ34.5/Δ47。
3.构建HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8病毒
1)获取插入IpaH9.8片段的EGFP-N1-for Kana中间质粒
以pCS2-IpaH9.8(pCS2-IpaH9.8的构建见Peng Li et al.,Nature,2017)为模板，PCR获取IpaH9.8片段，酶切连接至EGFP-N1-for Kana中间质粒NheI和EcoRI位点间，PCR引物序列分别如SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12所示。
上游引物：CTAgctagcatgttaccgataaataataacttttcattgcc(SEQ ID NO.11)，
下游引物：CCGgaattcttatgaatggtgcagttgtgagccg(SEQ ID NO.12)。
表3 PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 18 |
| 2×Phanta Gax Buffer | 25 |
| dNTP Gix(10mG) | 1 |
| 上游引物(10μG) | 2 |
| 下游引物(10μG) | 2 |
| Phanta Gax Super-Fidelity DNA Polymerase | 1 |
| 质粒模板(20ng) | 1 |
将上述组分混匀，在PCR仪上进行以下反应：预变性95℃30s，变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃2min，彻底延伸72℃5min，25cycles。
1％琼脂糖胶150V电泳20min，于紫外灯下切取约1.5Kb单一条带。OGEGA GelExtraction Kit(D2500)胶回收，片段序列如SEQ NO.19所示。
2)提取EGFP-N1-for Kana质粒，NEB公司NheI和EcoRI酶切。
表4酶切体系
| NheI | 1μL |
| EcoRI | 1μL |
| 10×NEB buffer | 5μL |
| 质粒 | 1μL |
加ddH2O补齐至50μL，37℃1h，OGEGA胶回收获取酶切质粒片段。
3)NEB T4连接酶连接将IpaH9.8插入酶切后的EGFP-N1-for Kana质粒
表5 T4连接酶体系
| 组分 | 20μL体系 |
| T4 DNA Ligase Buffer(10x) | 2μL |
| 酶切质粒(约6Kb) | 75ng(0.02pmol) |
| IpaH9.8片段(约1.6Kb) | 60ng(0.06pmol) |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | To 20μL |
室温2h，取DH5α感受态，加入20μL酶连体系，冰上30min，42℃热激90s，冰上2min后加入无抗性LB培养液，37℃活化1h，Amp抗性LB固体培养板过夜培养，挑取单克隆培养提质粒后，以NheI和EcoRI进行酶切鉴定。
3)获取插入IpaH9.8的HSV-1细菌人工染色体
a)PCR获取插入IpaH9.8的RED2同源重组片段
设计RED重组引物，以插入IpaH9.8片段的EGFP-N1-for Kana中间质粒为模板，PCR获取含有同源臂、IpaH9.8、部分EGFP、Kana及全长EGFP的IpaH9.8同源重组片段。IpaH9.8同源重组片段结构如图1所示，PCR引物序列分别见SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14。
上游引物：ATGCTTGCCTGTCAAACTCTACCACCCCGGCACGCTCTCTGTCTCCatgttaccgataaataataactt(SEQ ID NO.13)，
下游引物：GAGCTCCCGGGAGCTCCGCGGAAGACCCAGGCCGCCTCGGGTGTAACGtttacttgtacagctcgtccatgccgagag(SEQ ID NO.14)。
表6 PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 18 |
| 2×Phanta Gax Buffer | 25 |
| dNTP Gix(10mG) | 1 |
| 上游引物(10μG) | 2 |
| 下游引物(10μG) | 2 |
| Phanta Gax Super-Fidelity DNA Polymerase | 1 |
| 质粒模板(20ng) | 1 |
将上述组分混匀，在PCR仪上进行以下反应：预变性95℃30s，变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃4min，彻底延伸72℃5min，25cycle。
