KR20230084416A

KR20230084416A - Wnk3 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20230084416A
Application number: KR1020220128627A
Authority: KR
Inventors: 김현석; 윤현주; 권호근; 김기천
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2022-10-07
Publication date: 2023-06-13
Also published as: WO2023101505A1

Abstract

본 발명은 WNK3 억제제를 포함하는 면역관문 억제용 조성물 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 또는 면역 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 PD-L1 발현을 억제함으로써면역 세포에 대한 종양의 민감성을 증가시키는 한편 T 세포에 의한 GRANZYME B와 퍼포린(Perforin)의 분비를 촉진함으로써, 다각적인 항암 활성을 발휘한다. 또한 본 발명의 스크리닝 방법은 종양 세포의 면역회피기작에서 핵심적 역할을 하는 PD-L1의 발현을 효율적으로 억제하고 면역반응에 대한 암세포의 민감성을 현저히 개선하는 근원적인 항암 치료제 후보물질을 높은 신뢰도로 신속하게 탐색할 수 있다.

Description

WNK3 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제용 조성물{A Composition Immune Checkpoint Inhibition Comprising a WNK3 Inhibitor as an Active Ingredient}

본 발명은 면역관문 억제를 위한 신규 타겟으로서 WNK3를 발굴하고, 이를 이용하여 종양의 면역회피를 차단함으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

면역체계는 악성 종양을 인식하고 제거하는 역할을 하지만, 종양 세포는 진화하는 동안 획득된 유전적 변형을 통해 면역계를 회피할 수 있다¹. 암세포 및 암-관련 면역세포에서 모두 발현되는 PD-L1은 이의 면역관문 수용체인 PD-1에 결합함으로써 활성화된 T 세포에 대한 억제 신호를 유도하고 T 세포의 사멸, 결핍 및 기능 소진을 야기한다². 따라서, PD-L1/PD-1 축의 차단은 T-세포 기능을 회복시키고 암 환자 특히 흑색종, 비소세포 폐암, 신장세포선암 환자에서 지속적인 종양 관해(remission)를 유도한다³. PD-L1/PD-1 축을 차단하기 위한 최근의 치료 전략은 PD-L1 또는 PD-1에 대한 다양한 단클론 항체를 이용하는 것이다. 그러나, 종양-특이적 PD-L1 증가에 관여하는 유전적 조절자에 대한 보다 심도있는 연구가 필요하며, 특히 PD-L1/PD-1 축에 대한 새로운 조절자를 발굴하고 억제 전략을 수립하는 것이 면역관문치료에 있어 중요한 문제이다.

침윤 T 세포에 의해 분비되는 염증성 사이토카인인 IFN-γ는 종양 미세환경에서 가장 잘 알려진 PD-L1 유도인자이다. IFN-γ는 이의 동족 수용체에 결합하여 JAK-STAT 경로 활성화를 통해 PD-L1 발현을 촉진한다⁴. 나아가, 고유의 종양 신호는 PD-L1 발현을 증가시켜 면역세포의 공격으로부터 암세포를 보호한다. EGFR, ALK, MAPK, MET, AKT, MYC, STAT3, CDK5 및 YAP와 같은 종양유전자는 PD-L1 발현을 증가시킨다. 최근, PD-L1 조절자 동정을 위해 전장 유전체 스크리닝이 수행되었는데, 췌장암 세포에서 CRISPR-Cas9-매개 기능 상실 스크리닝을 이용한 연구⁵ 및 HAP1 세포에서 반수체 유전자 스크리닝을 이용한 연구⁶에서 PD-L1 촉진자로서 CMTM6를 동정하였다. 보다 최근에는 폐 및 대장암 세포주에서 CRISPR-Cas9-기반 스크리닝을 통해 전사개시인자인 eIF5B 및 MLLT6를 PD-L1의 새로운 조절자로서 동정하였다^7,8. 그러나, 동정된 유전자들은 약리학적으로 적용하기 어려워 이들 연구는 결과물의 임상적 적용에 한계를 가진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

비특허문헌 1. Proc Natl Acad Sci USA 15;102(46):16783-16788(2005)

본 발명자들은 종양세포의 면역 회피 반응을 현저히 차단함으로써 면역반응에 대한 암세포의 민감성을 향상시키는 효율적인 면역관문 억제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1의 13개의 유전자가 면역관문 수용체의 리간드인 PD-L1의 발현과 높은 상관 관계를 보일 뿐 아니라, 이들 유전자의 발현을 억제할 경우 암세포의 PD-L1 수준이 유의하게 감소함으로써 PD-L1/PD-1 축에 의해 억제된 T 세포의 활성이 현저히 회복되어 암세포의 사멸이 유도된다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 면역관문 억제용 조성물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 면역관문 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확해진다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 종양세포의 면역 회피 반응을 현저히 차단함으로써 면역반응에 대한 암세포의 민감성을 향상시키는 효율적인 면역관문 억제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 나열된 13개의 유전자가 면역관문 수용체의 리간드인 PD-L1과 동일한 발현 양상의 발현과 높은 상관 관계를 보일 뿐 아니라, 이들 유전자의 발현을 억제할 경우 암세포의 PD-L1 수준이 유의하게 감소함으로써 PD-L1/PD-1 축에 의해 억제된 T 세포의 활성이 현저히 회복되어 암세포의 사멸이 유도된다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“면역관문(immune checkpoint)”은 자기-관용을 유지하고 손상을 야기하는 과도한 면역 반응으로부터 조직을 보호하는 세포내 신호전달 체계를 의미한다. 면역관문 단백질은 면역 관문을 조절하는 세포막 단백질로서 면역세포의 분화, 증식, 활성을 억제할 수 있으며, 구체적으로 이들은 활성화된 T 세포에서 발현되어 T 세포의 증식, 사이토카인 분비 및 세포독성을 감소시키고, T 세포의 과도한 활성을 억제한다. 일부 면역관문은 종양세포가 환자의 면역반응을 회피하는 주요 메커니즘 중 하나로 작용한다. 이에, 용어 "면역관문 억제용 조성물(a composition for immune checkpoint inhibition)" 또는 "면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 면역관문 단백질의 발현 또는 활성을 차단함으로써 T 세포 활성을 강화하여 항 종양 면역반응을 촉진하는 항암 성분 또는 항암 보조제 성분을 의미한다.

본 명세서에서 용어“억제제”는 상기 나열된 11개 유전자의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 이들 유전자의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 이들 유전자에 의한 PD-L1의 발현 증가 및 이로 인한 면역세포 활성 억제가 유의하게 개선될 수 있을 정도로 이들의 활성 또는 발현을 감소시키는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 용어“발현의 감소”는 이들 유전자의 유전자 수준(예를 들어 DNA 또는 mRNA) 또는 이들이 인코딩하는 단백질 수준에서 그 발현량이 예를 들어 대조군에 비하여 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소한 상태, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어“활성의 감소”란 대조군에 비하여 이들 유전자 또는 이들이 인코딩하는 단백질의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소하는 것을 말하며, 구체적으로는 대상체 내에서의 면역세포 활성이 유의하게 개선 또는 회복될 수 있을 정도로 그 활성이 감소하는 것을 의미한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다.

상기 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 뉴클레오타이드 서열 및 그 인코딩 단백질의 아미노산 서열이 공지된 WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, CTRL 또는 OSGEPL1의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 타겟 유전자를 인식하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템과; 이들의 발현을 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 이들의 활성을 억제하는 저분자 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되지 않고 유전자 및 단백질 수준에서의 가능한 모든 억제수단이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 억제제는 상기 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자; 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머이다.

본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어“발현을 억제하는 핵산 분자”는 표적 유전자와 혼성화될 수 있는 상보적인 핵산 서열을 포함함으로써 표적 유전자를 특이적으로 인식하고, 이의 기능 저하를 야기하는 뉴클레오타이드 구조 상의 변형을 야기할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 예를 들어 상술한 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임, PNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, CRISPR 시스템에 포함된 gRNA를 포함한다.

본 명세서에서 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건 하에서 발현 억제용 핵산 분자가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지고, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 서열 특이적인 혼성화가 일어날 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 인 비보 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다.

본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다.

본 명세서에서 용어“miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.

본 명세서에서 용어“리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.

본 명세서에서 용어“PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다.

본 명세서에서 용어“안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 용어“gRNA(guideRNA)”는 타겟 유전자를 인식하여 핵산분해효소(nuclease)를 유도함으로써 인식된 분위를 특이적으로 절단하는 유전자 편집 시스템에 사용되는 RNA 분자를 의미한다. 이러한 유전자 편집 시스템에는 대표적으로 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템이 있다.

상술한 본 발명의 핵산 분자는 대상체(예를 들어 암 환자) 내에서 발현시킴으로써 WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, CTRL 또는 OSGEPL1의 발현을 유전자 수준에서 억제할 수 있다.

본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 억제제는 상기 나열된 13개 유전자의 활성을 단백질 수준에서 저해하는 특이적 항체일 수도 있다. 이들 유전자가 인코딩하는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 항체 대신 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용하여 이의 활성을 억제할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

그 밖에, 본 발명에서 이용되는 억제제에는 상기 13개 유전자에 대한 저분자 화합물 억제제도 포함된다. 당업계에 공지된 저분자 억제제는 하기 표 6에 예시적으로 나열되어 있으나, 이에 제한되지 않고 본 발명의 유전자의 발현 또는 활성을 측정 가능한 수준으로 저하시키는 여하한 저분자 화합물도 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 WNK3 또는 SIK3에 대한 억제제를 유효성분으로 포함한다.

보다 구체적으로는, 상기 억제제는 WNK3 또는 SIK3의 발현을 억제하는 핵산분자; WNK3 또는 SIK3가 인코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머; WNK463; WNK Inhibitor 11; 다사티닙; YKL-06-062; 및 YKL-05-099로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 억제제이다.

본 발명에서 용어 “WNK Inhibitor 11”은 WNK3 억제능이 있는 물질로서, CAS 번호가 2123489-30-3인 물질이다.

본 발명에서 용어 “WNK463”은 WNK3 억제능이 있는 물질로서, CAS 번호가 2012607-27-9인 물질이다.

본 발명에서 용어 “다사티닙”은 SIK3 억제능이 있는 물질로서, CAS 번호가 302962-49-8인 물질이다.

본 발명에서 용어 “YKL-06-062”은 SIK3 억제능이 있는 물질로서, CAS 번호가 2172617-16-0인 물질이다.

본 발명에서 용어 “YKL-05-099”은 SIK3 억제능이 있는 물질로서, CAS 번호가 1936529-65-5인 물질이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1)의 발현 또는 활성을 감소시킨다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 PD-L1의 발현을 억제함으로써 항암 면역활성이 현저히 회복되어 종양으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 암의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 항암 약리성분과 함께 투여되어 암에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.

본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 조성물은 PD-L1/PD-1 축에 의한 면역세포 억제를 차단함으로써 면역반응 회피 기작을 가지는 모든 종양을 제한없이 예방 또는 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암은 대장암, 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장세포선암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 다발성골수종, 유방암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 뇌암 중 교모세포종, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암 및 골암를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 암은 폐암, 흑색종, 뇌암, 신장세포선암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 뇌암은 교모세포종이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 면역관문 억제용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 이들이 인코딩하는 단백질 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 시료 내 상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,

상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 면역관문 억제용 조성물로 판정한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 또는 OSGEPL1 유전자, 이의 인코딩 단백질 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 암 조직에서 유래된 생물학적 시료이다. 보다 구체적으로는, 상기 암은 PD-L1/PD-1 축에 의한 면역반응을 회피 기작을 가지는 모든 종양을 제한없이 포함할 수 있으며, 예를 들어 폐암, 흑색종, 뇌암, 신장세포선암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“후보물질”은 상기 13개 유전자 중 하나 이상을 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 이들 유전자의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, 상기 유전자의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 면역관문 억제용 조성물로 판정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 PD-L1 발현 또는 활성 측정용 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1의 13개의 유전자가 면역관문 수용체의 리간드인 PD-L1의 발현과 높은 상관 관계를 보인다는 사실을 최초로 규명하였다. 따라서 이들의 유전자 수준 또는 단백질 수준에서의 발현량은 PD-L1의 발현량 또는 활성, 나아가 PD-L1으로 인한 면역 회피 반응 및 T 세포의 억제 정도를 평가할 수 있는 신뢰도 높은 지표가 될 수 있다. 이에, 용어“PD-L1 발현 또는 활성 측정용 조성물”은“PD-L1 과발현 또는 과활성화로 인한 질환(예컨대, 암)의 진단용 조성물”과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 PD-L1 발현(활성) 수준을 평가하고 이로 인한 면역 회피 반응 및 T 세포 억제 정도를 예측하기 위해 상기 나열된 유전자 또는 이들이 인코딩하는 단백질의 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.

본 명세서에서 사용되는 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 WNK3 유전자 등의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, WNK3 등 본 발명의 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’-말단 또는 5’-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머이다. 본 발명에서 이용되는 항체, 이의 항원 결합 단편 및 앱타머에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 WNK3 유전자의 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 T 세포의 활성을 증진시킨다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 활성이 증진되는 T 세포는 CD4+ T 세포; CD8+ T 세포; 및 CD4+CD8+ T 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 종양 항원을 타겟팅하도록 설계된 CAR-T 세포(Chimeric antigen receptor T cell)를 활성화함으로서 면역세포치료제의 항암 활성을 더욱 증진시키는 치료 보조제로 이용될 수도 있다.

본 명세서에서 용어 "CD4+ T 세포"는 "CD4+ T 림프구"라고도 호칭되며, 그의 표면에서 CD4를 발현하는 T 세포를 지칭한다. CD4+ T 세포에는 나이브 CD4+ T 세포(CD4+ TN), 보조 T 세포(CD4+ TH), 기억 줄기 CD4+ T 세포(CD4+ TMSc), 중추 기억 CD4+ T 세포(CD4+ TCM), 효과기 기억 CD4+ T 세포(CD4+ TEM), 이펙터 CD4+ T 세포(CD4+ TE), 또는 이들의 임의의 조합을 모두 포함된다.

