JP2008532520A - Ｔｏｌｌ様受容体８のシグナル伝達によるｃｄ４＋調節性ｔ細胞の抑制機能の直接的な反転 - Google Patents

Ｔｏｌｌ様受容体８のシグナル伝達によるｃｄ４＋調節性ｔ細胞の抑制機能の直接的な反転 Download PDF

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Abstract

ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は宿主の免疫応答を大きく抑制するため、自己免疫疾患から保護し、その一方で、所望される免疫応答（例えば、抗腫瘍免疫性など）を制限する。合成されたホスホロチオエート保護のグアノシン含有オリゴヌクレオチドは、樹状細胞に影響を与えることなく、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を直接に反転させることができる。この作用は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）８を介するシグナル伝達、ならびに、ＭｙＤ８８分子およびＩＲＡＫ４分子の関与によって伝達されるようである。ヒトＴＬＲ８に対する天然リガンドによるＴｒｅｇ細胞の刺激は、合成されたグアノシン含有オリゴヌクレオチドの作用を再現した。

Description

本出願は米国仮特許出願第６０／６６０，０２８号（その内容は参考として本出願に組み込まれる）の利益を主張する。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた補助金番号Ｒ０１ＣＡ９０３２７、同Ｒ０１ＣＡ１０１７９５、同Ｐ５０ＣＡ５８２０４、同Ｐ５０ＣＡ０９３４５９および同ＰＯ１ＣＡ９４２３７による政府援助により一部がなされた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）および抗原誘導性Ｔｒｅｇ細胞は、宿主の免疫応答を抑制することによって自己寛容を誘導するので、多くの自己免疫疾患の防止において非常に重要な役割を果たしている。しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞は、ワクチン接種または他の全身性抗原刺激によって誘発される免疫応答を潜在的には抑制するので、癌または他の病気に対する免疫治療への有害な作用を有し得る。様々なＣＤ４＋Ｔ細胞集団全体におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の割合が増大が、肺、乳房および卵巣の腫瘍を含める種々のタイプの癌患者において観測されている。患者から採取した新鮮な腫瘍組織に由来する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を単離することができ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）株を確立することができる。これらの細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制し、細胞−細胞の接触機構を介したＣＤ４＋エフェクター細胞によるインターロイキン（ＩＬ）−２の分泌を阻害しており、それらの抑制機能は高濃度のＩＬ−２によって反転させることができなかった。従って、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞および腫瘍部位に存在する腫瘍特異的Ｔｒｅｇ細胞はともに、癌および他の疾患の免疫治療を成功させることに対する大きな障害となっている。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）により、１組の保存された分子構造、いわゆる、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、これにより、Ｔｏｌｌ様受容体は自然免疫応答および適応免疫応答を検知し、開始させることができる。そのような応答は一般には、樹状細胞（ＤＣ）がナイーブＴ細胞を活性化すること、および、ＤＣがＴｒｅｇ細胞を制御する潜在能力を獲得することを可能にするＤＣ成熟プログラムの誘導によってもたらされると考えられている。ＴＬＲリガンド（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）およびＣｐＧ ＤＮＡなど）によるマウスＤＣの刺激は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−６など）を分泌するように、またＣＤ４＋エフェクター細胞をＴｒｅｇ細胞媒介の抑制に対して不応性にするようにＤＣを誘導することが報告されている。
本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞および抗原誘導されたＴｒｅｇ細胞の免疫抑制能を阻害する方法に関連する。これらの細胞の免疫抑制活性は、ＴＬＲ８−ＩＲＫＡ４−ＭｙＤ８８のシグナル変換経路を介して短いグアニン含有オリゴヌクレオチドによってダウンレギュレーションされる。本発明はまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞および抗原誘導されたＴｒｅｇ細胞の免疫抑制能を阻害する化合物を同定する方法を開示する。この方法は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の並行サンプルの細胞成長速度および／または細胞分裂速度の比較を含む。阻害されていないＴｒｅｇ細胞にさらされたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、対照ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、および、化合物で処理されたＴｒｅｇ細胞にさらされたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と比較される。Ｔｒｅｇ抑制の反転が、様々に処理されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の相対的な成長によって測定される。本発明はまた、疾患（例えば、感染症またはガンなど）に苦しむ生物に関連して、Ｔｒｅｇ細胞媒介による免疫抑制を低下させるための特定された阻害化合物の適用を包含する。免疫活性における生じる増大は、疾患状態と闘うための生物の免疫応答を助ける。
上記は、下記の本発明の詳細な説明がより十分に理解されるために、本発明の特徴および技術的利点をかなり広く概略している。本発明の請求項の主題を形成する本発明のさらなる特徴および利点が本明細書中下記に記載される。開示された概念および具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するために他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者によって理解されるはずである。そのような等価な構築は、添付される請求項に示されるような本発明の精神および範囲から逸脱しないこともまた当業者によって認識されるはずである。さらなる目的および利点と一緒になって、操作のその構成および方法の両方に関して本発明に特徴的であると考えられる新規な特徴が、添付される図面に関連して検討されるとき、下記の説明からより十分に理解される。しかしながら、図面のそれぞれは例示および説明のために提供されるだけであり、本発明の範囲の定義として意図されないことを特に理解しなければならない。本明細書中に引用されるすべての記事、論文および他の参考文献は参照により組み込まれる。参照によるこの組み込みには、これらの組み込まれた記事、論文および他の参考文献において示されるか、または、そうでない場合には、これらの組み込まれた記事、論文および他の参考文献によって引用される記事、論文および他の参考文献が含まれる。
本発明をより完全に理解するために、次に、添付される図面と合わせて下記の説明が参照される。
定義
本明細書中で使用されるように、請求項および／または明細書における用語「含む」と併せて使用されるとき、単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「ｏｎｅ（１つ）」を意味する場合があり、それはまた、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは２つ以上」の意味と一致する。なおさらに、用語「有する」、用語「包含する」、用語「含有する」および用語「含む」は交換可能であり、当業者は、これらの用語が制約のない用語であることを認識している。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法からなり得るか、あるいは、本発明の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法から本質的になり得る。本明細書中に記載される方法または組成物はどれも、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して実行され得ることが意図される。
別途定義されない限り、本明細書中で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語が下記において定義される。
「有効量」は、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を阻害することができる、Ｔｒｅｇ細胞の環境におけるオリゴヌクレオチドの濃度である。本明細書中で使用される用語「治療有効量」は、疾患または状態の症状の改善または治療をもたらす量を示す。
用語「核酸」は当技術分野では広く知られている。本明細書中で使用される「核酸」は一般には、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの誘導体もしくはアナログの分子（すなわち、鎖）を示す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡに見出される天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）、あるいは、ＲＮＡに見出される天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）が含まれる。用語「核酸」は用語「オリゴヌクレオチド」および用語「ポリヌクレオチド」を包含する（それぞれが用語「核酸」の下位概念として）。用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが約３個および約１００個の間の核酸塩基の分子を示す。用語「ポリヌクレオチド」は、長さが約１００個を超える核酸塩基の少なくとも１つの分子を示す。これらの定義は一般には一本鎖分子を示すが、特定の実施形態では、一本鎖分子に対して部分的、実質的または完全に相補性であるさらなる鎖もまた包含する。従って、核酸は、分子を構成する特定の配列の１つまたは複数の相補的な鎖または「相補体」を含む二本鎖分子または三本鎖分子を包含し得る。本明細書中で使用されるように、一本鎖核酸は接頭辞「ｓｓ」によって表示され、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」によって表示され、三本鎖核酸は接頭辞「ｔｓ」によって表示され得る。好ましくは、天然の有機塩基を含む核酸においては、塩基はメチル化されていない。核酸分子は、存在する核酸供給源から得ることができるが、好ましくは合成である。
用語「ライブラリー」には、小分子の検索可能な集団または分子の混合物が含まれる。１つの実施形態において、ライブラリーは、活性についてスクリーニングすることができるサンプルまたは試験画分（小分子または単離された小分子のいずれかの混合物）から構成される。例えば、サンプルをハイスループットスクリーニングアッセイに好適な様式でウエルに加えることができる。さらなる実施形態において、ライブラリーは、ライブラリーを目的とする標的（例えば、生細胞、タンパク質または核酸）と接触させることによって結合性化合物についてスクリーニングすることができる。
「Ｄ型ＣｐＧオリゴヌクレオチド」は、米国特許第６，９７７，２４５号（３参照により組み込まれる）によって開示されるように当技術分野では広く知られている。Ｄ型ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般には、ＣｐＧジヌクレオチド配列と、４個以上の連続したグアニン残基の領域とを含有する。Ｄ型ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般には、長さが１８ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチドの間であり、下記の配列内容の１つまたは複数を含有し得る：