1％琼脂糖胶150V电泳20min，于紫外灯下切取约3.6Kb单一条带。OGEGA GelExtraction Kit胶回收。
B)Red/ET重组
(一)第一步重组：取HSV-1Δ34.5/Δ47菌株，于氯霉素平板划线，30℃培养箱培养；挑单克隆30℃摇菌；14h后转接到25mL培养基中，培养至OD＝0.6，取15mL菌液于50mL锥形瓶里，42℃搅拌水浴15min；将锥形瓶转移至冰水混合物中搅拌冰浴20min；将菌液转移到50mL离心管中0℃4500g 5-10min集菌；超净台及冰上操作，完全弃去培养基，先缓慢加入5mL预冷的ddH2O，轻轻吹打混匀，再加入5mL ddH2O，离心10min，重复2-3次；弃上清，加入75μL H2O，吹打混匀，加入1.5mL EP管中，随后加入100ng IpaH9.8同源重组片段，混匀后加入电击杯进行电转，电压1.7kV，电击后电击常数值不小于4；完成后于电击杯中加入1mL新鲜LB，混匀后转移到1.5mL EP管中，摇床30℃、240rpm 1h；取菌液涂氯霉素(chloramphenicol)及卡那霉素(Kanamycin)双抗平板，30℃培养1d，Day2挑取单克隆，5mL氯霉素和卡那霉素双抗LB培养基30℃过夜后提BAC，根据HSV-1ICP34.5插入位点上下游设计PCR引物，根据PCR片段大小验证IpaH9.8是否插入HSV-1BAC中，PCR引物序列分别如SEQNO.3及SEQ NO.4所示。
(二)第二步重组：取第一步重组正确的单克隆菌液，转接到氯霉素抗性的2mL LB液体培养基中，32℃过夜培养；菌液按1:50转接到3mL LB中，培养至OD＝0.5-0.7；取2mL对数生长期菌液混合1.6mL LB及400μL 20％阿拉伯糖(终浓度为2％)，30℃培养45min，诱导I-Scel内切酶表达；42℃热激12min，32℃摇菌1-2h，取5-10μL菌液稀释涂板挑取菌落，分别于氯霉素及卡那霉素划线鉴定及PCR鉴定。仅于氯霉素LB固体培养板上生长的菌落说明第二步重组删除HSV-1基因组中卡那霉素基因；根据PCR片段产物大小验证HSV-1中卡那霉素基因是否被删除，PCR引物序列分别同SEQ NO.5及SEQ NO.6，此步验证正确的BAC命名为HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8。
4.获取表达IpaH9.8的重组HSV-1病毒
6孔板培养VERO细胞1.5×105/孔，待细胞密度达到70％左右进行转染；转染前30min换optiGEG，将10μL BAC DNA与90μL optiGEG混合，加入5μL Fugene HD混匀，室温孵育转染复合物10分钟，向细胞中滴加转染复合物。当100％的细胞表现出明显的细胞病变效应收集病毒。
5.重组HSV-1表达IpaH9.8的鉴定
1)RT-qPCR检测IpaH9.8基因转录
于6孔板中培养HT1080细胞，待细胞密度达到80％左右，以HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8GOI＝1感染细胞，分别于6h、12h、24h收取细胞，随后500μL Trizol重悬细胞，室温裂解5min；加入100μL氯仿，置于涡旋仪震荡混匀，静置5min；12000g离心15min，吸取上清水相转移至新1.5mL EP管中；加入400μL异丙醇，颠倒混匀后静置10min；12000g离心10min；吸弃上清，加500μL 75％无水乙醇润洗沉淀，7500g离心5min；RNA沉淀吹干后，用DEPC水溶解，Nanodrop测定RNA浓度；取1μg RNA逆转录获得cDNA；获取的cDNA稀释20倍后，RT-qPCR检测病毒基因表达，IpaH9.8 qPCR引物分别如SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16所示；HSV-1US3qPCR引物分别如SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18所示；内参端粒酶(Telomerase)qPCR引物分别如SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示。
IpaH9.8 qPCR引物：GAAAACCTGCCAGCTTTACCCGATTC(SEQ ID NO.15)，CAGTGAGGAAATTACGGGTCGCTCTG(SEQ ID NO.16)；
US3 qPCR引物：TTACCGCGGAAGAACTGGAC(SEQ ID NO.17)，CCGTGGATCGTAAAGCCCAT(SEQ ID NO.18)；
Telomerase qPCR引物：GGCACACGTGGCTTTTCG(SEQ ID NO.19)，GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA(SEQ ID NO.20)。