본 명세서에서 용어 "CD8+ T 세포"는 "CD8+ T 림프구"라고도 호칭되며, 그의 표면에서 CD8을 발현하는 T 세포를 지칭한다. CD8+ T 세포에는 나이브 CD8+ T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 기억 줄기 CD8+ T 세포(CD8+ TMsc), 중추 기억 CD8+ T 세포(CD8+ TCM), 효과기 기억 CD8+ T 세포(CD8+ TEM), 효과기 CD8+ T 세포(TE), 또는 이들의 조합을 모두 포함된다.

본 명세서에서 용어 “CD4+CD8+ T 세포”는 CD4와 CD8을 모두 발현하는 이중 파지티브(double positive) T 세포를 의미한다.

본 명세서에서 용어 “CAR-T 세포”는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “키메라 항원 수용체”는 항원의 결합 시 특정 기능을 수행하도록 세포를 지시하는 세포 내 도메인과 결합된 항원-특이적 세포 외 도메인을 갖는 재조합 융합 단백질을 지칭하며, “세포외 도메인”, "인공 T 세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 및 "키메라 면역수용체"라고도 지칭될 수 있다. 키메라 항원 수용체는 MHC 비의존성 항원에 결합하여 세포내 도메인을 통해 활성화 신호를 전달하는 능력에 의해 다른 항원 결합제와 구별된다.

본 발명에서 면역 증진이란 면역을 조절하여 생체방어 능력을 증강시키는 기능을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 억제제는 상기 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자; 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머; 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질의 활성을 억제할 수 있는 소분자 화합물이다. 본 발명에서 이용되는 항체, 이의 항원 결합 단편 및 앱타머에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 용어“소분자 화합물”은 “저분자 억제제”라고도 호칭되며, 일반적으로 500Da 이하의 분자량이 작은 물질로서 타겟 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 효과를 가지는 화합물을 의미한다. 구체적으로는, 본 발명의 명세서의 표 6에 기재된 화합물일 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하여 예방 또는 치료할 수 있는 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환은 예를 들어 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus:HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역 결핍 질환은 선천성 면역결핍증, 암, 만성바이러스 감염, 골수이식 후 면역결핍증, 박테리아 패혈증, 항암 치료 후 면역결핍증 및 뇌졸중에 의한 면역결핍으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 면역 증진용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) WNK3 유전자, 해당 유전자가 인코딩하는 단백질, 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;

상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 면역 증진용 조성물로 판정한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, WNK3을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“후보물질”은 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 인간의 혈액에서 유래된 생물학적 시료이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 면역관문억제제와의 병용투여용 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 WNK3 억제제는 WNK463이고, 본 발명의 면역관문억제제는 PD-1 억제제이다. 보다 구체적으로는, PD-1 억제제는 항-PD-1 항체이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 WNK3 억제제를 포함하는 면역관문 억제용 조성물 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 또는 면역 증진용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 PD-L1 발현을 억제함으로써면역 세포에 대한 종양의 민감성을 증가시키는 한편 T 세포에 의한 GRANZYME B와 퍼포린(Perforin)의 분비를 촉진함으로써, 다각적인 항암 활성을 발휘한다.

(c) 또한 본 발명의 스크리닝 방법은 종양 세포의 면역회피기작에서 핵심적 역할을 하는 PD-L1의 발현을 효율적으로 억제하고 면역반응에 대한 암세포의 민감성을 현저히 개선하는 근원적인 항암 치료제 후보물질을 높은 신뢰도로 신속하게 탐색할 수 있다.