５’−Ｘ１Ｘ２ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号１９）
５’−Ｘ１Ｘ２ＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号２０）
５’−Ｘ１Ｘ２ＴＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号２１）
５’−Ｘ１Ｘ２ＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号２２）
５’−ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号２３）
５’−ＧＧＴＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号２４）
５’−ＧＧＴＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３；（配列番号２５）または
５’−ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧ−３’；（配列番号２６），
式中、Ｘは任意の核酸塩基または非存在であり得る。
「ＣｐＧ非含有組換えＤＮＡ」は、ＣｐＧジヌクレオチド配列を含有しない組換えＤＮＡである。
「ヌクレアーゼ耐性の残基間骨格結合」は、天然に存在するホスホジエステル結合と比較して、インビボでヌクレアーゼ分解に対してより抵抗性がある核酸における有機塩基間の化学的結合である。好ましい化学的結合は、ホスホロチオエート（すなわち、核酸分子のリン酸の酸素の少なくとも１つが硫黄によって置換される）またはホスホロジチオエート修飾された核酸分子である。他の安定化された核酸分子には、非イオン性ＤＮＡアナログ、例えば、荷電酸素成分がアルキル化されるアルキルホスホナートおよびアリールホスホナート、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルなどが含まれる。ジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなど）をいずれかの末端または両末端に含有する核酸分子もまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に抵抗性であることが示されている。
「ヌクレアーゼ感受性の残基間骨格結合」は、核酸における有機塩基間のホスホジエステル結合であり、または、ホスホジエステル結合と少なくとも同じ速度でヌクレアーゼ活性からインビボで分解する、当技術分野において知られている代替物である。
「免疫原性組成物」は、投与されたときに対象において免疫応答を誘発することができる任意の組成物である。本明細書中で使用される用語「ワクチン」は、その物質を投与したときに免疫応答（例えば、抗体の産生）を惹起させることにより、免疫性を与えるために使用される物質として定義される。従って、ワクチンは抗原性および／または免疫原性の組成物である。
「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ細胞）は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能的に定義されたサブセットである。Ｔｒｅｇ細胞は、自己抗原に対する免疫学的反応性を制御するためにインビボで機能する。この機能は例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞などのナイーブ免疫エフェクター細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）の活性化を抑制することができるＴｒｅｇ細胞の能力によって明らかにされる。Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスが、胸腺由来の天然Ｔｒｅｇ細胞および抗原誘導されたＴｒｅｇ細胞である。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は自己抗原の免疫寛容を媒介しており、それらの調節異常が自己免疫疾患において役割を果たし得る。抗原誘導されたＴｒｅｇ細胞が末梢の抗原刺激によって誘導される。この下位カテゴリーのＴｒｅｇ細胞が腫瘍浸潤リンパ球の中に見出され、腫瘍抗原への寛容を媒介している。Ｔｒｅｇ細胞の活性化は抗原特異的であり得るが、Ｔｒｅｇの免疫抑制は抗原特異的ではない。従って、Ｔｒｅｇの活性により、全体的に抑制免疫状態がもたらされる。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−２受容体ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団として特徴づけられている。しかしながら、いくつかの実験では、ＣＤ２５が同じ条件のもとでＴｒｅｇ細胞によって発現されない場合があることが明らかにされている。Ｔｒｅｇ細胞に強く関連する他の分子マーカーが、転写因子ＦＯＸＰ３、および、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ、これはまたＴＮＦＲＳＦ１８として知られている）である。しかしながら、これらの分子マーカーはどれも、Ｔｒｅｇの正体を確定するものではなく、また、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性と完全には相関していない。
「サイトカイン」は、免疫性、炎症および造血を媒介および調節する小さい分泌タンパク質である。サイトカインは免疫刺激因子に応答して新たに産生されなければならない。サイトカインは一般に（必ずしも常にではない）、短い距離および短い時間期間で、また、非常に低い濃度で作用する。サイトカインは、特異的な膜受容体に結合し、その後、その受容体が二次メッセンジャー（多くの場合、チロシンキナーゼ）を介してシグナルを細胞に伝えて、その挙動を変化させることによって作用する。サイトカインに対する応答には、膜タンパク質（サイトカイン受容体を含む）の発現を増大または減少させること、増殖、および、エフェクター分子の分泌が含まれる。サイトカインは一般的な名称であり、他の名称には、リンホカイン（リンパ球によって産生されるサイトカイン）、モノカイン（単球によって産生されるサイトカイン）、ケモカイン（走化性活性を有するサイトカイン）およびインターロイキン（ある種の白血球によって産生され、他の白血球に作用するサイトカイン）が含まれる。サイトカインは、サイトカインを分泌する細胞に作用することができ（オートクリン作用）、または、近くの細胞に作用することができ（パラクリン作用）、または、一部の場合には、遠方の細胞に作用することができる（エンドクリン作用）。サイトカインは多くの細胞集団によって産生されるが、主たる産生体はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）およびマクロファージである。サイトカインの最大の群は免疫細胞の増殖および分化を刺激する。この群には、Ｔ細胞を活性化するインターロイキン１（ＩＬ−１）；抗原により活性化されたＴ細胞およびＢ細胞の増殖を刺激するＩＬ−２；Ｂ細胞の増殖および分化を刺激するＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−６；マクロファージを活性化するインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）；ならびに、造血を刺激するＩＬ−３、ＩＬ−７および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。
「対象」は、本明細書によって開示される方法に従って核酸が与えられている生物である。好ましくは、対象は機能的なＴＬＲ８を対象のＴｒｅｇ細胞において発現する。好ましくは、対象は、マウス（これは機能的なＴＬＲ８を発現しない）とは異なる哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
本発明の実施では、別途示されない限り、当技術分野の技術に含まれる、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡなどの従来の技術が用いられる。そのような技術が文献に詳しく説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版、１９８９）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ、Ｊ．Ａ．ＳｍｉｔｈおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編、１９８７）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１）；ＡＮＮＵＡＬ ＲＥＶＩＥＷ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、ならびに、雑誌におけるモノグラフ、例えば、ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹなどを参照のこと。
説明
新しいクラスの免疫学的に活性なオリゴヌクレオチドが開示される。これらの免疫学的に活性なオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）を介して作用し、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）におけるＴＬＲ８−ＩＲＫＡ４−ＭｙＤ８８シグナル交換経路を活性化する。このシグナル伝達により、免疫学的活性の低下をもたらすＴｒｅｇ細胞の活性がダウンレギュレーションされる。１つの実施形態において、この新しいクラスの免疫学的に活性なオリゴヌクレオチドには、グアノシンと、部分的に安定化された残基間骨格またはヌクレアーゼ耐性の残基間骨格とを伴うオリゴヌクレオチドが含まれる。代表的な一群のオリゴヌクレオチドが図２Ｆに示される（＊はヌクレアーゼ耐性の残基間骨格結合を示す）。この新しいクラスのオリゴヌクレオチドには、当技術分野で既に知られているＣｐＧ−ＡオリゴヌクレオチドまたはＤ型ＣｐＧオリゴヌクレオチドは含まれない。図２Ｃに示されるように、この新しいクラスの免疫学的に活性なオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチド配列を有することに依存しない。オリゴヌクレオチドは安定性の理由のためにデオキシリボ核酸であることが好ましく、しかし、他の実施形態では、リボ核酸が含まれる場合がある。このようなオリゴヌクレオチドの好ましい長さは約４ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは約５ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドである。部分的に安定化された骨格を伴う実施形態では、ヌクレアーゼ耐性の残基間結合をグアノシンと隣接残基との間に有することが好ましい。
本発明の別の実施形態は、この新しいクラスの免疫学的に活性なオリゴヌクレオチドを利用してＴｒｅｇ細胞の免疫抑制能を阻害する方法に関連する。図２Ａ〜図２Ｅに示されるように、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性が有効量のグアニン含有オリゴヌクレオチドによってダウンレギュレーションされる。具体的な実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の活性が、オリゴヌクレオチド投薬量の力価測定系列によって決定される有効量によりインビトロでダウンレギュレーションされる（図６）。このＴｒｅｇ抑制方法は、腫瘍由来の抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞（図２Ａ〜図２Ｄ）、および、胸腺由来の循環しているＴｒｅｇ細胞（図２Ｅ）に関して効果的である。従って、Ｔｒｅｇ細胞の活性を抑制するこの方法は、広範囲の様々な状況において、例えば、感染性疾患または癌の対象において効果的に適用することができる。