表7 RNA逆转录体系
| 组分 | 体积/质量 |
| RNA | 1μg |
| 5×TRUE RT GasterGix | 4μL |
| <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | To 20μL |
PCR仪进行以下程序：25℃10min，42℃15min，85℃5s。
表8莫纳GonAmpTG ChemoHS qPCR反应体系
表9 BioRad CFX ConnectTG qPCR反应程序
结果如图4A显示，IpaH9.8和病毒基因US3表达随着感染时间延长而显著上升。
2)免疫印迹验证HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8病毒
于6孔板中培养HT1080细胞，待细胞密度达到80％左右，HSV-1Δ34.5/Δ47及HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8分别以GOI＝1感染细胞；24h后收集细胞，100μL/样NP-40裂解液冰上裂解10min，12000rpm离心5min，取80μL细胞裂解液加20μL 5×SDS-loading Buffer，95℃煮10min制样。8％ SDS-PAGE凝胶电泳，电压分别为80V 20min，120V 1h。湿转电压为100V60min。进行抗体孵育检测。
结果如图4B显示，HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8可有效降解GBP1蛋白。
6.IpaH9.8通过降解GBP1促进病毒复制
1)荧光显微镜检测IpaH9.8在HSV-1复制中的功能
HEK293T铺12孔板3个孔，待细胞密度达到70％左右，一孔均转染pCS2-Vector空载质粒1μg，一孔转染pCS2-Vector空载500ng及pCS2-GBP1质粒(pCS2-GBP1质粒的构建见PengLi et al.,Nature,2017)，最后一孔转染pcs2-GBP1空载500ng及pcs2-IpaH9.8质粒，质粒与脂质体(PEI)混合后静置15min，加入293T培养基中；24h后以GOI＝0.01感染HSV-1-GFP；48h后，荧光显微镜观察HSV-1-GFP复制情况。
结果如图5A所示，IpaH9.8可以有效促进HSV-1-GFP复制。
2)免疫印迹检测IpaH9.8在HSV-1复制中的功能
HSV-1Δ34.5/Δ47及HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8分别以GOI＝1感染HT1080细胞，12h后收细胞，NP-40裂解液制备样品，8％ SDS-PAGE凝胶电泳，免疫印迹检测蛋白表达。
结果如图5B所示，HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8可有效降解GBP1，促进病毒蛋白ICP5及ICP8表达。
3)空斑试验检测IpaH9.8在HSV-1复制中的功能
于6孔板中铺293T细胞生长，待细胞密度达到70％左右，转染VSV-G 400ng/mL，PSPAX21μg/孔及pCDH-FLAG-GBP1 1.2μg/孔，转染后约2天收取慢病毒上清；用慢病毒感染HT1080细胞，puromycin筛选后获得稳定表达FLAG-GBP1的HT1080稳定细胞系。以HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8及HSV-1Δ34.5/Δ47GOI＝0.01分别感染HT1080空载及稳定表达FLAG-GBP1的HT1080细胞系，48h后收集上清中病毒进行空斑实验滴定滴度。
结果如图5C所示，IpaH9.8可有效拮抗GBP1对HSV-1复制的抑制作用，提高HSV-1滴度。
7.重组IpaH9.8溶瘤病毒体内治疗效果
1)检测重组IpaH9.8溶瘤病毒对肿瘤生长的影响
取小鼠C57/7J分为三组，对照组为2组，实验组为1组，5只小鼠每组。对照组和实验组小鼠均左后肢皮下成瘤(三组小鼠均成瘤，注射体外培养的GC38结肠癌细胞数为106)。当肿瘤生长至150mm3左右，对照组1注射PBS溶液(100μL)，对照组2小鼠肿瘤部位注射5×106PFU HSV-1Δ34.5/Δ47溶瘤病毒(100μL)，实验组1小鼠肿瘤部位注射5×106PFU HSV-1Δ34.5/Δ47-IpaH9.8溶瘤病毒(100μL)，隔天注射，连续注射5次，注射病毒后小鼠正常饲养，观察并测量瘤体体积。具体流程如图6A所示。
结果如图6B所示，HSV-1Δ34.5/Δ47处理较PBS处理组显著抑制肿瘤生长，表达IpaH9.8可以进一步显著提升对肿瘤的抑制效果。
2)流式细胞术检测淋巴细胞浸润
(1)获取脾脏及肿瘤中淋巴细胞
a.分离脾脏淋巴细胞