도 1은 PD-L1 발현을 조절하는 약물성 유전자 및 암 유발 유전자에 대한 shRNA 스크리닝 결과를 보여준다. 도 1a 및 1b는 10 ng/mL의 IFN-γ에 노출시킨 뒤 24시간 후 NSCLC 세포에서의 막 PD-L1 수준을 유세포분석(도 1a) 및 면역블롯팅(도 1b)로 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1c는 shRNA 스크리닝 과정의 모식도를 나타낸다. 퓨로마이신 선별 개시 후 3, 13 및 20일을 각각 나타내는 t0, t1 및 t2의 3개 시점에 shRNA 라이브러리를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 H2009 세포에 대해 FACS를 수행하여 PD-L1-high, -intermediate 및 -low 세포로 분류하였다. 지놈 DNA의 삽입 shRNA 서열은 PCR로 증폭하고 차세대 시퀀싱(NGS)을 하였다. 도 1d는 코어 필수 유전자 또는 비필수 유전자에 대한 shRNA를 발현하는 세포를 분석한 결과이다. 좌측은 CCE (constitutive core essential, 붉은색) 및 비필수(NE, 파란색) 유전자 군의 RIGER 순위 분포에 대한 누적분포함수(CDF)를 나타낸다(Hart T et al.)⁹. 우측은 log₂-배 변화(t2/t0)를 보이는 유전자의 분산 그래프이다. 도 1e는 히트 유전자에 대한 유전자-세트 증폭 분석 결과를 보여준다. 유의하게 증가된 유전자 세트(p<0.001)를 기본 파라미터와 함께 증폭 지도(enrichment map)로 나타내었으며, 원은 각 유전자 세트를, 원 간의 연결선은 유전자 세트 간의 중첩을 나타낸다. 원 크기는 유전자 세트 내 유전자 수와 비례하며, 원의 색은 유전자 세트의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 2는 PD-L1 조절 유전자들에 대한 유전적 및 화학적 검증 결과를 보여주는 그림이다. 도 2a는 PD-L1 양성 조절자 유전자들을 나타낸다. shRNA 발현 H2009 세포에서 PD-L1의 상대적 중앙 형광 강도(MFI)를 음성대조군(shNC; 검은색)과 비교하여 좌측에 표시하였다(N=1). 상응하는 shRNA에 의한 타겟 유전자 억제는 qRT-PCR로 측정하였으며, 우측에 표시하였다. 각 유전자별 스크리닝에서 가장 우수한(밝은 파란색) shRNA와 다음으로 우수한 shRNA(파란색)를 각각 나타내었다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, 유의성 없음 (ns) p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 2b 및 도 2d는 PD-L1 양성 조절자 유전자들을 나타낸다. shRNA 발현 H2009 세포와 H460에서 PD-L1의 상대적 중앙 형광 강도(MFI)를 음성대조군(shNC; 검은색)과 비교하여 좌측에 표시하였다(N=3). 상응하는 shRNA에 의한 타겟 유전자 억제는 qRT-PCR로 측정하였으며, 우측에 표시하였다. 도 2b는 각 유전자별 스크리닝에서 가장 우수한(파란색) shRNA와 다음으로 우수한 shRNA(밝은 파란색)를 각각 나타내었다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 2c는 PD-L1를 가장 잘 억제하는 13개 유전자의 shRNA로 형질도입된 H460 세포의 PD-L1에 대한 유세포분석 결과이다. 도 2e 및 도 2f는 H460 세포를 이용한 히트 유전자에 대한 화학적 검증 결과를 보여준다. 도 2f는 각 유전자의 저분자 억제제의 2가지 상이한 농도 또는 억제제와 동일한 농도의 DMSO(비이클 대조군)을 5일간 처리한 후 H460 세포의 PD-L1에 대한 유세포분석 (좌측) 및 세포 생존률 분석 (우측)을 수행하였다. 염색되지 않은 대조군은 상단(검은색)에 나타내었다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, 유의성 없음 (ns) p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다.
도 3은 인 비트로 공배양 조건에서 후보 유전자의 면역조절 효과를 나타낸 그림이다. 도 3a는 shPD-L1 또는 음성대조군(shNC)으로 형질도입된 H460 세포의 PD-L1 에 대한 유세포분석 결과이다. 도 3b는 자극되지 않은 PBMC(1:0) 또는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 72시간 동안 공배양된 shPD-L1 또는 shNC 발현 H460 세포의 상대적 생존률을 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. **p<0.01, 유의성 없음(ns) p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 각 자극 조건 하의 상대적 세포 생존률(%, shPD-L1/shNC)을 괄호 안에 표시하였다. 도 3c는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 72시간 동안 공배양된 shPD-L1 또는 shNC 발현 H460 세포의 자극되지 않은 PBMC와 공배양한 조건에 대한 상대적 생존률을 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. ***p<0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 3d는 PBMC와 공배양되지 않은 (1:0) 또는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 72시간 동안 공배양된 shWNK3 또는 shNC 발현 H2009 세포의 상대적 생존률을 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. **p<0.01, ***p<0.001; 양측 독립 스튜던트 T-검정. 각 자극 조건 하의 상대적 세포 생존률(%, shWNK3/shNC)을 괄호 안에 표시하였다. 도 3e는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 72시간 동안 공배양된 shWNK3 또는 shNC 발현 H2009 세포의 PBMC와 공배양하지 않은 조건(1:0)에 대한 상대적 생존률을 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. * p<0.05; 양측 독립 스튜던트 T-검정. 도 3f는 H2009 세포에 1μM WNK463 또는 DMSO 비이클 대조군을 9일 간 처리한 후, 활성화된 T 세포를 첨가한 결과를 보여준다. 공배양은 억제제의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 수행되었다. WNK463 또는 DMSO 비이클로 9일간 전처리된 후 PBMC와 공배양되지 않은(1:0) 또는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 48시간 동안 공배양된 H2009 세포의 상대적 생존률을 표시하였으며, 에러바는 ± 표준편차 (N=3)를 나타낸다. *p<0.05, ***p<0.001; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 각 자극 조건 하에서의 상대적 세포 생존률(%, WNK463/DMSO) 을 괄호 안에 표시하였다. 도 3g는 H2009 세포에 1μM WNK463 또는 DMSO 비이클 대조군을 9일 간 처리한 후, 활성화된 T 세포를 첨가한 결과를 보여준다. 공배양은 억제제의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 수행되었다. WNK463 또는 DMSO 비이클로 9일간 전처리된 후 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 48시간 동안 공배양된 H2009 세포의 PBMC와 공배양하지 않은 조건(1:0)에 대한 상대적 생존률을 표시하였으며, 에러바는 ± 표준편차 (N=3)를 나타낸다. **p<0.01; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 3h는 WNK463 또는 DMSO 비이클 대조군 처리 72시간 후 PBMC의 세포 생존률(좌측) 및 분비된 GRANZYME B(우측)의 측정 결과를 보여준다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. *p<0.05; 일원 독립 스튜던트 t-검정. 도 3i는 WNK463 또는 DMSO 비이클 대조군 처리 72시간 후 PBMC의 세포 생존률(좌측)(N=2) 및 분비된 IFN-γ, TNF-α, IL-10(우측)(N=3)의 측정 결과를 보여준다. 에러바는 ± 표준편차를 나타낸다. **p<0.01, ***p<0.001; 일원 독립 스튜던트 t-검정. 도 3j는 상이한 비드-세포 비율(0:1, 5:1, 10:1)(N=3)의 항-CD3/ CD28 비드로 자극한, shWNK3 또는 shNC를 발현하는 Jurkat T 세포에서 분비된 IL-2 (우측)를 측정한 결과이다. Jurkat T 세포에서의 WNK3 결핍은 qRT-PCR로 측정하였다(좌측)(N=2). 에러바는 ± 표준편차를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01; 양측 독립 스튜던트 T-검정. 각 자극 조건 하에서의 상대적 IL-2 농도(%, shWNK3/shNC)를 괄호 안에 표시하였다. 도 3k는 YKL-06-062 또는 DMSO 비이클과 함께 PBMC와 공배양되지 않은 또는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 96시간 동안 공배양된 H2009 세포의 상대적 생존률을 나타내는 그림이다. 에러바는 ±표준편차(N=3)를 나타낸다. *p<0.05, ***p<0.001; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 각 자극 조건 하에서 상대적 세포 생존률(%, YKL-06-062/DMSO)을 괄호 안에 표시하였다. 도 3l은 YKL-06-062 또는 DMSO 비이클과 함께 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 96시간 동안 공배양된 H2009 세포의 PBMC와 공배양하지 않은 조건(1:0)에 대한 상대적 생존률을 나타내는 그림이다. 에러바는 ±표준편차(N=3)를 나타낸다. *p<0.05; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 3m은 pan-SIK 억제제 또는 DMSO 비이클 대조군을 처리 후 72시간 뒤 PBMC의 세포 생존률(좌측) 및 분비된 GRANZYME B(우측)를 측정한 결과이다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. *p <0.05; 일원 독립 스튜던트 t-검정. 도 3n은 pan-SIK 억제제 또는 DMSO 비이클 대조군을 처리 후 72시간 뒤 PBMC의 세포 생존률(좌측) 및 분비된 GRANZYME B(우측)를 측정한 결과이다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; 일원분산분석 및 tukey 다중비교검정.
도 4는 WNK3가 PD-L1의 전사 조절자임을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 4a는 WNK3 녹다운 세포에서의 PD-L1 mRNA 수준을 보여준다. 지정된 shRNA로 형질도입된 H2009 및 H460 세포에서의 WNK3(좌측) 및 PD-L1(우측) mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정하였다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정을 통해 계산하였다. 도 4b는 WNK3 녹다운 세포에서의 PD-L1 mRNA 수준을 보여준다. 지정된 shRNA로 형질도입된 H2009 및 H460 세포에서의 WNK3(좌측) 및 PD-L1(우측) mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정하였다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. ** p<0.01, *** p<0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정을 통해 계산하였다. 도 4c는 WNK3 녹다운이 PD-L1 단백질 수준에 미치는 영향을 H2009 및 H460 세포주의 전체세포 용해물에 대한 면역블롯팅을 통해 측정한 결과와 PD-L1에 대한 이미지기반 정량분석 결과를 각각 정량적으로 보여주는 막대그래프를 나타낸다. 도 4d는 WNK3 과발현 세포에서의 PD-L1 mRNA 수준을 보여주는 그림이다. qRT-PCR로 WNK3 cDNA 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질감염된 H2009 세포 및 H460 세포에서의 WNK3(좌측) 및 PD-L1(우측)의 mRNA 수준을 측정하였다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 4e는 WNK3 과발현이 각 단백질의 발현에 미치는 영향을 H2009 및 H460 세포주의 전체세포 용해물에 대한 면역블롯팅을 통해 측정한 결과와 PD-L1에 대한 이미지기반 정량분석 결과를 각각 정량적으로 보여주는 막대그래프를 나타낸다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. *p<0.05; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 4f는 H460 세포에서 지정된 농도의 WNK463 처리 후 PD-L1 mRNA(좌측) 및 단백질(우측) 수준을 qRT-PCR과 면역블롯팅으로 각각 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. * p <0.05; 유의성 없음(ns) p >= 0.05; 양측 독립 스튜던트 T-검정. 도 4g는 H460 세포에서 지정된 농도의 WNK463 처리 후 PD-L1 mRNA(좌측) 및 단백질(우측) 수준을 qRT-PCR과 면역블롯팅으로 각각 측정한 결과와 PD-L1에 대한 이미지기반 정량분석 결과를 각각 정량적으로 보여주는 막대그래프를 나타낸다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; 양측 독립 스튜던트 T-검정. 도 4h는 shWNK3 또는 shNC를 발현하는 H460 및 H2009 세포(좌측) 및 WNK463 처리 72시간 후 H460 세포(우측)에서의 MHC class I 에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 5는 WNK3가 JNK/c-Jun 경로를 통해 PD-L1 발현을 유지함으로 보여주는 그림이다. 도 5a 및 5c는 IFN-γ(20 ng/mL)를 처리하거나 배지만을 처리한 지정된 세포주에서 막의 PD-L1 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. 세포는 지정된 shRNA로 형질도입되거나(도 5a) 또는 WNK463(1μM)를 처리하였다(도 5c). 도 5b 및 5d는 IFN-γ(10 ng/mL)를 처리하거나 배지만을 처리한 지정된 세포주에서 막의 PD-L1 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. 세포는 지정된 shRNA로 형질도입되거나(도 5b) 또는 WNK463(1μM)를 처리하였다(도 5d). 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. ** p <0.01, *** p <0.001; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 5e는 H2009 및 H460 세포주에서 WNK3의 녹다운이 알려진 PD-L1 전사 조절자(JNK, c-Jun, ERK, P38, AKT, p65 및 STAT3)의 인산화 수준에 미치는 영향을 면역블롯팅을 통해 조사한 결과이다. 상이하게 발현되는 단백질은 화살표머리로 표시하였다. 도 5f는 H2009 세포에서 JNK-IN-8를 이용한 JNK 억제가 PD-L1 수준에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 조사한 결과이다. H2009 세포에 지정된 농도의 JNK-IN-8를 48시간 동안 처리하였다. 도 5g는 WNK3 cDNA 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질감염된 H2009 세포에서 JNK-IN-8를 이용한 JNK 억제가 PD-L1 수준에 미치는 영향을 면역블롯팅으로 조사한 결과이다. H2009 세포에 지정된 농도의 JNK-IN-8를 48시간 동안 처리하였다. 도 5h는 shWNK3 또는 대조군 shRNA를 발현하는 H2009 및 H460 세포에서 AEBSF에 의한 JNK 활성화가 PD-L1 수준에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. H2009 세포에 100μM AEBSF를 24시간 동안 처리하고, H460 세포에 250μM AEBSF를 8시간 동안 처리하였다. 도 5i는 WNK3 단백질 도메인의 모식도를 나타낸다. 키나아제 도메인 내 보존적인 촉매성 라이신(Lys 159)은 검은색으로 표시하였다. 도 5j 및 도 5k는 H2009 세포에 대한 WNK3 야생형, WNK3 K159M 및 음성대조군 플라스미드 형질감염이 각 단백질 발현에 미치는 영향을 면역 블롯팅으로 평가한 결과이다.
도 6은 WNK3에 대한 유전적 및 화학적 억제가 PD-L1 의존적 동계 종양의 항-PD1 치료에 대한 민감성을 높여줌을 보여주는 그림이다. 도 6a는 Wnk3-결핍 MC38 세포에서 Pd-l1 발현수준을 보여준다. siWNK3 or 대조군 siRNA로 형질주입된 MC38 세포에서 Wnk3(좌측) 및 Pd-l1(우측)의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정하였다. 에러바는 ± 표준편차 (N=2)를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 6b는 Wnk3-결핍 MC38 세포에서 Pd-l1 발현수준을 보여준다. siWNK3 or 대조군 siRNA로 형질주입된 MC38 세포에서 Wnk3(좌측) 및 Pd-l1(우측)의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정하였다. 에러바는 ± 표준편차 (N=3)를 나타낸다. ** p<0.01, *** p<0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 6c는 Wnk3 녹다운이 PD-L1 단백질 수준에 미치는 영향을 MC38 세포에 대한 면역블롯팅을 통해 조사한 결과이다. 도 6d는 지정된 농도로 WNK463를 처리한 뒤 72시간 후 유세포분석으로 PD-L1 막 수준을 측정한 결과이다. 도 6e는 MC38 세포주에 상이한 농도의 WNK463 처리 후 지정된 항체로 면역 블롯팅을 수행한 결과를 보여준다. 도 6f는 인 비보 실험 프로토콜의 모식도를 나타낸다. 도 6g는 CD8 항체를 병용처리하거나(우측) 병용처리하지 않은 경우(좌측) WNK463 처리가 MC38 종양 성장에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 종양 용적을 지정된 시간에 측정하였다. 화살표머리는 WNK463 주입 1일째를 의미한다. 에러바는 평균의 ± 표준오차를 나타낸다. *p <0.05, **p <0.01, 유의성 없음(ns) p >= 0.05 ; 양측 독립 스튜던트 T-검정. 그룹당 n = 5 마우스. 도 6h는 CD8⁺T 세포 competent 마우스에서 채취한 MC38 종양의 무게를 나타낸 그림이다(도 6g, 좌측). *p<0.05, ** p <0.01; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하여 유의성을 계산하였다. 도 6i는 추출된 MC38 종양 세포에서의 아폽토시스(도 6g, 좌측)를 Annexin-V 염색을 통해 측정한 결과이다. *p <0.05, **p <0.01; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 6j는 추출된 MC38 종양 세포에서의 PD-L1 수준(도 6g, 좌측)을 유세포분석으로 측정한 결과이다. **p<0.01, ***p<0.001; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 6k은 종양-침윤 CD4⁺및 CD8⁺T 세포가 발현하는 IFN-γ 및 TNF-α(도 6g, 좌측)를 유세포분석으로 분석한 결과를 보여주는 그림이다. *p <0.05, ns, 유의성 없음, p >= 0.05; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 6l은 TCGA(좌측) 및 E-MTAB-923(우측) 코호트에서 WNK3 고발현 및 저발현 폐암 환자의 전체 생존기간에 대한 카플란-마이어 생존분석 결과를 보여준다. 환자는 유전자 발현 역치¹⁰에 기반하여 분류하였으며, 로그 순위법을 이용하여 각 그룹 간의 생존율 차이를 평가하였다.
도 7은 WNK3 억제에 의한 상승적 항종양 메카니즘을 도식화한 그림이다. WNK3는 JNK/c-Jun 다운스트림 신호 캐스캐이드를 활성화하고, 종양 세포에서 PD-L1 유전자 전사를 촉진하는 반면, CD4⁺ 및 CD8⁺T 세포의 세포독성 효소와 사이토카인 분비를 억제한다. 이에, WNK463 처리는 종양의 면역 회피를 억제하고 면역세포를 활성화함으로써 상승적 항종양 효과를 발휘한다.
도 8은 상기 도 1과 관련하여 PD-L1 발현을 조절하는 약물성 유전자 및 암 유발 유전자에 대한 shRNA 스크리닝 결과를 보여주는 그림이다. 도 8a는 약물성 유전자(N=5,069;좌측) 및 암 유발 유전자(N=800; 우측)를 타겟팅하는 shRNA의 양을 나타내는 히스토그램이다. 도 8b는 도 1a의 유세포분석 결과를 정량적으로 표현한 막대 그래프이다. 에러바는 ± 표준편차(N=4)를 나타낸다. **p<0.01; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 8c는 도 1b의 면역블롯팅 밀도측정 분석결과의 정량값을 정량적으로 표현한 막대 그래프이다. 도 8d는 t1에서 FACS 분류 전과 후의 세포 분포를 PD-L1 발현량을 기준으로 나타낸 그림이다. PD-L1-low 세포군은 대조군 shRNA를 발현하는 미염색 세포에 기반하여 정의하였다. 중간 정도의 PD-L1 발현수준을 보이는 PD-L1-intermediate 세포군(전체의 13-15%)은 대조군 shRNA를 발현하는 세포에 기반하여 정의하였으며, PD-L1-high 세포군은 가장 높은 PD-L1 발현을 보이는 상위 1-2%의 세포를 나타낸다. 도 8e는 NGS-기반 shRNA 계수(Deconvolution) 과정을 요약한 모식도이다. 도 8f는 RIGER 분석으로 도출된 히트 유전자의 동정결과이다. 유전자의 산점도를 통해 첫 번째(y-축) 및 두 번째(x-축)로 Enrichment 점수가 높은 shRNA를 보여준다. PD-L1-low 및 PD-L1-high 세포군의 Enrichment를 상단 및 하단에 각각 나타내었다. RIGER 분석으로 도출된 히트 유전자(FDR<0.05)는 붉은 점으로 표시하였다.
도 9는 상기 도 2와 관련하여 PD-L1 조절 유전자들에 대한 유전적 및 화학적 검증 결과를 보여주는 그림이다. 도 9a는 약물 처리에 따른 PD-L1의 막 발현 수준과 세포 생존률을 보여주는 그림이다. 저분자 억제제 처리 5일 뒤 DMSO 비이클 대조군과 비교한 PD-L1의 MFI에 대한 상대량(좌측; 도 2e의 유세포분석 히스토그램 참조) 및 H460 세포의 생존률(우측)을 나타내었다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 9b 및 9c는 다른 세포주인 H2009를 이용한 추가적인 화학적 검증 결과를 보여준다. H2009 세포에 WNK463, 다사티닙, YKL-06-062, YKL-05-099를 처리하거나 또는 동일 농도의 DMSO(비이클 대조군)을 처리한 뒤 PD-L1에 대한 유세포 분석(도 9b)과 세포 생존률 분석(도 9c)을 수행하였다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. 도 9d는 다른 세포주인 H2009를 이용한 추가적인 화학적 검증 결과를 보여준다. H2009 세포에 각 유전자에 대한 저분자 억제제를 처리하거나 또는 동일 농도의 DMSO(비이클 대조군)을 처리한 뒤 PD-L1에 대한 유세포 분석(좌측)과 세포 생존률 분석(우측)을 수행하였다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다.
도 10은 상기 도 4와 관련하여 WNK3가 PD-L1의 전사 조절자임을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 10a 및 10b는 도 4c 및 도 4e의 PD-L1에 대한 이미지기반 정량분석 결과를 각각 정량적으로 보여주는 막대그래프이다. 도 10c는 shWNK3에 의해 감소된 WNK3의 이소성 과발현이 PD-L1 수준에 미치는 효과를 보여준다. 인간 WNK3 유전자의 3’UTR 영역을 타겟팅하는 shWNK3를 발현하는 H2009 세포에 WNK3 cDNA 플라스미드를 처리하였다. PD-L1 단백질 수준은 면역블롯팅으로 측정하였다. 도 10d는 도 4f의 PD-L1에 대한 이미지기반 정량분석 결과를 정량적으로 보여주는 막대그래프이다. 도 10e는 각각 상이한 WNK 패밀리 단백질을 타겟팅하는 각 shRNA를 발현하는 H2009 세포주의 막에서의 PD-L1 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. 타겟 유전자의 녹다운 효율은 도 10f에 나타내었다. 에러바는 ± 표준편차(N=2)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 10g는 H2009 세포주에서 다른 WNK 패밀리 단백질의 이소성 과발현이 PD-L1 수준에 미치는 효과를 보여주는 그림이다.
도 11은 도 6과 관련하여 WNK3에 대한 유전적 및 화학적 억제가 PD-L1 의존적 동계 종양의 항-PD1 치료에 대한 민감성을 높여줌을 보여주는 그림이다. 도 11a는 shWNK3 또는 대조군 shRNA를 발현하는 HCT116 세포의 WNK3 (좌측) 및 PD-L1 (우측)의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. *p <0.05, **p <0.01; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 11b는 shWNK3 또는 대조군 shRNA를 발현하는 HCT116 세포의 막 PD-L1 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. 도 11c는 미처리(도 6g, 좌측) 또는 항-Cd8 항체 처리 마우스(도 6g, 우측)에서 추출한 CD4⁺및 CD8⁺T 세포를 유세포분석으로 측정한 결과이다. ***p <0.001, ns, 통계적 유의성 없음 p >= 0.05; 통계적 유의성은 일반 일원분산분석, Tukey 다중비교검정을 이용하여 계산하였다. 도 11d는 MC38 종양 세포 (도 6g, 우측)에서의 PD-L1 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. *p <0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다.
도 12는 WNK3에 대한 유전적 또는 화학적 억제가 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 사이토카인과 세포독성 효소 생성을 높임을 보여주는 그림이다. 도 12a는 1μM WNK463 또는 DMSO(비히클)로 6시간 처리한 후 TCR 자극 36시간 후 마우스 CD4+ T 세포(왼쪽) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽)에서 PERFORIN 및 GRANZYME B 생산 정도를 유세포분석으로 측정한 결과이다. 에러바는 ± 표준오차(N=3)를 나타낸다. ** p <0.01, *** p <0.001; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 12b는 TCR 자극 36시간 후 sgWnk3 또는 비표적화 sgRNA(Ctrl) 및 Cas9 단백질로 구성된 ribonucleoprotein 복합체로 형질감염된 마우스 CD4+ T 세포(왼쪽) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽)에서 PERFORIN, GRANZYME B 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. Wnk3 고갈은 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 에러바는 ± 표준오차(N=3)를 나타낸다. ** p <0.01, *** p <0.001; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 12c는 TCR 자극 36시간 후 shWNK3 또는 shNC를 발현하는 인간 CD4+ T 세포(상측) 또는 CD8+ T 세포(하측)에서 PERFORIN 및 GRANZYME B 생산 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. WNK3 고갈은 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 에러바는 ± 표준오차(N=3)를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 12d는 다양한 비드 대 세포 비율(5:1, 10:1) (오른쪽)에서 항-CD3/CD28 비드로 48시간 자극 후 WNK3 이식유전자(transgene)를 발현하는 렌티바이러스 벡터 또는 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat T 세포에서 얻은 상등액에서 ELISA에 의한 IL-2 농도를 도시한 그림이다. Jurkat T 세포에서 WNK3 과발현은 qRT-PCR에 의해 측정되었다(왼쪽). 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. * p <0.05, *** p <0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 12e는 5분간의 TCR 자극 후 sgWnk3 또는 비표적화 sgRNA (Ctrl) 및 Cas9 단백질로 구성된 ribonucleoprotein 복합체로 형질감염된 마우스 CD4+ T 세포(왼쪽) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽)에서 phospho-AKT 및 phospho-S6 수준을 유세포분석으로 측정한 결과이다. Wnk3 고갈은 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 에러바는 ± 표준오차(N=3)를 나타낸다. ** p <0.01, *** p <0.001, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 12f는 1μM WNK463 또는 DMSO(비히클)로 6시간 처리한 후 TCR 자극 5분으로 처리한 마우스 CD8+ T 세포에서 phospho-AKT 및 phospho-S6 수준을 도시한 그림이다. 에러바는 ± 표준오차(N=3)를 나타낸다. ** p <0.01, *** p <0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다.
도 13은 WNK463과 PD-1 차단의 조합에 의한 종양 성장 억제에 대한 상승효과를 보여주는 그림이다. 도 13a는 in vivo 실험 포로토콜의 개략도를 도시한 그림이다. 도 13b는 MC38 종양 성장에 대한 WNK463 및 항-PD-1 항체의 조합 치료 효과를 확인한 결과를 도시한 그림으로, 표시된 시점에서 종양 부피를 측정하였다. 에러바는 ± 표준오차를 나타낸다. *** p <0.001; 통계적 유의성은 이원분산분석으로 계산하였다. 그룹 당 n = 5 마우스. 도 13c는 종료점에서 마우스에서 얻은 MC38 종양의 무게를 측정한 결과를 도시한 그림이다. 에러바는 ± 표준편차를 나타낸다. * p <0.05, *** p <0.001, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 13d는 추출된 MC38 종양 세포(도 13b)의 PD-L1 수준을 유세포 분석으로 평가한 결과를 도시한 그림이다. 에러바는 ± 표준편차를 나타낸다. ** p <0.01, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 13e는 종양의 전체 CD8+ T 세포 중 CD8+, PD-1+, TIM3+, Tox+ T 세포의 비율을 유세포 분석으로 평가한 결과를 도시한 그림이다. 에러바는 ± 표준편차를 나타낸다. ** p <0.01, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 13f는 종양 침윤 CD8+ T 세포에 의해 생성된 IFN-γ 및 GRANZYME B를 유세포 분석에 의해 분석한 결과를 도시한 그림이다. 에러바는 ± 표준편차를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, ns, 통계적 유의성 없음. p >= 0.05; 단일합동분산으로 일반 일원분산분석 및 Tukey 다중비교검정을 수행하였다. 도 13g는 표시된 코호트에서 WNK3 발현이 높거나 낮은 경우 대장(왼쪽) 및 위(오른쪽) 암 환자의 전체 생존기간에 대한 Kaplan-Meier 생존 분석 결과를 도시한 그림이다. 환자는 유전자 발현 역치¹⁰에 기반하여 분류하였으며, 로그 순위법을 이용하여 각 그룹 간의 생존율 차이를 평가하였다.
도 14a는 shPD-L1 또는 음성대조군(shNC)으로 형질도입된 H2009 세포의 PD-L1 결핍을 유세포 분석으로 측정한 결과이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. ***p <0.001; 통계적 유의성은 양측 독립 스튜던트 t-검정으로 계산하였다. 도 14b는 IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:5, 1:10)와 72시간 동안 공배양된 shPD-L1 또는 shNC 발현 H2009 세포의 PBMC와 공배양하지 않은 조건(1:0)에 대한 상대적 생존률을 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. *p <0.05; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 14c는 qRT-PCR로 PD-L1 cDNA 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질도입된 H2009 세포에서의 PD-L1 수준을 유세포 분석에 의해 분석한 결과를 도시한 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. ***p <0.001; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 14d는 WNK463 또는 DMSO 비이클로 9일간 전처리된 후, IL-2 및 항-CD3-활성화된 PBMC(1:10)와 억제제의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 공배양된 PD-L1 cDNA 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질도입된 H2009 세포의 PBMC와 공배양하지 않은 조건(1:0)에 대한 상대적 생존률을 보여주는 그림이다. 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. **p <0.01; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 14e는 도 1a와 1b의 7개 NSCLC 세포주에서의 WNK3(x-축)와 PD-L1(y-축) 발현 정도의 상관성을 피어슨 상관계수로 보여주는 그림이다. 도 14f는 인 비트로 상에서 WNK3 야생형과 WNK3 K159M의 키나아제 활성을 측정한 결과이다. WNK3-Myc-Flag (야생형), WNK3-K159M-Myc-Flag (K159M) 또는 대조군 플라스미드로 형질감염된 HEK293 cell로부터 면역침강으로 얻은 물질, 기질, ATP, 보조인자를 반응시킨 뒤, ADP-Glo kinase assay를 수행하였다(우측). 면역침강으로 얻은 물질에서의 WNK3 단백질 수준은 면역블롯팅을 통해 측정하였다(좌측). 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. *p <0.05, **p <0.01; 양측 독립 스튜던트 t-검정. 도 14g는 인 비트로 상에서 WNK463, WNK inhibitor 11 처리에 따른 WNK3 야생형의 키나아제 활성을 측정한 결과이다. WNK3-Myc-Flag (야생형) 또는 대조군 플라스미드로 형질감염된 HEK293 cell에 1μM WNK463, 5μM WNK inhibitor 또는 DMSO(비이클)로 48시간 처리한 후, 면역침강으로 얻은 물질, 기질, ATP, 보조인자를 반응시킨 뒤, ADP-Glo kinase assay를 수행하였다(우측). 면역침강으로 얻은 물질에서의 WNK3 단백질 수준은 면역블롯팅을 통해 측정하였다(좌측). 에러바는 ± 표준편차(N=3)를 나타낸다. ***p <0.001; 일원분산분석 및 tukey 다중비교검정. 도 14h는 인간 교모세포종 세포주 (human GMB cell lines) 모델에서, WNK3 유전자를 siRNA로 넉다운하였을 때 PD-L1의 수준이 감소함을 확인한 결과를 도시한 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