本発明の別の実施形態は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞および抗原誘導されたＴｒｅｇ細胞の免疫抑制能を阻害する化合物を同定する新規な方法に関連する。図４Ａに示される好ましい実施形態において、この方法は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の並行サンプルの細胞成長速度および／または細胞分裂速度の比較を含む。阻害されていないＴｒｅｇ細胞にさらされたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、１）対照ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、および、２）目的とする化合物で処理されたＴｒｅｇ細胞にさらされたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と比較される。Ｔｒｅｇ抑制の反転が、様々に処理されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の相対的な成長速度によって測定される。具体的な実施形態において、化合物を同定するための方法は、化合物のライブラリーまたはコレクションをスクリーニングするために使用される。そのようなライブラリーは当技術分野では広く知られており、また、広範囲に入手可能である（例えば、ＮＩＨ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ｈｔｔｐ：／／ｍｌｓｍｒ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｐａｒｔｎｅｒｓ．ｃｏｍ／ＭＬＳＭＲ＿ＨｏｍｅＰａｇｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。ライブラリースクリーニングによって特定されたリード化合物は続いて、Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制を反転させるための医薬的に許容され得る化合物を得るために改変することができる。好ましい実施形態において、化合物を同定するための方法は、細胞に基づくアッセイのハイスループットライブラリースクリーニングのために当技術分野で広く知られているロボットシステムおよび他のデバイスを使用して半自動化または全自動化される（例えば、米国特許第６，４００，４８７号（化学化合物をスクリーニングするための方法および装置）を参照のこと）。
実施例
Ｔｒｅｇ細胞株の確立および天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の精製
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇクローンを、当技術分野で広く知られている方法（例えば、Ｈ．Ｙ．Ｗａｎｇ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０、１０７〜１１８（２００４）を参照のこと）を使用してＣＤ４＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ１０２およびＴＩＬ１６４）から確立し、１０％ヒトＡＢ血清および組換えＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ＴＩＬ１０２細胞またはＴＩＬ１６４細胞に由来するＴｒｅｇクローンを貯蔵し、Ｔｒｅｇ１０２またはＴｒｅｇ１６４と称した。天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２５抗体による染色の後、新鮮なＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞集団を分取することによって得た。最適な拡大を得るために、ＯＫＴ３拡大法を、当技術分野で広く知られている方法（例えば、Ｈ．Ｙ．Ｗａｎｇ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０、１０７〜１１８（２００４）を参照のこと）を使用して行った。Ｔ細胞クローンを低いＩＬ−２濃度（３００ＩＵ／ｍｌ）で維持した。この研究で使用されたメラノーマ細胞株およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株およびエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。
ナイーブＴ細胞集団のＴｒｅｇ抑制についてのアッセイ
Ａ．樹状細胞（ＤＣ）を用いた増殖アッセイ：ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｖｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから精製した。ＤＣは、ＩＬ−４（５００ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＰＢＭＣ由来の単球から７日間で発生した。１ｘ１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、２ｘ１０４個のＤＣと、抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）と、下記のＴＬＲリガンドまたはサイトカインの１つとを含有する２００ｕｌの培地において異なる比率（１：０．２、１：０．１および１：０．０５）で調節性Ｔ細胞とともに培養した：ＣｐＧ−Ａ（３ｕｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ−Ｂ（３ｕｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）。５６時間の培養の後、［３Ｈ］チミジンを１ｕＣｉ／ウエルの最終濃度で加え、その後、さらに１６時間の培養を行った。［３Ｈ］チミジンの取り込みを、当技術分野で広く知られている方法（例えば、Ｍ．Ｋ．Ｌｅｖｉｎｇｓ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９６、１３３５〜４６（２００２）を参照のこと）を使用して液体シンチレーションカウンターにより測定した。すべての実験を三回行った。
Ｂ．ＤＣ非存在下での増殖アッセイ：１ｘ１０５個のＣＤ４Ｔ細胞を、下記のＴＬＲリガンドまたはサイトカインの存在下または非存在下、抗ＣＤ３ｍＡｂ被覆（２ｕｇ／ｍｌ）の９６ウエルプレートにおいて異なる比率（１：０．２、１：０．１および１：０．０５）で調節性Ｔ細胞とともに培養した：ＣｐＧ−Ａ（３ｕｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ−Ｂ（３ｕｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）。５６時間の培養の後、［３Ｈ］チミジンを１ｕＣｉ／ウエルの最終濃度で加え、その後、さらに１６時間の培養を行った。［３Ｈ］チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した。
Ｃ．Ｔｒｅｇ細胞の前処理：１ｘ１０６個のＴｒｅｇ細胞を、ＣｐＧ−Ａ（３ｕｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ−Ｂ（３ｕｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地で３日間培養した。３回の洗浄の後、前処理されたＴｒｅｇ細胞を、それらの抑制機能を明らかにするために、抗ＣＤ３ｍＡｂ被覆プレート（ＤＣ非存在）においてナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とともに培養した。５６時間の培養の後、［３Ｈ］チミジンを１ｕＣｉ／ウエルの最終濃度で加え、さらに１６時間培養した。［３Ｈ］チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した。
ＦＡＣＳ分析
Ｔｒｅｇ細胞におけるＣＤ４、ＣＤ２５およびＧＩＴＲの発現を、特異的な抗体（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）による染色の後、ＦＡＣＳ分析によって測定した。天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を単離するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＰＥまたはＦＩＴＣのいずれかに共役化された抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２５抗体により染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣＳＡＲＩＡによってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団に分けた。カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識化細胞を用いた実験のために、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞（１ｘ１０７個）をＣＦＳＥ（４．５ｕＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから得られる）により３７℃で１５分間染色した。数回の洗浄の後、標識化細胞を、１０％ヒトＡＢ血清およびＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｔｒｅｇ細胞による細胞分裂の抑制を測定するために、非標識化Ｔｒｅｇ細胞を、ＣｐＧ−ＡまたはポリＧ２（３ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、ＯＫＴ３（２ｕｇ／ｍｌ）により事前に被覆された２４ウエルプレートにおいてＣＦＳＥ標識化ナイーブＴ細胞に１：１の比率で加えた。３日間の培養の後、細胞を、ＣＦＳＥ標識化細胞を対象とするＦＡＣＳによって分析した。
ｒｔＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴキット（逆転写）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＴ細胞から抽出した。２μｇの全ＲＮＡを含有する２０μｌの逆転写混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のｍＲＮＡレベルを、ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＰＣＲ反応を、プライマー、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ４またはＨＰＲＴに対して特異的な内部の蛍光性ＴａｑＭａｎプローブ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した）を用いて行った。それぞれのサンプルにおけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８およびＩＲＡＫ４のｍＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴの相対的な量に対して標準化した。すべてのサンプルを三回処理した。Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＬＲ８、ＭｙＤ８８およびＩＲＡＫ４の特異的なノックダウンのために、Ｔｒｅｇ細胞に、それぞれの遺伝子についての対応するｓｉＲＮＡを感染させ、Ｔｒｅｇ細胞を形質導入（ＧＦＰ＋）細胞集団および非形質導入（ＧＦＰ−）細胞集団に分けた。全ＲＮＡを、関連遺伝子の発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって明らかにするために、形質導入（ＧＦＰ＋）細胞集団および非形質導入（ＧＦＰ−）細胞集団の両方から抽出した。関連性のない遺伝子の発現レベルを対照とした。従来の逆転写ＰＣＲのために、遺伝子特異的なプライマーを使用し、反応を、最初の変性については９４℃で２分間の２８サイクル、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間および７２℃で４５秒間の２８サイクルについて処理し、その後、７２℃で１０分間の伸長を行った。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで分離した。
下記のプライマーをＴＬＲ７について使用した：
（ＴＬＲ７−５Ｐ，５’ＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＴＧＴ；（配列番号２７）
ＴＬＲ７−３Ｐ，５’ＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＴ），（配列番号２８）
ＴＬＲ８については、