从小鼠腹中取出脾脏，加GACS Buffer，并于单细胞滤网中揉搓，获取单细胞脾脏细胞，1800rpm离心4min；裂解红细胞后，细胞计数板计数，取106个细胞转移至1.5mL EP管用于细胞染色。
GACS Buffer(4℃储存)：1×PBS，0.5％ BSA，2mG EDTA。
b.分离肿瘤淋巴细胞
切取肿瘤组织，置于100mm培养皿中，加入5mL PBS，将肿瘤组织切成细碎小块；70μm单细胞滤网研磨过滤，1800rpm离心5min收集细胞；以3mL 40％percoll重悬吹打混匀并转移至15mL离心管中；用5mL注射器从注射管底缓慢加入3mL 80％percoll，室温2500rpm离心15min；收集40％与80％percoll中间界面的细胞至新15mL离心管中，1800rpm离心5min收集细胞；裂解红细胞后离心收集细胞，计数后取1million细胞转移至1.5mL EP管用于细胞染色。
(2)脾脏或肿瘤淋巴细胞染色
a.细胞表面染色
30μL体系以1:400稀释比例配制抗体cocktails，包括CD8-FITC、CD4-Blue、PD-1-APC及TIG3-PE；用抗体cocktails重悬细胞并吹打混匀，4℃黑暗中孵育15min；1800rpm离心4min收集细胞，1mL PBS吹打混匀；1800rpm离心4min，用250μL PBS重悬混匀并转移至FACS管中，进行流式分析。
b.细胞胞内染色
以RPGI1640(10％ FBS)配制刺激培养基，包含50ng/mL PGA、1μG Ionomycin、5μGBrefeldin A，1million细胞用400μL刺激培养基吹打混匀后转移到96孔板，放到细胞培养箱中处理4h；1800rpm离心4min，用150μL fixation buffer 4℃固定20min后，1800rpm离心4min；200μLperm wash buffer重悬离心后用30μL抗体cocktails(以perm wash buffer配制抗体cocktails：CD8-FITC、CD4-Blue、IFN-γ-APC及TNF-α-PE)重悬4℃过夜染色；第二天用500μL perm wash buffer洗两次后，用250μL PBS重悬细胞转移至流式管中，进行流式分析。
结果如图6C-6I所示，HSV-1-ICP34.5/47-KO IpaH9.8可有效提升肿瘤中的淋巴细胞浸润，并降低肿瘤淋巴细胞耗竭，提升脾脏淋巴细胞杀伤性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高溶瘤病毒复制能力的方法，其特征在于：所述的方法为在溶瘤病毒基因组中插入降解GBP蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的提高溶瘤病毒复制能力的方法，其特征在于：所述的溶瘤病毒为HSV-1溶瘤病毒；进一步地，所述的HSV-1敲除了ICP34.5基因和ICP47基因。
3.根据权利要求1或2所述的提高溶瘤病毒复制能力的方法，其特征在于：所述的降解GBP蛋白的基因为沙门氏杆菌IpaH9.8基因。
4.一种溶瘤病毒，其特征在于：通过权利要求1-3任一项所述的方法得到。
5.一种HSV-1溶瘤病毒，其特征在于：为表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV-1。
6.一种表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV-1的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)RED重组第一步，利用电转在HSV-1Δ34.5/Δ47BAC原ICP34.5处插入核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的重组片段，利用Kana抗性筛选，挑取单克隆鉴定；重组片段含同源臂、IpaH9.8、部分EGFP、Kana及全长EGFP；
(2)RED重组第二步，利用重组片段中部分EGFP片段，重组删除Kana抗性基因，获取只插入IpaH9.8及GFP的HSV-1BAC，挑取单克隆进行鉴定；
(3)转染获得的重组BAC，获得表达沙门氏杆菌IpaH9.8基因的重组HSV-1。
7.权利要求4或5所述的溶瘤病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的溶瘤病毒能够单独用于制备肿瘤治疗药物；或所述的溶瘤病毒联合其他肿瘤治疗药物用于制备肿瘤治疗药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：其他治疗药物包括放化疗、外科手术治疗、免疫检查点抑制剂、CAR-T治疗药物。
10.一种肿瘤治疗药物，其特征在于：包含权利要求4或5所述的溶瘤病毒。
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