세포주

인간 NSCLC 세포주(H2009, H460, HCC44, HCC461, H647, H2122, A549)는 Michael A. White (UT Southwestern Medical Center, TX, USA)로부터 제공받았다. 세포주들은 5% 우태아혈청(Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. Jurkat T 세포주는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. 마우스 MC38 세포주는 Kerafast(Boston, MA, USA)에서 구입하였다. MC38 세포주는 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle’s medium, Gibco/Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다.

shRNA 라이브러리의 구축

약물성 유전자 및 암 촉진자의 리스트는 약물-유전자 상호작용 데이터베이스¹¹(표 3) 및 pan-cancer genome atlas 연구 논문^12-19(표 4)에서 각각 수득하였으며, 각각 5,069개 약물성 유전자에 대해 32,643개 shRNA, 800개 암 촉진 유전자에 대해 5,611개 shRNA가 포함되어 있다. 이들을 5,592개 유전자에 대한 35,949개 shRNA를 포함하는 단일 라이브러리로 통합하였다.

shRNA pool을 제작하기 위해, MISSION shRNA 라이브러리 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 박테리아 저장액을 체리 피킹(cherry picking)하고 LB 아가 플레이트에 BioMek FXII (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 배양 후, 교반한 박테리아 클론에서 DNA-mag 플라스미드 DNA 정제 킷 (#17255, iNtRON Biotechnology, Seongnam-si, Korea)을 이용하여 DNA를 정제하였다. HEK 293FT 세포(1 x 10⁷)를 150 mm 디쉬에 밤새 흡착시켰다. HEK293FT 세포에 7.2μg의 플라스미드 DNA pool, 5.4μg psPAX2 (Didier Trono 제공, Addgene plasmid # 12260 ; http://n2t.net/addgene:12260 ; RRID:Addgene_12260) 및 1.8μg pMD2.G (Didier Trono 제공, Addgene plasmid # 12259 ; http://n2t.net/addgene:12259 ; RRID:Addgene_12259)를 공-형질주입함으로써 렌티바이러스를 제조하였다. 형질감염 24시간 뒤 배양 배지를 교체하고 바이러스 상등액을 형질감염 48시간 및 72시간 후 2회 수집하였다. 렌티바이러스 역가는 HIV Type 1 p24 Antigen ELISA kit(#0801111, Zeptometrix, City Road, London, UK)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다.

렌티바이러스 제조 및 shRNA 스크리닝

H2009 세포(4.8 x 10⁷)에 shRNA를 가지는 렌티바이러스를 0.3 MOI로 형질도입하고 형질도입 48시간 뒤부터 1μg/mL 퓨로마이신으로 72시간 동안 선별하였다. 선별된 세포는 BD FACSAria Ⅲ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 3일째[t0], 13일째[t1] 및 20일째[t2]에 세포 표면에서의 PD-L1 발현 수준에 기반하여 분류하였다. 분류를 위해 1.8 x 10⁷세포를 10 mM EDTA를 이용하여 수집하고, 0.5% BSA를 포함하는 PBS 내에서 5μg/mL PE 항-인간 PD-L1(#12-5983-42, eBioscience, San Diego, CA, USA)로 염색하였다. PD-L1-low 세포는 미염색 대조군 세포와 같은 정도의 PD-L1 발현을 보이는 세포군이며, PD-L1-high 및 PD-L1-intermediate 세포는 높거나 중간 정도의 PD-L1 발현을 보이는, 전체 세포의 각각 1-2% 및 13-15%에 해당하는 세포군이다. 분류하기 전의 1.8 x 10⁷세포를 [t0] 및 [t2]에 수집하고, 남은 세포는 FACS 분류를 위해 계대배양하였다.

QIAamp DNA Blood Mini Kit(#51104, QIAGEN, Germantown, MD, USA)를 이용하여 FACS로 분류되거나 분류되지 않은 세포로부터 지놈 DNA를 분리하였다. 삽입된 shRNA는 GoTaq Hot Start Polymerase(#M5001, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 2라운드의 PCR (라운드 당 20 사이클)로 증폭하였다. 제1 및 제2 라운드에서의 어닐링 온도는 각각 52℃ 및 56℃로 세팅하였다. 제1 라운드용 프라이머 서열은 Cowley GS 등²⁰이 사용한 서열과 동일한 프라이머를 사용하였다. 제2 라운드용 PCR 프라이머는 Illumina P5 및 P7 어댑터를 포함하고 stagger 영역을 가지는 다양한 서열을 포함하여 시퀀싱 과정의 첫 16 사이클에서 염기 다양성을 유지하도록 개량 설계하였다. 또한, 바코드화된 역방향 프라이머를 이용하여 모든 시료가 단일 레인에서 다중 증폭될 수 있도록 하였다. 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

PCR 생성물은 AMPure XP 정제 시스템(#A63880, Beckman Coulter)을 이용하여 정제한 뒤 Hiseq2000 상에서 페어드-엔드 100 bp 리드로 시퀸싱하였다. 평균 커버리지는 shRNA 풀의 1000 x 였다.

Cutadapt²¹을 이용하여 raw 리드의 잔여 서열을 제거함으로써 shRNA의 센스 및 안티센스 서열을 추출하였다. 3개 nt의 미스매치까지 허용되는 한도 내에서 기준 shRNA 서열에 대해 서열을 정렬하고 정렬된 리드를 Bedtools²²로 계수하였다. 센스 및 안티센스 서열이 단일 shRNA 서열과 매핑이 일치하는 리드만 계수에 포함시켰으며, PD-L1-low, -intermediate 및 -high 세포군의 총 숫자가 100 미만인 리드는 제외하였다. 리드 계수는 전체 리드 수 및 각 시료의 세포 수에 대해 정규화하였다. 이후, PD-L1-low 세포군의 enrichment 점수를 다음의 식으로 계산하였다: log2 low/ (intermediate+high) (low, intermediate 및 high는 PD-L1의 낮은 발현, 중간 발현 및 고발현을 보이는 시료에서 추출한 정규화된 리드 계수이다) PD-L1-high 세포군의 enrichment 점수도 같은 방법으로 계산하였다. Enrichment 점수는 shRNA-수준의 점수를 유전자-수준의 점수로 변환하는 RIGER 알고리즘²³을 이용하여 분석하였으며 분류된 세포군에서 고발현되는 shRNA의 타겟 유전자 순위를 매겼다. 이러한 순위 알고리즘은 두 번째로 우수한 shRNA를 기준으로 유전자 점수를 계산한다.

shRNA 증폭용 프라이머 서열

프라이머	서열
1 ^st PCR 정방향	5′-AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3′²⁰
1 ^st PCR 역방향	5′-CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCCC-3′²⁰
2 ^nd PCR 정방향	5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNTCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNGATCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGATCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNACGATCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCTAGAATCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNTGGACACATCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNGTCGGCACATCTTGTGGAAAGGACGA-3′ 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNAACCAGCACATCTTGTGGAAAGGACGA-3′
2 ^nd PCR 역방향	5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGT-3′

유전자 세트 증폭 분석 및 시각화

스크리닝된 73 hit 유전자(46개 PD-L1 인핸서 및 27개 PD-L1 억제자)에 대해 Metascape webtool²⁴(Gene Ontology, MSigDB, KEGG, Reactome, Hallmark gene sets) (https://metascape.org, v.3.5)을 이용하여 통합 유전자-세트 증폭 분석을 수행하였다. 수집된 shRNA에 의해 타겟팅되는 전체 유전자를 기본 파라미터의 백그라운드로 사용하였다(p-값 컷오프, 0.01; 최소 중첩, 3; 최소 증폭인자, 1.5). 유의하게 증폭된 유전자 세트(hypergeometric p<0.001)를 Cytoscape(v.3.8.2)의 Enrichment Map²⁵으로 시각화하였다.