（ＴＬＲ８−５Ｐ，５’−ＡＴＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＴＴ；（配列番号２９）
ＴＬＲ８−３Ｐ，５’ＴＧＣＴＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡ），（配列番号３０）
ＴＬＲ９については、
（ＴＬＲ９−５Ｐ，５’ＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣ；（配列番号３１）
ＴＬＲ９−３Ｐ，５’ＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＧＧＴＴＡＴＡＧＡＡＧＴＧＣ）（配列番号３２）
レンチウイルスに基づくｓｉＲＮＡ
それぞれの遺伝子について数個のｓｉＲＮＡ配列（１９ヌクレオチド）をコンピューター支援プログラムの使用によって選択した。ｓｉＲＮＡ配列、８ヌクレオチドのスペーサー、および、ポリＴ転写終結配列を含有するオリゴヌクレオチドを、当技術分野で広く知られている方法（例えば、Ｄ．Ａ．Ｒｕｂｉｎｓｏｎ他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３３、４０１〜６（２００３）を参照のこと）を使用してアニーリングさせ、その後、ＧＦＰ発現用ｐＬｅｎｔｉｌｏｘ３．７ベクターのＨａｐＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローン化した。ｓｉＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にあった。ＩＲＡＫ４、ＭｙＤ８８、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のためのｓｉＲＮＡを構築するために使用された下記のＤＮＡ配列は、それらの対応する遺伝子を沈黙させることにおいて効果的であった：
ＩＲＡＫ４ ｓｉＲＮＡ１，５’ＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡ；（配列番号３３）
ＩＲＡＫ４ ｓｉＲＮＡ２，５’ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＴＡ；（配列番号３４）
ＩＲＡＫ４ ｓｉＲＮＡ３，５’ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＧＡＣＴＡ；（配列番号３５）
ＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡ１，５’ＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＴＡ；（配列番号３６）
ＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡ２，５’ＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＴ；（配列番号３７）
ＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡ３，５’ＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡ；（配列番号３８）
ＴＬＲ７ ｓｉＲＮＡ１，５’ＧＣＣＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴ；（配列番号３９）
ＴＬＲ７ ｓｉＲＮＡ２，５’ＧＧＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧＡ；（配列番号４０）
ＴＬＲ７ ｓｉＲＮＡ３，５’ＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡ；（配列番号４１）
ＴＬＲ７ ｓｉＲＮＡ４，５’ＧＧＧＧＴＡＴＣＡＧＣＧＴＣＴＡＡＴＡ；（配列番号４２）
ＴＬＲ８ ｓｉＲＮＡ１，５’ＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴＡ；（配列番号４３）
ＴＬＲ８ ｓｉＲＮＡ２，５’ＧＡＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＡＴＡＣＣＴＡ；（配列番号４４）
ＴＬＲ８ ｓｉＲＮＡ３，５’ＧＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＡ；（配列番号４５）
ＴＬＲ８ ｓｉＲＮＡ４，５’ＧＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＡ；（配列番号４６）
ＴＬＲ９ ｓｉＲＮＡ１，５’ＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＴＡＣＡＡＧＡ；（配列番号４６）
ＴＬＲ９ ｓｉＲＮＡ２，５’ＧＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＣＴＡＧＡＴＧＴ；（配列番号４８）
ＴＬＲ９ ｓｉＲＮＡ３，５’ＧＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡ．（配列番号４９）
ウエスタンブロッティングおよびＲＮＡ干渉
それぞれの遺伝子の発現レベルを評価するために、ＩＲＡＫ４およびＭｙＤ８８をＦＬＡＧ付きｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローン化し、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９をＨＡ付きｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローン化した。２９３Ｔ細胞（１．２ｘ１０６個／ウエル）を６ウエルプレートに４時間播種し、その後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、標的遺伝子をコードする２μｇのプラスミド＋／−対応するｓｉＲＮＡプラスミドＤＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡプラスミドＤＮＡ（２μｇ）によりトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションされた細胞を溶解し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した後、標的タンパク質の発現を、ＭｙＤ８８およびＩＲＡＫ４については抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）、あるいは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９については抗ＨＡ抗体のいずれかによりプローブし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役化二次抗体によりプローブした。β−アクチンがサンプル負荷のための対照として役立ち、これを抗アクチン抗体により検出した。ウエスタンブロットをＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）により発色させ、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）で可視化した。
レンチウイルス上清の調製およびＴ細胞の形質導入
５ｘ１０６個の２９３Ｔ細胞を１００ｍｍディッシュに事前に播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、１２μｇのｓｉＲＮＡレンチウイルスＤＮＡ、１２μｇのＶＳＶ−ＧプラスミドＤＮＡおよび１２μｇのパッケージングウイルスＣＭＶデルタ８．９プラスミドによりトランスフェクションした。新鮮な培養培地を８時間後に加えた後、細胞をさらに２日間〜３日間培養した。ウイルス上清を集め、０．４５μＭのフィルターに通し、超遠心分離によって２０，０００ｒｐｍで２時間濃縮した。ウイルスペレットを少量の培地に再懸濁し、ウイルス力価を、２９３Ｔ細胞に連続希釈量のウイルスを感染させることによって求めた。Ｔ細部の形質導入のために、Ｔ細胞（２ｘ１０６個）を最初にＯＫＴ３（２ｕｇ／ｍｌ）被覆プレートによって活性化し、その後、８ｕｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含有する０．５ｍｌのＴ細胞培地の総体積において１０〜１５の感染多重度（ＭＯＩ）で濃縮レンチウイルス上清と混合し、その後、１０００ｘｇで１時間、室温で遠心分離した。１６時間のインキュベーションの後、０．５ｍｌのＴ細胞培地をそれぞれのウエルに加えた。４８時間後、Ｔ細胞を同じ濃度のウイルス上清により再び形質導入した。形質導入効率を形質導入後３日または４日で分析し、細胞をＦＡＣＳ ＡＲＩＡ分取装置によりＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ−細胞に分けた。分取された細胞（ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−）および形質導入されてないＴｒｅｇ細胞を、その後、機能的増殖アッセイにおけるポリＧ１０によるそれらの可逆性を明らかにするために使用した。
ＴＬＲリガンドアッセイ
ナイーブＣＤ４Ｔ＋細胞を、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｖｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用することによってＰＢＭＣから精製した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５個／ウエル）を、下記のリガンドを含有するＯＫＴ３（２ｕｇ／ｍｌ）被覆のＵ底９６ウエルプレートにおいて１０：１の比率で調節性Ｔ細胞とともに培養した：ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、イミキモド（１０μｇ／ｍｌ）、ロキソリビン（５００μＭ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（２５μｇ／ｍｌ）、ｓｓＲＮＡ４０／ＬｙｏＶｅｃ（３μｇ／ｍｌ）、ｓｓＲＮＡ３３／ＬｙｏＶｅｃ（３μｇ／ｍｌ）、ｐａｍ３ＣＳＫ４（２００ｎｇ／ｍｌ）およびフラゲリン（１０μｇ／ｍｌ）をＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、一方、ＣｐＧ−Ａオリゴヌクレオチド（３μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ−Ｂオリゴヌクレオチド（３μｇ／ｍｌ）およびポリＧオリゴヌクレオチド（３μｇ／ｍｌ）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）において合成した。機能的アッセイは、上記で記載されたアッセイと同一であった。
Ｒａｇ１−／−マウスおよびＲａｇ２−／−γＣ−／−マウスでの実験
１００μｌの緩衝化生理的食塩水中のヒト５８６ｍｅｌ腫瘍細胞（５ｘ１０６個）をＲａｇ１−／−マウス（Ｔ細胞およびＢ細胞を有しない）またはＲａｇ２−／−γＣ−／−マウス（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を有しない）に０日目に皮下注射した。腫瘍特異的なＣＤ８＋ＴＩＬ５８６細胞（２．５ｘ１０７個）（これは５８６ｍｅｌ細胞を認識し、殺す）を、ポリＧ１０またはポリＴ１０で前処理されたＴｒｅｇ１０２細胞（３ｘ１０６個）とともに、または、Ｔｒｅｇ１０２細胞を伴うことなく、３日目に静脈内注射した。腫瘍サイズを２日〜３日毎にカリパスにより測定した。腫瘍体積を二次元での測定に基づいて計算した。腫瘍成長曲線をＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定により比較した。
ＣｐＧ−ＡによるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転
２つのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞株（Ｔｒｅｇ１０２およびＴｒｅｇ１６４と称される）をＴＩＬ１０２細胞およびＴＩＬ１６４細胞に由来するＴｒｅｇ細胞クローンのパネルから作製した。予想されたように、両方の株は、可溶性の抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＤＣ（これは、ＧＭ−ＣＳＦ（８００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地において７日間の培養の後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の単球から作製された）を含有する培地においてＣＤ４＋ＣＤ２５−ナイーブＴ細胞の増殖を効果的に抑制した（図１Ａ）。機能的増殖アッセイを用いて、ＣｐＧ（ＴＬＲ９リガンド）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４リガンド）またはサイトカインのＩＬ−６もしくはＩＦＮ−αが抗原特異的なヒトＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性をＤＣの存在下で調節し得るかどうかを調べた。代表的なＣｐＧ−Ａオリゴヌクレオチド（配列番号１）（Ｇ＊ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ、式中、＊はホスホロチオエート結合を表す；これはまたＤ型ＣｐＧオリゴヌクレオチドと呼ばれる）によるＤＣの活性化は、Ｔｒｅｇ細胞媒介による抑制を反転させ、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を正常なレベルの５０％〜８０％に回復させた（図１Ａ）。この作用はまた、Ｔｒｅｇ細胞対レスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞の高い比率（１：１）でさえ、Ｔｒｅｇ１０２細胞株およびＴｒｅｇ１６４細胞株の両方について観測された。それに反して、ＬＰＳ、ＩＬ−６またはＩＦＮ−αによる処理は、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下においてナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能を回復させなかった（図１Ａ）。興味深いことに、これらのＴＬＲリガンドおよびサイトカインは、単独または組合せでのどちらでも、認められるほどの影響を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＤＣ、単独でのＴｒｅｇ細胞、Ｔｒｅｇ細胞＋ＤＣ、または、ナイーブＴ細胞＋ＤＣの増殖に対して及ぼさなかった（図１Ａ）。
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞増殖実験を、ＤＣの非存在下であることを除いて、図１Ａでの実験と同様に行った。精製されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）により被覆されたプレートにおいて活発に増殖し、そのような増殖がＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下では効果的に抑制された。驚くべきことに、ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）は、Ｔｒｅｇ細胞媒介による抑制をＤＣの非存在下では一層より良好に反転させ、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をほぼ正常なレベルに回復させ、その一方で、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞の単独での増殖に対する影響は何ら有していなかった（図１Ｂ）。ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）の反転作用は、ＣｐＧ−Ｂ（配列番号２）、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６またはＩＦＮ−αがＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を阻止することができないこととは対照的である（図１Ｂ）。このデータは、ナイーブＴ細胞の増殖に対するＴｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるためにＤＣは全く要求されないことを示す。
精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞に少数の単球またはＤＣが混入しているかもしれないという可能性を除外するために、培養されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（１００％の純度）をＣｐＧ−Ａ（配列番号１）により３日間にわたって前処理した。３回の洗浄の後、前処理されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を抗ＣＤ３抗体被覆プレートにおいてナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と混合して、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制するその能力を評価した。図１Ｃに示されるように、ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）前処理はＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞株の抑制作用を反転させた。
ＣｐＧ−ＡにおけるＣｐＧモチーフが、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞株の抑制機能を反転させる能力を与えるかどうかを明らかにするために、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞株を、３日間、ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）、非ＣｐＧ−Ａ（ＣｐＧ−ＡにおいてＣＧをＧＣに変化させた；配列番号３）、ＣｐＧ−Ｂ（配列番号２）、または、非ＣｐＧ−Ｂ（ＣｐＧ−ＢにおいてＣＧをＧＣに変化させた；配列番号４）により前処理し、それらを徹底的な洗浄の後で増殖アッセイにおいて使用した。ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）または非ＣｐＧ−Ａ（配列番号３）のいずれかによる前処理はＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を等しく十分に反転させた。対照的に、ＣｐＧ−Ｂ（配列番号２）および非ＣｐＧ−Ｂ（配列番号４）は何らかの認められる影響を有していなかった（図１Ｃ；データは平均±ＳＤとして示され、３回の独立した実験からの結果を表す）。これらの結果は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性のＣｐＧ−Ａ媒介による調節がＣｐＧモチーフに依存しないことを示している。
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの同定。
観測された反転作用に関わるＣｐＧ−Ａ（配列番号１）配列をさらに明確にするために、ＣｐＧ−ＮＧ（配列番号５）およびポリＧ１０（配列番号６）を、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるそれらの能力について調べた。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣｐＧ−ＮＧ（配列番号５）、ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）またはポリＧ１０（配列番号６）を含有する２００μｌの培地を伴う抗ＣＤ３抗体被覆の９６ウエルにおいてＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と混合した。増殖アッセイを図１に記載されるように行った。図２Ａに示されるように、Ｔｒｅｇ抑制の反転がＣｐＧ−ＮＧ（配列番号５）処理細胞では失われ、しかし、ポリＧ１０（配列番号６）では保持または一層強化された。対照的に、ポリＡ１０（配列番号７）、ポリＣ１０（配列番号８）およびポリＴ１０（配列番号９）（これらはすべて、同じ保護されたホスホロチオエート骨格を有する）は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を反転させる能力を失っていた（図２Ｂ）。図２Ｂに示される実験のために、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ポリＡ１０（配列番号７）、ポリＴ１０（配列番号９）またはポリＣ１０（配列番号８）を含有する２００μｌの培地を伴う抗ＣＤ３抗体被覆の９６ウエルにおいてＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と混合し、その一方で、ポリＧ１０（配列番号６）オリゴヌクレオチドを陽性対照とした。
グアノシンヌクレオシドの数を減少させた一連のオリゴヌクレオチドを、反転作用のために要求される最少数を明らかにするために構築した。図２Ｃにおける実験のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、様々な長さのオリゴヌクレオチドを含有する保護されたホスホロチオエートにより連結されたグアノシンヌクレオシドとともに培地を含む抗ＣＤ３抗体被覆の９６ウエルにおいてＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と混合し、その一方で、保護されていない５個のグアノシン（配列番号１０）を対照とした。Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるこれらの一本鎖オリゴヌクレオチドの能力は、オリゴヌクレオチドにおけるグアノシンの数が減少するにつれて徐々に増大した（図２Ｃ）。このことは、より短いオリゴヌクレオチドがより容易にＴＬＲ８に結合することを示す。しかしながら、通常のホスホジエステル骨格を有するグアノシンの領域（Ｇ５）（配列番号１０）は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を反転させることができなかった。これは、ヌクレアーゼによる迅速な分解のためである可能性が最も高い。Ａ４Ｇ１（配列番号１１）、Ｔ４Ｇ１（配列番号１２）およびＣ４Ｇ１（配列番号１３）もまた調べられ、これらは、ナイーブＴ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の抑制活性を反転させることが見出された（図２Ｄ）。このことは、保護されたホスホロチオエート結合を伴う１個のグアノシン＋他のヌクレオチドが、Ｔｒｅｇ細胞の機能を反転させるために十分であることを示している。
図２Ｅ：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の両方を、単離されたばかりの新鮮なヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２５抗体で染色した後で、分取した。分取されたＴ細胞の純度をＦＡＣＳによって求めた。データは平均±ＳＤとして示され、２つの独立した実験からの結果を表す。図２Ｅに示されるデータは、効果的なポリＧ５（配列番号１４）構築物は、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させることができることを示す。新鮮なヒトＰＢＭＣからのＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２５抗体で染色し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団に分けた。分取された細胞集団の純度が図２Ｅにおいて左側に示される。分取されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を明瞭に抑制し、しかし、その抑制活性はポリＧ５（配列番号１４）オリゴヌクレオチドによる処理によって完全に反転した（図２Ｅ）。まとめると、これらの結果は、２つのグアノシン、または、ＡＧ、ＴＧおよびＣＧを、ホスホロチオエート結合とともに含有する短いオリゴヌクレオチドは、抗原特異的なＴｒｅｇ細胞または天然に存在するＴｒｅｇ細胞のいずれかの抑制機能を反転させることにおいて、より長いオリゴヌクレオチドよりも効果的であることを示す。
ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求される。