T 세포-매개 종양세포 사멸 어세이

종양 세포를 96-웰 플레이트에 밤새 흡착시키고 상이한 타겟-작동세포 비율(1:0, 1:5, 1:10)로 인간 말초혈 단핵세포(PBMC; #70025, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)와 함께 공배양하였다. T 세포를 활성화하기 위해, 100 ng/mL 항-CD3 항체 및 10 ng/mL IL-2 (#317325, #589102, BioLegend, San Diego, CA, USA)를 웰에 첨가하였다. 48-96 시간 동안 공배양 후, PBMC를 제거하고 PBS로 세척 후, CellTiter-Glo assay 킷(Promega)으로 종양 세포 생존률을 측정하였다.

사이토카인 어세이

100 ng/mL 항-CD3 항체 및 10ng/mL IL-2 또는 Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28(#11161D, Gibco)로 활성화된 PBMC(2 x 10⁵)를 시험 물질과 함께 3일간 배양하였다. LEGEND MAX™ Human Granzyme B ELISA Kit(#439207, Biolegend)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 수집된 상등액 내 GRANZYME B 수준을 측정하였다. Jurkat T 세포(5 x 10⁴)를 Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28(#11161D, Gibco)와 함께 다양한 비드-세포 비율(0:1, 5:1, 10:1)로 48시간 동안 배양함으로써 활성화시켰다. 수집된 상등액 내 IL-2 수준은 LEGEND MAX™ Human IL-2 ELISA Kit(#431807, Biolegend)을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다. IL-2, 4, 5, 6, 9, 10, 13, 17A, 17F, 22, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 12개의 사이토카인은 Luminex platform (Human Th Cytokine Panel, BioLegend)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.

유전적 및 화학적 섭동(perturbation)

형질도입: 렌티바이러스 패키징을 위한 shRNA 플라스미드는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며 다음과 같다: WNK1(TRCN0000219719); WNK2(TRCN0000194773); WNK3 (TRCN0000219674, TRCN0000001531, TRCN0000195276, TRCN0000196566); HSP90AA1 (TRCN0000315007, TRCN0000001028); CA3(TRCN0000151024, TRCN0000184026); CAST(TRCN0000073638, TRCN0000073642); PFKFB4(TRCN0000037764, TRCN0000199612); SLC7A7(TRCN0000043033, TRCN0000043037); HDAC3(TRCN0000004824, TRCN0000196925); HSP90B1(TRCN0000029427, TRCN0000276250); SIK3 (TRCN0000194845, TRCN0000037450); PAN3(TRCN0000049805, TRCN0000049807); CTRL(TRCN0000003652, TRCN0000003651); SMAD4(TRCN0000010321, TRCN0000040031); OSGEPL1(TRCN0000047052, TRCN0000047050); PD-L1 (TRCN0000056913, H460에 사용). pGIPZ-shPD-L1 (#RHS4430-200253051, H2009에 사용)는 Horizon Discovery (Waterbeach, UK)에서 구입하였고, pGIPZ-PD-L1 WT²⁶은 Mien-Chie Hung (Addgene plasmid # 121486 ; http://n2t.net/addgene:121486 ; RRID:Addgene_121486)으로부터 제공받았다. 사람 WNK3 cDNA를 포함한 렌티바이러스 플라스미드를 만들기 위해, WNK3-Myc-DDK (#RC220755)를 pLVX vector (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA)에 서브클로닝하였다. 렌티바이러스는 1.3 x 10⁶HEK293FT 세포에 1μg의 플라스미드 DNA, 0.75μg의 psPAX2 및 0.25μg의 pMD2.G(Addgene)를 공-형질주입함으로써 제작하였으며, 60 mm 디쉬에 씨딩된 5 x 10⁵표적세포에 첨가하였다. 이후, 1μg/mL(H2009) 또는 2μg/mL(H460) 퓨로마이신을 이용하여 형질도입된 세포를 선별하였다.

cDNA 형질감염: 4 x 10⁵H2009 세포 또는 8 x 10⁵H460 세포를 6-웰 플레이트에 씨딩하고 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 2μg(H2009) 또는 4μg(H460)의 플라스미드로 형질감염시킨 뒤 72시간 뒤에 수집하였다. 인간 WNK1(#RC218208), WNK2(#RC212364), WNK3(#RC220755L3) 및 WNK4(#RC223269)를 인코딩하는 Myc-DDK-태깅된 플라스미드는 Origene(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. WNK3의 키나아제-상실 돌연변이 컨스트럭트(WNK3 K159M)는 Q5 위치지정 돌연변이 킷(#E0554S, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)을 이용하여 제조자의 가이드라인에 따라 제작하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: WNK3 K159M 정방향, 5′-AGGAGCATTTATGACAGTATATAAAGG-3′, 역방향, 5′-CTTCCTAGTTCTATGTCAAATTTC-3′.

siRNA 형질감염: 세포(2 x 10⁵)에 RNAiMAX(Invitrogen)와 혼합된 siRNA를 6-웰 플레이트의 각 웰에 50nM 씩 처리하고 형질감염 72시간 후 각각의 실험을 진행하였다. 다음의 서열을 가지는 각 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다(Genolution, Seoul, Korea) : 인간 WNK4:5′-GAUUGCAGCUGCCAUGGUA-3′, 마우스 WNK3:5′-GCCTCACGTTTGTCAGTAT-3′, 5′-ATACTGACAAACGTGAGGC-3′, 음성대조군: 5′-GCAGGACCAGGCCAUAUGA-3′.

화합물: WNK463(#CD00005886, Crysdot, Bel Air, MD, USA), 다사티닙 (#S1021, Selleckchem, Houston, TX, USA), YKL-06-062(#AOB37242, AOBIOUS, Gloucester, MA, USA), YKL-05-099(#HY-101147, MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), PU-H71(#NSC 750424, Selleckchem), CH5138303 (#S7340, Selleckchem), RGFP966(#S7229, Selleckchem), acetazolamide(#A6011, Sigma -Aldrich), 5MPN(#S656801, Sigma-Aldrich), JNK-IN-8(#18096, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) 및 AEBSF HCl (#A8456, Sigma-Aldrich)를 사용하였다.

qRT-PCR 어세이

RT-PCR로 합성된 cDNA 탬플레이트를 프로브 및 TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 혼합한 뒤 StepOne Plus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에 적용하였다. SYBR Green 어세이를 위해, 설계된 프라이머 및 QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Qiagen)를 이용하여 반응을 수행하였다. Taqman 어세이에 사용된 프로브는 다음과 같다: WNK3(Hs00908643_m1), HSP90AA1(Hs00743767_sH), CA3(Hs00193123_m1), CAST(Hs00156280_m1), PFKFB4 (Hs00894603_m1), SLC7A7(Hs00909952_m1), HDAC3(Hs00187320_m1), HSP90B1 (Hs00427665_g1), SIK3(Hs00228549_m1), PAN3(Hs01107000_m1), CTRL (Hs00157187_m1), SMAD4(Hs00929647_m1), OSGEPL1(Hs01088658_g1), PD-L1 (Hs00204257_m1) 및 18S(Hs99999901_s1). SYBR Green 어세이용 프라이머 서열은 표 2에 요약하였다. 인간 18S 리보좀 RNA 또는 마우스 β-액틴을 내부 대조군으로 이용하였다.

shRNA 증폭용 프라이머 서열

유전자	프라이머 서열
인간 PD-L1	정방향, 5′-CAATGTGACCAGCACACTGAGAA-3′
	역방향, 5′-GGCATAATAAGATGGCTCCCAGAA-3′
인간 WNK1	정방향, 5′- GCCGTCAGATCCTTAAAGGTC-3′
	역방향, 5′-CCAGTAGGGCCGGTGATAA-3′
인간 WNK2	정방향, 5′-CGCTTCCTCAAGTTCGACATC-3′
	역방향, 5′-TGGACTCCCAGAAGTCGTAGA-3′
인간 WNK3	정방향, 5′-ACTTCTCCTAGTGGCAGATTCC-3′
	역방향, 5′-GCAGCTCACACCAAGCAAC-3′
인간 WNK4	정방향, 5′-CGATGGCCGATACCTCAAGTT-3′
	역방향, 5′-GTCGGTGTCTAGCCCTCGAT-3′
인간 18S	정방향, 5′-ACTCAACACGGGAAACCTCA-3′
	역방향, 5′-AACCAGACAAATCGCTCCAC-3′
마우스 PD-L1	정방향, 5’-TGCGGACTACAAGCGAATCACG-3’
	역방향, 5′- CTCAGCTTCTGGATAACCCTCG-3′
마우스 WNK3	정방향, 5′-GGTGGTCAGTCTTCAAACACAA-3′ 정방향, 5′-ACTTCTCCTAGTGGCAGATTCC-3′(도 12b)
	역방향, 5′-GTGAACATCCCCTTCTTACTGG-3′ 역방향, 5′-GCAGCTCACACCAAGCAAC-3′(도 12b)
마우스 β-액틴	정방향, 5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′
	역방향, 5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′

유세포분석

세포를 분리하고 세척한 뒤 0.5% BSA를 포함하는 PBS에 다음의 형광 항체들과 함께 재부유하였다: 5μg/mL PE 항-인간 PD-L1 (#12-5983-42, eBioscience), 2.5 μg/mL PE 항-마우스 PD-L1(#124308, Biolegend) 및 3.2μg/mL APC 항-인간 MHC class I(#311409, Biolegend). 얼음 위에서 20분 간 배양한 뒤, 세포를 0.5% BSA 포함 PBS로 세척하고 BD FACSVerse 유세포분석기(BD Biosciences)에 적용하였다. 결과는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)로 분석하였다. IFN-γ에 의해 유도된 PD-L1의 유세포분석을 위해, 세포에 10 또는 20ng/mL 인간 IFN-γ(#PHC4031, Gibco)를 24시간 처리하였다.

WNK3 녹다운 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유세포 분석

인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 WNK3 녹다운을 하기 위해, MA900 분류기(SONY, San Jose, CA, USA)를 사용하여 인간 PBMC에서 살아있는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분류하고, 플레이트-결합된 항-인간 CD3(#BE0001- 2, BioXCell, Lebanon, NH, USA)/항-인간 CD28(#BE0248, BioXCell) 및 50IU IL-2로 24시간 동안 자극하였다. 이들 세포를 렌티바이러스 상층액(shNC 및 shWNK3)으로 스핀-감염(900g, 90분, 37°C)하였다. 렌티바이러스 감염 4일 후, 7일 동안 1㎍/ml 퓨로마이신으로 세포를 선택하였다. PERFORIN 및 GRANZYME B를 생성하는 WNK3 녹다운 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 정량화하기 위해, shNC 및 shWNK3 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco)로 36시간 동안 자극하였다. 자극 과정 중, 마지막 6시간 동안 BD GolgiStop(#554724, BD Biosciences)을 추가하였다. 자극 후, 세포를 세척하고 표면 분자를 항-CD4(OKT4, Biolegend) 및 항-CD8(SK1, Biolegend)로 염색하였다. 그런 다음, 세포를 eBioscience/Invitrogen Intracellular(IC) 고정 완충액(#00-8222-49, Invitrogen)으로 고정하고 1x Permeabilization Buffer(#00-8333-56, Invitrogen)로 세척하고 다음과 같은 항체로 염색하였다: 항-PERFORIN (B-D48, Biolegend), 항-GRANZYME B (QA16A02, Biolegend).

WNK463 처리 또는 Wnk3 녹아웃 마우스 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유세포 분석

마우스로부터 비장을 절제하여 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 CD19(6D5), B220(RA3-6B2), CD11b(M1/70), CD11c(N418) 및 NK.1 (PK136) 비오틴화된 항체(Biolegend)와 EasySep Mouse Na

ve CD4+ T 세포 분리 키트(#19765, STEMCELL Technologies)로 농축(enrich) 하였고, MA900 분류기(SONY)를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 나이브(naive) 세포를 분류하였다. 세포를 플레이트-바운드 항-마우스 CD3(#BE0001-1, BioXcell)/항-마우스 CD28(#BE0015-1, BioXcell)로 24시간 동안 자극하였다. 마우스 Wnk3 유전자를 표적화하기 위해 미리 설계된 sgRNA는 Integrated DNA Technologies(IDT; Coralville, IA, USA)에서 합성하였다.

실험에서 사용된 미리 설계된 sgRNA의 서열은 다음과 같다. 음성 대조군: 5'-mA*mC*mG* rArUrU rCrCrU rArArG rArUrG rCrUrU rGrCrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU rArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArA rCrUrU rGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU* rU-3', Wnk3: 5'- mU*mA*mG* rUrUrC rGrArU rUrCrU rArUrG rArUrU rCrArG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU rArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArA rCrUrU rGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU* rU-3'.

Ribonucleoprotein를 형성하기 위해 Alt-R CRISPR-Cas9 가이드 RNA 및 Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3(#1081061, IDT)를 혼합 후, 전기천공 프로그램 DN-100을 적용하고, Amaxa P3 1차 세포 4D-nucleofector X 키트(Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 형질감염시켰다. 회수된 세포를 유세포 분석 전에 72시간 동안 배양하였다.

PERFORIN 및 GRANZYME B 생산을 정량화하기 위해 CD4+ 및 CD8+ T 세포(2x10⁵)를 1μM WNK463 또는 DMSO로 6시간 동안 처리하고 Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28(#11452D, Invitrogen)으로 36시간 동안 자극하였다. 자극의 마지막 6시간 동안 BD GolgiStop(BD Biosciences)을 추가하였다. Wnk3 녹아웃 CD4+ 및 CD8+ T 세포(2x10⁵)를 Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)으로 36시간 동안 자극하였다. 자극 후, WNK463 처리 및 Wnk3 녹아웃 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 세척하고 표면 분자를 항-CD4(GK1.5, Biolegend) 및 항-CD8(53-6.7, Biolegend)로 염색하였다. 그런 다음, 세포를 eBioscience/Invitrogen Intracellular(IC) 고정 완충액(Invitrogen)으로 고정하고 1x Permeabilization Buffer(Invitrogen)로 세척한 다음 항-PERFORIN(S16009A, Biolegend), 항-GRANZYME B(QA16A02, Biolegend)로 염색하였다. phospho-AKT 및 phospho-S6 단백질을 정량화하기 위해 WNK463 처리 또는 Wnk3 녹아웃 마우스 CD4+ 및 CD8+ T 세포(2x10⁵)를 Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)으로 5분 동안 자극하였다. 자극 후 20부피(20 volumes)의 미리 데워진 1x BD 포스플로우 용해/고정 완충액(#558049, BD Biosciences)을 첨가하여 세포를 즉시 고정하고 BD 포스플로우 Perm/Wash 완충액(#557885, BD Biosciences)으로 투과화하였다. 세포를 항-포스포-AKT(Ser473)(#9271, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 항-포스포-S6 리보솜 단백질(Ser240/244)(#5364, Cell Signaling Technology) 항체로 염색하였고, 그 다음 PE 당나귀 항-토끼 IgG(최소 x-반응성) 항체(#406421, Biolegend)로 염색하였다. 세포 획득은 BD FACSCelesta 세포 분석기(BD Bioscience)에서 수행되었고 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

면역 블롯팅

세포를 PBS로 세척 후 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, Katy, TX, USA)을 포함하는 RIPA 라이시스 완충액(Sigma-Aldrich)에서 용해시켰다. 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였다. 동량의 단백질을 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Gels(Bio-Rad) 상에서 분리시켰다. 항-PD-L1 (#13684S), 항-p-JNK (#4668S), 항-JNK (#9252S), 항-p-c-Jun (#3270S), 항-p-ERK1/2 (#4370S), 항-ERK1/2 (#4348S), 항-p-p38 (#4631S), 항-p38 (#9212S), 항-p-AKT (#9271S), 항-AKT (#4691S), 항-p-P65 (#3033S), 항-P65 (#8242S), 항-p-STAT3 (#9145S), 항-STAT3 (#9139S), 항-HSP90 (#4877) 및 항-flag(DYKDDDDK) (#2368S) 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, 항-PD-L1 (마우스 특이적, #ab213480, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 항-β-액틴(#sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 항체를 각각 표시된 제조처에서 구입하였다. Peroxidase AffiniPure 고트 항-래빗 IgG (#111-035-144) 및 항-마우스 IgG (#115-035-003, Jackson ImmunoResearch, West Grove, RA, USA)를 2차 항체로 사용하였다. 1차 항체와 2차 항체는 각각 1:1000 및 1:5000로 희석하여 사용하였다.

생존분석

TCGA-폐암의 유전자 발현 데이터를 TCGAbiolinks 패키지(version 2.6.12)를 이용하여 다운로드 받고, TCGA pan-cancer 임상데이터 리소스²⁷에서 프로세싱된 임상 데이터를 다운로드 받았다. E-MTAB-923 코로트²⁸의 유전자 발현 및 임상 데이터는 Arrayexpress(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-923)에서 다운받았다. 대장(GSE39582)과 위(GSE62254) 암환자의 유전자 발현 및 임상 데이터는 GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 다운받았다. 동일한 환자의 여러 시료에서의 유전자 발현수준은 중복 제거를 위해 평균을 내었다. 다음으로, 환자를 각 유전자의 고발현 및 저발현 그룹으로 분리하였다. 최적 발현 컷오프는 종래 보고된 방법에 따라 결정하였다¹⁰. 서바이벌 패키지(version 2.42-6)를 이용하여 양측 로그 순위법을 수행하였다.

면역침강법 및 인 비트로 키나아제 활성 분석

6-웰 플레이트 각 웰의 HEK293FT 세포(1.5 x 10⁵)에 Lipfectamine2000을 사용해 2.5μg의 WNK3 야생형 또는 WNK3-K159M을 포워드-형질감염을 한 72시간 뒤, 세포를 거두었다. 또는 WNK3 야생형 형질감염 24시간 뒤, WNK463, WNK3 inhibitor 11 또는 DMSO를 48시간동안 처리하였다. 세포는 얼음 위에서 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 130mM 233 NaCl, 10% glycerol, 10mM MgCl2, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(GenDEPOT)으로 구성된 라이시스 완충액에서 용해되었다. 600μg의 세포 용해물을 2μl의 항-Myc 항체(#2276S, Cell Signaling Technology)와 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 준 뒤, 1:1 비율로 혼합한 SureBeads Protein A and Protein G Magnetic Beads(#1614013, #1614023, Bio-Rad)를 첨가해 1시간 동안 반응시켰다. 이렇게 얻은 침강물을 차가운 라이시스 완충액으로 세 번 세척하고, 인 비트로 키나아제 어세이를 위해, 항-Myc-침강된 키나아제를 포함한 비즈를 키나아제 희석 완충제 X(#K20-09, SignalChem, British Columbia, Canada)와 50μM DTT (#D86-09) 15μl에 희석한 뒤, 10μl 기질/ATP 혼합물 (1μl의 10mM ATP, 79μl의 키나아제 어세이 완충액 III(#K03-09, SignalChem, 사용 전 250μM 농도가 되도록 DTT를 첨가함), 80μl의 0.5mg/ml MBP(#M42-51N, SignalChem), 1μl의 1M MnCl2(#M40-09, SignalChem))과 상온에서 50분간 반응시켰다. 키나아제 반응에서 생성된 ADP를 ADP-Glo 키나아제 어세이(#V6930, Promega)로 측정하였다.

동물 실험

모든 동물 실험 과정은 연세대학교 의과대학의 동물실험윤리위원회의 승인 하에 수행되었다(Seoul, Korea; 2019-0333). 실험 전 동물들을 12시간 광/암 사이클에 7일간 적응시켰다. C57BL/6 마우스는 SLC, Inc.(Shizuoka, Japan)에서 구입하였다. 0일째에 6 내지 8주령 마우스의 오른쪽 옆구리에 5 x 10⁵MC38 세포를 피하주사하였다. 평균 종양 용적이 50-200mm³에 다다른 시점에 마우스 그룹당 5 마리에 매일 0, 5 또는 10mg/kg WNK463(#CD00005886, Crysdot, BelAir, MD, USA)를 경구투여하였다. CD8⁺T 세포 제거를 위해 마우스에 300μg의 항-CD8 제거 항체(clone 2.43, #BP0061, BioXcell, Lebanon, NH, USA)를 -1, 3, 6, 10 및 13일 째에 복강투여하였다. WNK463과 PD-1 차단 항체를 병합 처리하기 위해, 마우스에 종양 주사 8일 후 10μg 항-PD-1 항체 또는 IgG2a 대조군 항체를 복강투여, WNK463은 종양 주사 8일부터 매일 0 또는 10mg/kg WNK463을 경구투여하였다. 마우스를 처리군과 대조군(비이클) 그룹으로 무작위로 분류하고 표준적인 조건 하에서 유지하였다. 약물주입 첫날부터 캘리퍼스로 종양의 크기(길이 x 폭)를 측정하였다. 종양 용적은 다음의 식으로 계산하였다 :0.5 x 긴 지름 x 짧은 지름². 마우스에 약물을 9일간 매일 투여하였으며 최대 종양 용적이 2cm³에 이르렀을때 희생시켰다.

종양 세포에 대한 유세포분석

절개된 종양을 IV형 콜라게나아제 및 DNase로 37℃에서 20분 간 분해하고 분해된 조직을 100μm 여과기로 여과하여 세포 현탄액을 제작하였다. 이후, 종양 세포 및 종양-침윤 림프구(TIL)를 Percoll(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)의 40% 및 80%의 불연속적 농도 구배를 통한 원심분리(2000 rpm, 40 min, RT, break-off)를 이용하여 정제하였다.

TIL의 단일세포 현탄액을 제작하고 Fixable Viability Dye(Invitrogen)로 염색하여 죽은 세포를 표지하고 형광크롬-접합 항체와 반응시켰다. 표면 염색을 위해, 세포를 PBS로 세척 후 다음의 항체를 PBS로 1:400 희석하여 처리하였다: 항-CD4 (GK1.5, Biolegend), 항-CD8 (53-6.7, Biolegend), 항-CD45 (30-F11; BD Pharmingen, San Diego, CA, USA), 항-TCRβ (H57-597, Biolegend), 항-PD-L1 (10F.9G2, Biolegend), 항-PD1 (29F.1A12, BioLegend), 항-TIM3 (RMT3-23, BioLegend). 세포 내 전사인자 염색을 위해, eBioscience/Invitrogen Perm Buffer로 세척 후, 항-TOX (REA473, Miltenyi Biotech)를 처리하였다. 세포 내 사이토카인 염색을 위해 세포를 세포 자극 칵테일과 단백질 수송 억제제(00-4980-03, eBioscience/ Invitrogen)로 6시간 동안 자극한 뒤, 세포를 세척하고 표면 분자를 염색하였다. 이후 세포를 eBioscience/Invitrogen Intracellular(IC) 고정 완충액으로 고정시키고, 1 x 투과화 완충액(Invitrogen)으로 세척 후, PBS로 1:200 희석된 다음의 항체로 염색하였다: 항-TNF (MP6-XT22, BD Pharmingen), 항-IFN-γ (XMG1.2, Biolegend), 항-GRANZYME B (QA16A02, BioLegend). FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD PharMingen)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포 아폽토시스를 검출하였다. FACSCelesta(BD Biosciences)를 이용하여 세포 이미지를 수득하고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star)로 데이터를 분석하였다. 인 비보 실험의 데이터는 GraphPad Prism version 9 (San Diego, CA, USA)로 분석하였다.

교모세포종

- 세포주

U87MG는 ATCC(Manassas, VA, USA), SF295는 AddexBio(San Diego, CA, USA)에서 구입하여 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다.

- siRNA 형질감염

세포(4 x 10⁵)에 RNAiMAX(Invitrogen)와 혼합된 siRNA를 6-웰 플레이트의 각 웰에 100nM 씩 처리하고 형질감염 72시간 후 각각의 실험을 진행하였다. 다음의 서열을 가지는 각 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다(Genolution, Seoul, Korea) : 인간 WNK3:5′-GCCTCACGTTTGTCAGTAT-3′, 5′-ATACTGACAAACGTGAGGC-3′, 음성대조군: 5′-GCAGGACCAGGCCAUAUGA-3′.

- 면역 블롯팅

세포를 PBS로 세척 후 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, Katy, TX, USA)을 포함하는 RIPA 라이시스 완충액(Sigma-Aldrich)에서 용해시켰다. 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였다. 동량의 단백질을 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Gels(Bio-Rad) 상에서 분리시켰다. Bethyl Laboratories(Montgomery, TX, USA)에서 구매한 항-WNK3 (#A301-877A), Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구매한 항-PD-L1 (#13684S), 항-HSP90 (#4877) 항체를 사용하였다. Peroxidase AffiniPure 염소 항-토끼 IgG (#111-035-144) 및 항-마우스 IgG (#115-035-003, Jackson ImmunoResearch, West Grove, RA, USA)를 2차 항체로 사용하였다. 1차 항체와 2차 항체는 각각 1:1000 및 1:5000로 희석하여 사용하였다.

실험결과

shRNA 스크리닝 결과 PD-L1 발현을 조절하는 약물성 유전자 및 암 유발 유전자가 동정되었다.