ＴＬＲシグナル伝達経路の現在のモデルでは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９が、ＭｙＤ８８を、シグナルを伝達するための唯一の受容体−近位アダプターとして使用し、ＴＬＲ３がインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）を病原体認識に対する応答におけるＩＮＦ−αの産生のために使用し、その一方で、ＴＬＲ４がＭｙＤ８８依存的経路およびＭｙＤ８８非依存的経路の両方に結び付けられることが予測される。ＭｙＤ８８はほとんどのＴＬＲのシグナル伝達活性のために重要であるので、その依存的経路（この場合、ＩＲＫＡ４がシグナルをＭｙＤ８８からＴＲＡＦ６および他の下流側分子に伝達する）が、グアノシン含有オリゴヌクレオチドによって開始されるＴＬＲシグナル伝達に関与すると考えることは無理のないことであった。Ｕ６駆動のｓｉＲＮＡを含有する４つまたは５つのｅＧＦＰ発現用レンチウイルス構築物を、それぞれの遺伝子について作製し、それらのそれぞれの標的タンパク質を特異的にノックダウンするそれらの能力について調べた。機能的なＩＲＡＫ４ｓｉＲＮＡ構築物およびＭｙＤ８８ｓｉＲＮＡ構築物についての代表的なデータが図３Ａに示される。図３Ａにおいて、ｓｉＲＮＡによるノックダウン効率はウエスタンブロット分析によって求められた。ＩＲＡＫ４およびＭｙＤ８８はともにＦＬＡＧエピトープで、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）によって検出された。ＦＬＡＧ−ＩＲＡＫ４またはＦＬＡＧ−ＭｙＤ８８のいずれかでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞が陽性対照として役立ち、その一方で、トランスフェクションされなかった２９３Ｔ細胞が陰性対照であった。各レーンにおけるβ−アクチンの量はサンプルについての負荷対照として役立った。ウエスタンブロット分析によって、ＩＲＡＫ４およびＭｙＤ８８が、対応するｓｉＲＮＡによって特異的にノックダウンされ、一方、対照ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡはどちらのタンパク質の発現にも影響を及ぼさなかった。次にＴｒｅｇ１０２細胞に、ＩＲＡＫ４ｓｉＲＮＡ１レンチウイルスを形質導入した。３日間培養した後、細胞をＦＡＣＳによる形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ細胞集団および非形質導入（ＧＦＰ−対照）Ｔｒｅｇ細胞集団に分けた（図３Ｂ）。ＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ−細胞の純度をＦＡＣＳ分析によって確認した。ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇ細胞は、形質導入されていない親細胞と同じ可逆的な抑制機能を有していた（図３Ｃ）。形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができたが、この活性はポリＧ１０（配列番号６）オリゴヌクレオチドにより反転させることができなかった。このことは、ＩＲＡＫ４がＴｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転のために要求されることを示唆している。この考えは、Ｔｒｅｇ１０２細胞がＭｙＤ８８ｓｉＲＮＡにより形質導入された実験によってさらに裏付けられた。形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ１０２細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を依然として抑制することができたが、ポリＧ１０（配列番号６）による処理に応答するその能力を完全に失っていた（図３Ｂ）。抑制活性または抑制の可逆性はどちらも、Ｔｒｅｇ細胞が対照ｓｉＲＮＡウイルスにより形質導入されたときには影響を受けなかった（図３Ｃ）。図３Ｃについて、非感染の親Ｔｒｅｇ１０８細胞およびポリＴ１０オリゴヌクレオチドを対照とした。データは平均±ＳＤとして示され、３つの独立した実験からの結果を表す。類似する結果がＴｒｅｇ１６４細胞株を用いて得られた。
このデータは、グアノシン含有オリゴヌクレオチドによるＴｒｅｇ細胞の抑制活性の直接的な反転が、ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路を介するＴＬＲシグナル伝達に依ることを明らかにしている。従って、そのようなリガンドに対する受容体は、ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４をその唯一または一次のシグナル伝達経路として使用する受容体に限定されなければならない。すべての知られているＴＬＲリガンドの性質をレビューすると、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９が、ヌクレオチド関連リガンドと結合するための最も確からしい候補であることが示された。ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡを認識するが、ＴＬＲ３は、ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４に依存しないシグナル伝達経路に頼っている。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９（これらは進化的クラスターを形成する）は、エンドソームに存在し、ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路を介してシグナル伝達を開始することが考えられる。ＴＬＲ９は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する受容体として同定されており、一方、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、合成されたグアノシンアナログ（ロキソリビンおよびイミダゾキノリン）および一本鎖ＲＮＡに対する受容体として機能する。いくつかのＴＬＲは、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞によって発現されることが報告されているが、ヒトＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞によるＴＬＲの発現は、本明細書中のデータによって初めて明らかにされている。
ＴＬＲ８は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能のグアノシンオリゴヌクレオチド誘導による反転に関わる受容体である。
逆転写ＰＣＲにより、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９のいずれもが、抗原特異的なＴｒｅｇ細胞株、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞において発現されず、だが、ＴＬＲ７がＤＣおよびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞において多く発現されたことが明らかにされた（図１０）。それに反して、ＴＬＲ８が、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、抗原特異的なＴｒｅｇ細胞株、ＰＢＭＣ、単球由来のＤＣ（ｍＤＣ）、ならびに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞によって一貫して発現していたが、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞または２９３Ｔ細胞では検出できなかった（図１０）。類似する結果が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８についてのリアルタイムＰＣＲにより得られた。ＴＬＲ７はすべてのＴ細胞において陰性であった；ＴＬＲ８がＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞では非常に発現していたが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞では弱く発現していた（図１０；ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の発現が、ＴＬＲ８、ＴＬＲ８またはＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）についてのプライマーおよび内部の蛍光性プローブを使用して、各サンプルからのｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析によって測定された。各サンプルにおけるＴＬＲ７およびＴＬＲ８の相対的な量をＨＰＲＴの相対的な量に対して標準化した）。
Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９の発現パターンに基づいて、ＴＬＲ８は、グアノシン含有オリゴヌクレオチドに対する可能性のある受容体であった。いくつかのレンチウイルスｓｉＲＮＡ構築物を、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９に対してスクリーニングした。対応するｓｉＲＮＡによるＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９の機能的なノックダウンについての代表的なデータが図８に示される（抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）を用いたウエスタンブロット分析によって測定された）。Ｔｒｅｇ１０２細胞にＴＬＲ８ｓｉＲＮＡ１ウイルスを感染させ、細胞を形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ集団および非形質導入（ＧＦＰ−）Ｔｒｅｇ集団に分けた。形質導入されていない親Ｔｒｅｇ１０２細胞を機能的アッセイのための対照とした。ＴＬＲ８ｓｉＲＮＡにより形質導入されたＴｒｅｇ１０２細胞（ＧＦＰ＋）の抑制機能は、その抑制活性が親のＴｒｅｇ１０２細胞と同じほど容易に反転した非形質導入（ＧＦＰ−）Ｔｒｅｇ細胞とは対照的に、ポリＧ１０（配列番号６）によって反転させることができなかった（図３Ｃおよび図４Ｂ）；Ｔｒｅｇ１０２細胞に、ＴＬＲ７ｓｉＲＮＡ１、ＴＬＲ８ｓｉＲＮＡ１またはＴＬＲ９ｓｉＲＮＡ１を感染させ、３日後に、細胞を形質導入（ＧＦＰ＋）細胞集団および非形質導入（ＧＦＰ−）細胞集団に分け、それらをポリＧ１０（配列番号６）またはポリＴ１０（配列番号９）の存在下での機能的アッセイで調べた。ＴＬＲ７ｓｉＲＮＡまたはＴＬＲ９ｓｉＲＮＡにより形質導入されたＴｒｅｇ細胞（ＧＦＰ＋）は、非形質導入（ＧＦＰ−）のＴｒｅｇ１０２細胞および親のＴｒｅｇ１０２細胞と同じ可逆的な抑制機能を保持していた。このことは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９ではなく、ＴＬＲ８が実際に、グアノシン含有オリゴヌクレオチドを認識し、シグナルを、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を制御するＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路を介して開始する受容体であることを示唆する。
ＴＬＲ８−ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４のシグナル伝達経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転のために必要かつ十分であるならば、ヒトＴＬＲ８に対する天然リガンドによりそのような作用を生じさせることが可能であるはずである。図４Ａ〜図４Ｂでは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、種々のＴＬＲリガンドの存在下、抗ＣＤ３抗体被覆ウエルにおいて、Ｔｒｅｇ１０２細胞、Ｔｒｅｇ１６４細胞、または、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞と混合した。データは平均±ＳＤとして示され、３つの独立した実験からの結果を表す。図４Ａ〜図４Ｂに示されるように、ｓｓＲＮＡ４０およびｓｓＲＮＡ３３（ヒトＴＬＲ８に対する２つの天然リガンド）は、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞と同様に、抗原特異的なＴｒｅｇ１０２細胞およびＴｒｅｇ１６４細胞の抑制機能を完全に反転させた。イミキモド（ヒトＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する合成リガンド）は抗原特異的なＴｒｅｇ細胞の抑制機能の部分的反転を示したが、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞に対する影響をほとんどまたは全く有していなかった（図４Ａ〜図４Ｂ）。他のリガンド（例えば、ＴＬＲ２に対するｐａｍｓＣＳＫ４、ＴＬＲ３に対するポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ４に対するＬＰＳ、ＴＬＲ５に対するフラゲリン、ＴＬＲ７に対するロキソリビン、および、ＴＬＲ９に対するＣｐＧ−Ｂ（配列番号２）など）は、Ｔｒｅｇ細胞の存在下、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を回復させることができなかった（図４Ａ〜図４Ｂ）。