본 발명자들은 집중된 shRNA 라이브러리를 생성하여 조합하여 PD-L1 발현을 조절하는 약물성 유전자 및 암 유발자를 동정하고자 하였다(N = 35,949). 약물성 유전자 세트에는 5,069개 유전자(32,643개 shRNAs)가 포함되었으며 이들은 약물과 관련되거나 키나아제, 수용체 및 대사 효소¹¹와 같이 약물성 타겟에 속하였다(표 3). 암 유발 유전자 세트에는 13종의 종양 타입에서 800개의 가장 빈번한 돌연변이를 보이는 유전자(5,611개 shRNAs)가 포함되었다^12-19(표 4). 두 라이브러리에서 shRNA의 양은 정규 분포에 가까웠다(도 8a). 스크리닝을 위한 적절한 세포주 선정을 위해, 7개의 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주(H2009, HCC44, HCC461, H460, H647, H2122, A549)에서 기저 및 IFN-γ로 유도된 PD-L1 발현수준을 측정한 결과 가장 높은 기저 및 IFN-γ 유도 PD-L1 수준을 보이는 H2009를 선정하였다(도 1a, 1b, 8b 및 8c). 종양 고유의 PD-L1 조절 기작을 조사하기 위해, IFN-γ 미처리 조건 하에서 스크리닝을 수행하였다. H2009 세포에 렌티바이러스 shRNA(N = 35,949) 및 32개 비-표적화 음성대조군 shRNA (도 1c)를 형질도입하였다. 퓨로마이신 선별 후 3일(t0), 13일(t1) 및 20일 (t2) 뒤, FACS를 수행하여 각 세포를 다음의 그룹으로 분류하였다: PD-L1 low, PD-L1 intermediate 및 PD-L1 high 아집단(도 1c 및 8d). 다음으로, 각 세포 집단에서 삽입된 shRNA에 대한 앰플리콘 시퀀싱을 수행하였다(도 1c). 끝으로, RIGER(RNAi Gene Enrichment Ranking) 알고리즘²³(도 8e)의 차선 방법(second-best method)을 이용하여 유전자 수준의 enrichment 점수를 계산하였다. shRNA는 다양한 온-타겟 효율성 및 오프-타겟 효과를 가지므로, 이 방법은 최소 2개의 shRNA에 의한 표현형 변화를 관찰하기 위해 개발되었다. 먼저, FACS 분류를 하지 않은 t0 및 t2-세포를 이용하여 CCE(Constitutive core essential) 유전자⁹의 시간 의존적 결핍을 측정함으로써 스크리닝 데이터의 질(quality)을 평가하였다. CCE 유전자는 t0에 비해 t2에서 유의하게 결핍된 반면(콜모고로프-스미르노프 검정, p=2.2E-16), 비필수(NE) 유전자⁹는 그렇지 않아(도 1d), 본 발명의 스크리닝 데이터가 높은 퀄리티를 가짐을 알 수 있었다. 스크리닝 결과 t1 및 t2에 PD-L1 low 및 PD-L1 high 집단에서 46개의 PD-L1 인핸서 및 27개의 PD-L1 억제자자 각각 동정되었다(도 8f, 표 5). 동정된 타겟에는 40개의 약물성 PD-L1 인핸서 및 PD-L1 발현을 촉진하는 9개의 암 유발자 및 PD-L1 발현을 억제하는 7개의 암 유발자가 각각 동정되었다(표 5).

73개 히트 유전자(스크리닝된 46개 PD-L1 인핸서 및 27개 PD-L1 억제자)에 대한 유전자-세트 증폭 분석을 통해 PD-L1 조절자가“뉴클레오타이드 삭제 수리” 및 “BMP/SMAD 신호경로”에 유의하게 관여되었음을 알 수 있었다(p<0.001)(도 1e). “뉴클레오타이드 삭제 수리”유전자 세트에는 4개의 PD-L1 억제자(POLR2C, PARP1, COPS5, POLE4)가 포함되었으며(도 1e, 좌측), 이는 DNA 수리 신호 경로 결핍이 신항원-T 세포 활성화-IFN-γ 경로 및 ATR-CHK1-의존적 DNA 손상 신호를 통해 PD-L1 발현을 증가시킨다는 관찰결과와 일치한다²⁹. BMP/SMAD 신호유전자 세트에는 2개의 PD-L1 인핸서(BMPR2, SMAD4)와 하나의 PD-L1 억제자(UBE2D3)이 포함되었다(도 1e, 우측). 유비퀴틴 접합효소 E2D3(UBE2D3)가 BMP-BMPR에 의해 촉발된 SMAD 신호를 억제하므로^30,31, 이는 BMP 신호가 PD-L1 증가에 관여할 가능성을 제안한다. 이상과 같이 본 발명자들은 직접적인 치료 타겟이 될 수 있는 PD-L1 인핸서를 동정하였다.

본 발명에서 사용된 약물성 유전자

데이터 형태	문헌 ^[ref]	유전자
약물성 유전자	GO³² Russ & Lampel³³ Hopkins & Groom³⁴ dGene³⁵ BaderLabGenes³⁶ FoundationOneGenes³⁷	5815 3026 2668 2256 292 229
약물-유전자 상호작용	DrugBank³⁸ PharmGKB³⁹ TTD⁴⁰ TEND⁴¹ MyCancerGenome⁴² TALC⁴³ ClearityFoundationClinicalTrial* MyCancerGenomeClinicalTrial⁴⁴ CancerCommons⁴⁵ ClearityFoundationBiomarkers*	2049 594 477 430 169 153 93 78 48 34
	Totals (unique)	5069

* https://www.clearityfoundation.org (현재 데이터 접근 불가)

본 발명에서 사용된 약물성 유전자

문헌	종양 형태	암 유발 유전자
Pan-cancer studies
-Somatic mutations
Ciriello G. et al. Nat Genet 45, 1127-33 (2013)¹²	13	199
Kandoth C. et al. Nature 502, 333-9 (2013)¹³	13	127
Vogelstein, B. et al. Science 339, 1546-58 (2013)¹⁴	26	138
Chang M. T. et al. Nature Biotechnology 34, 155-163 (2016)¹⁵	41	275
-Somatic copy number alterations
Zack TI. et al. Nat Genet 45, 1134-40 (2013)¹⁶	12	131
Beroukhim R. et al. Nature 463, 899-905 (2010) ¹⁷	26	196
Gastric cancer studies
-Somatic mutations
Cancer Genome Atlas Research Network. Nature 513, 202-9 (2014)¹⁸	1	57
Cristescu R. et al. Nat Med 21, 449-56 (2015)¹⁹	1	17
Totals (unique)		800

PD-L1 발현을 촉진 또는 억제하는 73개 후보 유전자

	카테고리	유전자	수
PD-L1 인핸서	약물성 유전자	AKR1C1, BMPR2, CA3, CAST, CTRL, EPHB1, GGT5, GLRX, GSTT2, HCK, HDAC3, HSP90AA1, HSP90B1, KCNB2, KSR1, METAP1, NDUFS3, OAZ2, OR4Q3, OR52E2, OR9K2, OSGEPL1, PFKFB4, PLAUR, PSKH1, SDHC, SERPINA10, SIK3, SLC25A17, SLC7A7, SLC9A3, TAS2R13, TAS2R40, TIGD1, UQCRC1, USP17, WNK3	37
	암 유발 유전자	ARIH1, BRD1, CDKN2C, MYH3, NDRG2, SMAD4	6
	약물성 암 유발 유전자	ADAMTS20, CCDC105, PAN3	3
PD-L1 억제제	약물성 유전자	EWSR1, PSMD9, NT5C2, RIOK3, POLE4, APOE, POLR2C, COPS5, CD70, RPS6KA6, CPE, CRYBB1, FCGR3B, LDHC, CDKL3, ACBD4, BTNL3, TGM6, OR52L1, TRIM49L1	20
	암 유발 유전자	SMC3, SRSF2, UBE2D3, CHL1, IGFBP1, MYO18A	6
	약물성 암 유발 유전자	PARP1	1

WNK3 및 SIK3는 PD-L1에 대한 양의 조절자이다.

다음으로, 본 발명자들은 후보 유전자를 억제하는 첫 번째, 두 번째 효율적인 shRNA를 안정적으로 발현하도록 제작된 세포주(H2009 및 H460)를 이용하여 46개 PD-L1 인핸서의 PD-L1 조절 기능을 조사하였다. 이들 중, 13개 유전자(WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4, OSGEPL1)을 녹다운할 경우 PD-L1 수준이 현저히 감소함을 유세포분석 및 qPCR 분석을 통해 확인하였다(도 2a-2d). 이들 13개 PD-L1 인핸서 중 2개의 암 유발자(PAN3 및 SMAD4)를 제외한 11개는 약물성을 가진다. 특히, 약물성 유전자 중 7개(WNK3, SIK3, HSP90AA1, HSP90B1, HDAC3, CA3 및 PFKB4)에 대해서는 상업적으로 이용 가능한 저분자 억제제가 존재한다(표 6). 이들 중, WNK3, SIK3, HSP90AA1 및 HSP90B1 억제제는 H460 세포와 H2009 세포에서 막의 PD-L1 수준을 감소시켰으며(도 2e-2f, 도 9a, 9b, 9d), WNK3(WNK463) 및 SIK3 억제제(다사티닙, YKL-06-062 및 YKL-05-099) 만이 세포 생존성에 영향을 주지 않으면서 막 PD-L1 수준을 감소시켰다(도 2e-2f, 도 9a-9d). 놀랍게도, HDAC3 억제제인 RGFP966은 PD-L1 수준을 증가시켰으며(도 2e-2f, 도 9a, 9d), 이는 shHDAC3 또는 RGFP966의 오프-타겟 효과일 수 있다.

이러한 결과를 종합할 때, WNK3 및 SIK3는 폐암 세포에서 PD-L1의 양성 조절자임을 알 수 있으며, 이들 유전자의 억제는 H460(도 2e-2f, 도 9a) 및 H2009(도 9b-9d)에 대한 직접적인 세포독성 유발 없이 막 PD-L1 수준을 억제함을 알 수 있다.

PD-L1 발현 촉진 유전자를 억제하는 화합물

PD-L1 인핸서	화합물	타겟 특이성
WNK3	WNK463	Pan-WNK
SIK3	Dasatinib	Pan-SIK
	YKL-06-062	Pan-SIK
	YKL-05-099	Pan-SIK
HSP90AA1, HSP90B1	PU-H71	Pan-Hsp90
HSP90AA1	CH5138303	Hsp90a
HDAC3	RGFP966	HDAC3
CA3	Acetazolamide	Pan-CA
PFKFB4	5MPN	PFKFB4

WNK3는 공배양 조건에서 면역 조절 효과를 발휘한다.

암 세포-면역세포 공배양 방법을 통해 WNK3 및 SIK3 타겟팅 shRNA 및 이들의 화학 억제제의 면역세포-의존적 항암 효과를 평가하였다. 평가 전, shPD-L1을 안정적으로 발현하는 단클론 H460 세포(도 3a)와 H2009 세포 (도 14a)가 IL-2 및 항-CD3-활성화 말초혈 단핵세포(PBMC)에 대한 민감성이 증가하였음을 확인하였다(도 3b, 도 3c, 도 14b).

다음으로, shRNA-매개 WNK3 제거를 통해 암세포를 면역세포 공격에 대해 민감화시킬 수 있는지를 조사하였다. 그 결과 PBMC 부재 하의 조건에 비하여 활성화된 PBMC의 존재 하에 shWNK3 세포의 사멸이 증가함을 관찰하였다(도 3d, 3e). 마찬가지로, 공배양 조건 하에 pan-WNK 억제제인 WNK463로 PBMC 부재 하의 조건에 비해 활성화된 PBMC에 의한 촉발되는 암세포 사멸이 유의하게 증가하였다(도 3f, 3g). 이러한 활성화된 PBMC에 의한 촉발되는 암세포 사멸효과는 암세포의 PD-L1 과발현(도 14c)에 의해 일부 역전됨으로써(도 14d), 암세포의 PD-L1 결핍이 항암면역 상승에 일부 기여함을 보여주었다. 특히, WNK463은 PD-L1을 억제할 뿐 아니라, PBMC의 생존에 영향을 미치지 않는 농도에서 PBMC에 의한 Granzyme B 분비 및 면역활성작용 사이토카인, IFN-γ, TNF-α 분비를 증가시키고, 면역억제작용 사이토카인 IL-10을 억제시킴으로써 면역세포를 직접적으로 활성화하였다(도 3h, 3i). 이를 통해, WNK463이 암세포의 PD-L1 발현 억제와 면역세포의 활성 증진으로 이중 항암 기전을 가지고 있음을 보여주었다.

WNK463이 면역 세포 활성화를 촉진하는 방법을 추가로 파악하기 위하여, 마우스 비장에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 분리하고 WNK463의 존재 또는 부재하에 이들을 자극하였다. WNK463은 비히클과 비교하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 PERFORIN 및 GRANZYME B 생산을 증가시키기에 충분하였다(도 12a). 이러한 결과는 WNK가 T 세포 활성화에서 고유 기능을 수행함을 의미한다.

본 발명자들은 PERFORIN과 GRANZYME B의 생산이 쥐 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 Wnk3의 효과적인 녹아웃에 의해 상당히 증가되었음을 추가로 입증하였다(도 12b). 인간 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포는 WNK3가 대조군 shRNA에 비해 shRNA에 의해 녹다운되었을 때 훨씬 더 많은 PERFORIN 및/또는 GRANZYME B를 일관되게 생성하였다(도 12c). 또한, shWNK3을 안정적으로 발현하거나 WNK3을 과발현하는 Jurkat T 세포도 각각 IL-2 분비가 크게 향상되거나 억제된 것으로 나타났다(도 3j, 도 12d). 이러한 발견들에 의하여, WNK3가 T 세포 활성화를 억제하는 고유 T 세포 기능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

다음으로 WNK3가 T 세포 활성화를 억제하는 방법을 살펴보았다. WNK3가 키나제 활성을 가지고 있고 PI3K-AKT 신호전달이 GRANZYME B⁴⁶ 생성에 중요하다는 점을 감안하여, 본 발명자들은 WNK3이 AKT 경로를 조절함으로써 근위 TCR 신호전달 캐스케이드(proximal TCR signaling cascades)에 주로 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 실제로, 대조군 sgRNA 및 비히클과 비교할 때, Crispr/Cas9에 의한 Wnk3 녹-아웃 및 WNK463 처리는 특히 CD8+ T 세포에서, 또는 잠재적으로 CD4+ T 세포에서도 AKT 및 pS6의 인산화를 증가시키기에 충분하였다(도 12e, 도 12f).

반면, SIK3 억제는 면역세포에 대해 반대의 효과를 나타냈다. shSIK3 및 SIK3 억제제는 암세포에서 PD-L1 수준을 감소시키지만(도 2a-2f, 9a, 9b 및 9d), SIK3 억제제인 YKL-06-062는 공배양 조건에서 암세포에 면역세포에 대한 저항성을 부여한다(도 3k, 3l). 이러한 결과와 일치하여, SIK3 억제제(다사티닙 및 YKL-06-062)는 PBMC에 의한 GRANZYME B 분비를 유의하게 감소시켜(도 3m, 3n), SIK3 억제가 암세포-비의존적 항-면역 효과를 가짐을 알 수 있었다.