図４Ａ〜図４Ｂにおけるデータにより、ＴＬＲ８が、合成グアノシン含有オリゴヌクレオチド、ならびに、ＨＩＶ−１ウイルスに由来する天然のｓｓＲＮＡ４０リガンドおよびｓｓＲＮＡ３３リガンドに対する受容体として役立つこと、および、合成されたＤＮＡリガンドまたはｓｓＲＮＡリガンドによるエンドソームにおけるその活性化により、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させることができるシグナル伝達経路が開始されることが確認される。グアノシン含有オリゴヌクレオチドにより誘導されるインビボでのＴｒｅｇ細胞機能の反転を調べるために、ヒト腫瘍モデルを、５８６ｍｅｌヒト腫瘍細胞をＲａｇ１−／−マウス（Ｔ細胞およびＢ細胞が欠損するマウス）に皮下注射することによって確立した。Ｒａｇ１欠損マウスにヒト５８６ｍｅｌ腫瘍細胞を０日目に注入し、その後、マウスを３日目に、ポリＧ１０（配列番号６）またはポリＴ１０（配列番号９）とともに、あるいは、ポリＧ１０（配列番号６）またはポリＴ１０（配列番号９）を伴うことなく、自己の腫瘍特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ５８６細胞の単独、または、自己の腫瘍特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ５８６細胞＋Ｔｒｅｇ１０２細胞により処理した。Ｔｒｅｇ細胞は、養子移植の前に、ＯＫＴ３により事前に活性化され、洗浄された。腫瘍体積を測定し、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝６匹のマウス／群）。Ｐ値を、示されるように群間で求めた。結果は３つの独立した実験を表す。予想されたように、５８６ｍｅｌ腫瘍細胞が与えられたマウスは進行性の腫瘍成長を示し、一方、５８６ｍｅｌ＋自己の腫瘍特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ５８６細胞（これは５８６ｍｅｌ細胞を殺すことができる）が与えられたマウスでは、腫瘍成長が阻害された（図４Ｃ）。ＣＤ８＋ＴＩＬ５８６細胞およびＴｒｅｇ１０２細胞が、ポリＴ１０（対照オリゴヌクレオチド；配列番号９）とともに、または、ポリＴ１０を伴うことなく、腫瘍保有マウスに養子移植されたとき、５８６ｍｅｌ細胞は、５８６ｍｅｌ細胞が単独で与えられたマウスの場合よりも速く成長した。このことは、Ｔｒｅｇ１０２細胞が腫瘍特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞および残存する宿主の免疫細胞を阻害し、従って、腫瘍成長を高めたことを示唆する。それに反して、ポリＧ１０（配列番号６）、Ｔｒｅｇ１０２細胞およびＴＩＬ５８６細胞が与えられたマウスでは、腫瘍成長が、５８６ｍｅｌ細胞の腫瘍注入の後の最初の４２日の期間中には検出されなかった（図４Ｃ）。このことは、グアノシン含有オリゴヌクレオチドによる処理はＴｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させただけでなく、Ｔ細胞媒介による抗腫瘍免疫性をインビボで劇的に高めたこともまた示している。
Ｔｒｅｇ細胞を種々の濃度のクロロキンにおいてポリＧ２（配列番号１５）により前処理して、酸性化がグアノシン含有オリゴヌクレオチドの機能のために要求されるかどうかを調べた。徹底的な洗浄の後、前処理されたＴｒｅｇ細胞を機能的アッセイのために使用した。ポリＧ２（配列番号１５）オリゴヌクレオチドの反転作用はクロロキンの濃度の増大とともに低下した。このことは、グアノシン含有ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはグアノシン含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによるエンドソームにおけるＴＬＲ８の結合および活性化がＴｒｅｇ抑制機能の反転における重要な段階であることを示唆する。
Ｔｒｅｇ細胞の増殖および細胞毒性
図５。Ｔｒｅｇ１０２細胞（１ｘ１０７個）をＣＦＳＥにより標識化し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ヒト血清および３００ＩＵのＩＬ−２）で培養し、３つの群に分けた：１）ＯＫＴ３刺激を伴わないＣＦＳＥ標識化Ｔｒｅｇ細胞（対照）、２）ＯＫＴ３の存在下で等しい数のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と混合されたＣＦＳＥ標識化Ｔｒｅｇ細胞、および、３）ＯＫＴ３およびＣｐＧ−Ａ（３μｇ／ｍｌ）の存在下で等しい数のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と混合されたＣＦＳＥ標識化Ｔｒｅｇ細胞。３日間の培養の後、増殖プロファイルをＦＡＣＳ分析によって明らかにした。ＯＫＴ３刺激を伴わないＣＦＳＥ標識化Ｔｒｅｇ細胞をゲート化のための対照として使用した。死細胞をヨウ化プロピジウム染色によって除外した。結果は、Ｔｒｅｇ細胞が、ナイーブＴ細胞、ＯＫＴ３、ＩＬ−２および／またはＣｐＧ−Ａの存在下では増殖しないことを示している。Ｔｒｅｇ細胞の数はＣｐＧ−Ａの存在下または非存在下において変化しなかった。このことは、Ｔｒｅｇ細胞が細胞毒性でないことを示唆する。
Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの同定および力価測定。
図６。Ａ．Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転に対するポリＧオリゴヌクレオチドの用量応答。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、様々な長さのポリＧの種々の濃度とともに培地を含む抗ＣＤ３抗体被覆の９６ウエルにおいてＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と混合し、その一方で、通常のホスホジエステル結合を有する５個のグアノシン（Ｇ５）を対照とした。データが、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のパーセント反転として示される（この場合、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下でのナイーブＴ細胞の増殖が１００％として解釈される）。
Ｂ．Ａ４Ｇ１オリゴヌクレオチド、Ｃ４Ｇ１オリゴヌクレオチドおよびＴ４Ｇ１オリゴヌクレオチドによるＴｒｅｇ細胞の可逆性についての用量応答の関係性。実験をパネルＡでのように行った。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の精製および抑制機能ならびにポリＧ５によるその機能的反転。
図７。分取されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の純度をＦＡＣＳによって求めた。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を、（示されるような）異なる数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を一定数のナイーブＴ細胞に加えることによって明らかにした。天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を、ポリＴ１０ではなく、ポリＧ５によって反転させることができた。
ＲＮＡ干渉によるＩＲＡＫ４、ＭｙＤ８８、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウン。
図８。ＩＲＡＫ４およびＭｙＤ８８の両方をＦＬＡＧエピトープにより標識化し、一方、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９をＨＡ付きｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローン化した。それぞれの遺伝子についての発現レベルおよびノックダウンの効率を、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体または抗ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロット分析によって求めた。各レーンにおけるβ−アクチンの量をサンプルについての負荷対照とした。
ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ１６４細胞の抑制機能を反転させるために要求される。
図９。ポリＧ１０オリゴヌクレオチドによる形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ１６４細胞および非形質導入（ＧＦＰ−）Ｔｒｅｇ１６４細胞の可逆性（反転性）の評価。非感染の親Ｔｒｅｇ１６４細胞およびポリＴ１０オリゴヌクレオチドを対照とした。ＩＲＡＫ４ｓｉＲＮＡ形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ１６４細胞およびＭｙＤ８８ｓｉＲＮＡ形質導入（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇ１６４細胞はともに、ポリＧ１０の存在下で抑制機能を反転させる能力を失っていた。それに反して、対照ｓｉＲＮＡによる形質導入は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のＴｒｅｇ細胞媒介による抑制に対する影響は何ら有していなかった。
遺伝子特異的プライマーを用いた異なる細胞株におけるリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされるＴｒｅｇ細胞中のＴＬＲ７およびＴＬＲ８の発現レベル。
図１０。２９３細胞由来のＲＮＡを陰性対照とした。各サンプルにおけるＴＬＲ７およびＴＬＲ８の相対的な量がＨＰＲＴの相対的な量に対して標準化された。
本発明およびその利点が詳しく記載されているが、様々な変化、置換および代替が、添付されている請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書において行われ得ることを理解しなければならない。そのうえ、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者は本発明の開示から容易に理解するように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、または、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、または、今後開発されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程を本発明に従って利用することができる。従って、添付されている請求項は、その範囲内において、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程を含むことが意図される。
ＣｐＧ−ＡによるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転を示す。Ａ．ＴＬＲリガンドまたはサイトカインにより刺激されたＤＣを含有するアッセイシステムにおける、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞によって抑制されたナイーブＣＤ４＋細胞の増殖の回復。 ＣｐＧ−ＡによるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転を示す。Ｂ．ナイーブＴ細胞増殖についてＴｒｅｇ細胞の抑制機能を反転する際のＤＣの必要性。 ＣｐＧ−ＡによるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転を示す。Ｃ．ＣｐＧ−Ａ（配列番号１）または非ＣｐＧ−Ａ（配列番号３）によるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の前処理はその抑制機能を反転させる。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ａ．ＣｐＧモチーフではなく、ポリＧが、観測された反転作用に関わる。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ｂ．ポリＡ１０（配列番号６）、ポリＴ１０（配列番号９）およびポリＣ１０（配列番号８）はＴｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させることができなかった。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ｃ．Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求されるグアノシンヌクレオチドの最少数。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ｄ．ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるＡ４Ｇ１（配列番号１１）オリゴヌクレオチド、Ｔ４Ｇ１（配列番号１２）オリゴヌクレオチドおよびＣ４Ｇ１（配列番号１３）オリゴヌクレオチドの能力。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ｅ．ポリＧ５（配列番号１４）による天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ｅ．ポリＧ５（配列番号１４）による天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の反転。 ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定を示す。Ｆ．オリゴヌクレオチドＤＮＡ配列のリスト。＊はホスホロチオエート結合を表す。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。Ａ．ＲＮＡ干渉によるＩＲＡＫ４およびＭｙＤ８８のノックダウン。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。Ｂ．ＩＲＡＫ４ｓｉＲＮＡ１およびＭｙＤ８８ｓｉＲＮＡ１により形質導入されたＴｒｅｇ細胞の精製。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。Ｂ．ＩＲＡＫ４ｓｉＲＮＡ１およびＭｙＤ８８ｓｉＲＮＡ１により形質導入されたＴｒｅｇ細胞の精製。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。Ｃ．ポリＧ１０（配列番号６）オリゴヌクレオチドによる形質導入Ｔｒｅｇ細胞（ＧＦＰ＋）および非形質導入Ｔｒｅｇ細胞（ＧＦＰ−）の可逆性の評価。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。Ｃ．ポリＧ１０（配列番号６）オリゴヌクレオチドによる形質導入Ｔｒｅｇ細胞（ＧＦＰ＋）および非形質導入Ｔｒｅｇ細胞（ＧＦＰ−）の可逆性の評価。 ＴＬＲ８が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能のグアニンオリゴヌクレオチド誘導による反転に関わる受容体であることを示す。Ａ．遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって明らかにされたＴｒｅｇ細胞におけるＴＬＲ７発現、ＴＬＲ８発現およびＴＬＲ９発現のパターン。Ｂ．ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされたＴＬＲ７発現およびＴＬＲ８発現。Ｃ．ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウン。Ｄ．ＴＬＲ８ｓｉＲＮＡにより形質導入されたＴｒｅｇ細胞による可逆的抑制機能の部分的喪失。様々なＴＬＲリガンドにつき、Ｅ．Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させる能力についての評価。Ｆ．Ｔｒｅｇ細胞の機能のポリＧ１０（配列番号６）誘導による反転はインビボで抗腫瘍免疫性を高める。 ＴＬＲ８が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能のグアニンオリゴヌクレオチド誘導による反転に関わる受容体であることを示す。Ａ．遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって明らかにされたＴｒｅｇ細胞におけるＴＬＲ７発現、ＴＬＲ８発現およびＴＬＲ９発現のパターン。Ｂ．ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされたＴＬＲ７発現およびＴＬＲ８発現。Ｃ．ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウン。Ｄ．ＴＬＲ８ｓｉＲＮＡにより形質導入されたＴｒｅｇ細胞による可逆的抑制機能の部分的喪失。様々なＴＬＲリガンドにつき、Ｅ．Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させる能力についての評価。Ｆ．Ｔｒｅｇ細胞の機能のポリＧ１０（配列番号６）誘導による反転はインビボで抗腫瘍免疫性を高める。 ＴＬＲ８が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能のグアニンオリゴヌクレオチド誘導による反転に関わる受容体であることを示す。Ａ．遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって明らかにされたＴｒｅｇ細胞におけるＴＬＲ７発現、ＴＬＲ８発現およびＴＬＲ９発現のパターン。Ｂ．ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされたＴＬＲ７発現およびＴＬＲ８発現。Ｃ．ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウン。Ｄ．ＴＬＲ８ｓｉＲＮＡにより形質導入されたＴｒｅｇ細胞による可逆的抑制機能の部分的喪失。様々なＴＬＲリガンドにつき、Ｅ．Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させる能力についての評価。Ｆ．Ｔｒｅｇ細胞の機能のポリＧ１０（配列番号６）誘導による反転はインビボで抗腫瘍免疫性を高める。 ＴＬＲ８が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能のグアニンオリゴヌクレオチド誘導による反転に関わる受容体であることを示す。Ａ．遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって明らかにされたＴｒｅｇ細胞におけるＴＬＲ７発現、ＴＬＲ８発現およびＴＬＲ９発現のパターン。Ｂ．ｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされたＴＬＲ７発現およびＴＬＲ８発現。Ｃ．ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウン。Ｄ．ＴＬＲ８ｓｉＲＮＡにより形質導入されたＴｒｅｇ細胞による可逆的抑制機能の部分的喪失。様々なＴＬＲリガンドにつき、Ｅ．Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を反転させる能力についての評価。Ｆ．Ｔｒｅｇ細胞の機能のポリＧ１０（配列番号６）誘導による反転はインビボで抗腫瘍免疫性を高める。 Ｔｒｅｇ細胞の増殖および細胞毒性を示す。 Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の直接的な反転に関わるＣｐＧ−Ａにおける配列エレメントの特定および力価測定を示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の精製および抑制機能ならびにポリＧ５によるその機能的反転を示す。 ＲＮＡ干渉による、ＩＲＡＫ４、ＭｙＤ８８、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウンを示す。 ＲＮＡ干渉による、ＩＲＡＫ４、ＭｙＤ８８、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のノックダウンを示す。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ１６４細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。 ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路が、Ｔｒｅｇ１６４細胞の抑制機能を反転させるために要求されることを示す。 遺伝子特異的プライマーを用いた種々の細胞株におけるリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにされるＴｒｅｇ細胞でのＴＬＲ７およびＴＬＲ８の発現レベルを示す。

Claims (15)

  1. ＣＤ４＋Ｔ調節性細胞の活性を抑制する方法であって、Ｔ調節性細胞の活性を抑制することができるオリゴヌクレオチドの有効量を細胞に与えることを含み、オリゴヌクレオチドがＤ型ＣｐＧオリゴヌクレオチドではない、方法。
  2. オリゴヌクレオチドがＣｐＧ非含有オリゴヌクレオチドとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
  3. オリゴヌクレオチドが約４個〜約１５個のヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の方法。
  4. オリゴヌクレオチドが、グアニンと、ヌクレアーゼ耐性の残基間骨格結合とを含む、請求項１に記載の方法。
  5. オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ感受性の残基間骨格結合をさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. オリゴヌクレオチドが、グアニンを隣接する核酸塩基に連結するヌクレアーゼ耐性の残基間骨格結合を含む、請求項４または５に記載の方法。
  7. 細胞が対象体内に存在する、請求項１に記載の方法。
  8. 対象がヒトである、請求項７に記載の方法。
  9. ヒトに免疫原性組成物を与えることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. グアニンと、グアニンを隣接する核酸塩基につなぐヌクレアーゼ耐性の残基間骨格結合とを含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが４個〜１５個のヌクレオチド残基を有し、残基間骨格結合がヌクレアーゼ感受性であるオリゴヌクレオチド。
  12. 配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、またはそれらの組合せからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
  13. Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を阻害する化合物についてスクリーニングするための方法であって、
    ａ．Ｔｒｅｇ細胞を、スクリーニングされる化合物にさらす工程、
    ｂ．ナイーブＴ細胞の増殖を刺激する工程、
    ｃ．ナイーブＴ細胞をＴｒｅｇ細胞にさらす工程、および
    ｄ．ナイーブＴ細胞の成長の程度を決定する工程
    を含む、方法。
  14. 化合物が化合物のライブラリーまたはコレクションから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. ナイーブＴ細胞の成長の程度が、対照ナイーブＴ細胞の成長との比較によって測定される、請求項１３に記載の方法。
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