이러한 데이터를 통해 공배양 조건에서 WNK3 억제의 이중적인 기능을 알 수 있다. WNK3의 억제는 암세포에서 PD-L1 발현을 억제함으로써 CD8⁺T 세포에 대한 민감성을 증가시키는 반면, 면역세포에서는 CD8⁺T 세포에 의한 항종양 사이토카인 분비를 촉진한다.

WNK3는 PD-L1의 전사 조절자이다.

다음으로, shWNK3를 발현하거나 WNK3를 과발현하는 H2009 및 H460 세포주를 이용하여 WNK3에 의한 PD-L1 조절이 mRNA 수준에서 이루어지는지 또는 단백질 수준에서 이루어지는지를 조사하였다. 두 개의 shWNK3 발현 세포주에서 PD-L1의 mRNA 및 단백질 수준이 모두 감소하였다(도 4a, 4b, 4c 및 10a); 아울러, WNK3-과발현 세포주에서 PD-L1의 mRNA 및 단백질 수준이 모두 증가하였다(도 4d, 4e 및 10b). shWNK3를 발현하는 세포에서 WNK3의 이소성 발현이 감소된 PD-L1 수준을 회복시키기에 충분하였으므로, 본 발명자들은 shWNK3-매개 PD-L1 감소가 온-타겟 효과라고 추정하였다(도 10c). 또한, 7개의 NSCLC 세포주에서의 WNK3와 PD-L1의 발현이 양의 상관관계를 보여주었다(도 14e). 이들 결과를 종합하면 WNK3은 PD-L1 발현을 전사적으로 조절함을 알 수 있다. 유전자 데이터와 일치하여, pan-WNK 억제제인 WNK463 역시 PD-L1의 mRNA 및 단백질 수준을 감소시켰다(도 2e, 2f, 4f, 4g, 9a, 9b, 9d 및 10d). WNK463는 pan-WNK 억제제이므로, 다른 WNK 패밀리(WNK1, WNK2, WNK4)의 PD-L1 조절 능력을 조사하고자 하였다. WNK3와 달리 WNK1 및 WNK2의 shRNA-매개 녹다운과 WNK4의 siRNA-매개 녹다운은 PD-L1 발현에 영향을 미치지 않았다(도 10e, 10f). 나아가, H2009 세포에서 WNK1, WNK2 또는 WNK4의 과발현은 PD-L1 수준에 영향을 미치지 못했다(도 10g). 다른 WNK 패밀리 멤버가 PD-L1 발현에 영향을 미치지 못하는 것은 WNK463가 WNK3 억제를 통해 PD-L1을 조절함을 말해준다. 특히, WNK3 억제는 I형 MHC 단백질 발현에 영향을 미치지 못함으로써, 암세포의 CD8⁺T 세포에 대한 항원 제시를 저하시키지 않음을 알 수 있다(도 4h). 이러한 결과를 통해 WNK3가 PD-L1 mRNA 발현을 조절하는 필수적 인자이며 WNK463가 WNK3-녹다운의 표현형을 모사함을 알 수 있다.

WNK3는 JNK/c-Jun 경로를 통해 PD-L1 발현을 촉진한다

WNK3-의존적 PD-L1 전사활성화가 IFN-γ 경로와 결합되어 있는지를 조사하기 위해, IFN-γ의 존재 또는 부재 하에서 WNK3-결핍 또는 억제 세포에서의 막 PD-L1 수준을 측정하였다. WNK3이 IFN-γ 신호경로의 다운스트림에 작용한다면 IFN-γ의 첨가가 WNK3-삭제 또는 억제에 의해 감소된 PD-L1 발현을 회복시키지 못할 것이라 가정하였다. 그러나, PD-L1 수준의 감소는 재조합 인간 IFN-γ에 의해 회복되어, WNK3가 IFN-γ 신호경로와 독립적으로 작용함을 알 수 있었다(도 5a-5d). WNK3-매개 PD-L1 조절에 관여하는 신호경로를 규명하기 위해, 본 발명자들은 JNK/c-Jun, ERK, p38, AKT, NF-κB 및 JAK/STAT를 포함하는, 암세포에서 PD-L1 전사를 조절하는 몇몇 핵심 신호경로를 조사하였다⁴⁷. 그 결과 WNK3 녹다운에 의해 phospho-JNK 및 phospho-c-Jun 만이 감소함을 관찰함으로써(도 5e), WNK3가 JNK 신호경로의 업스트림 조절자임을 알 수 있었다. 마찬가지로, JNK-IN-8에 의한 JNK의 억제(도 5f)는 H2009 세포에서 WNK3 과발현에 의해 증가된 PD-L1 발현을 억제한 반면(도 5g); 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐플루라이드하이드로클로라이드(AEBSF)에 의한 JNK 활성화는 WNK3-녹다운 세포에서 PD-L1 발현을 회복시켰다(도 5h). 다음으로, WNK3-매개된 PD-L1 수준의 조절이 WNK3의 키나아제 활성에 좌우되는지를 조사하기 위해, WNK3 키나아제-결핍 돌연변이(WNK3-K159M)^48,49의 PD-L1 조절 능력을 평가하였다(도 5i). 면역침강법으로 얻은 WNK3-K159M 돌연변이는 키나아제 활성이 보이지 않은 반면에, WNK3 야생형은 기질, MBP를 인산화하였다(도 14f). WNK3-K159M 돌연변이는 야생형 WNK3처럼 PD-L1 발현수준을 증가시키지 못하여(도 5j 및 도 5k), PD-L1 조절은 적어도 부분적으로 WNK3 키나아제 활성에 의해 매개되는 것으로 보인다. 인산화된 JNK 수준 역시 WNK3 키나아제 활성과 연관되어 있었다(도 5j 및 5k). 또한, WNK3를 과발현하는 HEK293FT 세포에 처리한 pan-WNK 억제제, WNK463, WNK inhibitor 11에 의해 WNK3의 키나아제 활성이 억제되어 있었다(도 14g). 이들 데이터는 WNK3가 JNK/c-Jun 경로를 통해 PD-L1 발현을 증진시킴을 보여준다.

pan-WNK 억제제인 WNK463는 종양 PD-L1을 억제하고 CD8 ⁺ T 세포를 활성화하여 MC38 종양 성장을 저해한다

인간 대장암 세포주 HCT116에서도 역시 WNK3/PD-L1 관계가 재연되어(도 11a, 11b), 이러한 축이 NSCLC 외의 암에서도 작동함을 알 수 있었다. WNK3/PD-L1 축의 기능적 역할을 조사하기 위해 항-PD1 또는 항-PD-L1 단일 치료에 반응성을 가지는 MC38 동계 대장선암 마우스 모델을 이용하였다⁵⁰. 인간 NSCLC 세포주와 유사하게, siWnk3-매개 Pd-l1 결핍(도 6a, 6b, 6c)으로 알수 있듯이 MC38은 온전한 WNK3/PD-L1 축을 가짐을 확인하였다. 나아가, pan-WNK3 억제제인 WNK463은 MC38 세포에서 PD-L1 발현을 감소시켰다(도 6d, 6e). WNK463(0, 5 또는 10 mg/kg; 1일 1회)를 MC38 종양을 가지는 정상 면역기능의 C57BL/6 마우스에 경구 위관으로 투여한 결과(도 6f), 종양 성장을 용량 의존적으로 억제하였다(도 6g 좌측 및 도 6h). 마찬가지로, WNK463 처리에 의해 신생물(neoplasm) 세포 또는 종양세포의 아폽토시스가 촉진되었다(도 6i). 그러나, CD8⁺T 세포-결핍 마우스에서는 WNK463 처리에 의해 PD-L1 발현은 감소하였으나 유의한 종양 관해(regression)는 관찰되지 않아(도 11c, 11d 및 6g 우측), WNK463의 항종양 효과는 주로 CD8⁺T 세포 매개 면역반응에 주로 좌우됨을 알 수 있었다. 특히, WNK463-처리 9일 후의 CD45 음성 종양세포군(도 6g 좌측)에서 PD-L1 막 수준의 용량-의존적인 감소(도 6j) 및 종양-침윤 림프구의 CD4⁺및 CD8⁺T 세포에 의해 분비되는 IFN-γ 및 TNF-α의 용량 의존적 증가(도 6k)도 관찰되었다. 이들 결과를 통해 WNK3 억제가 종양의 PD-L1 억제 및 면역세포 활성화를 통해 CD8⁺T 세포-매개 항종양 면역반응을 증진시킴을 알 수 있다.

WNK463 및 PD-1 차단 조합 치료의 상승 효과는 생체 내(in vivo) CD8+ T 세포의 세포 독성에 의존적이다

생체 내 WNK463 치료는 PD-L1 발현 감소를 통해 종양 성장을 억제하기 때문에, WNK463이 저용량 PD-1 차단의 치료 효능을 향상시킬 수 있다고 가정하였다. 피하 MC38 종양이 있는 마우스를 WNK463(10mg/kg), 항 PD-1 항체(10μg) 또는 병용으로 투여하였다(도 13a). 종양 성장에 직접적인 영향을 미치지 않는 저용량 항PD-1 항체(10μg)를 사용한 단일 요법과 대조적으로, WNK463과의 병용 치료는 종양 성장을 완전히 차단하고(도 13b) 종양 무게의 현저한 감소를 보였다(도 13c). 예상대로 종양 세포 집단의 PD-L1 수준은 WNK463 처리 그룹에서 감소하였다(도 13d). 해당 관찰 결과와 일관되게, 병용 투여 그룹은 CD8+, PD-1+, TIM3+ 및 TOX+ 탈진 T 세포(exhausted T cells)의 가장 유의한 감소를 보여주었으며(도 13e), 이를 통하여 종양 침윤 CD8+ T 세포(tumor-infiltrating CD8+ T cells)의 활성이 향상되었다는 것을 알 수 있었다. 또한, IFN-γ 및 GRANZYME B를 생성하는 세포독성 CD8+ T 세포는 WNK463 및 항-PD-1로 공동 처리된 종양에서 현저하게 증가하였다(도 13f). 전반적으로, 이러한 결과를 통하여 WNK463과 저용량 항PD-1 요법이 종양 침윤 CD8+ T 세포의 활성화 및 종양 성장 억제에 상승 효과가 있음을 입증할 수 있었다. 최종적으로 종양 면역 내성에서 WNK3의 임상적 의미를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 WNK3-고발현 및 WNK3-저발현 종양이 있는 폐암 환자의 예후를 비교하였다. TCGA와 E-MTAB-923 코호트 모두에서, 가장 높은 WNK3 발현을 가진 환자의 3.6% 내지 10%는 낮은 WNK3 발현을 가진 환자보다 더 나쁜 예후와 짧은 전체 생존율을 나타냈다(도 6l). 일관되게, WNK3 발현 수준은 대장(GSE39582) 및 위(GSE62254) 암 코호트에서의 불량한 전체 생존 기간과 유의하게 연관되어 있었다(도 13g). 이러한 관찰 결과는 WNK3 고발현 종양의 더 나쁜 예후가 WNK3에 의해 유발된 항-종양 면역의 억제에 의한 것일 수 있음을 제시한다.

교모세포종 세포주 모델에서 WNK3 억제에 의하여 PD-L1이 감소함을 확인하였다.

교모세포종 (Glioblastoma, GBM) 세포주 모델 U87MG, SF295에 대한 siRNA 형질감염 및 PD-L1에 대한 면역블롯팅 실험 결과, 교모세포종 세포주에서도 WNK3의 억제에 의하여 PD-L1이 감소함을 확인하였다(도 14h).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 상기 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자; 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 WNK3 또는 SIK3에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 억제제는 WNK3 또는 SIK3의 발현을 억제하는 핵산분자; WNK3 또는 SIK3가 인코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머; WNK463; WNK Inhibitor 11; 다사티닙; YKL-06-062; 및 YKL-05-099로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1)의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제 6 항에 있어서 상기 암은 폐암, 흑색종, 뇌암, 신장세포선암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 면역관문 억제용 조성물의 스크리닝 방법:
(a) WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 이들이 인코딩하는 단백질 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료 내 상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,
상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 면역관문 억제용 조성물로 판정한다.
제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 암 조직에서 유래된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 흑색종, 뇌암, 신장세포선암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
WNK3, HSP90AA1, CA3, CAST, PFKFB4, SLC7A7, HDAC3, HSP90B1, SIK3, PAN3, CTRL, SMAD4 및 OSGEPL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 PD-L1 발현 또는 활성 측정용 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
WNK3 유전자의 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 CD4+ T 세포; CD8+ T 세포; 및 CD4+CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포의 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 억제제는 상기 유전자의 발현을 억제하는 핵산분자; 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머 또는 상기 유전자가 인코딩하는 단백질의 활성을 억제할 수 있는 소분자 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항의 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 면역 결핍 질환은 선천성 면역결핍증, 암, 만성바이러스 감염, 골수이식 후 면역결핍증, 박테리아 패혈증, 항암 치료 후 면역결핍증 및 뇌졸중에 의한 면역결핍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
다음의 단계를 포함하는 면역 증진용 조성물의 스크리닝 방법:
(a) WNK3 유전자, 이에 의해 인코딩되는 단백질, 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료 내 상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,
상기 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 면역 증진용 조성물로 판정한다.
WNK3 억제제를 포함하는, 면역관문억제제와의 병용투여용 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 WNK3 억제제는 WNK463이고, 상기 면역관문억제제는 PD-1 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 PD-1 억제제는 항-PD-1 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 뇌암은 교모세포종인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 뇌암은 교모세포종인 것을 특징으로 하는 방법.